питательная среда для микроразмножения лимонника китайского (schisandra chinensis (turcz.) baill.) в условиях in vitro

Формула изобретения

Питательная среда для клонального микроразмножения лимонника китайского (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.), содержащая аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, магний сернокислый, калий фосфорнокислый, кальций азотнокислый, железо сернокислое, этилендиаминотетраацетат натрия, марганец сернокислый, борную кислоту, цинк сернокислый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, калий йодистый, тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту, глицин, инозитол, гидролизат казеина, глюкозу, агар, 6-бензиламинопурин, индолилмасляную кислоту и воду при следующем соотношении компонентов, мг/л:

NH4NO3	400,0±12,0
KNO3	1800,0±54,0
MgSO4 ·H2O	360,0±10,8
KH2PO4	270,0±8,1
Ca(NO3)2·4H2O	1200,0±36,0
FeSO4·7H2O	27,8±0,83
Na2ЭДТА·2H2O	37,3±1,1
MnSO4·4H2O	1,0±0,03
Н3ВО3	6,2±0,19
ZnSO4·7H2O	8,6±0,26
Na2MoO4·2H2O	0,25±0,008
CuSO4·5H2O	0,025±0,001
CoCl2·6H2O	0,025±0,001
KI	0,08±0,002
Тиамин (B 1)	0,4±0,01
Пиридоксин (B 6)	0,5±0,02
Никотиновая кислота	0,5±0,02
Глицин	2,0±0,06
Инозитол	100,0±3,0
Гидролизат казеина	250,0±7,5
Глюкоза	15000,0±450,0
Агар	7000,0±210,0
6-БАП	1,0±0,03
ИМК	0,1±0,003
Вода	до 1 л
pH	5,5-5,8

Описание изобретения к патенту

Использование: биотехнология и сельское хозяйство.

Сущность изобретения: Питательная среда, содержащая (мг/л): аммоний азотнокислый 400,0±12,0; калий азотнокислый 1800,0±54,0; магний сернокислый 360,0±10,8; калий фосфорнокислый 270,0±8,1; кальций азотнокислый 1200,0±36,0; железо сернокислое 27,8±0,83; этилендиаминотетраацетат натрия 37,3±1,1; марганец сернокислый 1,0±0,03; борную кислоту 6,2±0,19; цинк сернокислый 8,6±0,26; натрий молибденовокислый 0,25±0,008; медь сернокислую 0,025±0,001; кобальт хлористый 0,025±0,001; калий йодистый 0,08±0,002; тиамин 0,4±0,01; пиридоксин 0,5±0,02; никотиновую кислоту 0,5±0,02; глицин 2,0±0,06; инозитол 100,0±3,0; гидролизат казеина 250,0±7,5; глюкозу 15000,0±450,0; агар 7000,0±210,0; 6-бензиламинопурин 1,0±0,03; индолилмасляную кислоту 0,1±0,003 и воду до 1 л. Заявляемое изобретение относится к биотехнологии растений и может быть использовано для мультипликации культур, трудно размножаемых вегетативным способом.

Лимонник китайский (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.) является ценным лекарственным растением, богатым биологически активными веществами и микроэлементами, и относится к трудно укореняемым культурам, вегетативное размножение которых методом зеленого черенкования затруднено и характеризуется низкой эффективностью. В настоящее время получены первые сорта этой нетрадиционной культуры, поэтому разработка результативных способов размножения, позволяющих сохранить сортовые признаки у вегетативного потомства, особенно актуальна.

Альтернативой зеленому черенкованию является метод клонального микроразмножения через культуру меристем, высокая эффективность которого уже доказана на примере многих сельскохозяйственных, декоративных и древесных растений. Однако до настоящего времени так и не определен состав питательной среды, обеспечивающей интенсивное формирование микропобегов лимонника из изолированных меристем. Этим объясняется то, что попытки культивировать лимонник in vitro так немногочисленны и пока что не принесли существенных положительных результатов.

Известна питательная среда, содержащая минеральную основу по Mura-shige-Skoog [1], зеатин 0,1 мг/л или 2-iP 1 мг/л и 1-3 мл/л настойки семян лимонника [3].

Также известна питательная среда, содержащая макроэлементы по Mura-shige-Skoog [1] и микроэлементы по Harada [4], мезоинозит 100 мг/л, никотиновую кислоту 0,5 мг/л, тиамин 0,5 мг/л, пиридоксин 0,5 мг/л, аскорбиновую кислоту 1 мг/л, гидролизат казеина 500 мг/л, сахарозу 30 г/л, агар 7 г/л, а также 2-iP 5 мг/л или 6-БАП 0,25-0,5 мг/л [5].

Общими недостатками этих сред являются практически полное отсутствие коэффициента размножения, некроз тканей и высокий уровень гибели эксплантов, достигающий 65-70%. В результате за весь период культивирования получены лишь единичные регенеранты, высота которых не превышала 8-10 мм.

Известна питательная среда по прописи Lloyd-McCown [6] содержащая 6-БАП 1 мг/л, сахарозу 30 г/л и агар 7 г/л [7].

Несмотря на высокий коэффициент размножения, данная среда эффективна только когда в качестве первичных эксплантов используют семена с зародышем, а не почки, что не позволяет сохранить у вегетативного потомства генетические признаки материнского растения, и следовательно, не пригодна для микроразмножения сортов и ценных генотипов лимонника.

Наиболее близкой по своей сущности к заявленному изобретению является питательная среда, включающая макроэлементы по Murashige-Skoog [1], микроэлементы по Harada [4], мезоинозит 100 мг/л, никотиновую кислоту 0,5 мг/л, тиа-мин 0,5 мг/л, пиридоксин 0,5 мг/л, аскорбиновую кислоту 1 мг/л, гидролизат казеина 500 мг/л, сахарозу 30 г/л, агар 7 г/л, а так же 6-БАП 1 мг/л, ИМК 0,3 мг/л [8].

Недостатками прототипа являются длительный лаг-период (в течение нескольких месяцев) на этапе введения в культуру и постепенная гибель меристем в процессе культивирования. Данная пропись питательной среды не позволяет в полной мере реализовать регенерационный потенциал лимонника и получать побеги длиной свыше 1,5 см, пригодные для укоренения in vitro.

Целью изобретения является повышение коэффициента размножения и увеличение длины формирующихся побегов лимонника китайского в культуре in vitro.

Цель достигается за счет того, что питательная среда содержит (мг/л): аммоний азотнокислый 400,0±12,0; калий азотнокислый 1800,0±54,0; магний сернокислый 360,0±10,8; калий фосфорнокислый 270,0±8,1; кальций азотнокислый 1200,0±36,0; железо сернокислое 27,8±0,83; этилендиаминотетраацетат натрия 37,3±1,1; марганец сернокислый 1,0±0,03; борную кислоту 6,2±0,19; цинк сернокислый 8,6±0,26; натрий молибденовокислый 0,25±0,008; медь сернокислую 0,025±0,001; кобальт хлористый 0,025±0,001; калий йодистый 0,08±0,002; тиамин 0,4±0,01; пиридоксин 0,5±0,02; никотиновую кислоту 0,5±0,02; глицин 2,0±0,06; инозитол 100,0±3,0; гидролизат казеина 250,0±7,5; глюкозу 15000,0±450,0; агар 7000,0±210,0; 6-бензиламинопурин 1,0±0,03; индолилмасляную кислоту 0,1±0,003 и воду до 1 л.

Пример 1. Экспланты лимонника, полученные из стерильных апикальных и латеральных почек, помещали на питательную среду, содержащую минеральную основу по Quoirin-Lepoivre в модификации Standardi-Catalano [2], витамины по Murashige-Skoog [1], регуляторы роста 6-БАП и ИМК, а также различные концентрации гидролизата казеина по вариантам.

Как следует из данных, представленных на фиг.1-2, гидролизат казеина в концентрации 250 мг/л значительно усиливал побегообразование лимонника in vitro. При этом микрочеренки в данном варианте опыта уже на 12 сутки культивирования и далее в течение пассажа превосходили контроль по величине коэффициента размножения. Различия существенны при пятипроцентном уровне значимости нулевой гипотезы ( =0,05).

Пример 2. Экспланты лимонника, полученные из стерильных апикальных и латеральных почек, в контроле помещали на среду по прописи Murashige-Skoog [1], в опыте - на питательную среду по Quoirin-Lepoivre в модификации Standardi-Catalano [2]. Среды включали одинаковый набор витаминов по Мурасиге-Скугу и регуляторов роста (6-БАП, ИМК). Каждый вариант дополнительно разбивали еще на два, содержащих 250 мг/л гидролизата казеина и без него (фиг.3). Экспланты, культивируемые на модифицированной среде QL, как с гидролизатом казеина так и без него существенно превосходили по коэффициенту размножения соответствующие контрольные варианты на среде Мурасиге-Скуга при пятипроцентном уровне значимости нулевой гипотезы ( =0,05), что подтверждает непригодность минеральной основы среды Мурасиге-Скуга для микроразмножения лимонника и демонстрирует явное преимущество предложенной модифицированной прописи перед существующими аналогами (фиг.4).

Пример 3. Экспланты лимонника, полученные из стерильных апикальных и латеральных почек, помещали на питательную среду заявленного состава, содержавшую 6-БАП, ИМК, гидролизат казеина 250 мг/л и различные типы и концентрации сахаров по вариантам (фиг.5). Замена в среде сахарозы на глюкозу в концентрации 15 г/л позволила существенно увеличить среднюю длину побега лимонника и получить в достаточном количестве побеги длиной свыше 1,5 см, пригодные для укоренения in vitro (фиг.6). Различия существенны при пятипроцентном уровне значимости нулевой гипотезы ( =0,05).

Представленные результаты исследований доказывают, что предлагаемая питательная среда для микроразмножения лимонника китайского впервые позволяет достигнуть коэффициента размножения, равного в среднем 2,2-2,4 новых побега на эксплант при средней длине побега 25,7 мм, используя в качестве эксплантов апикальные и латеральные почки, чего не удавалось добиться на известных средах-аналогах.

Источники информации

1. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - vol.5., № 95 - P.473-497.

2. Standardi A., Catalano F. Tissue culture propagation of kiwifruit // Comb. proc. Intern, plant propagators' soc. - 1984. - vol.34. - P.236-243.

3. Туть Е.А. Ускорение вегетативного размножения оздоровленного посадочного материала актинидии и лимонника. Автореф. дис. канд. с.-х. наук. - М., 2007. - 22 с.

4. Harada H. A new method for obtaining protoplasts from mesophyll cells // Z. Plantzenphysiol. - 1973. - vol.69. - № 1. - P.77-80.

5. Туть Е.А., Упадышев М.Т. Особенности микроразмножения актинидии и лимонника китайского // Сельскохозяйственная биология. - 2008. - № 3. - С.96-101.

6. Lloyd G., McCown В. Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture // Comb. Proc. Intl. Prop. Soc. - 1980. - vol. 30. - P.421-427.

7. Hong M.H., Kim O.T., Park J.I., Hwang B. Micropropagation of Schisandra chinensis Baillon using glucose from cotyledonary nodes // J. of Plant Biology. - 2004. - vol. 47, № 3. - P.270-274.

8. Упадышев М.Т., Туть Е.А. Особенности размножения актинидии и лимонника китайского in vitro и зелеными черенками // Плодоводство и ягодоводство в России: Сб. науч. работ. - М.: ВСТИСП, 2004. - T.XI. - С.200-209.