препарат, ускоряющий заживление ран
Классы МПК: | A61K31/722 хитин; хитозан A61K31/717 целлюлозы A61K47/10 спирты; фенолы; их соли A61P31/04 антибактериальные средства |
Автор(ы): | Глущенко Наталья Николаевна (RU), Богословская Ольга Александровна (RU), Алексеева Татьяна Павловна (RU), Рахметова Алла Александровна (RU), Овсянникова Маргарита Николаевна (RU), Ольховская Ирина Павловна (RU), Варламов Валерий Петрович (RU), Левов Александр Николаевич (RU), Лопатин Сергей Александрович (RU) |
Патентообладатель(и): | Учреждение Российской академии наук Институт энергетических проблем химической физики РАН (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2010-07-01 публикация патента:
20.01.2012 |
Изобретение относится к области медицины и касается препарата, ускоряющего заживление ран и обладающего антимикробной активностью. Препарат представляет собой раствор низкомолекулярного хитозана (НМХ), который имеет молекулярную массу 5-72 кДа, со степенью деацетилирования 20-89% в гидрогеле, содержащем метилцеллюлозу (МЦ-100) и воду. Препарат дополнительно может содержать глицерин и нипагин при следующем соотношении компонентов, г: НМХ - 0.05-2.0, МЦ-100 - 1.0-3.0, глицерин - 10.0-20.0, нипагин - 0.1-0.3, вода до 100,0. Изобретение обеспечивает высокий ранозаживляющий эффект. 1 з.п. ф-лы, 8 ил., 6 табл.
![препарат, ускоряющий заживление ран, патент № 2440122](/images/patents/18/2440122/2440122.jpg)
![препарат, ускоряющий заживление ран, патент № 2440122](/images/patents/18/2440122/2440122-2.jpg)
![препарат, ускоряющий заживление ран, патент № 2440122](/images/patents/18/2440122/2440122-3.jpg)
![препарат, ускоряющий заживление ран, патент № 2440122](/images/patents/18/2440122/2440122-4.jpg)
![препарат, ускоряющий заживление ран, патент № 2440122](/images/patents/18/2440122/2440122-5.jpg)
![препарат, ускоряющий заживление ран, патент № 2440122](/images/patents/18/2440122/2440122-6.jpg)
![препарат, ускоряющий заживление ран, патент № 2440122](/images/patents/18/2440122/2440122-7.jpg)
![препарат, ускоряющий заживление ран, патент № 2440122](/images/patents/18/2440122/2440122-8.jpg)
Формула изобретения
1. Препарат, ускоряющий ранозаживление и обладающий антимикробной активностью, включающий действующее вещество и основу, отличающийся тем, что в качестве активного вещества используются низкомолекулярные хитозаны, а в качестве основы - метилцеллюлоза-100 (МЦ-100) и вода, при этом низкомолекулярный хитозан имеет молекулярную массу от 5 до 72 кДа со степенью деацетилирования от 20 до 89% и содержится в концентрации от 0,05 до 2,0%.
2. Препарат по п.1, который дополнительно содержит глицерин и в качестве консерванта нипагин при следующем соотношении компонентов, г:
низкомолекулярный хитозан | 0,05-2,0 |
метилцеллюлоза (МЦ-100) | 1,0-3,0 |
глицерин | 10,0-20,0 |
нипагин | 0,1-0,3 |
вода | до 100,0 |
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к медицине, в частности к препаратам, ускоряющим ранозаживление.
Одной из актуальных проблем современной медицины является создание высокоэффективных ранозаживляющих препаратов, обладающих антимикробной активностью. Это связано с высоким уровнем травматизма, который увеличивается при возникновении экстремальных ситуаций на производстве и природных катаклизмах, в результате проведения боевых действий и террористических актов. В России ежегодно более 13 млн человек подвергается различным видам травм, ожогов, ушибов, течение которых, как правило, сопровождается развитием гнойных процессов. Замедление процесса заживления ран увеличивает риск повторного травмирования и инфицирования раневой поверхности.
Современная фармация имеет широкий набор лекарственных средств: мази, гели, повязки, пластыри, присыпки, в которых в качестве действующих веществ использованы антисептики, обезболивающие и антибактериальные препараты, низкомолекулярные белки, ферменты, природные и синтетические антиоксиданты. Однако, учитывая высокую резистентность бактерий к антибиотикам и сульфаниламидным препаратам, потребность в эффективной регенерирующей компоненте в составе лекарственных средств широкого спектра действия для лечения травм, ран и ожогов остается высокой. Вот почему продолжаются исследования и разработки новых ранозаживляющих средств, особенно мягких лекарственных форм, которые пользуются наибольшим спросом, удобны в использовании и хранении. В этом отношении низкомолекулярные хитозаны (НМХ) являются перспективными веществами для разработки и создания нового класса мягких лекарственных форм, обладающих ранозаживляющей и антибактериальной активностями. В настоящее время высокомолекулярные хитозаны в виде губок, гидрогелей и т.д. уже применяются для местного лечения ран и ожогов, в раневой хирургии [2, 3, 6].
Известно, что хитиновые соединения влияют на процесс ранозаживления благодаря следующим свойствам:
1) они усиливают иммунный ответ;
2) ацетилглюкозамин хитозанов используется для синтеза мукополисахаридов и дальнейшего синтеза некоторых биоструктур;
3) хитозаны стимулируют пролиферацию фибробластов;
4) хитозаны вызывают уменьшение синтеза медиаторов воспаления: простагландина Е2 и циклооксигеназы-2;
5) хитозаны ингибируют синтез оксида азота - цитотоксического фактора в стадии воспаления [1, 5, 7, 8, 9, 10].
Среди аналогов представленного изобретения можно назвать нетканые раневые (губчатые) покрытия на основе коллаген-хитозанового комплекса: «Коллахит-Г», «Коллахит-Ш», «Коллахит-ФА» (Россия); мазь для заживления ран «Левомеколь», мазь и гель «Солкосерил».
Наиболее близким к предлагаемому нами изобретению является композиция, описанная в патенте US 6896902, 24.05.2005 - препарат, который после растворения в воде применяется для лечения кожных ран, а также при профилактике и лечении маститов у животных [11].
К недостаткам известного решения относятся следующие:
1. Для получения готового к употреблению раствора/суспензии хитозана необходима вода высокой степени чистоты. В случае отсутствия высокоочищенной воды приготовление препарата становится невозможным.
2. Поскольку препарат растворяется в воде непосредственно потребителем, возникает опасность ошибочной дозировки.
3. Предлагаемая в патенте США композиция неустойчива к влаге. Следовательно, предъявляются дополнительные требования к транспортировке и хранению препарата.
4. Согласно патенту в определенных случаях необходимо доводить рН получаемого раствора/суспензии хитозана до нужных значений. Такая задача требует наличия высококвалифицированного персонала.
5. Для удобства хранения авторы изобретения предлагают хранить порошок хитозана отдельно от СО2 -образующих компонентов. В противном случае увеличивается вероятность ошибки и неправильной дозировки.
Целью данного изобретения является создание ранозаживляющего препарата полифункционального действия, обеспечивающего высокий уровень ранозаживления и обладающего антимикробным эффектом.
Цель достигается тем, что разработан препарат, ускоряющий ранозаживление и обладающий антимикробной активностью, представляющий собой гель следующего состава (в г): низкомолекулярный хитозан - 0.05-2.00; метилцеллюлоза-100 - 1.0-3.0; глицерин - 10.0-20.0; нипагин - 0.1-0.3; вода - до 100.0, в предпочтительном варианте изобретения низкомолекулярный хитозан имеет молекулярную массу от 5 кДа до 72 кДа со степенью деацетилирования от 20% до 85-89% в концентрациях от 0.05% до 2.0%.
В качестве гелеобразующих компонентов разработанного препарата вводили следующие вещества: метилцеллюлоза (МЦ-100) и глицерин; в качестве консерванта применяли нипагин. Для приготовления препарата, ускоряющего ранозаживление, использовали низкомолекулярные хитозаны с молекулярными массами 5-7 кДа, 10-11 кДа, 24 кДа, 56 кДа, 72 кДа и степенью деацетилирования 20%, 24%, 51%, 60%, 73%, 80%, 85-89% в концентрациях 0.05%, 0.1%, 0.5%, 2.0%.
Препарат имеет следующий состав, г:
низкомолекулярного хитозана | 0.05-2.00 |
метилцеллюлозы-100 | 1.0-3.0 |
глицерина | 10.0-20.0 |
нипагина | 0.1-0.3 |
воды | до 100.0 |
Гель готовили по следующей схеме.
На первом этапе получали гель МЦ-100, затем точную навеску одного из образцов низкомолекулярного хитозана растворяли в воде, прибавляли к определенному количеству геля МЦ-100 и перемешивали с помощью высокоскоростной мешалки.
Полученный продукт представлял собой прозрачный желтоватый гель, однородный по составу, без механических включений, с очень слабым специфическим запахом и стабильный при хранении.
I. Ранозаживляющая активность геля.
Исследуемые низкомолекулярные хитозаны с разной степенью деацетилирования и различной молекулярной массой в составе геля наносили на поверхность полнослойных ран первоначальной площадью 60 мм2 в количестве 0.2 г. В качестве эталонных препаратов использовали мазь «Левомиколь» и гель «Солкосерил», которые наносили на раны тем же путем, в том же количестве и по той же схеме. Во всех вариантах опытов регистрировали изменение площади ран и рассчитывали время полузаживления и полного заживления по кинетическим кривым изменения площади ран. Действие препаратов изучали на белых мышах-самках весом 18-20 г линии SHK, находящихся на общевиварийном рационе кормления.
Пример 1. Ранозаживляющее действие низкомолекулярных хитозанов разной степени деацетилирования с молекулярной массой 24 кДа в составе геля по показателям времени полузаживления и полного заживления ран.
Под эфирным наркозом на спине у мышей выстригали шерсть, по трафарету наносили контуры раны (площадью 60 мм2), и затем с помощью хирургических ножниц с закругленными концами вырезали лоскут кожи. Все раны оставались открытыми вплоть до окончания опыта. Ежедневно на поверхность ран мышей наносили по 0.2 г геля, содержащего низкомолекулярный хитозан разной степени деацетилирования, или по 0.2 г эталонных препаратов (гель «Солкосерил», мазь «Левомеколь»). В таблице 1 представлены результаты сравнительных исследований ранозаживляющей активности разработанных нами гелей и мягких лекарственных форм промышленного производства «Левомеколь» и «Солкосерил» в качестве эталонов.
Установлено, что исследуемые гели с низкомолекулярными хитозанами с молекулярной массой 24 кДа и разной степенью деацетилирования 20%, 51%, 60%, 73%, 80%, 85-89% обладают ранозаживляющей активностью, по показателю времени полузаживления ран достоверно ускоряя процесс регенерации кожи на 31%, 40%, 42%, 55%, 69%, 84% и по показателю полного заживления - на 14%, 8%, 13%, 8%, 13%, 30%, соответственно, по сравнению с гелем без НМХ (таблица 1). Наибольшим эффектом обладает гель с низкомолекулярным хитозаном с молекулярной массой 24 кДа и степенью деацетилирования 85-89%, снижающий время полузаживления ран на 84%, время полного заживления - на 30% по сравнению с контролем.
Препараты сравнения «Солкосерил» и «Левомеколь» в указанных условиях опыта на модели полнослойной экспериментальной раны оказались менее эффективными, чем гели с низкомолекулярными хитозанами с молекулярной массой 24 кДа и степенью деацетилирования 80% и 85-89%.
Пример 2. Ранозаживляющее действие низкомолекулярных хитозанов с разной молекулярной массой и в разных концентрациях в составе геля по показателям времени полузаживления ран.
Под эфирным наркозом на спине у мышей выстригали шерсть, по трафарету наносили контуры раны (площадью 60 мм2), и затем с помощью хирургических ножниц с закругленными концами вырезали лоскут кожи. Все раны оставались открытыми вплоть до окончания опыта. Ежедневно на поверхность ран мышей наносили по 0.2 г геля, содержащего низкомолекулярный хитозан с разными молекулярными массами: 5-7 кДа, 11 кДа, 56 кДа, 72 кДа, в разных концентрациях: 0.05%, 0.1%, 0.5%, 2.0%. Для изученных образцов низкомолекулярных хитозанов степень деацетилирования составляла 85-89% (Таблица 2).
Нами установлено, что низкомолекулярные хитозаны с молекулярными массами 5-7 кДа, 11 кДа, 56 кДа, 72 кДа обладают ранозаживляющей активностью. Наибольшим ранозаживляющим действием обладает гель, содержащий НМХ с молекулярной массой 5-7 кДа и 72 кДа. Эффективность их ранозаживления зависит от концентрации НМХ в геле: чем выше концентрация, тем ранозаживляющая активность выше. Наибольшей ранозаживляющей активностью обладает 2.0% гель с НМХ молекулярной массой 5-7 кДа - при его применении наблюдается уменьшение времени полузаживления ран на 61.9% по сравнению со временем полузаживления ран животных в контроле. Нами не установлена концентрационная зависимость для геля с НМХ молекулярной массой 11кДа: 0.1%, 0.5%, 2.0% гели практически в одинаковой степени уменьшают время полузаживления ран в среднем на 39.7%.
Следовательно, ранозаживляющие свойства гелей с НМХ зависят от молекулярной массы низкомолекулярных хитозанов и их концентрации в геле. Наибольшим ранозаживляющим действием обладает гель, содержащий НМХ с молекулярной массой 5-7 кДа в концентрации 2.0%.
Пример 3. Влияние низкомолекулярных хитозанов со степенью деацетилирования 85-89% с разной молекулярной массой в составе 0.5% геля на показатели времени полузаживления и полного заживления ран.
Под эфирным наркозом на спине у мышей выстригали шерсть, по трафарету наносили контуры раны (площадью 60 мм2), и затем с помощью хирургических ножниц с закругленными концами вырезали лоскут кожи. Все раны оставались открытыми вплоть до окончания опыта. Ежедневно на поверхность ран мышей наносили по 0.2 г геля, содержащего низкомолекулярный хитозан с разными молекулярными массами: 11 кДа, 56 кДа, 72 кДа в концентрации 0.5%. Для всех образцов низкомолекулярных хитозанов степень деацетилирования составляла 85-89%. Результаты сравнительного исследования ранозаживляющего действия низкомолекулярных хитозанов со степенью деацетилирования 85-89%, имеющих разную молекулярную массу, представлены в таблице 3.
При сравнении эффективности действия низкомолекулярных хитозанов, взятых в равной концентрации в составе геля, но имеющих разную молекулярную массу: 5-7, 11, 72 кДа на показатели полу- и полного заживления ран установлено, что изученные низкомолекулярные хитозаны значимо уменьшают время полузаживления ран. Гель, содержащий НМХ с молекулярной массой 5-7 кДа, уменьшает время полузаживления на 48.6%, гель с НМХ 11 кДа - на 31.7%, гель с НМХ 72 кДа - на 38.3%. Время полного заживления ран при нанесении геля с НМХ 5-7 кДа уменьшается на 29.5%, геля с НМХ 11 кДа - на 7.2%, а гель с НМХ 72 кДа не оказывает влияния на показатель полного заживления ран.
Следовательно, наибольшим ранозаживляющим эффектом обладает 0.5% гель, содержащий низкомолекулярный хитозан с молекулярной массой 5-7 кДа, степенью деацетилирования 85-89%, сокращающий время полузаживления на 48.6% по сравнению с контролем, а время полного заживления на 29.5%.
II. Антимикробная активность геля.
В стерильные чашки Петри одинакового диаметра с ровным плоским дном разливается среда, пригодная для выращивания тест-микробов: Staphylococcus albus (St.albus) и Escherichia coli (E.coli AB1157). Состав среды роста микроорганизмов (в г): на 1 л дистиллированной воды: пептон - 10, дрожжевой экстракт - 5, натрий хлорид - 5, агар-агар - 20. После застывания агар-агара в чашки Петри высевают тест-культуру микроорганизмов. Посев проводят равномерно и одинаково во все чашки из предварительно подготовленной суспензии. Плотность засева должна быть достаточной для роста сплошного газона. Чашки растирают стерильным шпателем, после чего в сделанные лунки дозированно закапывают растворы низкомолекулярных хитозанов, обладающих разными характеристиками, или помещают диски с левомицетина сукцинатом или фталазолом, используемыми в качестве эталонов. Готовые чашки Петри на сутки ставят в термостат при температуре, оптимальной для выращивания тест-организмов. Экспозиция в термостате зависит от скорости роста тест-культуры. Через сутки чашки вынимают из термостата и просматривают. Если испытуемый образец оказывает влияние на рост тест-микроба, то вокруг лунок образуется зона задержки роста. По площади зоны задержки роста (мм2) можно судить об интенсивности влияния испытуемого образца на тест-микробы [4].
Пример 4. Влияние растворов низкомолекулярных хитозанов с молекулярной массой 24 кДа с различной степенью деацетилирования в концентрациях 0.5% и 2.0% на изменение площади зоны задержки роста (мм 2) культуры St.albus и E.coli AB1157.
Данные по влиянию растворов низкомолекулярных хитозанов с молекулярной массой 24 кДа с разной степенью деацетилирования в концентрациях 0.5% и 2.0% на изменение площади зоны задержки роста (мм 2) тест-культур St.albus и E.coli АВ1157 представлены в таблице 4, на ФИГ.1-8. Результаты свидетельствуют, что растворы деацетилированных хитозанов обладают антимикробной активностью.
Антимикробное действие растворов НМХ с разной степенью деацетилирования в концентрациях 0.5% и 2.0% на тест-культуру St.albus зависит от степени деацетилирования НМХ. Наибольшей антимикробной активностью обладает НМХ с СД 85-89%. Причем зона задержки роста бактерий при действии НМХ с СД 85-89% соизмерима с зоной задержки роста микроорганизмов при нанесении эталона сравнения - раствора антибиотика (левомицетина сукцината) в концентрации 0.5% (ФИГ.1). Раствор сравнения фталазол в указанных условиях опыта оказался неэффективным.
Растворы НМХ в концентрации 2.0% оказывают более сильное влияние на St.albus, чем НМХ в концентрации 0.5%. Наиболее выраженным антимикробным эффектом обладает хитозан со степенью деацетилирования 85-89%, а наименьшим - хитозан с со степенью деацетилирования 73% (Таблица 4, ФИГ.1, 2).
Эффективность антимикробного действия НМХ в концентрации 0.5% и 2.0% увеличивается с повышением степени деацетилирования хитозана: чем выше степень деацетилирования хитозана, тем сильнее антимикробное действие (ФИГ.3, 4).
Наибольшим антибактериальным действием обладает низкомолекулярный хитозан молекулярной массой 24 кДа со степенью деацетилирования 85-89% в концентрации 2.0% на клетки тест-культуры грамположительных бактерий St.albus: действие указанного хитозана соизмеримо с действием эталона сравнения - раствора левомицетина сукцината в концентрации 0.5%. Исследования показали, что растворы деацетилированных хитозанов обладают антимикробной активностью и в отношении тест-культуры грамотрицательных бактерий Е.coli AB1157 (Таблица 4, ФИГ.5-8).
Видно, что с повышением степени деацетилирования НМХ антибактериальный эффект увеличивается. Наибольшим действием обладает НМХ со степенью деацетилирования 85-89%. Однако зона лизиса эталона сравнения - левомицетина сукцината в концентрации 0.5% - в 8.5 раз больше зоны лизиса НМХ со степенью деацетилирования 85-89% в той же концентрации. При этом эталон сравнения фталазол не проявлял активности. Антибактериальное действие НМХ в концентрации 0.5% имеет прямую зависимость от степени деацетилирования (ФИГ.7). При увеличении концентрации до 2.0% сохраняются те же закономерности, что и при концентрации 0.5%: с увеличением степени деацетилирования антимикробный эффект усиливается, причем зависимость носит прямой характер (Таблица 4, ФИГ.8). Увеличение концентрации НМХ до 2.0% незначительно повышает эффективность НМХ по сравнении с концентрацией 0.5%. В целом, антимикробный эффект растворов хитозана с разной степенью деацетилирования в обеих концентрациях выражен слабее на клетки E.coli АВ1157, чем на клетки тест-культуры St.albus.
Пример 5. Влияние концентрации (0.02%, 0.2% и 2.0%) низкомолекулярного хитозана с молекулярной массой 72 кДа со степенью деацетилирования 85-89%, на изменение площади зоны задержки роста (мм2) культуры St.albus и E.coli АВ1157.
Результаты исследований по влиянию растворов низкомолекулярного хитозана с молекулярной массой 72 кДа со степенью деацетилирования 85-89%, в разных концентрациях (0.02%, 0.2% и 2.0%) на изменение площади зоны задержки роста (мм2) культуры St.albus показывают, что с увеличением концентрации НМХ эффективность антимикробного действия становится выше (таблица 5). Антибактериальное действие низкомолекулярного хитозана с молекулярной массой 72 кДа со степенью деацетилирования 85-89% на клетки тест-культуры E.coli AB1157 ниже, чем на клетки St.albus. Наибольшим антимикробным действием обладает низкомолекулярный хитозан с молекулярной массой 72 кДа, со степенью деацетилирования 85%-89% в концентрации 2.0% на клетки тест-культуры грамположительных бактерий St.albus. Фталазол, взятый в качестве эталона, в указанных условиях опыта оказался неэффективным.
Пример 6. Антимикробная активность геля с низкомолекулярными хитозанами с молекулярной массой 56 кДа со степенью деацетилирования 85-89% в концентрациях 0.05% и 0.5%
Наши исследования позволили установить, что растворы низкомолекулярных хитозанов с разной степенью деацетилирования и молекулярной массой обладают антимикробной активностью по отношению к тест-культурам St.albus и E.coli AB1157 (Примеры 4 и 5). Для проверки антимикробной активности разработанного нами геля с низкомолекулярным хитозаном были использованы гели следующего состава (г):
низкомолекулярного хитозана | 0.05 и 0.5 |
метилцеллюлозы-100 | 4.0 |
глицерина | 10.0 |
нипагина | 0.02 |
воды | до 100.0 |
Результаты исследования приведены в таблице 6. Установлено, что гели с низкомолекулярными хитозанами с молекулярной массой 56 кДа со степенью деацетилирования 85-89% в концентрациях 0.05% и 0.5% (образцы № 1 и № 2) обладают антимикробной активностью по отношению к тест-культурам St.albus и E.coli AB1157. Зоны задержки роста тест-культур при нанесении на чашку разработанных нами гелей имеет значительную площадь, особенно для тест-культуры St.albus. Сравнение проведено с эталонами - мягкими лекарственными формами промышленного производства «Левомеколь» и «Солкосерил». Установлено, что разработанные нами гели с НМХ при тестировании на клетки Е.coli AB1157 являются более эффективными по антимикробному действию, чем «Солкосерил» в 3.5 раза (образец № 1) и в 2.4 раза (образец № 2). Показано, что разработанные нами гели с НМХ при тестировании на клетки St.albus являются более эффективными по антимикробному действию, чем «Солкосерил» в 3.1 раза (образец № 1) и в 2.7 раз (образец № 2). При сравнении антимикробного действия разработанных нами гелей с НМХ с эталоном сравнения - «Левомеколем» по площади зоны задержки роста бактерий показано, что их антимикробное действие на клетки тест-культур Е.coli AB1157 и St.albus ниже, чем у антибиотика.
Следовательно, разработанные нами гели обладают антимикробной активностью по отношению к тест-культурам St.albus и Е.coli AB1157 и более эффективны, чем «Солкосерил».
Таким образом, представленные данные свидетельствуют о ранозаживляющей и антимикробной активностях разработанного нами препарата
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
ФИГ.1. Зоны задержки роста тест-культуры St.albus на чашках Петри при действии растворов левомицетина и НМХ СД 73%, 80-85%, 89% в концентрации 0.5%.
На фиг.1 представлены фотографии чашек Петри, засеянные тест-культурой St.albus. На поверхности чашек Петри сделаны лунки, в которые дозированно в концентрации 0.5% добавлены раствор левомицетина сукцината, используемый в качестве эталона, и растворы низкомолекулярных хитозанов (НМХ), СД 73%, 80-85%, 89%, в концентрации 0.5%. Вокруг лунок с препаратами образовались зоны задержки роста тест-культуры, заметные в виде колец. В дальнейшем, по площади зон задержки роста, оценивали эффективность действия препарата на микробные клетки.
ФИГ.2. Зоны задержки роста тест-культуры St.albus на чашках Петри при действии растворов левомицетина и НМХ СД 73%, 80-85%, 89% в концентрации 2.0%.
На фиг.2 представлены фотографии чашек Петри, засеянные тест-культурой St.albus. На поверхности чашек Петри сделаны лунки, в которые дозированно в концентрации 2.0% добавлены раствор левомицетина сукцината, используемый в качестве эталона, и растворы низкомолекулярных хитозанов (НМХ), СД 73%, 80-85%, 89%, в концентрации 2.0%. Вокруг лунок с препаратами образовались зоны задержки роста тест-культуры, заметные в виде колец. В дальнейшем, по площади зон задержки роста, оценивали эффективность действия препарата на микробные клетки.
ФИГ.3. Зависимость зоны задержки роста тест-культуры St.albus на чашках Петри при действии растворов НМХ СД 73%, 80%, 85-89% в концентрации 0.5% от степени деацетилирования НМХ, молекулярная масса 24 кДа.
На фиг.3 представлена зависимость зоны задержки роста тест-культуры St.albus на чашках Петри при действии растворов НМХ СД 73%, 80%, 85-89% в концентрации 0.5% от степени деацетилирования НМХ с молекулярной массой 24 кДа. Видно, что с повышением степени деацетилирования НМХ антибактериальный эффект увеличивается.
ФИГ.4. Зависимость зоны задержки роста тест-культуры St.albus на чашках Петри при действии растворов НМХ СД 73%, 80%, 85-89% в концентрации 2.0% от степени деацетилирования НМХ, молекулярная масса 24 кДа.
На фиг.4 представлена зависимость зоны задержки роста тест-культуры St.albus на чашках Петри при действии растворов НМХ СД 73%, 80%, 85-89% в концентрации 2.0% от степени деацетилирования НМХ с молекулярной массой 24 кДа. Видно, что с повышением степени деацетилирования НМХ антибактериальный эффект увеличивается.
ФИГ.5. Зоны задержки роста тест-культуры Е.coli 1157 на чашках Петри при действии растворов левомицетина сукцината и НМХ с СД 73%, 80%, 85-89% в концентрации 0.5%.
На фиг.5 представлены фотографии чашек Петри, засеянные тест-культурой E.coli 1157. На поверхности чашек Петри сделаны лунки, в которые дозировано в концентрации 0.5% добавлены раствор левомицетина сукцината, используемый в качестве эталона, и растворы низкомолекулярных хитозанов (НМХ), СД 73%, 80-85%, 89%, в концентрации 0.5%. Вокруг лунок с препаратами образовались зоны задержки роста тест-культуры, заметные в виде колец. В дальнейшем, по площади зон задержки роста, оценивали эффективность действия препарата на микробные клетки.
ФИГ.6. Зоны задержки роста тест-культуры E.coli 1157 на чашках Петри при действии растворов левомицетина сукцинат и НМХ СД 73%, 80-85, 89% в концентрации 2%.
На фиг.6 представлены фотографии чашек Петри, засеянные тест-культурой E.coli 1157. На поверхности чашек Петри сделаны лунки, в которые дозированно в концентрации 2.0% добавлены раствор левомицетина сукцината, используемый в качестве эталона, и растворы низкомолекулярных хитозанов (НМХ), СД 73%, 80-85%, 89%, в концентрации 2.0%. Вокруг лунок с препаратами образовались зоны задержки роста тест-культуры, заметные в виде колец. В дальнейшем, по площади зон задержки роста, оценивали эффективность действия препарата на микробные клетки.
ФИГ.7. Зависимость зоны задержки роста тест-культуры E.coli 1157 на чашках Петри при действии растворов НМХ СД 73%, 80%, 85-89% в концентрации 0.5% от степени деацетилирования НМХ, молекулярная масса 24 кДа.
На фиг.7 представлена зависимость зоны задержки роста тест-культуры E.coli 1157 на чашках Петри при действии растворов НМХ СД 73%, 80%, 85-89% в концентрации 0.5% от степени деацетилирования НМХ с молекулярной массой 24 кДа. Видно, что с повышением степени деацетилирования НМХ антибактериальный эффект увеличивается.
ФИГ.8. Зависимость зоны задержки роста тест-культуры E.coli 1157 на чашках Петри при действии растворов НМХ СД 73%, 80%, 85-89% в концентрации 2.0% от степени деацетилирования НМХ, молекулярная масса 24 кДа.
На фиг.8 представлена зависимость зоны задержки роста тест-культуры E.coli 1157 на чашках Петри при действии растворов НМХ СД 73%, 80%, 85-89% в концентрации 2.0% от степени деацетилирования НМХ с молекулярной массой 24 кДа. Видно, что с повышением степени деацетилирования НМХ антибактериальный эффект увеличивается.
ЛИТЕРАТУРА
1. Большаков И.Н., Горбунов Н.С., Насибов С.М., Шамова Е.С.и др. Раневые покрытия на основе коллахита - этап получения и использования дермально-эпидермального эквивалента кожи человека. Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана. Материалы Седьмой Международной конференции. - М.: ВНИРО, 2003. - С.136-139.
2. Никонов Б.А., Панов В.В., Парамонов Б.А., Вербицкая Н.Б., Антонов С.Ф., Золина Н.Н. Антибактериальные свойства губок на хитозан-коллагеновой основе. Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана. Матер. VII международной коференции. - Спб: ВНИРО, 2003. - С.181-183.
3. Панов В.В., Парамонов Б.А., Никонов Б.А., Золина Н.Н., Антонов С.Ф. Опыт применения хитозан-коллагеновых губок при лечении огнестрельных ран мягких тканей. Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана. Матер. VII международной коференции. - Спб: ВНИРО, 2003. - С.185-186.
4. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. / Под редакцией Биргера М.О. - М.: Медицина, 1982. - 464 с.
5. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Меморская А.С. Новая отрасль биотехнологии - медицинские препараты на основе полиаминосахаридов грибов. // Новые достижения в исследовании хитина и хитозана. Материалы Шестой Международной конференции. - М.: ВНИРО, 2001. - С.248-251.
6. Berger J., Reist М., Mayer J.M., Felt O., Gurny R. Structure and Interactions in Chitosan Hydrogels Formed by Complexation or Aggregation for Biomedical Applications. // Eur. J. Pharm. Biopharm. - 2004. - V.57. - P.35-52.
7. Chou T.C., Fu E., Shen E.C. Chitosan inhibits prostaglandin E2 formation and cyclooxy-genase-2 induction in lipopolysaccharide-treated RAW 264.7 macrophages. Biochem Biophys Res Commun. - 2003. V.2. - P.403-407.
8. Hwang S.M., Chen C.Y., Chen S.S., Chen J.C. Chitinous materials inhibit nitric oxide production by activated RAW 264.7 macrophages. Biochem Biophys Res Commun. 2000. - V.1. - P.229-233.
9. Obminska-Mrucowicz В., Szczypka М., Gaweda В. Modulatory effects of chitosan adipate on the Т and В lymphocyte subsets in mice. // J. Vet. Sci. 2006. V.7. P.157-160.
10. Peluso G., Petillo O., Ranieri M., Santin M., Ambrosio L., Calabro D., Avallone В., Balsamo G. Chitosan-mediated stimulation of macrophage function. // Biomaterials. - 1994. - V.15. - 1215-1220.
11. Патент США 6,896,902. Effervescent solid composition of matter. 24.05.2005. - прототип.
ПРИЛОЖЕНИЕ
Таблица 1 | |||||
Влияние низкомолекулярных хитозанов разной степени деацетилирования с молекулярной массой 24 кДа в составе геля по показателям времени полу- и полного заживления ран | |||||
Группа | Степень деацетилирования НМХ, % | | Уровень значимости по критерию Стьюдента* | Уровень значимости по критерию Стьюдента** | |
1 | Контроль | 100 | 100 | | |
2 | Контроль-гель без НМХ | 94.5±23.2 | 100.0±9.0 | | |
3 | 85-89 | 16.4±4.3 | 70.0±15.0 | Р<0.05 | р<0.05 |
4 | 80 | 31.0±7.4 | 77.5±4.2 | р<0.01 | р<0.05 |
5 | 73 | 45.5±5.2 | 82.5±6.5 | р<0.01 | р<0.05 |
6 | 60 | 58.0±5.1 | 87.5±5.0 | р<0.05 | Не значим |
7 | 51 | 60.9±4.3 | 92.5±5.6 | р<0.05 | Не значим |
8 | 20 | 69.9±11.6 | 86.2±0.8 | р<0.05 | Не значим |
Заводские мази | «Солкосерил» | 41.5±5.3 | 110±9.3 | р<0.05 | Не значим |
«Левомеколь» | 52.2±5.6 | 112±8.4 | р<0.05 | Не значим | |
* для времени полузаживления ран по сравнению с основой - гелем на МЦ-100 без НМХ | |||||
** для времени полного заживления ран по сравнению с основой - гелем на МЦ-100 без НМХ |
Таблица 2 | ||||
Влияние низкомолекулярных хитозанов со степенью деацетилирования 85-89% с разной молекулярной массой и в разных концентрациях в составе геля на ранозаживление по показателю времени полузаживления ран | ||||
Группа | Молекулярная масса НМХ, кДа | Концентрация НМХ в геле, % | Уровень значимости по критерию Стьюдента* | |
1 | Контроль | 100 | | |
2 | Контроль-гель без НМХ | 94.5±23.2 | ||
3 | 5-7 | 0.5 | 51.4±9.8 | р<0.05 |
2.0 | 38.1±11.5 | р<0.05 | ||
4 | 11 | 0.1 | 53.3±15.0 | р<0.05 |
0.5 | 68.3±2.6 | р<0.01 | ||
2.0 | 63.3±15.0 | р<0.01 | ||
5 | 56 | 0.05 | 84.6±23.1 | р<0.05 |
6 | 72 | 0.1 | 61.7±11.7 | р<0.05 |
0.5 | 61.7±16.7 | р<0.05 | ||
2.0 | 41.7±15.0 | р<0.05 | ||
* для времени полузаживления ран по сравнению с основой - гелем на МЦ-100 без НМХ |
Таблица 3 | |||||
Влияние низкомолекулярных хитозанов со степенью деацетилирования 85-89% с разной молекулярной массой в составе 0.5% геля на показатели времени полузаживления и полного заживления ран | |||||
Группа | Молекулярная масса НМХ, кДа | | | Уровень значимости по критерию Стьюдента* | Уровень значимости по критерию Стьюдента** |
1 | Контроль | 100 | 100 | | |
2 | Контроль-гель без НМХ | 94.5±23.2 | 100.0±4.5 | | |
3 | 5-7 | 51.4±9.8 | 70.5±7.3 | р<0.05 | р<0.05 |
4 | 11 | 68.3±2.6 | 92.8±7.5 | р<0.01 | р<0.05 |
5 | 72 | 61.7±16.7 | 100.0±8.9 | р<0.05 | Не значим |
* для времени полузаживления ран по сравнению с основой - гелем на МЦ-100 без НМХ | |||||
** для времени полного заживления ран по сравнению с основой - гелем на МЦ-100 без НМХ |
Таблица 4 | |||||
Влияние растворов низкомолекулярных хитозанов с молекулярной массой 24 кДа с различной степенью деацетилирования в концентрациях 0.5 мг/мл и 2.0 мг/мл на изменение площади зоны задержки роста (мм2) культуры Staph. albus и E.coli AB1157 | |||||
Испытуемое вещество | Степень деацетилирования НМХ, % | Площадь зоны задержки роста (мм2) | |||
Staph. albus | E.coli AB1157 | ||||
Концентрация, % | |||||
0.5 | 2.0 | 0.5 | 2.0 | ||
НМХ | 85-89 | 152.7±8.7 | 171.5±5.0 | 45.7±6.1 | 57.7±13.5 |
НМХ | 80 | 92.3±12.8 | 142.2±22.0 | 25.9±0.7 | 38.7±3.7 |
НМХ | 73 | 51.4±14.5 | 91.2±19.3 | 16.5±5.8 | 23.0±5.7 |
Эталон-фталазол | 0 | 0 | |||
Эталон-левомицетина сукцинат | 241.0±20.0 | 577.3±46.5 | 388.1±47.6 | 528.6±39.8 |
Таблица 5 | ||||
Влияние растворов низкомолекулярного хитозана с молекулярной массой 72 кДа со степенью деацетилирования 85-89%, в концентрациях 0.02%, 0.2% и 2.0% на изменение площади зоны задержки роста (мм 2) культуры St.albus и E.coli AB1157 | ||||
Тест-культуры | НМХ СД=85-89%, молекулярная масса 72 кДа | Эталон (фталазол) | ||
Концентрация,% | ||||
0.02 | 0.2 | 2.0 | 0.2-2.0 | |
Площадь зоны задержки роста (мм2) | ||||
St.albus | 110.0±9.8 | 187.0±15.1 | 254.0±20.0 | 0 |
E.coli AB1157 | 32.0±4.5 | 54.0±6.1 | 95.0±12.8 | 0 |
Таблица 6 | |||
Влияние геля с низкомолекулярным хитозаном с молекулярной массой 56 кДа со степенью деацетилирования 85-89% в концентрациях 0.05% и 0.5% и эталонов сравнения - заводских мазей «Солкосерил» и «Левомеколь» на изменение площади зоны задержки роста (мм2) культуры St.albus и E.coli AB 1157 | |||
№ | Образцы | Площадь зоны лизиса, мм2 | |
Тест-культуры | |||
E.coli AB1157 | St.albus | ||
1. | 0.5% Мазь с НМХ | 359.0±35.0 | 409.0±60.0 |
2. | 0.05% Мазь с НМХ | 242.0±53.0 | 362.0±30.0 |
3. | Эталон сравнения-«Солкосерил» | 103.8±15.6 | 132.7±7.5 |
4. | Эталон сравнения-«Левомеколь» | 730.2±54.5 | 604.0±45.7 |
Класс A61K31/722 хитин; хитозан
Класс A61K47/10 спирты; фенолы; их соли
Класс A61P31/04 антибактериальные средства