олигонуклеотидный зонд для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза b. pseudomallei и b. mallei

Формула изобретения

Олигонуклеотидный зонд с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярного маяка», обеспечивающий флуоресцентную детекцию при идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза В.pseudomallei и В.mallei методом полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидными праймерами BTTS-s1/BTTS-as3, комплементарными фрагменту гена 23 S рРНК В.pseudomallei и В.mallei:

5'-(FAM)-CGCGCACCGGCAGTGATGAGCCACGCGCG-(RTQ1)-3',

где FAM - карбоксифлуоресцеин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 492 нм, а длина волны флуоресценции - 520 нм; RTQ1 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 470-570 нм.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано в медицине для выявления генетического материала возбудителей сапа и мелиоидоза В.pseudomallei и В.mallei в пробах как для диагностики в практическом здравоохранении и службе Роспотребнадзора, так и для научных исследований.

Возбудитель сапа (Burkholderia mallei) и возбудитель мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) - аэробные грамотрицательные неферментирующие бактерии, принадлежащие к роду Burkholderia. Мелиоидоз - эндемичное для Австралии и ряда стран Юго-Восточной Азии инфекционное заболевание людей и животных. Сап - особо опасная зоонозная инфекция.

Метод полимеразной цепной реакции является прямым методом выявления ДНК данных патогенных буркхольдерий. И обладает высокой специфичностью и чувствительностью. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК - комплементарное достраивание ДНК, матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.

Процесс удвоения нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза.

Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для каждого типа возбудителей. Праймеры комплиментарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа исследуемых микроорганизмов.

Использование специальных флуоресцентных меток позволяет отказаться от стадии электрофореза, что снижает риск перекрестной контаминации продуктами ПЦР и соответственно уменьшает число ложноположительных результатов. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в процессе реакции амплификации, весь анализ можно проводить в одной-двух комнатах лаборатории силами одного сотрудника. Этот подход позволяет проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает проблему субъективной оценки электрофореграмм. Существует множество флуоресцентных технологий, различающихся по способам генерации репортерной флуоресценции. В данной работе использовались зонды с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярных маяков» (molecular beacons).

Наиболее близким аналогом являются специфичные праймеры на кластер генов TTS1, предложенные в формате стандартной ПЦР для детекции возбудителя мелиоидоза в клинических образцах (кровь, мокрота, суставная жидкость, кожа, перикард) (Short report: a rapid method for the differentiation of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis; Wuthiekanun V., Anuntagool N., White N.J. et al.; Am. J. Trop. Med. Hyg. - 2002. - Vol.66. - P.759-761). Тест-система отличалась 100% специфичностью, но низкой чувствительностью, особенно при исследовании образцов крови в отличие от культурального метода.

R.Novak с соавторами (Development and evaluation of a real-time PCR assay targeting the type III secretion system of Burkholderia pseudomallei; Novak R.Т., Glass M.В., Gee J.E. et al.; J. Clin. Microbiol. - 2006. - Vol.44. - P.85-90) описали быстрый и более чувствительный метод ПЦР в режиме реального времени на основе ДНК-мишени orf2, из кластера генов III типа секреции (TTS1), который со 100% специфичностью детектировал чистые культуры штаммов В.pseudomallei.

Целью настоящего изобретения является получение высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации В.pseudomallei и В.mallei методом полимеразной цепной реакции.

Цель достигается конструированием специфичных олигонуклеотидов для идентификации ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, имеющих следующую структуру:

5'-GACTGACCGCGCTCAAAGCCG-3'-BTTS-s1

5'-TCCGGCCTGACAAACGTTTGG-3'-BTTS-as3

Флуоресцентная детекция реализуется при помощи сконструированного олигонуклеотидного зонда с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярного маяка»:

5'-(FAM)-CGCGCACCGGCAGTGATGAGCCACGCGCG-(RTQ1)-3'

Где FAM - карбоксифлуоресцеин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого сотавляет 492 нм, а длина волны флуоресценции - 520 нм. RTQ1 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 470-570 нм.

Характеристика олигонуклеотидных праймеров, зонда и участка амплифицируемой ДНК.

Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, США), были подобраны праймеры, обозначенные BTTS-s1/BTTS-as3, комплементарные фрагменту гена orf13 из кластера генов III типа секреции (TTS1) для идентификации B.pseudomallei и B.mallei. Расчетная длина специфического фрагмента составляла 162 п.н.

В качестве положительного контроля эксперименты проводили на типовом штамме В.pseudomallei 100, используя для выделения ДНК обеззараженные суспензии микроорганизма в концентрациях от 1×10⁹ м.к./мл до 1×10 ¹ м.к./мл. Апробация праймеров и зонда была осуществлена на наборе штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза коллекционного центра МЖК Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.

Чувствительность реакции амплификации с флуоресцентной детекцией «по конечной точке» с праймерами BTTS-s1/BTTS-as3 оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений чистых культур возбудителей сапа и мелиоидоза, и составила 1×10³ м.к./мл. При использовании ПЦР в режиме реального времени чувствительность реакции удалось повысить до 1×10² м.к./мл.

Для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР с флуоресцентной детекцией оценена возможность использования сконструированных праймеров и зондов для анализа биологического материала (кровь, печень, селезенка, легкие и лимфатические узлы) и при экспериментальной инфекции. Показано, что в реакции амплификации возбудитель детектировался в суспензиях органов от всех золотистых хомячков, зараженных культурой данных микроорганизмов, на всех сроках наблюдения.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров и гибридизационного зонда для идентификации ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР.

На основе теоретического изучения секвенированных нуклеотидных последовательностей возбудителей сапа и мелиоидоза, присутствующих в базах данных (EMBL, Genbank, DDBJ) для конструирования праймеров, была выбрана последовательность гена orf13 из кластера генов III типа секреции (TTS1), размер которой составляет 29814 п.н. (GenBank NCBI, GeneID: 14719861). Расчетная длина фрагмента ДНК, фланкируемого предлагаемыми праймерами - 162 п.н.

При подборе зондов руководствовались общими требованиями к олигонуклеотидным затравкам, используемым в ПЦР. При использовании компьютерных программ была проанализирована структура выбранных пар праймеров и зондов (образование димеров, шпилек и других вторичных структур) и показана их теоретическая пригодность для успешной инициации реакции амплификации и гибридизации.

Праймеры и зонд были также проанализированы с помощью компьютерной программы BLAST на web-сервере Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) (bttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) для установления гомологии между ними и нуклеотидными последовательностями близкородственных буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов, присутствующих в базах данных (EMBL, GenBank, DDBJ). На момент проведения компьютерного анализа гомологии выявлено не было.

Пример 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК с помощью разработанных праймеров и зонда для идентификации ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза проводилась в двух форматах: с детекцией результатов ПНР «по конечной точке» и в режиме реального времени.

В состав реакционных смесей входили комплементарные специфическому фрагменту олигонуклеотидные зонды, меченные флуорофором FAM и гасителем флуоресценции (RTQ1), а также праймеры, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буферный раствор и фермент Taq-полимераза. Зонд для внутреннего контроля использовали при проверке тест-систем на специфичность и при анализе способов выделения ДНК. Для предупреждения испарения в процессе амплификации на мультициклере «Терцик» на поверхность смеси наслаивали 20 мкл минерального масла. В ПЦР с детекцией «по конечной точке» использовали 5 мкл образца, с детекцией в режиме реального времени - 10 мкл. Для отрицательного контроля в пробирку вместо образца вносили такой же объем дистиллированной воды.

Амплификацию продолжительностью 45 циклов проводили в микроцентрифужных пробирках (0,5 мл) на мультициклере «Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-технология», г.Москва) и на приборах «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия) и «SmartCycler» (Cepheid, США) в режиме реального времени в микроцентрифужных пробирках (0,2 мл) в объеме 25 мкл с использованием «горячего старта».

Анализ продуктов ПЦР осуществляли с помощью детектора флуоресценции «Gene» (ЗАО «НПФ ДНК-технология», г.Москва) «по конечной точке» и в режиме реального времени - «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия) и «SmartCycler» («Cepheid», США). Регистрацию результатов проводили в табличной и графической форме с помощью компьютерных программ. В режиме реального времени результаты анализировали по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что определяется значением порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов.

Параллельно проводили анализ продуктов ПЦР методом гель-электрофореза в 1,5% агарозном геле с окраской фрагментов ДНК этидиум бромидом и визуализацией в УФ-свете. Результаты оценивали по наличию или отсутствию в геле после электрофореза фрагментов ДНК необходимого размера.

Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждалась ее положением по отношению к контрольным маркерным фрагментам (леддер 100 п.н. ДНК, ООО «Интерлабсервис», Москва) и ДНК-стандарту (ДНК, выделенная из В.mallei 10230 или В.pseudomallei 100 в концентрации 1×10⁵ м.к./мл).

Пример 3. Определение чувствительности и специфичности реакции амплификации с помощью разработанных олигонуклеотидных праймеров и зонда для идентификации ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза.

Чувствительность реакции амплификации с разработанными специфичными праймерами и зондом оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из бактериальных взвесей клеток, выращенных на плотных питательных средах в 4 мл 0,15 М NaCl в концентрации, соответствующей 1×10⁹ м.к./мл по стандартному образцу мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича (ОСО 42-28-85 П), и раститрованных до необходимых разведений (от 1×10⁹ до 1×10 м.к./мл). Из разведения 1×10³ м.к./мл делали контрольный высев по 0,1 мл каждой пробы на чашки Петри с агаром BHI для определения количества КОЕ. Обеззараживание материала проводили в соответствии с МУ 1.3.1794-03 и МУ 3.5.5.1034-01.

Обеззараживание исследуемых проб производят добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,1% и прогреванием в течение 30 мин при температуре 56°С. Выделение ДНК из чистых культур буркхольдерий осуществляют с помощью метода нуклеосорбции на силикагеле в присутствии гуанидинтиоционата (R.Boom et al. - 1990 г). Постановку реакции ПЦР, осуществляют как описано в примере 2. При тестировании коллекции культур В.mallei и В.pseudomallei Волгоградского научно-исследовательского противочумного института с использованием разработанных олигонуклеотидных праймеров и зонда продукт амплификации синтезировался с ДНК всех штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза с чувствительностью 1×10 ²-1×10³ м.к./мл. С другими видами близкородственных буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов в реакции ПЦР с разработанными праймерами в 100% случаев получен отрицательный результат.

Таким образом, разработанные праймеры BTTS-s1/BTTS-as3 и зонд могут быть использованы для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза и позволяют в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать возбудителей сапа и мелиоидоза в биологическом материале и объектах окружающей среды.