нуклеотидная последовательность, кодирующая иммуногенный полипептид lcrv(g113), вызывающий защитный иммунный ответ против yersinia pestis; рекомбинантная плазмидная днк petv-i-3455, кодирующая иммуногенный полипептид lcrv(g113); рекомбинантный штамм escherichia coli bl21(de3)/petv-i-3455 - продуцент иммуногенного полипептида lcrv(g113); полипептид lcrv(g113) и способ его получения

Формула изобретения

1. Нуклеотидная последовательность, кодирующая иммуногенный полипептид LcrV(G113), приведена на рис.2.

2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pETV-I-3455, имеющая размер 6538 п.н., кодирующая иммуногенный полипептид LcrV(G113) и состоящая из следующих элементов:

репликон плазмиды pBR322,

ген -лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину,

Т7-промотор,

1ас-оператор,

fl-репликон,

фрагмент ДНК, фланкированный сайтами для рестриктаз Ndel и Hindlll, кодирующий синтез белка LcrV(G113), начинающегося с инициирующего кодона ATG.

3. Рекомбинантный штамм бактерий Е. coli BL21(DE3)/pETV-I-3455 - продуцент иммуногенного полипептида LcrV(G113), депонированный в ФГУН ГНЦ ПМБ (каталожный номер В-6527).

4. Иммуногенный полипептид LcrV(G113), продуцируемый рекомбинантным штаммом Е. coli BL21(DE3)/pETV-I-3455, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную на рис.3, в которой произведена замена триптофана в позиции 113 (W113) на глицин.

5. Способ получения рекомбинантного полипептида LcrV(G113) путем культивирования штамма Е. coli с последующим выделением полипептида, отличающийся тем, что культивируют штамм Е. coli BL21(DE3)/pETV-I-3455, а культивируемые клетки разрушают в буферном растворе ультразвуком, причем выделение целевого продукта начинают с этапа гель-проникающей хроматографии с использованием носителя TSK HW-40 и завершают последовательно анионообменной и гидрофобной хроматографией.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению иммуногенного полипептида, обеспечивающего формирование иммунного протективного ответа против инфекции, вызываемой Yersinia pestis.

Специфическая профилактика особо опасных инфекций бактериальной этиологии, в частности чумы, обусловлена напряженной эпидемиологической ситуацией, обусловленной наличием на территории России активных природных очагов чумы, возможностью завоза инфекции из-за рубежа, а также реальной угрозой биотерроризма - причин, способных вызывать эпидемические проявления чрезвычайного характера. В настоящее время в Российской Федерации для специфической профилактики чумы применяются живые вакцины, разработанные в середине прошлого века и характеризующиеся значительной реактогенностью. Обладая наибольшей протективностью, живые вакцины дешевы в производстве, однако из-за присутствия значительного количества "балластных" компонентов вызывают высокую антигенную нагрузку на организм, усиление аллергических реакций и недостаточно эффективны для проведения ревакцинаций. Этих недостатков лишены, в частности, химические (субъединичные, молекулярные) вакцины, которые позволяют за счет введения в их состав только иммунодоминантных антигенов значительно снизить реактогенность препарата в целом; эффективны для ревакцинации; могут быть использованы на фоне экстренной профилактики антибиотиками; исключают возможность возникновения инфекционного процесса у лиц с нарушениями иммунного статуса.

Известно, что иммунизация животных живыми бактериями Y. pestis, продуцирующими V антиген [1], а также очищенным нативным [2] либо рекомбинантным [3] V антигеном приводила к индукции антительного ответа и защищала мышей от заражения вирулентным штаммом возбудителя чумы.

V антиген (LcrV), один из "классических" факторов патогенности Y. pestis, кодируется геном IcrV в составе оперона IcrGVH [4], расположенного на плазмиде кальцийзависимости pCad (pCD1, pVW, pYV или pLcr), присутствующей у всех патогенных для человека йерсиний [5], был впервые описан T.W. Burrows [6]. V антиген продуцируют и два других патогенных для человека представителя рода Yersinia: Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica [5]. Установлено, что продукция V антигена коррелирует с вирулентностью Yersinia spp. [7]. Мутация по гену IcrV вела к утрате вирулентности [8]. V антиген регулирует секрецию цитотоксических Yop белков [9], ингибирует хемотаксис нейтрофилов [10], обладает иммуносупрессивным действием [11]. Механизм иммуносупрессивного действия V антигена заключается в прямой стимуляции синтеза противовоспалительного цитокина, интерлекина-10 (IL-10), приводящего к общему ингибированию противоспалительных цитокинов [12].

V антиген представляет собой белок, включающий 326 аминокислотных остатка (а.о.), что соответствует молекулярному весу в 37,2 кДа [13]. Полипептид образует смесь мономеров, димеров с молекулярной массой 85-95 кДа и тетрамеров [14]. Эксперименты с использованием масс-спектрометрии определили молекулярную массу димеров - 75 кДа [2]. Температурное воздействие (45°С, 20 час) стимулировало возрастание количества димеров [15]. Установлено, что олигомерные формы LcrV обладают большей протективной способностью [16] и стимулируют TLR2 (Toll- like receptor 2) опосредованного иммунного ответа [14].

Известна рекомбинантная плазмида, кодирующая синтез V антигена, вызывающего защитный эффект в отношении действия Y. pestis [17]. Однако IcrV гены Yersinia spp. кодирует различные варианты полипептида LcrV [18], отличающиеся друг от друга по аминокислотной последовательности [19]. Аминокислотные последовательности V антигенов Yersinia spp. делятся на семь классов, один из которых составляют последовательности LcrV Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, остальные принадлежат штаммам Y. enterocolitica. Установлена взаимосвязь между структурой отдельных классов V антигена Y. enterocolitica и вирулентностью продуцирующих их штаммов этого микроорганизма [20].

Для V антигена Y. pestis была показана высокая консервативность гена IcrV в штаммах основного подвида [21]. Штаммам Y. pestis неосновных подвидов свойственен полиморфизм гена IcrV [22], выявленный в основном в четырех так называемых "горячих точках" [23], соответствующих аминокислотным остаткам 18, 72, 273 и 324-326. Согласно результатам трехмерного моделирования на основе этих данных, такая локализация не оказывает значительного влияния на структуру белка и, как следствие, не приводит к изменению химических и физических свойств молекулы [23].

Нативный V антиген чувствителен к действию бактериальных протеаз, что ведет к его низкому выходу при выделении из клеток йерсиний [24]. Для решения этой проблемы были сконструированы устойчивые к протеолизу "слитные" белки: протеин A-V антиген или глютатион-S-трансфераза-V антиген. Существенным недостатком этого способа является необходимость протеолитического расщепления предшественника иммуногенного пептида и введение дополнительного этапа удаления отщепленного пептида-носителя. Глютатион-S-трансферазу отрезают от последовательности слитного белка с помощью фактора Ха [25]. Использование в процессе очистки фактора Ха является серьезным ограничением в применении полученного подобным образом иммуногенного полипептида в качестве компонента вакцины для людей, так как фактор Ха получают из организма быков, а для его активации используют яд гадюки Рассела.

Известен способ получения иммуногенного полипептида методом аффинной хроматографии на носителях с иммобилизованными металлохелатными группами, в основе которого лежит химическое сродство генетически модифицированной последовательности иммуногенного полипептида к ионам двухвалентных металлов, акцепторов координационной связи, возникающее в результате введения дополнительной полигистидиновой вставки в полипептид. Прочность новообразованной координационной связи: ион двухвалентного металла (Ni⁺⁺ ) - полигистидин (His)₆ достаточна для того, чтобы удерживать целевой белок на колонке при промывке последней различными буферными растворами, в том числе, в денатурированном состоянии, например, в присутствии концентрированных растворов мочевины или хлористого гуанидина. Освобождение связанного белка с колонки индуцируют перераспределением координационных связей после введения сильных хелатирующих веществ в элюционный буфер. Это позволяет провести одноэтапную очистку белка, пригодного для иммунизации животных [26].

Главными недостатками этого способа является, во-первых, вынужденная генетическая модификация V антигена, увеличивающая его первичную последовательность, по крайней мере, на 6 аминокислотных остатков. Во-вторых, необходимость введения в первичную последовательность сайта для последующего специфического протеолитического отщепления (His)₆. В-третьих необходимость дополнительных этапов очистки продуктов протеолиза.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения иммуногенного полипетида из клеток Е. coli, первичная последовательность которого полностью идентична природному. В этом случае клетки Е. coli разрушают давлением, центрифугируют и выделяют V антиген из надосадочной фракции с помощью стандартных хроматографических этапов [27]. Первоначально из надосадочной фракции удаляют часть балластных белков осаждением 1 М сернокислым аммонием. Осветленную центрифугированием фракцию пропускают через колонку с фенил-сефарозой и последовательно элюируют связанные белки нисходящим линейным градиентом сернокислого аммония. Фракции, содержащие целевой белок, объединяют и удаляют сернокислый аммоний исчерпывающим диализом. Второй этап выделения проводят по заряду на хроматографической колонке с ДЕАЕ-сефарозой, с которой белки элюируют буферным раствором с возрастающей концентрацией хлористого натрия. Полученные фракции элюата объединяют, концентрируют и подвергают дополнительной очистке с использованием высокоэффективной гель-эксклюзивной хроматографии на колонке «Hiprep Superdex 75» (26/60).

Главным недостатком этого способа является несоответствие друг другу этапов хроматографической очистки, вынуждающее авторов вводить промежуточные длительные подготовительные этапы. Кроме того, в основную схему включена гель-эксклюзивная хроматография на колонке «Hiprep Superdex 75», которая обладает низкой производительностью, что приводит к 20-кратному разбавлению конечного препарата очищенного белка.

Задачей настоящего изобретения является получение нового иммуногенного полипептида, перспективного для разработки новой субъединичной чумной вакцины с повышенной иммуногенностью.

Для решения поставленной задачи:

- предложена нуклеотидная последовательность, кодирующая иммуногенный полипептид LcrV(G113), приведеная на фиг.2;

- сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pETV-I-3455, имеющая размер 6538 п.н., кодирующая иммуногенный полипептид LcrV(G113) и состоящая из следующих элементов: репликона плазмиды pBR322, гена -лактамазы, определяющего устойчивость к ампициллину, T7 - промотора, lac-оператора, f1-репликона и фрагмента ДНК, фланкированного сайтами для рестриктаз NdeI и HindIII, кодирующего синтез белка LcrV(G113), начинающегося с инициирующего ко дона ATG;

- предложен рекомбинантный штамм бактерий Е. coli BL21(DE3)/pETV-I-3455 - продуцент иммуногенного полипептида LcrV(Gl13);

- разработан способ получения рекомбинантного полипетида LcrV(G113) при культивировании штамма Е. coli BL21(DE3)/pETV-I-3455, отличающийся тем, что культивируемые клетки разрушают в буферном растворе ультразвуком, причем выделение начинают с этапа гель-проникающей хроматографии с использованием носителя TSK HW-40 и завершают последовательно анионообменной и гидрофобной хроматографией;

- предложен иммуногенный полипептид LcrV(G113), продуцируемый рекомбинантным штаммом Е. coli BL21(DE3)/pETV-I-3455, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.3, в которой произведена замена триптофана в позиции 113 (W113) на глицин.

Мы установили, что замена триптофана на глицин в аминокислотной последовательности LcrV(G113) приводит к утрате локальных гидрофобных и водородных связей, дестабилизации петли 108-112 и изменению ее структуры и, как следствие, структуры всего белка, что, в свою очередь, ведет к изменению физических свойств молекулы - гидрофобности, устойчивости к протеолизу, способности к агломерации. Повышенная агломерирующая способность LcrV(G113) коррелирует с увеличением его иммуногенности и протективной активности, что в настоящем изобретении подтверждается существенным усилением защиты от инфекции, вызванной Y. pestis, за счет введения достаточного количества иммуногенного полипептида LcrV(G113) на подходящем носителе.

В процессе изучения физико-химических и биологических свойств улучшенного иммуногенного полипептида LcrV(G113), мы установили, что:

- Антиген LcrV(G113) проявляет выраженную способность к агломерации. При проведении денатурирующего электрофореза в нередуцирующих условиях до 50% белка располагалось в полосе, соответствующей димерной форме.

- Ограниченый протеолиз V антигенов с различной аминокислотной последовательностью сопровождается появлением различных протеолитических фрагментов, молекулярные массы которых зависели от природы антигена и продолжительности протеолиза.

- Полученный нами полипептид LcrV(G113) вызывает более выраженный иммунный ответ у животных по сравнению с другими исследованными структурными вариантами белка LcrV. У животных, вакцинированных LcrV(G113), титры антител достигали 1:254000, а индекс иммунитета (отношение величины LD₅₀, рассчитанной для вакцинированных животных, к аналогичному показателю, рассчитанному для интактных животных) составил 5,7×10⁵, в то время как иммунизация неагломерирующими структурными вариантами белка LcrV(W113) индуцировала низкие титры антител (1:16000) и практически не защищала мышей от заражения. Отсутствие выраженной антитело-индуцирующей и протективной активностей у большинства исследованных нами типов LcrV позволяет предположить, что в публикациях зарубежных исследователей опущено "ноу-хау", позволяющее на стадии подготовки вакцинного препарата повысить степень агломерации входящего в его состав белка. При заражении животных вирулентным штаммом Y. pestis полипептид LcrV(G113) обладал значительно более высокими протективными свойствами по сравнению с другими структурными вариантами LcrV - LcrV(W113) и LcrV(E113). Предлагается рассматривать LcrV(G113) в качестве перспективного кандидата для разработки новой субъединичной чумной вакцины с повышенной иммуногенностью.

Предлагаемый штамм бактерий Е. coli BL21(DE3)/pETV-I-3455 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. По этим признакам штамм-продуцент рекомбинантного белка LcrV(G113) не отличается от исходного штамма Е. coli BL21(DE3), не содержащего плазмиду рЕТV-1-3455.

Культуральные признаки. По культуральным признакам штамм-продуцент рекомбинантного белка LcrV(G113) не отличается от исходного штамма Е. coli BL21(DE3), не содержащего целевую плазмиду.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки штамма-продуцента рекомбинантного белка LcrV(G113) проявляют устойчивость к ампициллину, обусловленную наличием целевой плазмиды.

Существенным отличием штамма Е. coli BL21(DE3)/pETV-I-3455 является то, что он обеспечивает синтез полипептида LcrV(G113), обладающего свойствами иммуногенного антигена с уровнем продукции растворимой формы целевого белка до 120 мг/л.

Штамм Е. coli BL21(DE3)/pETV-I-3455 депонирован в коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ПМБ, каталожный номер В-6527.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.

Фиг.1. - Схема организации рекомбинантной плазмиды pETV-I-3455, где: LcrV -клонированный фрагмент, включающий полный ген белка LcrV(G113); уникальные сайты эндонуклеаз рестрикции - HindIII и NdeI, использованные при создании данной конструкции; Т7 - промотор, присутствующий в рекомбинантной плазмиде; 1acI - ген -лактамазы, обеспечивающий трансформированным бактериальным клеткам устойчивость к ампициллину.

Фиг.2. Нуклеотидная последовательность гена IcrV, кодирующего синтез иммуногенного полипептида LcrV(G113).

Фиг.3. Аминокислотная последовательность иммуногенного полипептида LcrV(G113).

Фиг.4. Сравнение последовательностей генов IcrV различных штаммов Y. pestis.

Фиг.5. Сравнение аминокислотных последовательностей белка LcrV из разных штаммов Y. pestis.

Фиг.6. Электрофоретический анализ V антигенов после термообработки.

Фиг.7. Электрофоретический анализ частичного трипсинолиза V антигенов.

Фиг.8. Титры антител в сыворотках мышей после иммунизации.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют подробные примеры его конкретного выполнения со ссылками на прилагаемые таблицы и рисунки.

Пример 1.

СИКВЕНС, АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ.

Для определения нуклеотидной последовательности гена IcrV Y. pestis используют прямой метод секвенирования без предварительного клонирования геномных фрагментов ДНК. Определяют нуклеотидную последовательность открытой рамки считывания (ORF) гена IcrV штамма Y. pestis И-3455 subsp. altaica. Определение нуклеотидной последовательности проводят на приборе ABI Applied Biosistems с использованием секвенирующих олигонуклеотидных праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности генов IcrG (Forward I primer), IcrV (Forward 2 inside primer), sycD (Reverse primer).

На основании полученного сиквенса определяют аминокислотную последовательность белка LcrV(G113), используемую в дальнейшем для разработки трехмерной модели LcrV(G113) и прогнозирования его физико-химических и биологических свойств (фиг.3).

На рисунках (фиг.4 и 5) представлены результаты сравнения нуклеотидных и аминокислотных последовательностей из различных штаммов Y. pestis.

Пример 2.

КОСТРУИРОВАНИЕ ПЛАЗМИДЫ.

Плазмиду pETV-I-3455 конструют в результате следующих манипуляций: амплификация гена lcrV(9Sl н.п.) в ПЦР на матрице суммарной ДНК штамма Y. pestis I-3455 с использованием клонирующих праймеров "Forward 3 и Reverse 2", рестрикция ПЦР-фрагмента эндонуклеазами NdeI и HindIII, лигирование его с рестрицированной эндонуклеазами NdeI и HindIII векторной ДНК, под контроль Т7lас-промотора в векторе рЕТ32b(+), трансформация клеток реципиентного штамма; селекция на среде, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Отобранные рекомбинантные клоны Е. coli проявляют максимальную продукцию белка после 3 ч индукции 1 мМ изопропил- -D-тиогалактопиранозид (ИПТГ), причем целевой белок составляет не менее 50% всех клеточных белков штамма-продуцента.

Секвенирующие праймеры:

Forward I primer

5' - cag cct caac atc cct acga

Forward 2 inside primer

5' - gca aaa tgg cat caa gcg ag

Reverse primer

5' - tag ttc ccc ctc ctt tta gg-3'

Клонирующие праймеры:

Forward 3

5'- gg cat atg att aga gcc tac gaa c-3'

Reverse 2

5' - aa aag ctt gtc tgt cgt ctc ttg ttg c-3'

Фиг.2 представляет нуклеотидную последовательность гена IcrV Y. pestis, размером 981 п.н., которая кодирует синтез иммуногенного полипептида LcrV(Gl 13).

Пример 3

ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА УЛУЧШЕННОГО ИММУНОГЕННОГО ПОЛИПЕПТИДА LcrV(G113).

Штамм-продуцент иммуногенного полипептида LcrV(G113) конструируют на основе протеазодефицитного штамма Е. coli BL21(DE3) [F^- ompT hsdSB (r_B ^- m_B ^-) gal dcm (DE3)], несущего ген Т7 РНК полимеразы под контролем ИПТГ-индуцибельного lacUV5 промотора (No-vagen, США). Штамм получают в результате следующих манипуляций:

амплификации гена IcrV Y.pestis И-3455 методом ПЦР,

встраивания ПЦР-фрагмента в вектор рЕТ32b(+),

трансформации клеток реципиентного штамма.

В качестве матрицы в ПЦР используют ДНК штамма Y. pestis И-3455.

Клетки Е. coli BL21(DE3) трансформируют рекомбинантной плазмидой pETV-I-3455 и отбирают клоны с фенотипом Ap^R на селективной среде с ампициллином (50 мкг/мл). Штамм получил название Е. coli BL21(DE3)/pETV-I-3455.

Пример 4.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ИММУНОГЕННОГО ПОЛИПЕПТИДА LcrV(Gl 13).

Для выделения V антигена клетки Е. coli BL21(DE3)/pETV-I-3455 выращивают при температуре 37°С в жидкой аэрируемой среде Luria-Bertani в лабораторном ферментере New Brunsuik Scientific с рабочим объемом 2 л. Клеточную суспензию центрифугируют при 7000 × g в течение 10 мин и температуре 4°С, осадок суспендируют в 10 объемах 20 мМ трис-НСl (рН 7,5) буферного раствора. Лизис клеток проводят на льду при помощи ультразвукового дезинтегратора (Virsonic 16-850, США). Эффективность озвучивания контролируют микроскопиией, после чего центрифугируют клеточный лизат при 15000 × g в течение 25 мин и надосадочную фракцию стерилизуют микрофильтрацией (0,22 мкм). На первом этапе фильтрат подвергают гельэксклюзивной хроматографии, пропуская через колонку (26/60), упакованную TSK HW-40, предварительно уравновешенную 20 мМ Трис-НСl буфером, рН 8,0, содержащем 1 мМ ЭД-ТА. Этим же буфером предварительно уравновешивают анионообменную колонку второго этапа. Целевой белок собирают в расчетном объеме элюата, во фракциях, следующих непосредственно за свободным объемом колонки. Таким образом, на первом этапе удаляют низкомолекулярные (менее 10 кДа) примеси и одновременно заменяют буферный раствор, свойства которого в оптимальной степени соответствуют условиям анионообменной хроматографии на втором этапе очистки. Второй этап очистки начинают сразу же после отбора рассчетного объема элюата, который наносят на колонку, упакованную DEAE TSK 650F (26/20). Несвязанные белки отделяют, промывая колонку тем же буферным раствором, и элюируют V антиген ступенчатым градиентом хлористого натрия. Фракции анализируют, объединяют и смешивают с эквивалентным объемом 2 М раствора сернокислого аммония. Полученный раствор центрифугируют и пропускают через колонку с фенил-сефарозой (26/10), предварительно уравновешенную трис-буфером, содержащим 1 М сернокислый аммоний. На заключительном, третьем этапе очистки, балластные белки удаляют с колонки тем же буфером с сернокислым аммонием и проводят элюцию V антигена нисходящим ступенчатым градиентом этой соли. Полученный препарат высокоочищенного V антигена диализуют с целью удаления следов сернокислого аммония. Выход V антигена чистотой не менее 95% составляет 35 мг с одного литра культуры при уровне продукции белка 75 мг/л (по результатам ДСН-электрофореза в редуцирующих условиях). Предложенный способ позволяет упростить и ускорить процесс за счет исключения необходимости подготовки препарата перед каждым этапом хроматографии. Так, начальный этап гель-эксклюзивной хроматографии осветленного лизата одновременно является подготовкой препарата для второго этапа анионообменной хроматографии. Низкая эффективность гель-эксклюзивной хроматографии преодолевается за счет высокой скорости потока на жестком носителе TSK HW-40, разрешающем белки с молекулярными массами от 0,5 кДа до 10 кДа. Таким образом, иммуногенный полипептид быстро элюируют непосредственно за свободным объемом колонки и отделяют от всех примесей, молекулярные массы которых не превышали 10 кДа. Это позволяет использовать большие объемы нанесения лизата, предельная величина которых достигает 1/3 объема колонки. Освобождение препарата от низкомолекулярных примесей, способных уменьшить емкость анионообменной колонки, позволяет на втором этапе провести анионо-обменную хроматографию в оптимальных условиях и улучшить разделение целевого белка. Подготовка фракций, содержащих иммуногенный полипептид, к третьему этапу сводится по существу к двукратному разбавлению раствором 2 М сернокислого аммония. Таким образом, исключают длительные промежуточные этапы диализа и концентрирования препарата ультрафильтрацией.

Проверка предложенного способа на соответствие его критерию "изобретательский уровень" показала, что ни в научной, ни в патентной литературе не выявлено совокупности признаков, указанной в отличительной части формулы изобретения.

Пример 5. ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛУЧЕННОГО ПРОДУКТА.

Агломерация. Растворы антигенов LcrV(W113), LcrV(G113) нормируют по концентрации общего белка до величины 1 мг/мл и инкубируют при 45°С в течение 20 ч, после чего пробы анализируют при помощи денатурирующего электрофореза в 12% полиакриламидном геле в нередуцирующих условиях, а также в 7% геле, приготовленном без додецилсульфата натрия. Каждую пробу смешивают в соотношении 1:1 с буферным расвором, содержащим 125 мМ трис-HCl, рН 6,8, 4% додецилсульфата натрия, 20% глицерина, 0,02% бромфенолового синего и прогревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин, параллельно, пробы подвергают такой же обработке буфером, содержащим 10% 2-меркаптоэтанол, для 7%-ного геля пробы не прогревают. Белки в гелях окрашивают Кумасси G-250.

Длительное прогревание способствует образованию агломерированных форм белка в препаратах, что видно по усилению высокомолекулярных полос на электрофореграммах (фиг.6). Обработка проб перед электрофорезом 2-меркаптоэтанолом приводит к исчезновению высокомолекулярных полос во всех соответствующих пробах как на нативном геле (Б), так и на геле (А) с додецилсульфатом натрия (фиг.6). Таким образом, стабильность агломерированного V антигена поддерживается дисульфидными связями, что подтверждает обработка 2-меркаптоэтанолом, ведущая к образованию мономеров, причем доля мономеров уменьшается при термообработке растворов белка.

Протеолиз. Используют протеолитическое расщепление для анализа особенностей тепловой агломерации V антигенов. Путь ферментативного расщепления белковых антигенов в неденатурирующих условиях определяется доступностью сайтов протеолиза на поверхности белка, что может приводить к образованию различных протеолитических фраментов. Препараты V антигенов обрабатывают трипсином при комнатной температуре, соотношение массовых долей фермента и расщепляемого белка, а также продолжительность протеолиза устанавливют предварительными опытами.

Показано, что в течение 2 ч обработки ферментом проходит частичный протеолиз V антигенов, сопровождавшийся появлением различных протеолитических фрагментов (фиг.7). Молекулярные массы фрагментов зависят от продолжительности протеолиза и природы антигена.

Пример 6. ТЕСТИРОВАНИЕ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ

Иммунизация и заражение мышей. Антигены LcrV(W113), LcrV(E113), LcrV(G113) сорбируют на стерильной гидроокиси алюминия в фосфатно-солевом буфере при перемешивании в течение 2 ч при комнатной температуре. Белки предварительно стерилизуют, пропуская через мембрану с диаметром пор 0,22 мкм. Концентрацию белка рассчитывают таким образом, чтобы 200 мкл суспензии содержало 10 мкг белка. Иммунизацию и заражение проводят по следующей схеме:

0-й день: иммунизация мышей 10 мкг белками LcrV, сорбированного на гидроокиси алюминия.

30-й день - повторная иммунизация той же дозой белка LcrV, сорбированного на гидроокиси алюминия.

62-й день - отбор крови для определения титров антител контрольной группы.

64-й день - заражение мышей вирулентным штаммом Y. pestis 231.

85-й день (21-й день после заражения) - окончательный учет результатов эксперимента.

В опыте используют разделенных на группы самок мышей BALB/c в возрасте 7-8 недель, иммунизированных следующими белками: LcrV(W113) с триптофаном в положении 113, LcrV(E113) с глутаминовой кислотой в положении 113 и LcrV(G113) с глицином в положении 113. Контрольная группа представлена животными, иммунизированными гидроокисью алюминия в дозе, равной количеству препарата, вводимого животным вместе с белками LcrV. Препараты V антигенов вводят мышам подкожно в объеме 200 мкл, в паховую область.

Определение титров антител. Используют твердофазный иммуноферментный анализ; в лунки планшетов сорбируют V антигены в течение 1 ч при 37°С, в 0,1 М карбонатном буфере, рН 9,6. На всех этапах ИФА лунки промывают 10 мМ трис-буфером, рН 7,2, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твина-20. Сыворотки иммунизированных животных разводят этим же буфером, наименьшее разведение составляет 1:1000, затем, начиная с этой пробы, последовательно, с шагом 2,5. Продолжительность инкубации рабочих растворов в лунках на всех этапах является одинаковой и составляет 1 ч при 37°С. Конъюгаты антимышиных антител с пероксидазой хрена разводят 1:3000. Развитие цветной реакции происходит за счет донорно-акцепторной пары: перекись водорода - о-фенилендиамин в составе субстратного раствора. Реакцию останавливают через 15 мин добавлением в лунки 50 мкл 1 М раствора серной кислоты и измеряют оптическую плотность растворов в пробах при 492 нм. Титр определяют как величину наибольшего разведения сыворотки, оптическая плотность которой в два раза превышала оптическую плотность раствора в соответствующей контрольной лунке.

Полученные результаты представлены на фиг.8. Рисунок представляет собой график, на котором показаны титры анти-LcrV антител в крови мышей, иммунизированных иммуногенным полипептидом LcrV(G113), по сравнению с титрами антител мышей, иммунизированных другими препаратами LcrV.

Препараты LcrV обладают различной степенью иммуногенности и вызывают у мышей выработку антител, специфических к белку Lcr. Титры антител, определенные по результатам твердофазного иммуноферментного анализа, находятся в широких пределах, от 1:8300 до 1:254000, и проявляют зависимость от структуры используемых полипептидов. Наибольшую степень иммуногенности показал иммуногенный полипептид LcrV(G113), титры антител к которому достигают 1:254000 (фиг.8). Титры антител к белкам LcrV(W113) и LcrV(E113) составляли величину 1:16000, то есть они обладают значительно более низкой иммуногенностью.

Определение протективности. Протективность V антигенов определяют путем заражения предварительно иммунизированных мышей вирулентным штаммом Ypestis 231. Заражение проводят введением под кожу бедра животных десятикратных разведении бактериальной культуры в 0,2 мл забуференного физиологического раствора. Наблюдение за зараженными животными проводят в течение 21 сут. Выживших животных гуманно эвтаназируют ингаляцией СО₂.

Вычисление величин LD₅₀ и доверительного интервала (для вероятности 95%) проводят по методу Karber в модификации И.П.Ашмарина и А.А.Воробьева [28].

В таблицах 1 и 2 приведены данные о протективности различных структурных вариантов LcrV.

Таблица 1
Гибель мышей, предварительно иммунизированных различными структурными вариантами иммуногенного полипептида LcrV, после заражения F. pestis 231 (срок наблюдения 21 сут).
Варианты иммуногенного полипептида LcrV	Заражающая доза Y. pestis 231, КОЕ
1	10	102	10 3	104	105	106	107
LcrV(W113)		2/5*	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	1/5
LcrV(G113)		5/5	5/5	4/5	3/5	4/5	4/5	5/5
LcrV(E113)		2/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5
Контроль 1 (вакцинированные Аl(ОН)3)	2/5	2/5	0/5	0/5	-	-	-	-
Контроль 2 (не вакцинированные)	5/5	1/5	0/5	0/5	-	-	-	-
* выжившие после заражения/всего животных в группе

Таблица 2
Характеристика протективности различных структурных вариантов иммуногенного полипептида LcrV.
Варианты иммуногенного полипептида LcrV	LD50	Индекс иммунитета*
LcrV(W113)	7	2,3
LcrV(G113)	1,7×10 6	5,7×10 5
LcrV(E113)	4	1,3
Контроль 1 (вакцинированные Аl(ОН)3)	1	0,3
Контроль 2 (не вакцинированные)	3	-
*Индекс иммунитета - LD50 для иммунизированных / LD 50 для интактных животных

Заражение вирулентным штаммом Y. pestis 231 приводит к практически полной гибели животных, иммунизированных LcrV(W113), при всех заражающих дозах (табл.1). LD₅₀ штамма 231 в отношении мышей, иммунизированных антигеном LcrV(W113), незначительно отличается от контрольных. В группах мышей, предварительно иммунизированных антигеном LcrV(G113), отмечен незначительный падеж животных (в среднем по одной особи на каждую из заражающих доз). Для этой же группы животных отмечали увеличение LD₅₀ на шесть порядков как по сравнению с контрольными группами, так и с группами, иммунизированными другими структурными вариантами LcrV (табл.2).

Таким образом, изменение аминокислотной последовательности LcrV, заключающееся в замене в положении 113 триптофана на глицин, приводит, в конечном счете, к повышению способности этого полипептида к агломерации, резкому увеличению его иммуногенности и протективной активности. Сконструирован продуцент улучшенного иммуногенного полипептида LcrV(G113), пригодный для получения препаративных количеств антигена для использования в составе субъединичной чумной вакцины.