способ определения эсфенвалерата в биологическом материале

Формула изобретения

Способ определения эсфенвалерата в биологическом материале, заключающийся в том, что биологическую пробу измельчают, неоднократно настаивают с органическим растворителем, отдельные извлечения объединяют, фильтруют, растворитель из фильтрата испаряют и проводят определение методом газо-жидкостной хроматографии, отличающийся тем, что после измельчения биологической пробы ее дважды настаивают с порциями диоксана, масса каждой из которых в 2 раза превышает массу биоматериала, фильтрат упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С, разбавляют в 5 раз водой, экстрагируют этилацетатом, этилацетатное извлечение отделяют, обезвоживают, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (150:5:1), очищают методом колоночной хроматографии в колонке размером 490х11 мм, заполненной 10 г силикагеля L 40/100 µ, с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (150:5:1), фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С до незначительного объема, затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в гексане и проводят определение методом газожидкостной хроматографии с применением капиллярной колонки DB-1701 длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм со стационарной фазой толщиной 0,25 мкм, содержащей полисилоксан и полиэтиленгликоль, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1 мл/мин и масс-спектрометрический детектор, работающий в режиме электронного удара, с регистрацией масс-спектра по полному ионному току, количество эсфенвалерата вычисляют из данных хроматограммы, полученной регистрацией интенсивности сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии, а именно к способам определения эсфенвалерата ( -циан-3-феноксибензил-(R,S)-2-(4-хлорфенил)-3-метилбутирата) в биологическом материале, и может быть использовано в практике химико-токсикологических и ветеринарных лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения производных изовалериановой (3-метилбутановой) кислоты (к которым относится и эсфенвалерат) в биологическом материале растительного происхождения (рисе), заключающийся в том, что анализируемую пробу измельчают, проводят изолирование анализируемых веществ ацетоном путем настаивания в течение 48 часов, очистку экстракта проводят методом колоночной хроматографии путем последовательного пропускания через колонки с флорисилом, силасорбом C-18 и оксидом алюминия. Очищенный экстракт анализируют методом ВЭЖХ со спектрометрическим способом детектирования (Haddad Paul R., Brayan John.G., Sharp Gerard J., Dilli Sergio. Determination of pyretroid residues on paddy rice by reversed-phase high-performance liquid chromatography // Journal of Chromatography. - 1989. - Vol.461. - P.337-346).

Способ характеризуется длительностью выполнения, недостаточно высокой чувствительностью, не может обеспечить селективное определение близких по структуре синтетических пиретроидов производных изовалериановой кислоты.

Известен способ определения производных изовалериановой кислоты (к которым относится и эсфенвалерат) в растительных биологических объектах (фруктах и овощах) путем настаивания с метанолом, отделения метанольных извлечений, их объединения, упаривания объединенного извлечения в токе воздуха до полного испарения растворителя, разбавления 10% раствором хлорида натрия и экстрагирования толуолом, хроматографирования на макроколонке с использованием в качестве подвижной фазы толуола, объединения фракций элюата, содержащих исследуемое вещество, упаривания в токе воздуха до незначительного объема, растворения в органическом растворителе с последующим определением методом газожидкостной хроматографии с использованием детектора электронного захвата, капиллярной колонки НР-1 (длина 5 м, диаметр 0,53 мм, толщина пленки стационарной фазы 2,65 мкм) и подвижной фазы - смеси аргона и метана (10:90) (Guo-Fang Pang, Chun-lin Fan, Jan-Zhong Chao, Tie-Sheng Zhao. Rapid method for the determination of multiple pyretroid residues in fruits and vegetables by capillary column gas chromatography // Journal of chromatographya. - 1994. - Vol.667, № 1+2. - P.348-353).

Способ характеризуется недостаточно высокой селективностью и чувствительностью.

Наиболее близким является способ определения эсфенвалерата ( -циан-3-феноксибензил-(R,S)-2-(4-хлорфенил)-3-метилбутирата) в биологическом материале (ткани печени), заключающийся в том, что к анализируемой пробе прибавляют воду, подщелачивают 0,1 М раствором гидроксида натрия до pH 9,0, обрабатывают концентрированным раствором хлорида натрия, трехкратно (по 1 часу) настаивают с порциями хлороформа, масса каждой из которых в 1,5 раза превышает массу биологического материала, отдельные извлечения объединяют, обезвоживают путем фильтрования через фильтр с безводным сульфатом натрия, растворитель испаряют из фильтрата при температуре не выше 40°C до сухого остатка, остаток растворяют в гексане и проводят определение методом газожидкостной хроматографии с применением пламенно-ионизационного детектора, набивной колонки размерами 130×0,2 см со стационарной фазой SE-30, нанесенной на твердый носитель N-AW-DMCS в количестве 5%, используя в качестве газа-носителя азот, скорость подачи которого составляет 30 мл/мин (З.А.Юлдашев, В.А.Попков. Химико-токсикологическое исследование синтетических пиретроидов. - М.: Издательство Московского университета. - 2006. - С.160-161, 119-121).

Задачей настоящего изобретения является повышение чувствительности определения.

Поставленная задача достигается с помощью предлагаемого способа, который заключается в том, что биологическую ткань (например, ткань печени) измельчают, дважды по 1 часу настаивают с порциями диоксана; масса каждой из которых в два раза превышает массу биоматериала, отдельные извлечения объединяют, фильтруют, фильтрат упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°C до незначительного объема, разбавляют в 5 раз водой, экстрагируют этилацетатом, этилацетатное извлечение отделяют, обезвоживают, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°C до незначительного объема, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (150:5:1), очищают методом колоночной хроматографии в колонке размером 490×11 мм, заполненной 10 г силикагеля L 40/100 µ, с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (150:5:1), фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C до незначительного объема, затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в гексане и проводят определение методом газожидкостной хроматографии с применением капиллярной колонки DB-1701 длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм со стационарной фазой толщиной 0,25 мкм, содержащей полисилоксан и полиэтиленгликоль, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1 мл/мин и масс-спектрометрический детектор, работающий в режиме электронного удара, с регистрацией масс-спектра по полному ионному току, количество эсфенвалерата вычисляют из данных хроматограммы, полученной регистрацией интенсивности сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ.

Способ осуществляется следующим образом: биологический материал, содержащий эсфенвалерат, дважды по 1 часу настаивают с порциями диоксана, каждая из которых в два раза по массе превышает количество биоматериала, отдельные извлечения объединяют, фильтруют, фильтрат упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°C до незначительного объема, разбавляют в 5 раз водой, экстрагируют этилацетатом, этилацетатное извлечение отделяют, обезвоживают, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до незначительного объема, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (150:5:1), очищают методом колоночной хроматографии в колонке размером 490×11 мм, заполненной 10 г силикагеля L 40/100 µ, с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (150:5:1), фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C до незначительного объема, затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в гексане и проводят определение методом газожидкостной хроматографии с применением капиллярной колонки DB-1701 длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм со стационарной фазой толщиной 0,25 мкм, содержащей полисилоксан и полиэтиленгликоль, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1 мл/мин и масс-спектрометрический детектор, работающий в режиме электронного удара, с регистрацией масс-спектра по полному ионному току, количество эсфенвалерата вычисляют из данных хроматограммы, полученной регистрацией интенсивности сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ.

Пример 1

Определение эсфенвалерата в ткани печени

К 10 г мелкоизмельченной ткани печени прибавляют 0,2 мг эсфенвалерата, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 18-22°C. По истечении указанного времени биологический объект, содержащий анализируемое вещество, заливают 20 г диоксана и выдерживают 60 минут при периодическом перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Отдельные вытяжки объединяют, фильтруют через бумажный фильтр, фильтр дополнительно промывают 10 г диоксана. Фильтрат и промывную жидкость объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°C до объема менее 4 мл, доводят до 4 мл диоксаном, переносят в делительную воронку, добавляют 16 мл воды, 20 мл этилацетата и экстрагируют путем встряхивания содержимого воронки в течение 4 минут (120 встряхиваний). Процесс экстракции повторяют дважды. Извлечения объединяют в выпарительной чашке, растворитель испаряют из экстракта в токе воздуха при температуре 18-22°C до незначительного объема, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 3-4 мл системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в объемных соотношениях (150:5:1). Полученный раствор вносят в колонку размером 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 µ. После полного вхождения раствора в слой сорбента в колонку прибавляют элюент - систему растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в объемных соотношениях 150:5:1. Выходящий из колонки элюат собирают отдельными порциями по 2 мл каждая. Фракции с 14 по 25 включительно объединяют в выпарительной чашке, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C до незначительного объема, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 10 мл гексана, 2 мкл полученного раствора вводят в хроматограф типа «Agilent 7890 A C/5975C MSD».

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-1701 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщиной стационарной фазы 0,25 мкм, содержащей полисилоксан и полиэтиленгликоль.

Начальная температура термостата колонки составляет 50°C (задержка на 1 минуту). Температура программируется от 50°C до 200°C со скоростью 50°C в минуту, от 200°C до 280°C со скоростью 20°C в минуту с выдержкой при конечной температуре 10 минут. Температура инжектора составляет 280°C, температура интерфейса - 260°C, температура квадруполя - 150°C, температура источника ионов - 230°C.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1 мл/мин. Режим без деления потока с задержкой 1 минута. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 8 минут. Диапазон сканирования составляет 40-550 m/z. Ток детектора 1500.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 12,01 мин соответствует эсфенвалерату. В масс-спектре данного соединения, снятом по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 55, 77, 125, 167, 225, 293, 419. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 125, интенсивность которой принимается за 100%.

Эсфенвалерат идентифицируют по сочетанию времени удерживания вещества в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание анализируемого соединения, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение калибровочного графика

В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 0,01 г эсфенвалерата и доводят объем содержимого колбы до метки гексаном (раствор А). 1 мл раствора A вносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят до метки гексаном (раствор Б). 1 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят до метки гексаном (раствор В). 1, 3, 5 мкл полученных растворов А, Б и С вводят в колонку хроматографа.

Определение проводят, используя хромато-масс-спектрометрическую систему, марки «Agilent 7890 A C/5975С MSD» с квадрупольным масс-селективным детектором. Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-1701 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,3 мм, толщиной пленки стационарной фазы 0,25 мкм, содержащей полисилоксан и полиэтиленгликоль. Начальная температура термостата колонки составляет 50°C (задержка на 1 минуту). Температура программируется от 50°C до 200°C со скоростью 50°C в минуту, от 200°C до 280°C со скоростью 20°C в минуту с выдержкой при конечной температуре 10 минут. Температура инжектора составляет 280°C, температура интерфейса - 260°C, температура квадруполя -150°C, температура источника ионов - 230°C.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1 мл/мин. Режим без деления потока с задержкой 1 минута. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 8 минут. Диапазон сканирования составляет 40-550 m/z. Ток детектора 1500.

По результатам измерений на хромато-масс-спектрометре строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 2·10 ^-10-5·10^-7 г.

Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид:

S=795332·C+56121,

где S - площадь хроматографического пика;

C - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, нг.

Результаты количественного определения эсфенвалерата в ткани печени представлены в таблице 1.

Пример 2

Определение эсфенвалерата в ткани почек

К 10 г мелкоизмельченной ткани почек прибавляют 0,2 мг эсфенвалерата, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 18-22°C. По истечении указанного времени биологический объект, содержащий анализируемое вещество, заливают 20 г диоксана и выдерживают 60 минут при периодическом перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Отдельные вытяжки объединяют, фильтруют через бумажный фильтр, фильтр дополнительно промывают 10 г диоксана. Фильтрат и промывную жидкость объединяют, упаривают в токе воздуха при при температуре 18-22°C до объема менее 4 мл, доводят до 4 мл диоксаном, переносят в делительную воронку, добавляют 16 мл воды, 20 мл этилацетата и экстрагируют путем встряхивания содержимого воронки в течение 4 минут (120 встряхиваний). Процесс экстракции повторяют дважды. Извлечения объединяют в выпарительной чашке, растворитель испаряют из экстракта в токе воздуха при температуре 18-22°C до незначительного объема, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 3-4 мл системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в объемных соотношениях (150:5:1). Полученный раствор вносят в колонку размером 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 µ. После полного вхождения раствора в слой сорбента в колонку прибавляют элюент - систему растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в объемных соотношениях 150:5:1. Выходящий из колонки элюат собирают отдельными порциями по 2 мл каждая. Фракции с 14 по 25 включительно объединяют в выпарительной чашке, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C до незначительного объема, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 10 мл гексана, 2 мкл полученного раствора вводят в хроматограф типа «Agilent 7890 A C/5975C MSD».

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-1701 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщиной стационарной фазы 0,25 мкм, содержащей полисилоксан и полиэтиленгликоль.

Начальная температура термостата колонки составляет 50°C (задержка на 1 минуту). Температура программируется от 50°C до 200°C со скоростью 50°C в минуту, от 200°C до 280°C со скоростью 20°C в минуту с выдержкой при конечной температуре 10 минут. Температура инжектора составляет 280°C, температура интерфейса - 260°C, температура квадруполя - 150°C, температура источника ионов - 230°C.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1 мл/мин. Режим без деления потока с задержкой 1 минута. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 8 минут. Диапазон сканирования составляет 40-550 m/z. Ток детектора 1500.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 12,01 мин соответствует эсфенвалерату. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 55, 77, 125, 167, 225, 293, 419. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 125, интенсивность которой принимается за 100%.

Эсфенвалерат идентифицируют по сочетанию времени удерживания вещества в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание анализируемого соединения, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Процесс построения градуировочного графика и его уравнение приведены выше в примере 1.

Результаты количественного определения эсфенвалерата в ткани почек представлены в таблице 2.

Пример 3

Определение эсфенвалерата в ткани желудка

К 10 г мелкоизмельченной ткани желудка прибавляют 0,2 мг эсфенвалерата, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 18-22°C. По истечении указанного времени биологический объект, содержащий анализируемое вещество, заливают 20 г диоксана и выдерживают 60 минут при периодическом перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Отдельные вытяжки объединяют, фильтруют через бумажный фильтр, фильтр дополнительно промывают 10 г диоксана. Фильтрат и промывную жидкость объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°C до объема менее 4 мл, доводят до 4 мл диоксаном, переносят в делительную воронку, добавляют 16 мл воды, 20 мл этилацетата и экстрагируют путем встряхивания содержимого воронки в течение 4 минут (120 встряхиваний). Процесс экстракции повторяют дважды. Извлечения объединяют в выпарительной чашке, растворитель испаряют из экстракта в токе воздуха при температуре 18-22°C до незначительного объема, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 3-4 мл системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в объемных соотношениях (150:5:1). Полученный раствор вносят в колонку размером 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 µ. После полного вхождения раствора в слой сорбента в колонку прибавляют элюент - систему растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в объемных соотношениях 150:5:1. Выходящий из колонки элюат собирают отдельными порциями по 2 мл каждая. Фракции с 14 по 25 включительно объединяют в выпарительной чашке, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C до незначительного объема, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 10 мл гексана, 2 мкл полученного раствора вводят в хроматограф типа «Agilent 7890 A C/5975C MSD».

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-1701 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщиной стационарной фазы 0,25 мкм, содержащей полисилоксан и полиэтиленгликоль.

Начальная температура термостата колонки составляет 50°C (задержка на 1 минуту). Температура программируется от 50°C до 200°C со скоростью 50°C в минуту, от 200°C до 280°C со скоростью 20°C в минуту с выдержкой при конечной температуре 10 минут. Температура инжектора составляет 280°C, температура интерфейса - 260°C, температура квадруполя - 150°C, температура источника ионов - 230°C.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1 мл/мин. Режим без деления потока с задержкой 1 минута. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 8 минут. Диапазон сканирования составляет 40-550 m/z. Ток детектора 1500.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 12,01 мин соответствует эсфенвалерату. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 55, 77, 125, 167, 225, 293, 419. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 125, интенсивность которой принимается за 100%.

Эсфенвалерат идентифицируют по сочетанию времени удерживания вещества в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание анализируемого соединения, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Процесс построения градуировочного графика и его уравнение приведены выше в примере 1.

Результаты количественного определения эсфенвалерата в ткани желудка представлены в таблице 3.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 250 раз повышает чувствительность определения в хроматографируемой пробе и в 20 раз - в биологическом материале.

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в таблице 4.