способ определения сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий

Формула изобретения

Способ определения сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий, включающий проведение аллергических исследований крупного рогатого скота, выделение из биоматериала атипичных микобактерий и определение их сенсибилизирующих свойств на морских свинках путем подкожного заражения выделенной культурой, отличающийся тем, что атипичные культуры вводят дробно трехкратно равными частями через 24 ч в дозе 20 мг/гол. с последующим внутрикожным введением на 30 сутки только ППД-туберкулина и учетом наличия через 48 ч аллергической реакции, гиперемии, увеличения более 5 мм объема ткани и язв в месте введения, а также гиперплазии региональных лимфатических узлов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к способу диагностики туберкулеза, и может быть использовано для установления причин парааллергических реакций на туберкулин в благополучных по туберкулезу хозяйствах, возникающих при микобактериозах.

В благополучных по туберкулезу хозяйствах довольно часто регистрируются парааллергические реакции на ППД-туберкулин. Они в большинстве случаев обусловлены сенсибилизацией организма животных атипичными микобактериями, которые широко распространены в окружающей среде. Реакции в стадах крупного рогатого скота проявляются длительно, приобретая стационарный характер. В связи с этим оценка истинной эпизоотической ситуации в хозяйствах становится затруднительной. Методом систематических диагностических исследований, как правило, не удается достигнуть прекращения реакций в стаде и установления истинной природы этих реакций (Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных // Сборник санитарных и ветеринарных правил. - М., 1996).

Кроме того, наличие параалергических реакций требует выполнения большого объема работ по санации помещений и территорий ферм, которые сопровождаются большими материальными затратами. Возможно повторное заражение животных атипичными микобактериями. Это ведет к большим затратам времени и средств при оздоровлении хозяйств, что подтверждают многолетние исследования.

Известен способ определения сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий, который предусматривает выделение культуры микобактерий из биоматериала от убитых с диагностической целью животных, реагирующих на ППД-туберкулин для млекопитающих. Изолированную культуру атипичных микобактерий вводят 2-м морским свинкам в дозе 1 мг/мл. Через 21-30 суток после введения культуры их исследуют симультанной аллергической пробой с КАМ. ППД-туберкулин для млекопитающих в дозе 25 ТЕ и КАМ в дозе 10 ЕД в объеме 0,1 мл физиологического раствора или растворителя вводят с левой и правой стороны в депилированные участки кожи на боках животного. Реакцию учитывают через 24-48 часов (Наставление по диагностике туберкулеза животных. // МСХ РФ. Департамент ветеринарии / М., 2002. С.61-62).

Однако инокуляция атипичных микобактерий в дозе 1 мг/мл зачастую не вызывает ответной аллергической реакции у морских свинок, поэтому известный способ сенсибилизации не позволяет точно определить причину парааллергических реакций у крупного рогатого скота.

Задачей изобретения является повышение эффективности дифференциальной диагностики, которая решается следующим образом: в хозяйстве проводят аллергические исследования крупного рогатого скота, дифференцируют выделенные из биоматериала типичные и атипичные микобактерии. При выделении типичных (вирулентных культур) устанавливают туберкулез. При выделении атипичных - проводят определение сенсибилизирующих свойств на морских свинках. Выделенные атипичные культуры вводят дробно, трехкратно равными частями через 24 часа в дозе 20 мг/гол. Через 30 дней проводят аллергические исследования ППД-туберкулином, учет реакции проводят через 48 часов.

Дробное введение культуры атипичных микобактерий приближает к естественным условиям заражения, а доза 20 мг/гол является необходимой для проявления сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий, вызывая аллергическую реакцию у морских свинок на ППД-туберкулин, этим достигается поставленная цель: повышение точности дифференциальной диагностики до 90-95%, что позволяет предотвратить необоснованный убой продуктивных животных.

Пример 1. Определение оптимальной дозы, вызывающей аллергические реакции у морских свинок.

Аллергизирующие и патогенные свойства выделенных от представителей дикой фауны культур изучали на 18 морских свинках массой по 300-350 г, которые были сформированы по принципу аналогов в 5 групп, по 3 головы в каждой. Эксперимент проведен с целью изучения оптимальной заражающей дозы, которая вызывает аллергические реакции у морских свинок. Перед началом эксперимента и на 30 сутки после заражения животным опытных и контрольной групп вводили внутрикожно туберкулин для млекопитающих в дозе 25 ТЕ и объеме 0,1 мл, серия 10, госконтроль 10, изготовленный Курской биофабрикой 24.08.06, срок годности 3 года. Учет реакции проводили через 48 часов. Через 30 суток после заражения опытные и контрольные животные были убиты.

Морских свинок 1-й группы заражали подкожно атипичными микобактериями M.scrofulaceum, выделенными от хорька, - в дозе 1 мг/мл на каждое животное(прототип)

2-й группа - животных заражали M.scrofulaceum в дозе 10 мг/гол.

3-й группа - животных заражали M.scrofulaceum в дозе 20 мг/гол.

4-й группа - животных заражали M.bovis шт. № 14 в дозе 0,00001 мг/гол, выделенными от крупного рогатого скота (контрольная).

5-я группа - контрольная (интактная).

Из таблицы 1 видно, что у животных 1 группы (доза 1 мг/мл) аллергическая реакция на ППД-туберкулин не проявлялась. У животных с заражающей дозой 10 мг/гол реагировало на туберкулин одно животное, у морских свинок (доза 20 мг/гол) реагировали все животные. У животных 4 группы, зараженной M.bovis, реагировали также все животные. Животные 5 группы (контрольная) не реагировали.

Таким образом, введение морским свинкам атипичных микобактерий в дозе, регламентированной "Наставлением по диагностике туберкулеза животных" - 1 мг/мл, не вызвало аллергизирующего действия. Экспериментально подобранные дозы (10 и 20 мг/гол) способствуют сенсибилизации, т.е. вызывают аллергические реакции у 66,6%, но не выявляет всех животных, зараженных атипичными микобактериями.

Таблица 1
Результаты аллергических исследований морских свинок, зараженных культурами микобактерий
Группа №	Ко-во голов	До заражения	Заражение культурой МБ	Аллерг.иссл. на 30 сутки после заражения
1	3	№ 1 - отр	M.scrofulaceum доза - 1 мг/мл	№ 1 - отр
№ 2 - отр	№ 2 - отр
№ 3 - отр	№ 3 - отр
2	3	№ 1 - отр	- -	№ 1 - пол
№ 2 - отр	доза - 10 мг/гол	№ 2 - отр
№ 3 - отр		№ 3 - пол
3	3	№ 1 - отр	- -	№ 1 - пол
№ 2 - отр	доза - 20 мг/гол	№ 2 - отр
№ 3 - отр		№ 3 - пол
4	3	№ 1 - отр	M.bovis шт. № 14 (контроль)	№ 1 - пол
№ 2 - отр	№ 2 - пол
№ 3 - отр	№ 3 - пол
5	3	№ 1 - отр	Контроль	№ 1 - отр
№ 2 - отр	№ 2 - отр
№ 3 - отр	№ 3 - отр

Патологические изменения, вызванные M.bovis, характеризовались образованием язв на месте введения, увеличением регионарных лимфатических узлов, селезенки и печени, со множеством серых милиарных узелков (генерализованный туберкулез).

Патологические изменения, вызванные атипичными микобактериями M.scrofulaceum (2, 3 группы), характеризовались образованием язв на месте введения, увеличением регионарного лимфатического узла и единичных лимфатических узлов в легких.

Пример 2. Отработка режима введения атипичных микобактерий.

Группы формировали аналогично описанному примеру 1:

- животные 1 группы были заражены атипичными микобактериями M.scrofulaceum в дозе 1 мг/мл;

- животные 2 группы были заражены атипичными микобактериями M.scrofulaceum, выделенного от представителей дикой фауны. Заражение проводили в дозе 10 мг/гол. подкожно, причем общую заражающую дозу делили на 3 равные части и вводили культуру с интервалом в 24 часа.

- 3 группа была заражена этой же культурой в дозе 20 мг/гол. аналогично схеме заражения второй группы;

- 4 группа контрольная, интактная.

Таблица 2
Результаты аллергических исследований животных, зараженных M.srcrofulaceum микобактерий
Группа №	Ко-во голов	До заражения	Заражение культурой МБ, M.scrofulaceum	Аллерг. иссл. на 30 сутки после заражения
1	3	№ 1 - отр	доза - 1 мг/мл	№ 1 - отр
№ 2 - отр	№ 2 - отр
№ 3 - отр	№ 3 - отр
2	3	№ 1 - отр	доза - 10 мг/гол.	№ 1 - пол
№ 2 - отр	№ 2 - пол
№ 3 - отр	№ 3 - пол
3	3	№ 1 - отр	доза - 20 мг/гол.	№ 1 - пол
№ 2 - отр	№ 2 - пол
№ 3 - отр	№ 3 - пол
4	3	№ 1 - отр	Контроль	№ 1 - отр
№ 2 - отр	№ 2 - отр
№ 3 - отр	№ 3 - отр

Из таблицы 2 видно, что животные 1 группы (доза 1 мг/мл) на ППД туберкулин не реагировали. Животные с заражающей дозой 10 мг/гол. и 20 мг/гол. (2, 3 группы) все реагировали положительно. Контрольная группа - все реагировали отрицательно. Таким образом, предлагаемый режим введения атипичной культуры в дозе 10 и 20 мг/гол. дробно, разделенной на 3 равные части с интервалом 24 часа вызывает сенсибилизацию у 100% морских свинок. Патологические изменения, вызванные атипичными микобактериями M.scrofulaceum (2, 3 группы) характеризовались образованием язв на месте введения, которые сохранялись до 21 дня, увеличением региональных, а также единичных лимфатических узлов в легких.

Определение сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий

Для опыта использовали штамм № 42 - полевой штамм, выделенный от хорька. Исследования проводили на 20 морских свинках, которых распределили в 4 группы по 5 голов в каждой. Заражение проводили по описанной выше методике.

Таблица 3
Результаты аллергических исследований животных, зараженных штаммом № 42 атипичных микобактерий
Группа №	Ко-во голов	До заражения	Заражение культурой МБ, scrofulaceum	Аллерг. иссл. на 30 сутки после заражения	Аллерг. иссл. на 65 сутки после заражения
1	5	№ 1 - отр	доза - 5 мг/мл	№ 1 - отр	№ 1 - отр
№ 2 - отр	№ 2 - отр	№ 2 - отр
№ 3 - отр	№ 3 - отр	№ 3 - отр
№ 4 - отр	№ 4 - отр	№ 4 - отр
№ 5 - отр	№ 5 - отр	№ 5 - отр
2	5	№ 1 - отр	доза - 10 мг/гол.	№ 1 - пол	№ 1 - пол
№ 2 - отр	№ 2 - отр	№ 2 - отр
№ 3 - отр	№ 3 - отр	№ 3 - отр
№ 4 - отр	№ 4 - пол	№ 4 - пол
№ 5 - отр	№ 5 - отр	№ 5 - отр
3	5	№ 1 - отр	доза - 20 мг/гол.	№ 1 - пол	№ 1 - пол
№ 2 - отр	№ 2 - пол	№ 2 - пол
№ 3 - отр	№ 3 - пол	№ 3 - пол
№ 4 - отр	№ 4 - пол	№ 4 - пол
№ 5 - отр	№ 5 - пол	№ 5 - пол
4	5	№ 1 - отр	доза - 30 мг/гол.	№ 1 - пол	№ 1 - отр
№ 2 - отр	№ 2 - отр	№ 2 - отр
№ 3 - отр	№ 3 - отр	№ 3 - отр
№ 4 - отр	№ 4 - отр	№ 4 - отр
№ 5 - отр	№ 5 - отр	№ 5 - отр

- животные 1 группы были заражены атипичными микобактериями штамм № 42 в дозе 5 мг/мл;

- животные 2 группы были заражены атипичными микобактериями штамм № 42 в дозе 10 мг/гол;

- 3 группа была заражена этой же культурой в дозе 20 мг/гол. аналогично схеме заражения второй группы;

- 4 была заражена этой же культурой в дозе 30 мг/гол.

Из таблицы 3 видно, что животные 1 группы (доза 5 мг/гол.) на ППД туберкулин не реагировали. Животные с заражающей дозой 20 мг/гол. (3 группа) все реагировали положительно. Животные 2 и 4 групп реагировали не все (10-50%). Таким образом, предлагаемый дробный режим введения атипичной культуры в дозе 20 мг/гол., разделенной на 3 равные части с интервалом 24 часа, вызывает сенсибилизацию у 100% морских свинок.

Пример 4. Производственные испытания.

В различных зонах Омской области в благополучных по туберкулезу хозяйствах из биоматериала от реагирующих на ППД-туберкулин животных были выделены разные виды культур атипичных микобактерий. Для изучения сенсибилизирующих свойств данных культур было отобрано 24 морских свинок, отрицательно реагировавших на ППД-туберкулин, весом 300-350 г, по принципу аналогов, которых распределили в 8 групп по 3 головы в каждой, а затем заразили этими культурами по следующей методике:

- животных первой группы заражали изолированными культурами - M.xenopi - в дозе 10 мг/гол на каждое животное, причем общую заражающую дозу для каждого животного разделяли на 3 равные части и вводили культуру МБ с интервалом 24 часа. Такой метод введения обоснован тем, что атипичные микобактерии широко распространены в окружающей среде, и сельскохозяйственные животные имеют постоянный контакт с этими микобактериями через корма, воду, предметы окружающей среды, этим самым условия эксперимента приблизили к естественным.

- 2-й группы - M.intracellulare в дозе 10 мг/гол.

- 3-й группы - M.scrofulaceum в дозе 10 мг/гол.

- 4-й группы - M.smegmatic в дозе 10 мг/гол.

- 5-й группы - M.xenopi в дозе 20 мг/гол.

- 6-й группы - M.scrofulaceum M.intracellulare в дозе 20 мг/гол.

- 7-й группы - M.intracellulare в дозе 20 мг/гол.

- 8-я группа - M.smegmatic в дозе 20 мг/гол.

На 30-е сутки после заражения провели аллергическое исследование на ППД-туберкулин животных опытных и контрольных групп.

Таблица 4
Результаты аллергических исследований морских свинок, зараженных разными видами атипичных культур
Хозяйство №	Культуры атипичных микобактерий	Заражение культурой МБ, доза - 10 мг/гол.	Заражение культурой МБ, доза - 20 мг/гол
1	M.xenopi	№ 1 - отр	№ 1 - пол
№ 2 - пол	№ 2 - пол
№ 3 - отр	№ 3 - пол
2	M.intracellulare	№ 1 - отр	№ 1 - пол
№ 2 - отр	№ 2 - пол
№ 3 - пол	№ 3 - пол
3	M.scrofulaceum	№ 1 - пол	№ 1 - пол
№ 2 - пол	№ 2 - пол
№ 3 - пол	№ 3 - пол
4	M.smegmatic	№ 1 - отр	№ 1 - пол
№ 2 - пол	№ 2 - пол
№ 3 - отр	№ 3 - пол

На 32 сутки все животные были убиты.

Из таблицы 4 видно, что доза 10 мг/гол. разных видов атипичных микобактерий вызывает сенсибилизацию не у всех морских свинок, этот факт подтверждает проявление аллергических реакций на ППД-туберкулин и составляет 33,3-66,6%, а доза 20 мг/гол. вызывает проявление аллергических реакций у 100% животных и является оптимальной дозой для сенсибилизации морских свинок разными видами атипичных микобактерий.

Патологические изменения характеризовались образованием язв на месте введения культур 2, 3, 6 и 7 групп, которые сохранились до 20 дня. Исходная заражающая культура выделена из биоматериала от всех опытных животных.

Предлагаемый способ повышает эффективность определения сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий, что повышает точность дифференциальной диагностики до 90-95% и этим самым позволяет предотвратить необоснованный убой продуктивных животных в хозяйствах.