средство для стимуляции синтеза гликогена в сердечной мышце и способ стимуляции синтеза гликогена в сердечной мышце

Формула изобретения

1. Средство для стимуляции синтеза гликогена в сердечной мышце, характеризующееся тем, что оно представляет собой спиртовой экстракт коры надпочечников свиных или фетальных.

2. Способ стимуляции синтеза гликогена в сердечной мышце, характеризующийся тем, что парентерально вводят спиртовой экстракт коры надпочечников свиных или фетальных в разовой дозе 0,5 мл экстракта на 100 г массы тела организма через день в течение 5 недель.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемые средство для стимуляции синтеза гликогена в сердечной мышце и способ стимуляции синтеза гликогена в сердечной мышце относятся к медицине, в частности к экспериментальной медицине, и могут быть использованы для стимуляции синтеза гликогена в сердечной мышце.

Гликоген является непосредственным источником глюкозы для сердечной ткани.

Сердцу принадлежит особое место в поддержании гомеостаза в организме человека. При каждом сокращении сердце доставляет к тканям обогащенную необходимыми веществами кровь и удаляет от них токсичные продукты через другие специализированные органы во внешнюю среду. Уменьшение числа сердечных сокращений до 30 в минуту (одно сокращение за 2 секунды) угрожает жизни, а выпадение подряд трех сокращений сердца в минуту приводит к потере сознания. В то же время задержка дыхания возможна в течение 3 минут (и больше) без того, чтобы наступили расстройства сознания, если продолжает работать сердце. Остановка в работе сердца, как правило, приводит к прекращению акта дыхания.

В регуляции частоты и глубины сердечных сокращений участвуют нервная и эндокринная системы, действие которых на сердце опосредуются через изменения метаболизма в кардиомиоцитах водителей ритма.

Смена электролитов за пределами мембран кардиомиоцитов, как и сокращение миофибрилл мышцы сердца, требуют энергетического обеспечения. Энергия для перемещения электролитов через клеточную мембрану доставляется, главным образом, посредством гликолиза, а энергия сокращения мышцы сердца - преимущественно путем окисления органических веществ в цикле лимонной кислоты.

Основным топливом для гликолиза является гликоген, содержащийся в кардиомиоцитах (депо топлива) и доставляемая с кровью глюкоза, а основным топливом в цикле трикарбоновых кислот являются жирные кислоты и пировиноградная кислота, образующаяся в процессе гликолиза.

Основные запасы гликогена в организме сосредоточены в мышцах, в частности в сердечной мышце.

Глюкоза, которая высвобождается из гликогена в мышцах под воздействием специфической для мышц фосфорилазы, в виде глюкоза-1-фосфата превращается затем в глюкоза-6-фосфат, последний вступает в гликолиз через превращение в фруктоза-1,6-дифосфат. Из-за отсутствия в мышцах фермента глюкоза-6-фосфатазы глюкоза-6-фосфат не может выйти из мышечной клетки, а гликоген мышц не может использоваться для энергетического обеспечения других тканей.

Синтез гликогена в мышечных клетках протекает при участии так же специфической для мышц гликоген-синтазы, находящейся под влиянием инсулина, который обеспечивает поступление глюкозы из кровяного русла в мышечную клетку преимущественно через специфический рецептор ГЛЮК-4.

Гликоген в мышечной клетке откладывается вначале под сарколеммой, затем в цитозоле между фибриллами и в последнюю очередь внутри фибрилл. Как свидетельствуют данные, представленные в работе (1), при запасании гликогена в мышцах формируются вначале мелкие гранулы, при достижении определенного количества гранул в дальнейшем происходит их увеличение, причем крупные гранулы располагаются преимущественно под сарколеммой. В обратной последовательности происходит использование гликогена в мышцах.

Вначале метаболизируется внутрифибриллярный гликоген, затем гликоген, находящийся между миофибриллами, и последним потребляется гликоген, располагающийся под сарколеммой. Из других особенностей следует отметить, что в составе гранул в процессе формирования включаются ферменты гликоген-синтаза и гликоген-фосфорилаза, которые определяют его метаболизм.

В работе (2) представлены результаты исследования, касающегося влияния глюкокортикостероидов на регулирование метаболизма гликогена в скелетной мышце крыс. У адреналэктомированных животных уменьшалась деятельность гликоген-синтазы, что привело к уменьшению гликогена (25,7+/-0,9 mumol/g против 33,0+/-1,9 mumol/g; р<0,01). Обработка адреналином увеличивала деятельность гликоген-фосфорилазы и уменьшала деятельность гликоген-синтазы, что также приводило к уменьшению гликогена.

Удаление надпочечной железы уменьшило содержание гликогена в мышце на 35%. В этих условиях адреналин не оказывал никакого эффекта на активность ферментов, не влиял на активность гликоген-фосфорилазы, был сниженный эффект на гликоген-синтазу, не влиял на содержание гликогена.

После введения кортикостерона нормализовалось содержание гликогена в мышце адреналэктомированных животных, нормализовался ответ ферментов на адреналин.

Сокращение мускула привело к уменьшению гликогена, а также к уменьшению активности гликоген-фосфорилазы, но к увеличению активности гликоген-синтазы.

В работах (3, 4) изучено гормональное регулирование синтеза и метаболизма гликогена в белых мышцах форели. В отсутствие гормонов количество синтезируемого гликогена было обратно пропорционально исходному содержанию гликогена в мышцах. Когда уровень гликогена был меньше 5 micromol/g, синтезировалось приблизительно 4,3 mikromol/g гликогена. Но когда уровень гликогена превышал 5 mikromol/g, синтезировалось только приблизительно 1,7 mikromol/g. Эти различия в количестве синтезируемого гликогена в мышцах оказывало влияние на ответные реакции при введении адреналина [10(-8) М] и дексаметазона [10(-8) М]. При высоких уровнях гликогена (>5 mkM/g) адреналин и дексаметазон стимулировали гликоген-фосфорилазу и ферментативную систему гликогенолиза, тогда как при низком уровне гликогена (<5 mkM/g) стимулировался гликогеногенез, и гликоген-синтазная деятельность преобладала.

Из полученных результатов можно сделать вывод, что гормональные влияния на синтез и метаболизм гликогена зависят от исходного его содержания.

В настоящее время остается не решенным вопрос энергетического обеспечения работы сердца при различных патологических процессах, в том числе и гипоксии. Важную роль играет мобильный гликоген в энергетическом обеспечении процессов, связанных с рождением, проведением импульса и сокращением сердца.

Возможно, отрицательное влияние избыточного гликогена на работу сердца связано не столько с накоплением гликогена, сколько с дефицитом энергии из-за нарушенного его использования.

Нарушение использования глюкозы наблюдается при сахарном диабете в связи со снижением инсулина (сахарный диабет 1 типа) или повышением толерантности к инсулину (при сахарном диабете 2 типа). При обоих патологических процессах формируется тяжелая кардиомиопатия, наблюдается рано развивающийся атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, инфаркты миокарда и сердечная недостаточность (5)

В литературе обращается внимание на возможное отрицательное влияние избытка гликогена на сердце при длительном лечении кортикостероидами.

В качестве прототипа авторами выбран известный способ стимуляции синтеза гликогена, заключающийся во введении половых гормонов (тестостерона и эстрадиола) кастрированным самцам крыс, при этом кастрация приводила к увеличению содержания глюкозы в крови и уменьшению гликогена во всех мышцах (6).

Данный способ включает введение животным тестостерона в дозе 100 мкг и эстрадиола 5 мкг на 100 г массы животного в течение 30 дней.

Введение тестостерона кастрированным животным приводило к нормализации содержания гликогена, в частности и в сердечной мышце.

Тестостерон является естественным гормоном у всех млекопитающих. Он синтезируется корой надпочечников, а у лиц мужского пола большая часть тестостерона синтезируется в яичках. Тестостерон превращается в организме в 5-альфа-дигидротестостерон, который связывается с рецептором и проникает в ядро клеток, вызывает половую дифференцировку мальчиков, обладает анаболическими эффектами, повышая синтез мышечного белка и содержание гликогена. Применяется при задержке полового развития, после вынужденной кастрации, при истощающих заболеваниях, тяжелых травмах, хирургических вмешательствах, у женщин при опухолевых заболеваниях грудных желез и половых органов, когда применение эстрогенов противопоказано. Широкому применению тестостерона в качестве анаболического средства препятствует его сильное андрогенное действие. У мальчиков это проявляется преждевременным половым созреванием и последующей задержкой роста.

А у женщин вызывает торможение гонадотропной функции гипофиза, угнетение функции фолликулярного аппарата и яичников, атрофию эндометрия, подавление функции молочных желез (7).

На основании полученных результатов был сделан вывод, что тестостерон стимулирует в скелетной мышце гликогеногенез и запрещает гликогенолиз, а эстрадиол при этом не играет какой-либо существенной роли.

Однако введение внешних кортикостероидов, в частности тестостерона, способствует сердечно-сосудистым осложнениям. И если эти осложнения сохраняются хронически, они могут объяснить увеличение заболеваемости и смертности, вызываемые долгосрочным приемом кортикостероидов. Эти сердечные осложнениям могут быть вторичными к вызванному глюкокортикостероидам сопротивлению инсулина.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка эффективного средства и способа стимуляции синтеза гликогена в сердечной мышце, позволяющего повысить качество энергетического обеспечения работы сердца при отсутствии побочных эффектов, а также и расширяющего арсенал эффективных действующих средств и способов для стимуляции синтеза гликогена в сердечной мышце.

Поставленная задача решается предлагаемым средством для стимуляции синтеза гликогена в сердечной мышце, характеризующимся тем, что оно представляет собой спиртовой экстракт коры надпочечников свиных или фетальных.

Поставленная задача решается предлагаемым способом стимуляции синтеза гликогена в сердечной мышце, характеризующимся тем, что парентерально вводят спиртовой экстракт коры надпочечников свиных или фетальных в разовой дозе 0,5 мл экстракта на 100 г массы тела организма через день в течение 5 недель.

Техническим результатом предлагаемого средства и способа с использованием предлагаемого средства является повышение эффективности стимуляции синтеза гликогена в сердечной мышце и, как следствие, повышение качества энергетического обеспечения работы сердца и отсутствие побочных эффектов.

Данный технический результат обусловлен тем, что предлагаемое средство представляет собой спиртовой экстракт коры надпочечников свиных или фетальных, который содержит минорные концентрации кортикостероидов, таких как гидрокортизон, дегидроэпеандростерон и прогестерон, при их физиологическом соотношении, а также использованием предлагаемого средства в предлагаемом способе путем его парентерального введения спиртового экстракта коры надпочечников свиных или фетальных в разовой дозе 0,5 мл экстракта на 100 г массы тела организма через день в течение 5 недель.

При этом повышение энергетических запасов сердечной мышцы в виде гликогена обусловлено не только содержанием в экстракте коры надпочечников свиных или фетальных минорных концентраций кортикостероидов природного происхождения, таких как гидрокортизона, дегидроэпеандростерона и прогестерона, при их физиологическом соотношении, но и присутствием в экстракте в минимальных количествах других гормонов, которое усиливает или ослабляет степень сродства специфических рецепторов к кортикостероидам.

При низких концентрациях кортикостероидов пермиссивный эффект распространяется на инсулин: через его посредников активируются ферментные системы анаболической направленности - синтез гликогена.

В современных подходах к пониманию сердечно-сосудистых заболеваний сохраняются ранее установившиеся представления о важнейшем значении нейроэндокринных механизмов, которые вызывают различные функциональные изменения в миокарде. В свете этих данных заслуживают внимание полученные нами анаболические эффекты минорных концентраций кортикостероидов, содержащихся в экстрактах коры фетальных и свиных надпочечников, на миокард экспериментальных животных в условиях длительного парентерального введения (в течение 5 недель) и при гипобарической гипоксии.

Как известно, надпочечники вместе с плацентой играют исключительную роль в обеспечении интенсивного внутриутробного роста. В первые 5 месяцев длина тела плода равняется возрасту в месяцах, возведенному в квадрат, а в последние 5 месяцев - возрасту в месяцах, умноженному на 5. Так интенсивно организм никогда больше не растет. Этому способствует сочетание отдельных гормонов, присутствие в повышенной концентрации дегидроэпиандростерона, являющегося слабым андрогеном и предшественником тестостерона и эстрогенов, которые синтезируются у него на тканевом уровне. Имеются предпосылки связывать долговечность и меньшую вероятность смерти от сердечно-сосудистых заболеваний при высокой обеспеченности организма этим гормоном. Таким образом, экстракты коры надпочечников, содержащие гамму гормоноактивных соединений, оказывающих также и паракринные влияния на метаболические процессы в тканях, могут оказаться полезными при дистрофических процессах в мышце сердца, потере части сократительного миокарда и сердечной недостаточности.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом

Предлагаемое средство, представляющее собой спиртовой экстракт коры надпочечников свиных или фетальных, который содержит в минорных концентрациях кортикостероиды природного происхождения, такие как гидрокортизон, дегидроэпеандростерона и прогестерон и другие гормоны, вводят парентерально через день в течение 5 недель в разовой дозе 0,5 мл экстракта на 100 г массы тела организма.

Способ получения экстракта коры надпочечников

Экстракт коры надпочечников свиных или фетальных готовят по принципу органных препаратов: из 3,0 г ткани коры надпочечников получают 1 мл экстракта этилового спирта при нормальных условиях.

Конкретное применение предлагаемого средства и способа

Предлагаемое средство для стимуляции синтеза гликогена в сердечной мышце и способ стимуляции синтеза гликогена в сердечной мышце были использованы в эксперименте в 30 растущих беспородных крысах-самцах с массой тела в начале опыта 99,8+/-3,7 г и длиной тела 12,44+/-0,58 см. В конце опыта животные имели вес 181,7+-12,7 г и длину тела 14,0 см. Животные были разделены на 6 групп, из которых 5 животных были интактными (1 группа контроля), 5 животных получали 10% раствор этилового спирта на физиологическом растворе хлорида натрия (2 группа контроля), 5 животных получали экстракт коры свиных надпочечников (3 группа), 5 животных получали экстракт коры фетальных надпочечников (4 группа) и 5 животных получали гидрокортизон (10 мг/кг) на основе 10% раствора этилового спирта (5 группа).

Методом радиоиммунологического анализа в экстрактах коры надпочечников были определены концентрации гидрокортизона, дегидроэпиандростерона и прогестерона. Так, в 0,5 мл экстракта коры свиных надпочечников содержалось гидрокортизона - 65 нмоль, дегидроэпиандростерона - 0,83 нмоль и прогестерона - 1,1 нмоль. В 0,5 мл экстракта коры фетальных надпочечников содержалось гидрокортизона - 5,0 нмоль, дегидроэпиандростерона - 1,15 нмоль и прогестерона - 0,45 нмоль

В группе 5 в 0,5 мл вводимого животным раствора гидрокортизона содержалось 2,6 мкмоль гидрокортизона.

Исследования проводить начинали после введения 16 инъекций препаратов, выполняемых через день, для этого забивались по 3 животных из каждой группы.

С остальными (по 2 животных в каждой группе) проводились испытания на выживаемость в условиях гипобарической гипоксии. За 30 минут до проведения гипобарической гипоксии всем животным вводился соответственно ранее используемый препарат в объеме 0,5 мл подкожно.

Животные медленно (по 1000 м за 1 минуту) поднимались на высоту до 12000 м в барокамере, причем для одной партии были созданы условия малой смены воздуха, а второй - большей сменой воздуха, что достигалось регулировкой клапана для поступления воздуха. Все животные каждой партии находились одновременно в одной камере. Животные были помечены краской. Регистрировалась длительность выживания каждого животного. Животные считались умершими, если становились неподвижными, появлялись пенистые выделения из дыхательных путей и прекращалось дыхание. После смерти брались органы (сердце) для гистологического исследования. После парафинизации срезы окрашивались шифф-йодной кислотой по Мак-Манусу.

Содержание гликогена в мышечном волокне сердца оценивалось следующим образом.

+1 балл - очень мелкие гранулы гликогена цепочкой располагаются под сарколеммой кардиомиоцитов;

++2 балла - более крупные хорошо заметные гранулы гликогена располагаются под сарколеммой кардиомиоцитов;

+++3 балла - гранулы гликогена располагаются под сарколеммой и обнаруживаются в небольшом количестве в саркоплазме кардиомиоцитов;

++++4 балла - гранулы гликогена хорошо представлены под сарколеммой и имеются большие скопления гранул в саркоплазме кардиомиоцитов.

Результаты исследований, отражающие содержание гликогена в каждой группе животных, представлены в таблице.

На фотографиях 1, 2 представлен препарат среза сердца, содержащего гликоген под сарколеммой кардиомиоцитов у животных в группе 1 и 4.

На фотографии 1 представлен препарат среза сердца, содержащего гликоген под сарколеммой кардиомиоцитов у животных в группе 1.

На фотографии 2 представлен препарат среза сердца, содержащего гликоген под сарколеммой кардиомиоцитов у животных в группе 4.

На гистологических срезах сердца определялось количество гликогена в 150 полях зрения в каждой группе, которые представлены в таблице. Обращает внимание, что у интактных животных (1 группа, 1 контроль) гликоген был представлен в основном в малом и умеренном количестве (+, ++), в среднем составлял 1,31+/-0,46 баллов. При введении этанола представительство гликогена в кардиомиоцитах было несколько повышено в сравнении с интактными животными, различия статистически достоверны. В большей мере и в другом качестве был представлен гликоген в кардиомиоцитах у животных, получивших экстракт коры свиных надпочечников. В три балла были оценены содержания гликогена в 35,33% полях просмотра гистологических препаратов сердца, и в 30,0% выявлялся отличительный признак достаточности гликогена в кардиомиоцитах в виде скоплений гранул в саркоплазме. Различия в сравнении с первыми двумя группами животных статистически значимы.

В такой же мере, но с большей выраженностью, изменения в содержании гликогена в кардиомиоцитах были обнаружены у животных, получивших экстракты коры фетальных надпочечников. Различия между третьей и четвертой группами были тоже статистически достоверны.

Обращает внимание в шестой группе особенность воздействия гидрокортизона (в дозе - 10 мг/кг массы). Содержание гликогена в кардиомиоцитах у этой группы животных было выше, чем в контрольных (1-й и 2-й) групп, но существенно ниже, чем после введения кортикостероидов природного происхождения в низких (минорных) концентрациях (3-4 группы).

В группах животных, подвергшихся гипобарической гипоксии после 5-недельного введения выше названных препаратов, содержащих кортикостероиды препаратов, обращало внимание следующее.

Раньше других погибли животные в барокамере при резко ограниченной смене воздуха (17,2+-5,38 мин против 28,5+-4,59 мин (р=0,003). В условиях летальной гипоксии не удалось обнаружить существенного влияния вводимых препаратов на продолжительность жизни. Все же несколько дольше жили получившие этиловый спирт в 10% растворе (25 минут и 33 минуты), а также гидрокортизон - одно животное 34 минуты (зато другое жило только 15 минут, меньше, чем средняя выживаемость в 1 группе (17,2 мин). Это можно объяснить тем, что в экстремальной ситуации этанол хорошо используется как топливо, а гидрокортизон в большой дозе усиливает глюконеогенез, столь необходимый для обеспечения организма энергией в гликолизе, который усилен при гипоксии. Гликоген в кардиомиоцитах был представлен больше у животных первой группы с меньшей продолжительностью жизни. У них чаще встречались крупные гранулы гликогена, а во второй группе - мелкие.

При сопоставлении материалов гистохимического исследования на присутствие гликогена в сердце и печени обращала внимание у всех животных более длительная сохранность гликогена под сарколеммой кардиомиоцитов. В то же время ни у одного животного не обнаруживался гликоген в саркоплазме, что позволяет относить такой гликоген к более доступному топливу в условиях гипоксии. Так как гликоген печени у погибших животных большей частью резко снижался или почти полностью отсутствовал, то (при исходно высоком его содержании до проведения гипобарической гипоксии) это подчеркивает роль последнего в энергетическом обеспечении прежде всего сердечной деятельности. Заслуживает внимания и тот факт, что и при малой продолжительности жизни животных в условиях гипобарической гипоксии потребление гликогена печени сочеталось с отсутствием гликогена в саркоплазме кардиомиоцитов при введении экстрактов коры надпочечников. Очевидно, что в минорных концентрациях комплекс гормонов стимулирует синтез гликогена в мышце сердца. Меньшее содержание гликогена при введении гидрокортизона в высоких концентрациях в сравнении с содержанием его после введения экстрактов коры надпочечников позволяют считать, что гидрокортизон в высоких концентрациях тормозил и синтез и использование гликогена в сердце.

Влияние экстрактов коры свиных, фетальных надпочечников на содержание гликогена в миокарде крыс приведено в таблице.

Таблица
№	Наименование Группы животных n=18	1 балл	2 балла	3 балла	4 балла	В среднем баллов
1	Интактные n=3	113 (75,33%)	27 (18,0%)	10 (6,66%)	0	1,31+/-0,46
2	Этанол n=3	86 (57,33%)	45 (30,0%)	19 (12,66%)	0	1,55+/-0,63
3	Экстр. свиных надп. n=3	10 (6,66%)	42 (28,0%)	53 (35,33%)	45 (30,0%)	2,88+/-0,74
4	Экстр. фетальн. надп. n=3	10 (6,66%)	25 (16,66%)	60 (40,0%)	55 (36,66%)	3,06+/-0,67
5	Гидрокортизон n=3	20 (13,33%)	78 (52,0%)	43 (28,66%)	9 (6,0%)	2,27+/-0,61

Парный

критерий Стьюдента

t 1-2=6,859 p=0,000

t 2-3=-27,295 p=0,000

t 2-4=29,843 p=0,000

t 2-5=19,574 p=0,000

t 3-4=5,719 p=0,000

t 3-5=15,374 p=0,000

t 4-5=-21,443 p=0,000

Как видно из полученных результатов, предлагаемое средство, содержащее кортикостероиды природного происхождения в минорных концентрациях при их физиологических соотношении, оказывают стимулирующее влияние на синтез гликогена в сердечной мышце, а предлагаемый способ с использованием предлагаемого средства является эффективным для стимулирования синтеза гликогена в сердечной мышце, при отсутствии побочных эффектов.

Кроме того, предлагаемое средство расширяют арсенал эффективно действующих средств природного происхождения для стимуляции синтеза гликогена в сердечной мышце и способов для стимуляции синтеза гликогена в сердечной мышце с использованием средства природного происхождения.

Источники информации

1. Murchand J., Tarnopolsky М., Adamo K.В., Bourgeois J.M., Chorneyko K. and Gracham Т.Е. Quantitative assessment of Human muscle glycogen granules size and numer in subcellular location during recovery from prolonged exercise. The Journal of physiology, 2007, p.580, 617.

2. Coderre L., Srivastava A.K., Chiasson. Role of glucocorticoid in the regulation of glycogen metabolism in skeletal muscle. Am. J. Physiol. 1991, jun, 260 (6 Pt 1) E 927-32.

3. Milligan C.L. A regulatory role for cortisol in muscle glycogen metabolism in rainbow trout oncorhynchus my Kiss Walbaum. J. Exp. Biol, 2003 Sep; 206 (Pt 18): 3167-73

4. Frolow J., Milligan C.L. Hormonal regulation of glycogen metyabolism im white muscle from slices from rainbow trout (oncorhynchus mykiss Walbaum. Am J Physiol Regul Integr comp Physiol, 2004, Dec 287 (6): R 1 344-53.

5. Беленков Ю.Н., Мареев В.Ю., Агеев Ф.Т., Фомин И.В., Хохлов Р.А., Галявич А.С., Камалов Г.М., Тарновская Е.И., Щербина Е.В., Сайфутдинова Р.И., Макарова В.Г., Якушин С.С., Кочетжиева С.Г., Макарова Н.В., Маленкова В.Ю. Первые результаты Российского эпидемиологического исследования по ХСН. Ж. Сердечная недостаточность, т.4, № 1 (17), 2003, с.17.

6. Ramamani A., Aruldhas M.M., Govindarajulu P. Differential response of rat skeletal muscle glycogen metabolism to testosterone and estradiol. Can. J. Physiol. Pharmacol. 1999, Apr. 77 (4): 300-4.

7. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Пособие для врачей. М., 1999, ч.1, с.701.