состав препарата и способ его получения для лечения хронических вирусных гепатитов в или с и спида

Формула изобретения

1. Лиофилизированный препарат для лечения хронических вирусных гепатитов В или С и СПИДа, содержащий альфа фетопротеин (АФП) 60-150 мкг, интерферон 3000000-6000000 Ед и декстран 2-6 мг.

2. Препарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве декстрана используется реополиглюкин.

3. Способ получения препарата для лечения хронических вирусных гепатитов и СПИДа по п.1, отличающийся тем, что стабилизированный реополиглюкином АФП смешивают с интерфероном так, чтобы в 1 мл раствора содержалось 3-6 миллиона единиц интерферона, 60-150 мкг АФП и 2-6 мг декстрана, полученный состав подвергают стерилизующей фильтрации и производят розлив в стерильные флаконы или ампулы с последующей лиофильной сушкой.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что фильтрацию осуществляют через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической гепатологии, вирусологии, иммунологии и фармакологии, и может быть использовано для производства комбинированного лекарственного препарата на основе альфа-фетопротеина человеческого и интерферона и его использования для лечения хронических вирусных гепатитов В или С и СПИДа.

В настоящее время существуют способы этиотропного лечения хронических вирусных гепатитов В и С (ХВГВ и ХВГС), заключающиеся в назначении интерферонов, представляющих собой группу белков, вырабатываемых эукариотическими клетками в ответ на различные стимулы важных в подавлении вирусных инфекций. Механизм его действия интерферонов на ХВГ В и С заключается в ингибировании репликации и транскрипции вирусов, в результате снижается уровень РНК вирусов в сыворотке. Также усиливает активность естественных Т-киллеров, Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов, фагоцитарную активность, интенсивность дифференцировки В-лимфоцитов, экспрессию МНС I и II типа. В результате уровень виремии в сыворотке снижается [1, 2].

Однако известно, что интерферон в организме подвергается быстрому распаду и выводится из организма, таким образом эффективность терапии значительно уменьшается. Поэтому в последнее время для лечения ХВГ В используются пролонгированные (пегилированные) интерфероны (пегинтрон; пегасис), а в случае ХВГ С - в сочетании с рибовирином или его аналогами [3, 4].

В настоящее время разработано свыше 200 возможных комбинаций антиретровирусной терапии, но нет, ни одной, которая являлась бы наилучшей для всех больных. В схему лечение ВИЧ-инфекции с целью наибольшей эффективности включаются в максимальных дозах три антиретровирусных препарата. Наиболее эффективна комбинация - два нуклеозидных аналога-ингибитора обратной транскриптазы и один ингибитор протеазы. Основная проблема в лечении ВИЧ-инфекции заключается в низкой биодоступности препаратов и их выраженной токсичности. При этом препараты, применяемые при лечении ВИЧ-инфекции, дорогие и применяются в основном препараты зарубежного производства.

ХВГ В и С, а также ВИЧ - внутриклеточная инфекция. И основная проблема противовирусной терапии заключается в низкой биодоступности препаратов к вирусам внутри клетки. Они туда не проникают! Не срабатывают и вакцины, т.к. иммуноглобулины не могут проникнуть ни в гепатоцит, ни в лимфоцит. На мембранах клеток печени и лимфоцитов нет ни одного рецептора ни к одному из известных антиретровирусных препаратов. А проникновение в клетку всегда рецепторопосредованно.

Такие рецепторы есть к эмбриональному белку альфа фетопротеину (АФП) на мембранах и гепатоцитов и лимфоцитов [6].

АФП - представляет собой фетальный гликопротеин с молекулярной массой около 70000 Д. АФП в большом количестве продуцируются клетками печени плода. Он является белком альбуминоидного семейства с одинаковой молекулярной массой с альбумином и так же, как и альбумин, является транспортным белком для транспортировки биологических соединений в клетки. Но, в 15-40 раз превосходит в эффективности транспортные свойства альбумина. К тому же, если на мембранах гепатоцитов и лимфоцитов рецепторов к альбумину нет, то к АФП они есть [6]. Сырьем для получения АФП служит абортивная, пуповинная и плацентарная кровь, получаемая при медицинских абортах от клинически здоровых женщин, прошедших стандартное обследование.

Наиболее близким к заявляемому составу для лечения ХВГ В и С является препарат (Albuferon®), состоящий из связанных между собой альбумина человеческого и интерферона - [5].

Несмотря на увеличение срока активности интерферона при соединении его с альбумином человека, состав при его применении обладает следующими недостатками.

1. Сохраняется иммуногенность препарата, т.е. на интерферон и на альбумин в организме пациента нарабатываются нейтрализующие антитела, снижающие эффективность лечения и способствующие снижению переносимости.

2. Несмотря на транспортные свойства альбумина он не может проникнуть внутрь клетки и не может транспортировать интерферон, т.к. к нему нет рецепторов.

3. Сохраняются осложнения при проведении длительной интерферонотерапии (анемия, тромбоцитопения, лейкопения, депрессия и др.).

4. Длительное лечение 24-72 недели.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в улучшении результатов лечения за счет присоединения интерферона с АФП, уменьшения осложнений и сроков лечения.

Смешивая или химически сшивая АФП (препарат Профеталь®) с интерфероном, и подвергая полученную комбанацию последующему лиофильному высушиванию, и получаем, таким образом, ковалентный или нековалентный комплекс, который способен осуществить «адресную» внутриклеточную «доставку» (рецепторзависимый эндоцитоз) интерферона и усилить противовирусный эффект (чертеж).

Известно, что АФП обладает гепатопротекторным свойством благодаря мембраностабилизирующему эффекту за счет транспорта полиненасыщенных жирных кислот [6]. АФП является природным иммуносупрессором (на него практически не вырабатываются антитела) и блокирует образование нейтрализующих антител против интерферона [7].

Указанный технический результат достигается следующим образом. Производится выделение белка АФП из ретроплацентарной, пуповинной или абортной крови по одному из способов [8-14].

В полученный белок АФП добавляют стабилизатор декстран молекулярной массой 40000-80000 килодальтон и интерферон в следующих соотношениях.

1. АФП - от 40 мкг/мл до 100 мкг/мл.

2. Интерферон- - от 3000000 Ед/мл до 18000000 Ед/мл.

3. Декстран от 2 мг/мл до 6 мг/мл.

Полученный таким образом состав подвергают стерилизующей фильтрации, розливу в ампулы или флаконы и лиофилизируют (сушат).

После проверки качества препарата он назначается для лечения больным хроническими вирусными гепатитами и СПИДом. Препарат вводят подкожно или внутримышечно 1 раз в сутки в течение 30 дней в дозах АФП от 0,5 мкг/кг, интерферона от 10000 Ед/кг.

Примеры конкретного выполнения задачи.

Пример 1.

В 10 л ретроплацентарной крови человека добавляют хлороформ в количестве 100 мл на 10 л и апротинин в количестве 5 г. Отстаивают кровь в холодильнике при температуре 2-6°С в течение 24 часов. Центрифугируют при 6000 об/мин в течение 40 минут, декантация. Объем сыворотки после центрифугирования составил 7680 мл. Фильтрация через 3 слоя хлопчатобумажной ткани и мембранные фильтры 3,0-0,22 мкм. Добавляют к сыворотке раствор Тритона Х-100 до 0,01% насыщения.

Сорбент (сефароза FF) с ковалентно пришитыми антителами (15-30 мг/мл) против АФП человека, объемом 180 мл отмывают 5 объемами раствора 0,15 М натрия хлорида.

Перед нанесением сыворотки сорбент прошел обработку 1,5 М раствором магния хлорида: сорбент/MgCl₂=1:3, экспозиция в течение 30 минут (2 раза). Затем сорбент отмывают 0,15 М раствором натрия хлорида (10 объемов).

Сыворотку крупного рогатого скота нагревают до 37°С в термостате и соединяют с сорбентом. Блокировка длится в течение 30 минут при температуре 18-20°С (в соотношении 1:3). После этого сорбент отмывают 0,15 М раствором натрия хлорида (10 объемов).

Сорбция происходит при рН 9,0 в течение 60 минут при комнатной температуре и интенсивном перемешивании верхнеприводной мешалкой до полного истощения содержания АФП с последующим отстаиванием в течение 2 часов.

После отстаивания сыворотку декантируют и сорбент отмывают 1,0 М раствором магния хлорида на фильтре Шотта с экспозицией в течение 30 минут при перемешивании. Повторную неспецифическую элюцию проводят 2,0 М раствором магния хлорида в аналогичных условиях. Затем сорбент промывают 0,15 М раствором натрия хлорида (10 объемов).

Элюцию АФП проводят дважды (по 1,5 часа) при интенсивном перемешивании и комнатной температуре 2,8-4 М магния хлоридом с 0,5% Тритоном Х-100, доведенным 0,1 М Gly-HCl буфером до рН 2,0-3,0 при постоянном контроле рН. Соотношение элюента к объему сорбента составляет 1:1. Затем сорбент отмывают 0,15М раствором натрия хлорида до рН 7,0. Элюент нейтрализуют раствором натрия гидроксида до рН 6,8.

Концентрат АФП, имеющий общий объем не более 0,25 л, пропускают через подготовленную хроматографическую колонку с сорбентом Sephedex G-25 со скоростью 20,0 мл/мин.

В процессе хроматографии происходит замена буфера: элюирующего буфера на 0,02 М трис-соляная кислота, рН 6,3. При увеличении оптической плотности раствор на выходе из колонки собирается в стерильную емкость. Коллекцию препарата продолжают до тех пор, пока оптическая плотность не станет ниже 0,003 Au.

Ионообменная хроматография. Подготовку хроматографической колонки для ионообменной хроматографии проводят в асептических условиях. 60 мл сорбента, DEAE Sepharose, промывают не менее чем 1,2 л стерильного раствора трис-соляная кислота, рН 6,3 со скоростью 4,0 мл/мин через хроматограф. По окончании этого процесса проверяют рН раствора на выходе из колонки.

Концентрат АФП, имеющий общий объем не более 0,8 л, пропускают через подготовленную хроматографическую колонку со скоростью 4,0 мл/мин.

Перед нанесением на ионообменную колонку в растворе АФП проверяется рН, которая должна быть 6,3. При отклонении раствор дотитровывают соответствующим раствором (0,1 М NaOH или 0,1 М HCl).

Затем подключают стерильный раствор 0,02 М трис-соляная кислота, рН 6,3 и отмывают колонку до нулевой оптической плотности (не менее 2,0 л). Проводится контроль на отсутствие белка в отмывке от тритона после проведения процедуры.

Затем проводят градиентную элюцию АФП с ионообменной колонки стерильным раствором 0,02 М трис-соляная кислота на 0,5 М растворе натрия хлорида, рН 6,3, длина градиента - 400 мл, скорость - 4 мл/мин.

По увеличению оптической плотности белковый раствор на выходе из колонки собирается в стерильную емкость.

В полученном растворе АФП определяют концентрацию общего белка и содержание АФП. Чистота АФП определяется методом SDS электрофореза в полиакриламидном геле и должна быть не ниже 95%.

Для получения полупродукта используется 10% раствор реополиглюкина. При расчете объема реополиглюкина учитывается фактическое содержание АФП в очищенном концентрате. Рассчитанный объем, отмеренный с помощью цилиндра, добавляется в емкость с белком.

; ;

,

Vп/п - объем получаемого раствора полупродукта, мл;

Vp/г - объем реополиглюкина, мл;

m - общее содержание АФП в концентрате, мкг.

Общий объем субстанции должен составлять V_п/п

V_п/п=m/80.

В емкость с белком и рассчитанным объемом реополиглюкина добавляется раствор 0,15 М натрия хлорида:

V_NaCl=V_п/п-V_р/г-V _АФП.

Полученную субстанцию АФП тестируют на отсутствие антител к ВИЧ, вируса гепатита В и антител к вирусу гепатита С.

После проведенных технологических этапов АФП стабилизированный реополиглюкином смешивают с интерфероном так, чтобы в 1 мл раствора содержалось 3-6 миллиона единиц интерферена, 60-150 мкг АФП и 2-6 мг реополиглюкина.

Далее препарат АФП с интерфероном стабилизированный реополиглюкином подвергают стерилизующей фильтрации через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 микрона, производят розлив в стерильные флаконы или ампулы и подвергают лиофильной сушке.

Полученный таким образом препарат тестируют в соответствии с нормативно-технологической документацией в отделе контроля качества лекарственных средств. Лиофильно высушенный препарат АФП должен содержать 3-6 миллионов единиц интерферена, 60-150 мкг АФП и 2-6 мг реополиглюкина.

Пример 2.

Вирусный гепатит В

История болезни № 4735. Больная Ю., 25 лет находилась на стационарном лечении в отделении терапии НУЗ ОКБ ст. Пермь II г.Перми с 3.12.07 по 21.12.07.

Диагноз: Хронический вирусный гепатит В (HBsAg+), неактивный, фаза репликации, низкая вирусная нагрузка.

Жалобы при поступлении на периодическую тяжесть в правом подреберье, слабость, быструю утомляемость.

Анамнез заболевания: осенью 2006 г. на профосмотре обнаружен HBsAg. Направлена в гепатоцентр. Проводился 3-недельный курс реаферона, затем получала пегинтрон по общепринятой схеме. На фоне лечения наблюдалось увеличение копий вируса в 40 раз (410000 копий вируса/мл).

Клиническое наблюдение:

В стационаре назначена терапия интерферона - по 3000000 ME в сочетании с АФП по 0,075 мг в/м. Препараты интерферона и АФП, полученные по технологии, представленной в примере 1, вводились подкожно 1 раз в день. Больная получала лечение в течение 17 дней, ежедневно.

На 17 день терапии по данным ПЦР диагностики - DNA HBV не обнаружено.

Пример 3.

Вирусный гепатит С.

История болезни № 4658. Больной К. находился на лечении в отделении терапии НУЗ ОКБ ст.Пермь II с 27.11.07 по 29.12.07 с диагнозом: Основной: Хронический вирусный гепатит С, генотип 1b, фаза репликации, неактивный, синдром холестаза, умеренная вирусная нагрузка.

Сопутствующий: Язвенная болезнь ДПК, ремиссия.

При поступлении предъявлял жалобы на чувство тяжести в правом подреберье, возникающее периодически, чаще после нарушения диеты.

Анамнез заболевания: В детстве болел вирусным гепатитом А. В 1976 г. - больному проводилась гемотрансфузия (ампутация голени после автокатастрофы). В июне 2007 г. находился на санаторно-курортном лечении, при обследовании выявлена гипербилирубинемия до 85,0 ммоль/л, повышение активности трансаминаз до трех норм. Методом ПЦР выявлен вирусный гепатит С, генотип 1b, умеренная вирусная нагрузка - 4,2*10⁵/мл. Консультирован в гепатоцентре в ноябре 2007 г. Лечение не проводилось.

Клиническое наблюдение:

Назначен интерферон - 3000000 ME в сочетании с АФП 0,075 мг, препараты, полученные по технологии, представленной в примере 1, вводились подкожно 1 раз в день в течение 27 дней ежедневно в/м.

После проведенного курса терапии отмечалась положительная динамика: снижение уровня общего билирубина с 87,4 до 39,1 ммоль/л, значительно уменьшилась желтушность кожных покровов, вирусная нагрузка снизилась до нуля.

Пример 4.

Вирусный гепатит С.

История болезни № 1053. Пациент Г., 27 лет, находился на лечении в отделении терапии НУЗ ОКБ ст.Пермь II с 17.03.08 по 17.02.08 с диагнозом:

Основной: Хронический вирусный гепатит С, неактивный, генотип 3а, фаза репликации.

Сопутствующий: хронический гастрит, ремиссия.

При поступлении жалоб активно не предъявлял.

Анамнез заболевания: На очередном профосмотре в декабре 2007 г. методом ИФА выявлены антитела к вирусному гепатиту С.

Клиническое наблюдение: Общее состояние удовлетворительное. Объективный статус без особенностей. Вирусная нагрузка до лечения составляла 6,8*10⁶/мл.

Уровень трансаминаз в норме (ACT 26 ммоль/л, АЛТ 28 ммоль/л).

Назначен интерферон - в дозе 3000000 ME и АФП 0,075 мг, препараты, полученные по технологии, представленной в примере 1, вводились подкожно 1 раз в день в течение 30 дней ежедневно в/м.

В результате проведенного лечения при обследовании методом ПЦР RNA HCV не выявлено.

Уровень трансаминаз сохранялся в пределах нормы - ACT 21 ммоль/л, АЛТ 22 ммоль/л.

Пример 5.

Вирусный гепатит С.

История болезни № 1426. Пациент Д., 54 года, находился на лечении в отделении терапии «НУЗ ОКБ ст.Пермь-II ОАО РЖД» с 10.04.08 по 09.05.08 с диагнозом:

Основной: Хронический вирусный гепатит С, генотип 2а, неактивный, умеренная вирусная нагрузка.

Сопутствующий: Хронический пиелонефрит, неполная ремиссия. Хронический простатит.

При поступлении жалоб активно не предъявлял.

Анамнез заболевания: В ноябре 2007 г. на очередном профосмотре по месту работы методом ИФА выявлены антитела к вирусному гепатиту С.

Направлен для дообследования и проведения курса индивидуальной противовирусной терапии.

Клиническое наблюдение: Общее состояние удовлетворительное. Объективный статус без особенностей.

Вирусная нагрузка до лечения составляла 2,74* 10 ⁵/мл.

Трансаминазы в норме (ACT 26 ммоль/л, АЛТ 26 ммоль/л).

Назначен интерферон - в дозе 3000000 ME в сочетании с АФП в дозе 150 мкг, препараты, полученные по технологии, представленной в примере 1, вводились подкожно 1 раз в день препараты вводились в течение 30 дней ежедневно внутримышечно.

После проведенного курса терапии трансаминазы сохранялись в пределах нормы. RNA HCV методом ПЦР не обнаружено.

Пример 6.

Вирусный гепатит С.

История болезни № 1743. Пациент Л., 54 года, находился на лечении в отделении терапии «НУЗ ОКБ ст.Пермь-II ОАО РЖД» с 05.05.08 по 03.06.08 с диагнозом:

Основной: Хронический вирусный гепатит С, генотип 1b, фаза репликации, неактивный, низкая вирусная нагрузка.

При поступлении жалоб активно не предъявлял.

Анамнез заболевания: В сентябре 2007 г. на очередном профосмотре по месту работы методом ИФА выявлены антитела к вирусу гепатита С.

Направлен для дообследования и проведения курса индивидуальной противовирусной терапии.

Клиническое наблюдение: Общее состояние удовлетворительное. Объективный статус без особенностей. Вирусная нагрузка до лечения составила 1,3*10³/мл.

Трансаминазы в норме (ACT 25 ммоль/л, АЛТ 28 ммоль/л).

Назначен интерферон - в дозе 3000000 ME в сочетании с АФП в дозе 150 мкг, препараты, полученные по технологии, представленной в примере 1, вводились подкожно 1 раз в день в течение 30 дней ежедневно внутримышечно.

После проведенного курса терапии трансаминазы сохранялись в пределах нормы. RNA HCV методом ПЦР не обнаружено.

Пример 7.

Вирусный гепатит С.

История болезни № 2015. Пациент Т., 53 года, находился на лечении в отделении терапии «НУЗ ОКБ ст.Пермь-II ОАО РЖД» с 26.05.08 по 24.06.08 с диагнозом:

Основной: Хронический вирусный гепатит С, генотип 3а, фаза репликации, активный цитолиз, умеренная вирусная нагрузка.

При поступлении жалоб активно не предъявлял.

Анамнез заболевания: В марте 2007 г. на очередном профосмотре по месту работы методом ИФА выявлены антитела к вирусу гепатита С.

Направлен для дообследования и проведения курса индивидуальной противовирусной терапии.

Клиническое наблюдение: Общее состояние удовлетворительное. Объективный статус без особенностей. Вирусная нагрузка до лечения составила 1,89*10⁵/мл. АЛТ 169 ммоль/л, ACT 82 ммоль/л. Остальные биохимические показатели были в норме.

Назначен интерферон - а в дозе 3000000 ME в сочетании с АФП в дозе 150 мкг, препараты, полученные по технологии, представленной в примере 1, вводились подкожно 1 раз в день в течение 30 дней ежедневно внутримышечно.

После проведенного курса терапии RNA HCV методом ПЦР не обнаружено. Отмечено также значительное снижение уровня трансаминаз АЛТ 58 ммоль/л, ACT 34 ммоль/л.

Пример 8.

Вирусный гепатит С.

Пациент Р., 45 лет. Диагноз основной: Хронический вирусный гепатит С, средней степени активности, генотип 3а, фаза репликации. Заболевание профессиональное.

Сопутствующий: хронический гастродуоденит, обострение.

Жалобы на: общую слабость, снижение работоспособности, нарушение сна, изжогу, дискомфорт в эпигастральной области и правом подреберье.

Анамнез заболевания: Болен с 2002 г. Заболевание профессиональное. Врач-хирург во время проведения оперативного лечения пациента с вирусным гепатитом С травмировал кисть правой руки.

После дополнительного обследования были обнаружены антитела к ВГС. С 2002 г. неоднократно без эффекта проводил курсы противовирусной терапии препаратами -интерферона.

Клиническое наблюдение: Общее состояние удовлетворительное. Объективный статус без особенностей. Вирусная нагрузка до лечения составляла 5,9*10⁵ копий/мл, генотип 3а. Уровень трансаминаз: ACT 33 ммоль/л, АЛТ 73 ммоль/л.

Назначен интерферон - а в дозе 3000000 ME и АФП 0,075 мг, препараты, полученные по технологии, представленной в примере 1, вводились подкожно 1 раз в день в течение 30 дней ежедневно внутримышечно.

В результате проведенного лечения при обследовании методом ПЦР RNA HCV не выявлено. Уровень трансаминаз в пределах нормы - ACT 18 ммоль/л, АЛТ 22 ммоль/л. Также пациент отмечает повышение работоспособности, нормализацию сна, исчезновение дискомфорта в эпигастральной области и правом подреберье.

Вирусный гепатит С + ВИЧ инфекция.

Пример 9.

ВИЧ + вирусный гепатит С.

Пациент П., 27 лет, находился на амбулаторном лечении с 17.03.08 по 17.2.08 с диагнозом:

Основной: Хронический вирусный гепатит С, генотоп 3а, неактивный, ВИЧ.

Сопутствующий: хронический гастрит, ремиссия.

При поступлении жалоб активно не предъявлял.

Анамнез заболевания: На очередном профосмотре методом ИФА выявлены антитела к вирусному гепатиту С и ВИЧ.

Направлен для обследования и проведения курса индивидуальной противовирусной терапии.

Клиническое наблюдение:

Выявлена вирусная нагрузка гепатита С до лечения 6.8*10⁶/мл, генотип 3а и ВИЧ (240000 копий/мл).

Назначен интерферон - 3000000 ME и АФП 0,075 мг, препараты, полученные по технологии, представленной в примере 1, вводились подкожно 1 раз в день в течение 30 дней ежедневно вутримышечно.

После проведенного курса терапии RNA HCV и РНК вируса ВИЧ методом ПЦР не обнаружено.

Срок наблюдения за пациентом 12 месяцев с ежемесячным вирусологическим контролем. Вирусы гепатита С и ВИЧ отсутствуют.

Литература

1. Manns M.P. et al. Lancet, 2001; 358: 958-965.

2. Fried M.W. et al. N.Engl.J.Med., 2002; 347: 975-982.

3. Hadziyannis S.J. et al. Ann Intern Med., 2004; 140: 346-355.

4. Zeuzem S. et al. J.Hepatol. 2004; 40: 993-999.

5. Rustgi V. et al. J., EASL 2006. Hepatol., 2006, 44 (suppl. 2), A. 113.

6. Черешнев В.А., Родионов С.Ю., с соавт., Альфа-фетопротеин. Екатеринбург: УрО РАН, 2004. - 376 с.

7. Mizejewski G.J. Alpha-fetoprotein as a biologic response modifier: Relevance to domain and sub domain structure. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (N.Y.). - 1997. - Vol.215: P.333-362.

8. Патент РФ № 2100031 «Способ получения альфа-фетопротеина» по заявке № 95120418 от 01.12.1995.

9. Патент РФ № 2121350 «Способ получения препарата альфа-фетопротеина» по заявке № 96111118 от 03.06.1996.

10. Патент РФ № 2163139 «Способ получения препарата альфа-фетопротеина» по заявке № 2000104564 от 23.02.2000.

11. Патент РФ № 2169578 «Способ получения препарата альфа-фетопротеина» по заявке № 2000104565 от 23.02.2000.

12. Патент РФ № 2170586 «Способ получения препарата альфа-фетопротеина» по заявке № 2000104566 от 23.02.2000.

13. Патент РФ № 2283131 «Способ получения препарата альфа-фетопротеин сухой» по заявке № 2005109879 от 05.04.2005.

14. Патент РФ № 2308286 «Способ получения препарата альфа-фетопротеина» по заявке № 2006100948 от 10.01.2006.