моющие средства со стабилизированными ферментными системами

Формула изобретения

1. Стабилизированная оксидазная композиция, содержащая указанную оксидазу, и стабилизатор, и по меньшей мере один субстрат указанной оксидазы, где указанный стабилизатор содержит по меньшей мере один ингибитор оксидазы, причем указанный стабилизатор выбирают из тиосульфата и 2-амино-2-метил-1-пропанола.

2. Композиция по п.1, где указанную оксидазу выбирают из глюкозооксидазы, сорбитоксидазы, холиноксидазы, гексозооксидазы и спиртовой оксидазы.

3. Композиция по п.1, где указанный субстрат выбирают из глюкозы, лактата, сорбита, холина, глицерина, этиленгликоля, пропиленгликоля и этанола.

4. Композиция по п.1, где указанный стабилизатор содержит по меньшей мере один сульфит.

5. Композиция по п.4, где указанный по меньшей мере один сульфит выбирают из гидросульфита натрия, метабисульфита натрия и/или бисульфита натрия.

6. Композиция по п.1, где указанная композиция представляет собой очищающую, отбеливающую или дезинфицирующую композицию.

7. Композиция по п.6, где указанное моющее средство представляет собой моющее средство для стирки или моющее средство для мытья посуды.

8. Композиция по п.7, где указанное моющее средство выбирают из порошкообразных, жидких и гелеобразных моющих средств.

9. Композиция по п.1, где указанная композиция представляет собой моющую (детергентную) добавку или продукт предварительной обработки.

10. Композиция по п.1, дополнительно содержащая активатор отбеливания или предшественник отбеливателя.

11. Композиция по п.10, где указанный активатор выбирают из предшественников перкислоты, комплексов металлов, пероксидазы и системы ацилтрансфераза/субстрат.

12. Композиция по п.1, дополнительно содержащая по меньшей мере один фермент, выбранный из протеаз, амилаз, пектиназ, пектатлиаз, липаз, маннаназ, целлюлаз, эстераз, кутиназ, оксидоредуктаз, гемицеллюлаз и карбогидраз.

13. Композиция по п.1, дополнительно содержащая по меньшей мере один вспомогательный ингредиент, выбранный из поверхностно-активных веществ, структурообразователей, отбеливающих средств, противомикробных средств, полимеров, растворителей, солей, буферных средств, хелатообразующих средств, средств, ингибирующих перенос красителя, добавок для осаждения, диспергирующих средств, ферментов, стабилизаторов ферментов, каталитических материалов, активаторов отбеливания, ускорителей отбеливания, предварительно полученных перкислот, полимерных диспергирующих средств, грязеудаляющих средств/средств против повторного осаждения, оптических отбеливателей, гасителей мыльной пены, красителей, отдушек, средств, придающих упругость структуре, мягчителей ткани, носителей, гидротропов, технологических добавок, пигментов и их смесей.

14. Способ образования отбеливающего продукта в моющем растворе, включающий стадию добавления указанной композиции по п.1 к указанному моющему раствору.

15. Способ по п.14, где указанный отбеливающий продукт представляет собой пероксид или отбеливающую систему, которую можно активировать с помощью пероксида.

Описание изобретения к патенту

По настоящей заявке испрашивается приоритет согласно находящейся на рассмотрении предварительной патентной заявке США с серийным номером 60/818824, поданной 6 июля 2006 г.

В настоящем изобретении предлагаются способы и композиции для стабилизации ферментов оксидаз во время хранения. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения оксидаза является компонентом жидких композиций, которые дополнительно содержат по меньшей мере один оксидазный субстрат. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения оксидаза является компонентом жидких моющих (детергентных) композиций. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения оксидазу стабилизируют путем добавления к жидкому моющему средству обратимого ингибитора оксидазы. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения оксидазу стабилизируют бисульфитом. В предпочтительных дополнительных вариантах осуществления изобретения применение обратимого ингибитора также предотвращает преждевременное образование пероксида во время хранения жидкого моющего средства. В дополнительных вариантах осуществления изобретения жидкие препараты моющего средства, состоящие из фермента оксидазы, ее субстрата и ее обратимого ингибитора, при разведении жидкого моющего средства в моющем растворе для стирки вырабатывают продукт с активным кислородом (пероксид).

Моющие средства для стирки и мытья посуды состоят из комплексных смесей, содержащих широкий спектр ингредиентов, которые обычно включают ряд компонентов, таких как ионогенные и неионогенные поверхностно-активные вещества, растворители, структурообразователи, отдушки, ферменты и отбеливающие компоненты. Для таких комплексных смесей хорошо известны проблемы, связанные со стабильностью при хранении, в частности со стабильностью ферментов. В некоторых случаях проблемы стабильности связаны с физической стабильностью моющего средства, в то время как в других случаях они связаны с функциональной стабильностью отдельных ингредиентов моющего средства. Ферменты, такие как оксидазы, в частности, подвержены ограничениям стабильности при хранении в жидком препарате моющего средства. Это препятствует их широкому применению в очищающих композициях, предназначенных для тканей и для домашнего пользования, для которых подразумевается отбеливающее действие. Сохранение ферментативной активности оксидазы в моющих средствах во время хранения является трудной задачей, особенно в моющих средствах, которые также содержат компоненты в виде оксидазного субстрата. Присутствие как оксидазы, так и оксидазного субстрата приводит к образованию пероксида водорода непосредственно in situ. Пероксид водорода приводит к уменьшению стабильности фермента вследствие окисления ферментов как в жидких, так и в сухих препаратах. Считается, что разрушение ферментов под действием пероксида осуществляется благодаря различным механизмам (например, окислению важнейших аминокислотных остатков в ферменте путем взаимодействия с кофакторами ферментов и т.д.). Однако считается, что настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным механизмом. Тем не менее, разрушение ферментов под действием пероксида часто приводит к постепенной потере активности. В сухих препаратах моющего средства ферменты можно стабилизировать (например, с помощью инкапсуляции ферментов, как описано в заявке WO 96/02623, включенной в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки).

В данной области известны различные отбеливатели для стирки и активаторы стирки (см., например, публикации Grime and Clauss, Chem. Indust., 20:647-649, 652-653 [1990]; Sheane and Wilkinson, Tinctoria 101:36-41 [2004]; и Broze, Handbook of Detergents, Warwick International, [1999]). Применяемые наиболее часто отбеливающие средства включают перборат натрия, перкарбонат натрия, персульфат натрия, перфосфат натрия, пероксид мочевины, персиликат натрия, их аммониевые, калиевые и литиевые аналоги; в моющих средствах, зубных пастах и других продуктах широко используются пероксид кальция, пероксид цинка, пероксид натрия, карбамидпероксид и другие, такие как гипохлорит натрия и оксид хлора. Окислительную способность таких пероксидов при низкой температуре можно улучшать путем добавления "активатора отбеливания". В данной области известно множество активаторов отбеливания, которые включают ацильные соединения, такие как тетраацетилэтилендиамин (TAED), сложноэфирные соединения, такие как нонаноилоксибензолсульфонат (NOBS) и изононаноилоксибензолсульфонат (ISONOBS), комплексы переходных металлов и другие соединения.

В такой отбеливающей системе при добавлении воды во время цикла стирки вырабатываются перкислоты (например, надуксусная кислота), пероксид водорода и/или другие родственные продукты. Перкислоты и другие продукты с активным кислородом, присутствующие в системе, затем действуют, чтобы отбеливать или осветлять некоторые пятна на ткани или посуде. Однако активаторы отбеливания нельзя добавлять в жидкие моющие средства с перкарбонатом, поскольку они будут взаимодействовать и образовывать перкислоты и/или другие активированные окисляющие средства. Поэтому существует потребность в системе, вырабатывающей H₂O₂, которая неактивна во время хранения, однако вырабатывает пероксид водорода во время цикла стирки.

Отбеливающие средства обычно не включаются в жидкие моющие средства вследствие плохой стабильности при хранении отбеливающих средств в моющих средствах, которые содержат значительные количества воды (например, более 1% воды). Присутствие отбеливающих средств также весьма негативно воздействует на стабильность при хранении ферментов, чувствительных к окислению, и других соединений, включенных в моющие средства. Поэтому существует потребность в жидких моющих средствах, которые обеспечивают выработку отбеливающих средств in situ при разведении моющего средства в моющем растворе.

Было описано несколько оксидаз (см., например, публикации: Beck et al., Bleach activators. Carbohydrates as Organic Raw Materials III, developed from a Workshop, Wageningen, Nov. 28-29, 1994, стр. 295-306 [1996]; Nakayama и Amachi, J. Mol. Catalysis B: Enzymatic 6: 185-198 [1999]; WO 06/008497; WO 05/124012; патент США № 6399329; WO 01/007555 и WO 03/36094). Однако важное ограничение для таких систем состоит в том, что когда оксидазы вместе с их субстратами хранятся в жидком моющем средстве, они вырабатывают пероксид водорода, который сам по себе может разрушать ферменты, а также может взаимодействовать с активаторами отбеливания, присутствующими в системе. Поэтому такие системы с оксидазным субстратом нестабильны. Фактически в данной области сохраняется потребность в средстве, обеспечивающем оксидазы, обратимо ингибируемые в присутствии субстратов во время хранения, которое будет вырабатывать отбеливающие средства in situ при разведении в моющем растворе. Кроме того, существует потребность в получении отбеливающих средств (например, продуктов с активным кислородом, пероксида и перкислот) при разведении моющего средства в моющем растворе для стирки с целью отбеливания и/или осветления пятен.

Как и в случае жидкостей, присутствие отбеливающих средств в порошкообразных моющих средствах часто оказывает сильно негативное влияние на стабильность ферментов, присутствующих в моющем средстве. Следовательно, предполагается большая осторожность в разделении молекул ферментов и отбеливающих средств в порошкообразном моющем средстве. Обычно этого достигают путем отдельного составления смеси для ферментов и отбеливающих средств. Например, в некоторых случаях ферменты получают в виде гранулятов, приготовленных таким образом, чтобы уменьшить проникновение продукта с активным кислородом в гранулы, содержащие фермент, во время хранения. Для таких порошкообразных детергентных (моющих) систем также может быть полезно применение обратимо ингибируемой системы фермента с оксидазным субстратом.

В настоящем изобретении предлагаются способы и композиции для стабилизации ферментов оксидаз во время хранения. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения оксидаза является компонентом жидких моющих композиций. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения оксидазу стабилизируют путем добавления к жидкому моющему средству обратимого ингибитора оксидазы. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения оксидазу стабилизируют бисульфитом. В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления изобретения применение обратимого ингибитора также предотвращает преждевременное образование пероксида во время хранения жидкого моющего средства. В дополнительных вариантах осуществления изобретения жидкие препараты моющего средства, содержащие фермент оксидазу, ее субстрат и ее обратимый ингибитор, при разведении жидкого моющего средства в моющем растворе для стирки вырабатывают продукт с активным кислородом (пероксид). В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются порошкообразные препараты моющего средства, содержащие по меньшей мере один фермент оксидазу, по меньшей мере один оксидазный субстрат и по меньшей мере один обратимый ингибитор. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения такие порошкообразные препараты моющего средства вырабатывают продукты с активным кислородом (пероксид) при разведении порошкообразного моющего средства в моющем растворе для стирки.

В настоящем изобретении предлагаются стабилизированные композиции оксидазы, содержащие по меньшей мере одну оксидазу и по меньшей мере один стабилизатор. В некоторых вариантах осуществления изобретения оксидаза выбрана из глюкозооксидазы, сорбитоксидазы, холиноксидазы, гексозооксидазы и спиртовой оксидазы. В некоторых альтернативных вариантах осуществления изобретения композиции дополнительно содержат по меньшей мере один субстрат по меньшей мере для одной оксидазы. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения субстрат выбирают из глюкозы, лактата, сорбита, холина, глицерина, этиленгликоля, пропиленгликоля и этанола. В некоторых альтернативных вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один стабилизатор содержит по меньшей мере один ингибитор оксидазы. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения стабилизатор содержит по меньшей мере один сульфит. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один сульфит выбирают из гидросульфита натрия, метабисульфита натрия и/или бисульфита натрия. В некоторых альтернативных предпочтительных вариантах осуществления изобретения стабилизатор выбирают из тиосульфата и 2-амино-2-метил-1-пропанола. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения композиция представляет собой очищающую, отбеливающую и/или дезинфицирующую композицию. При некоторых альтернативных предпочтительных вариантах осуществления изобретения моющее средство представляет собой моющее средство для стирки или моющее средство для посуды. В некоторых дополнительных вариантах осуществления изобретения моющее средство выбирают из порошкообразных, жидких и гелеобразных моющих средств. В некоторых еще одних дополнительных вариантах осуществления изобретения композиция представляет собой моющую (детергентную) добавку или продукт предварительной обработки. В еще некоторых дополнительных вариантах осуществления изобретения композиция дополнительно содержит активатор отбеливания или предшественник отбеливателя. В некоторых вариантах осуществления изобретения активатор отбеливания выбирают из предшественников перкислот, комплексов металлов, пероксидаз и системы ацилтрансфераза-субстрат. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения композиции дополнительно содержат по меньшей мере один фермент, выбранный из протеаз, амилаз, пектиназ, пектатлиаз, липаз, маннаназ, целлюлаз, эстераз, кутиназ, оксидоредуктаз, гемицеллюлаз и карбогидраз. В некоторых дополнительных вариантах осуществления изобретения композиции дополнительно содержат по меньшей мере один вспомогательный ингредиент, выбранный из поверхностно-активных веществ, структурообразователей, отбеливающих средств, противомикробных средств, полимеров, растворителей, солей, буферных средств, хелатообразующих средств, средств, ингибирующих перенос красителя, добавок для осаждения, диспергирующих средств, ферментов, стабилизаторов ферментов, каталитических материалов, активаторов отбеливания, ускорителей отбеливания, предварительно полученных перкислот, полимерных диспергирующих средств, грязеудаляющих средств/средств против повторного осаждения, оптических отбеливателей, гасителей мыльной пены, красителей, отдушек, средств, придающих упругость структуре, мягчителей ткани, носителей, гидротропов, технологических добавок, пигментов и их смесей.

В настоящем изобретении также предлагаются способы получения отбеливающего продукта в моющем растворе, включающие стадию добавления к моющему раствору по меньшей мере одной композиции по настоящему изобретению. В еще одних дополнительных вариантах осуществления изобретения отбеливающий продукт представляет собой пероксид или отбеливающую систему, которую можно активировать с помощью пероксида.

На фиг.1 представлен график, показывающий влияние бисульфита на стабильность и отбеливающие характеристики глюкозооксидазы.

На фиг.2 представлен график, показывающий влияние бисульфита на стабильность и отбеливающие характеристики глюкозооксидазы в испытаниях дисков, загрязненных черникой.

На фиг.3 представлен график, показывающий влияние бисульфита на стабильность и отбеливающие характеристики глюкозооксидазы при испытании образцов ткани с многочисленными загрязнениями в терготометре.

В настоящем изобретении предлагаются способы и композиции для стабилизации ферментов оксидаз во время хранения. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения оксидаза является компонентом жидких моющих композиций. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения оксидаза стабилизируется путем добавления к жидкому моющему средству обратимого ингибитора оксидазы. В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления изобретения применение обратимого ингибитора также предотвращает преждевременное образование пероксида во время хранения жидкого моющего средства. В дополнительных вариантах осуществления изобретения жидкие препараты моющего средства, содержащие фермент оксидазу, ее субстрат и ее обратимый ингибитор, при разведении жидкого моющего средства в моющем растворе для стирки вырабатывают продукт с активным кислородом (пероксид). В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения оксидаза стабилизируется бисульфитом. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются жидкие препараты моющего средства, содержащие по меньшей мере одну оксидазу, по меньшей мере один оксидазный субстрат и по меньшей мере один обратимый ингибитор. В особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения такие жидкие препараты моющего средства при разведении жидкого моющего средства в моющем растворе для стирки вырабатывают продукт с активным кислородом (например, пероксид).

Если не указано иное, осуществление настоящего изобретения на практике подразумевает применение традиционных методик, широко применяемых в молекулярной биологии, микробиологии, очистке белков, белковой инженерии, определении последовательностей белков и ДНК, областей рекомбинантной ДНК и промышленном применении и развитии ферментов, все из которых находятся в компетенции специалиста в данной области. Все патенты, патентные заявки, статьи и публикации, приведенные в данном описании как выше, так и ниже, тем самым в явной форме включены в данное описание посредством ссылки.

Кроме того, предусмотренные в данном описании рубрики не являются ограничениями различных аспектов или вариантов осуществления изобретения, которые можно получить посредством ссылки на описание изобретения в целом. Соответственно, термины, определенные непосредственно ниже, более полно определены посредством ссылки на описание изобретения во всей полноте. Тем не менее, для того чтобы облегчить понимание изобретения, ниже приведены определения ряда терминов.

Если не указано иное, все используемые в данном описании технические и научные термины имеют то же значение, которое широко понятно специалисту в данной области, к которой относится данное изобретение. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в данном описании, найдут применение при осуществлении настоящего изобретения на практике, в настоящем описании описаны предпочтительные способы и материалы. Соответственно, термины, определенные непосредственно ниже, более полно описаны посредством ссылки на описание изобретения во всей его полноте. Также применяемые формы единственного числа включают ссылку на множественное число, если в контексте ясно не указывается на другое. Если не указано иное, нуклеиновые кислоты записаны слева направо при ориентации от 5' к 3'; аминокислотные последовательности записаны слева направо при направлении от аминогруппы к карбоксигруппе, соответственно. Следует понимать, что данное изобретение не ограничивается конкретной методологией, протоколами и описанными реагентами, которые могут различаться в зависимости от контекста, при котором они используются специалистами в данной области.

Считается, что каждое из максимальных численных ограничений, приводимых на всем протяжении данного описания изобретения, включает любое численное ограничение более низкого порядка, как если бы такие численные ограничения более низкого порядка были описаны в данном описании в явно выраженной форме. Каждое из минимальных численных ограничений, приводимых на всем протяжении данного описания изобретения, будет включать любое численное ограничение более высокого порядка, как если бы такие численные ограничения более высокого порядка были описаны в данном описании в явно выраженной форме. Каждый численный диапазон, приведенный на всем протяжении данного описания изобретения, будет включать любой более узкий численный диапазон, который находится в пределах такого более широкого численного диапазона, как если бы все такие более узкие численные диапазоны были описаны в данном описании в явно выраженной форме.

Используемый в данном описании термин "оксидаза" относится к ферментам, которые катализируют реакцию окисления/восстановления, включая молекулярный кислород (O₂) в качестве акцептора электронов. В таких реакциях кислород восстанавливается до воды (H₂ O) или пероксида водорода (H₂O₂). Оксидазы представляют собой подкласс оксидоредуктаз.

Используемый в данном описании термин "глюкозооксидаза" ("Gox") относится к ферменту оксидазе (EC 1.1.3.4), которая катализирует окисление -D-глюкозы в D-глюконо-l,5-лактон, который затем гидролизуется до глюконовой кислоты с сопутствующим восстановлением молекулярного кислорода до пероксида водорода.

Используемый в данном описании термин "спиртовая оксидаза" ("Aox") относится к ферменту оксидазе (EC 1.1.3.13), которая превращает спирт в альдегид с сопутствующим восстановлением молекулярного кислорода до пероксида водорода.

Используемый в данном описании термин "холиноксидаза" ("Cox") относится к ферменту оксидазе (EC 1.1.3.17), которая катализирует окисление холина до глицинбетаина с переносом четырех электронов и с бетаиновым альдегидом в качестве промежуточного продукта и сопутствующим восстановлением двух молекул молекулярного кислорода до двух молекул пероксида водорода.

Используемый в данном описании термин "гексозооксидаза" ("Hox") относится к ферменту оксидазе (EC 1.1.3.5) для окисления моно- и дисахаридов до их соответствующих лактонов с сопутствующим восстановлением молекулярного кислорода до пероксида водорода. Гексозооксидаза способна окислять различные субстраты, включая D-глюкозу, D-галактозу, мальтозу, целлобиозу и лактозу, и т.д. Считается, что настоящее изобретение не ограничивается какой-либо конкретной гексозой.

Используемый в данном описании термин "глицериноксидаза" относится к ферменту оксидазе (EC 1.1.3.), которая катализирует окисление глицерина до глицеральдегида с сопутствующим восстановлением молекулярного кислорода до пероксида водорода.

Используемый в данном описании термин "сорбитоксидаза" относится к ферменту оксидазе полиолов (EC 1.1.3.), которая катализирует окисление субстрата (например, D-сорбита) до D-глюкозы с сопутствующим восстановлением молекулярного кислорода до пероксида водорода. Субстраты для сорбитоксидазы также включают различные полиолы (например, ксилит, арабит, маннит, рибит, глицерин, пропандиол и пропиленгликоль). Используемый в данном описании термин "полиол" относится к химическим соединениям, которые содержат множество гидроксильных групп.

В настоящем изобретении находят применение дополнительные оксидазы, включая, но не ограничиваясь ими, холестериноксидазу, пиранозооксидазу, карбоксиспиртовую оксидазу, L-аминокислотную оксидазу, глициноксидазу, пируватоксидазу, глутаматоксидазу, саркозиноксидазу, лизиноксидазу, лактатоксидазу, ваниллилоксидазу, гликолятоксидазу, галактозооксидазу, уриказу, оксалатоксидазу, ксантиноксидазу.

Используемый в данном описании термин "ингибиторы" относится к химическим соединениям, которые могут уменьшать или блокировать каталитическую активность фермента. В особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения ингибиторы уменьшают или блокируют каталитическую активность по меньшей мере одной оксидазы. Примеры ингибиторов оксидазы включают ацетат, соли серебра, ионы галогенида, вторичные и третичные спирты, изоцианат, изотиоцианат, аналоги глюкозы, бисульфит, сульфит, тиосульфат, метабисульфит, соли цинка, диэтилдикарбамат, метилметансульфонат, акрилонитрил, 2-амино-2-метил-1-пропанол.

Используемый в данном описании термин "обратимый ингибитор фермента" относится к молекулам, которые присоединяются к ферменту и уменьшают скорость реакции с его участием. В некоторых вариантах осуществления изобретения обратимые ингибиторы ферментов находятся под влиянием изменения концентрации ферментного субстрата в зависимости от ингибитора. В некоторых вариантах осуществления изобретения обратимые ингибиторы ферментов присоединяются к ферменту с помощью слабых связей, которые подобны связям, используемым для присоединения к субстрату. Таким образом, обратимый ингибитор блокирует фермент не навсегда, по мере удаления ингибитора фермент имеет возможность присоединяться к своему субстрату и обмениваться своим субстратом. В некоторых вариантах осуществления изобретения обратимые ингибиторы ферментов представляют собой конкурирующие ингибиторы, которые нековалентно взаимодействуют с ферментом, и/или конкурируют с субстратом за активный участок фермента, и/или имеют структуры, подобные субстрату, продуктам и/или переходному состоянию. В дополнительных вариантах осуществления изобретения обратимый ингибитор представляет собой неконкурирующий ингибитор фермента, который присоединяется на участке, присутствующем на ферменте и отличающемся от активного участка, и/или вызывает конформационные изменения фермента, которые уменьшают и/или блокируют каталитическую активность. Считается, что данный термин не ограничивается каким-либо конкретным механизмом или типом обратимого ингибитора фермента. Необходимым условием является только то, чтобы воздействия ингибитора фермента были обратимы, чтобы фермент функционировал при отсутствии ингибитора и/или при отсутствии воздействий ингибитора.

Используемый в данном описании термин "совместимые" означает, что материалы очищающих композиций не уменьшают ферментативную активность предлагаемого фермента(ов) оксидазы до такой степени, что оксидаза(ы) становится неэффективной, как желательно в ситуациях обычного применения. Материалы конкретной очищающей композиции подробно приводятся в качестве примера ниже.

Используемый в данном описании термин "эффективное количество фермента" относится к количеству фермента, необходимому для достижения ферментативной активности, предусмотренной при конкретном применении. Такие эффективные количества легко определяются специалистом в данной области и основаны на многих факторах, таких как конкретный вариант используемого фермента, применение очистки, конкретный состав очищающей композиции, требуется жидкая или сухая (например, гранулированная) композиция и т.п.

Используемая в данном описании фраза "стабильность моющего средства" относится к стабильности композиции моющего средства. В некоторых вариантах осуществления изобретения стабильность оценивается во время применения моющего средства, в то время как в других вариантах осуществления изобретения указанный термин относится к стабильности композиции моющего средства во время хранения.

Термин "улучшенная стабильность" используется для того, чтобы показать лучшую стабильность ферментов в композициях, содержащих субстрат. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения в моющих средствах с ингибиторами, предназначенных для стирки или ухода за посудой, ферменты обладают улучшенной стабильностью во время хранения по сравнению с соответствующими препаратами без ингибиторов ферментов. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения система фермент/субстрат в моющих средствах с ингибиторами, предназначенных для стирки или ухода за посудой, обладает улучшенной стабильностью во время хранения по сравнению с соответствующими препаратами без ингибиторов ферментов.

Используемый в данном описании термин "стабильность при окислении" относится к способности белков функционировать в окислительных условиях. В частности, термин относится к способности белков функционировать в присутствии различных концентраций H ₂O₂, перкислот и других окислителей. Стабильность при различных окислительных условиях можно измерить либо с помощью стандартных методик, известных специалистам в данной области, и/или с помощью описанных в данном описании способов. Значительное изменение стабильности при окислении подтверждается увеличением или уменьшением (в большинстве вариантов осуществления изобретения предпочтительным является увеличение) по меньшей мере приблизительно на 5% или более полупериода ферментативной активности по сравнению с ферментативной активностью, наблюдающейся при отсутствии окислительных соединений.

Используемый в данном описании термин "стабильность при изменении pH" относится к способности белков функционировать при конкретном pH. Как правило, большинство ферментов имеет ограниченный диапазон pH, в котором они будут функционировать. В дополнение к ферментам, которые функционируют в среднем диапазоне значений pH (то есть около pH 7), существуют ферменты, которые способны работать в условиях с очень высокими или очень низкими pH. Стабильность при различных pH можно измерить либо с помощью стандартных методик, известных специалистам в данной области, и/или с помощью описанных в данном описании способов. Значительное изменение стабильности при изменении pH подтверждается увеличением или уменьшением (в большинстве вариантов осуществления изобретения предпочтительным является увеличение) по меньшей мере приблизительно на 5% или более полупериода ферментативной активности по сравнению с ферментативной активностью при оптимальном для ферментов pH. Однако считается, что настоящее изобретение не ограничивается ни каким-либо уровнем стабильности при изменении pH, ни диапазоном pH.

Используемый в данном описании термин "термическая стабильность" относится к способности белков функционировать при конкретной температуре. Как правило, большинство ферментов имеет ограниченный диапазон температур, при которых они будут функционировать. В дополнение к ферментам, которые работают в умеренном диапазоне температур (например, при комнатной температуре), существуют ферменты, которые способны работать при очень высоких или очень низких температурах. Термическую стабильность можно измерить либо с помощью известных методик, либо с помощью описанных в данном описании способов. Значительное изменение термической стабильности подтверждается увеличением или уменьшением (в большинстве вариантов осуществления изобретения предпочтительным является увеличение) по меньшей мере приблизительно на 5% или более полупериода каталитической активности мутанта, когда он подвергается воздействию заданной температуры. Однако считается, что настоящее изобретение не ограничивается ни уровнем стабильности при какой-либо температуре, ни диапазоном температур.

Используемый в данном описании термин "химическая стабильность" относится к стабильности белков (например, фермента) по отношению к химическим веществам, которые могут оказывать отрицательное влияние на их активность. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие химические вещества включают, но не ограничиваются ими, пероксид водорода, перкислоты, анионогенные моющие средства, катионогенные моющие средства, неионогенные моющие средства, хелатирующие средства и т.д. Однако считается, что настоящее изобретение не ограничивается ни каким-либо конкретным уровнем химической стабильности, ни диапазоном химической стабильности.

Используемые в данном описании термины "очищенный" и "выделенный" относятся к удалению загрязнений из образца. Например, фермент, представляющий интерес, очищают путем удаления загрязняющих белков и других соединений, которые не являются ферментом, представляющим интерес, из раствора или при получении. В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные ферменты, представляющие интерес, экспрессируются в бактериальных или грибковых клетках хозяина, и такие рекомбинантные ферменты, представляющие интерес, очищают путем удаления других составляющих клеток хозяина; процент рекомбинантного фермента, представляющего интерес, среди полипептидов в образце при этом увеличивается.

Используемый в данном описании термин "белки, представляющие интерес" относится к белкам (например, ферменту или "ферменту, представляющему интерес"), которые подвергаются анализу, идентификации и/или модификации. В настоящем изобретении находят применение природные, а также рекомбинантные (например, мутантные) белки.

Используемый в данном описании термин "белковая" относится к любой композиции, содержащей аминокислоты и идентифицируемой специалистом в данной области как белковая. Термины "белок", "пептид" и полипептид применяются в данном описании взаимозаменяемо. Когда пептид является частью белка, специалисту в данной области применение данного термина будет понятно в контексте.

Используемые в данном описании термины "очищающие композиции" и "очищающие препараты" относятся к композициям, которые находят применение при удалении нежелательных соединений с изделий, подвергаемых очистке, таких как ткань, посуда, контактные линзы, другие твердые субстраты, при удалении нежелательных соединений с волос (шампуни), кожи (мыла и кремы), зубов (жидкости для полоскания полости рта, зубные пасты) и т.д. Термин охватывает любые материалы/соединения, выбранные для конкретного типа требуемой очищающей композиции, и форму продукта (например, жидкая, гелеобразная композиция, композиция в виде гранул или спрея) при условии, что композиция совместима с оксидазой и другим ферментом(ами), используемыми в композиции, и любыми обратимыми ингибиторами ферментов в композиции. Конкретный выбор материалов очищающей композиции легко осуществить с учетом поверхности, изделия или ткани, подвергаемой очистке, и требуемой формы композиции для применения в условиях очистки.

Кроме того, термины относятся к любой композиции, которая подходит для очистки, отбеливания, дезинфекции и/или стерилизации любого объекта и/или поверхности. Считается, что термины включают, но не ограничиваются ими, моющие композиции (например, жидкие и/или твердые моющие средства для стирки и моющие средства для тонких тканей; моющие препараты для твердых поверхностей, таких как стеклянные, деревянные, керамические и металлические столешницы и окна; чистящие средства для ковров; чистящие средства для духовых шкафов; освежители тканей; мягчители тканей и пятновыводители для предварительного выведения пятен при стирке и для текстильных изделий, а также моющие средства для посуды).

Более того, используемый в данном описании термин "очищающая композиция" включает, если не указано иное, моющие средства общего назначения в гранулированной или порошкообразной форме или моющие средства, предназначенные для интенсивного режима очистки, в частности очищающие моющие средства; моющие средства общего назначения в жидкой, гелеобразной или пастообразной форме, в частности так называемые типы жидкостей, предназначенные для интенсивного режима очистки (HDL); жидкие моющие средства для тонких тканей; средства для ручного мытья посуды или средства для облегченного мытья посуды, в частности средства, относящиеся к типу обильного пенообразования; средства для машинного мытья посуды, включая различные типы в виде таблеток, гранул, жидкостей и добавок для споласкивания, предназначенных для домашнего пользования и применения в учреждениях; жидкие очищающие и дезинфицирующие средства, включая антибактериальные типы для умывания, куски очищающего мыла, жидкости для полоскания полости рта, очищающие средства для зубных протезов, шампуни для автомобилей или ковров, чистящие средства для ванной комнаты; шампуни для волос и ополаскиватели для волос; гели для душа и пену для ванн, чистящие средства для металлов; а также очищающие вспомогательные средства, такие как отбеливающие добавки и средства типа "карандаша для удаления пятен" или предварительной обработки.

Термины "композиция моющего средства" и "препарат моющего средства" применяются в отношении смесей, которые предназначены для применения в моющей среде для очистки загрязненных объектов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения термин применяется в отношении стирки тканей и/или предметов одежды (например, "моющие средства для стирки"). В альтернативных вариантах осуществления изобретения термин относится к другим моющим средствам, таким как моющие средства, применяемые для очистки посуды, столовых приборов и т.д. (например, "моющие средства для мытья посуды"). Считается, что настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным препаратом моющего средства или композицией. Более того, считается, что кроме пергидролазы термин охватывает моющие средства, которые содержат поверхностно-активные вещества, трансферазу(ы), гидролитические ферменты, оксидоредуктазы, структурообразователи, отбеливающие средства, активаторы отбеливания, подсинивающие средства и флуоресцентные красители, ингибиторы комкования, маскирующие средства, активаторы ферментов, ингибиторы ферментов, антиокислители и солюбилизаторы. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения препараты моющего средства включают, но не ограничиваются ими, средства, опубликованные в патентных заявках США серийные № № 10/576331 и 10/581014, а также заявках WO 05/52161 и WO 05/056782, нашедших применение в настоящем изобретении. Однако считается, что настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным препаратом моющего средства(ми), поскольку в настоящем изобретении находит применение любой подходящий препарат моющего средства.

Используемый в данном описании термин "композиция для мытья посуды " относится ко всем формам композиций для очистки посуды, включая столовые приборы, включая, но не ограничиваясь ими, гранулированные и жидкие формы. Считается, что настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным типом или композицией для посуды. Более того, настоящее изобретение находит применение при очистке посуды (например, посуды, включающей, но не ограничивающейся ими, тарелки, чашки, стаканы, миски и т.д.) и столовых приборов (например, приборов, включающих, но не ограничивающихся ими, ложки, ножи, вилки, приборы для сервировки и т.д.) из любого материала, включая, но не ограничиваясь ими, керамики, пластики, металлы, фарфор, стекло, акриловые материалы и т.д. Термин "посуда" применяется в отношении как посуды, так и столовых приборов.

Используемый в данном описании термин "моющие характеристики" фермента относится к вкладу фермента в мытье, который обеспечивает моющему средству дополнительные очищающие характеристики по сравнению с моющим средством без добавления фермента к композиции. Моющие характеристики сравнивают в соответствующих условиях мытья.

Термин "соответствующие условия мытья" используется в данном описании для того, чтобы указать условия, в частности температуру мытья, время, моющие механизмы, концентрацию мыльных растворов, тип моющего средства и жесткость воды, фактически применяемые в сегменте рынка моющих средств, предназначенных для домашнего пользования.

Термин "улучшенные моющие характеристики" применяется для того, чтобы указать, что при удалении пятен с изделий (например, тканей или посуды и/или столовых приборов), отмываемых в соответствующих условиях мытья, получается лучший конечный результат или требуется меньшее количество фермента, в расчете на массу, для получения такого же конечного результата по сравнению с другим ферментом.

Термин "не меняющиеся моющие характеристики" применяется для того, чтобы указать, что моющие характеристики фермента, в расчете на массу, составляют по меньшей мере 80% по отношению к другому ферменту в соответствующих условиях мытья.

Моющие характеристики ферментов обычно измеряют по их способности удалять определенные конкретные пятна в соответствующих условиях испытания. В таких испытательных системах можно регулировать другие соответствующие факторы, такие как состав композиции моющего средства, концентрация мыльного раствора, жесткость воды, моющие механизмы, время, pH и/или температура, таким образом, чтобы имитировать условия, типичные для домашнего применения в определенном сегменте рынка.

Используемый в данном описании термин "дезинфицирующая" относится к удалению загрязнений с поверхностей, а также к ингибированию или уничтожению микробов на поверхностях изделий. Считается, что настоящее изобретение не ограничивается какой-либо конкретной поверхностью, изделием, или загрязнением(ями), или микробами, подлежащими удалению.

Очищающие и моющие препараты

Моющие композиции по настоящему изобретению предлагаются в любой подходящей форме, включая, например, но не ограничиваясь ими, жидкости, гранулы, эмульсии, гели и пасты. Когда используют твердую композицию моющего средства, моющее средство предпочтительно получают в виде гранул. Гранулы предпочтительно получают с дополнительным содержанием защитного средства (см., например, патентную заявку США, серийный № 07/642669, поданную 17 января 1991, включенную в данное описание посредством ссылки). Аналогично, в некоторых вариантах осуществления изобретения гранулы получают таким образом, чтобы они содержали материалы, предназначенные для уменьшения скорости растворения гранулы в моющей среде (см., например, патент США № 5254283, включенный в данное описание во всей полноте посредством ссылки). Кроме того, ферменты по настоящему изобретению находят применение в препаратах, в которых субстрат и фермент находятся в одной и той же грануле. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения эффективность фермента, присутствующего в препарате, увеличивается благодаря обеспечению высоких локальных концентраций фермента и субстрата (см., например, публикацию патентной заявки США US2003/0191033, включенную в данное описание посредством ссылки). В настоящем изобретении находит применение любой подходящий препарат и/или система препаратов (см., например, патент США № 5204015, включенный в данное описание посредством ссылки). Специалистам в данной области хорошо известны другие препараты, которые находят применение в качестве очищающих композиций.

Кроме того, белки, в частности стабилизированные оксидазы по настоящему изобретению, можно включать в рецептуру известных порошкообразных и жидких моющих средств, имеющих pH от 3 до 12,0, при содержании от приблизительно 0,001 до приблизительно 5% (предпочтительно от 0,1 до 0,5%) по массе.

Предполагается, что стабилизированные оксидазы по настоящему изобретению найдут применение в любой подходящей очищающей композиции, включая, но не ограничиваясь ими, применения в кусковом и жидком мыле, препараты для ухода за посудой, применения для очистки поверхностей, очищающие растворы или продукты для контактных линз, обработку отходов, применения для текстиля, для отбеливания пульпы, в дезинфицирующих веществах, для ухода за кожей, ухода за полостью рта, ухода за волосами и т.д.

Несмотря на то что это не является обязательным с точки зрения целей настоящего изобретения, в дальнейшем проиллюстрирован неограничивающий перечень вспомогательных материалов, подходящих для применения в растворимых очищающих композициях и находящих применение в определенных вариантах осуществления изобретения, например, для поддержки или усиления очищающих характеристик, для обработки субстрата, подлежащего очистке, или для модификации эстетических свойств очищающей композиции, как в случае отдушек, пигментов, красителей или т.п. Понятно, что такие вспомогательные материалы применяются в дополнение к стабилизированным ферментам по настоящему изобретению. Точная природа таких дополнительных компонентов и уровни их включения зависят от физической формы композиции и природы операции очистки, для которой она должна применяться. Подходящие вспомогательные материалы включают, но не ограничиваются ими, поверхностно-активные вещества, структурообразователи, хелатообразующие средства, средства, ингибирующие перенос красителя, осаждающие добавки, диспергирующие средства, дополнительные ферменты и стабилизаторы ферментов, каталитические материалы, активаторы отбеливания, ускорители отбеливания, предварительно полученные перкислоты, полимерные диспергирующие средства, грязеудаляющие средства/средства против повторного осаждения, оптические отбеливатели, гасители мыльной пены, красители, отдушки, средства, придающие упругость структуре, мягчители тканей, носители, гидротропы, технологические добавки и/или пигменты (см., например, патенты США № № 5576282, 6306812 и 6326348, включенные в данное описание посредством ссылки). Приведенные выше вспомогательные ингредиенты могут составлять баланс очищающих композиций по настоящему изобретению.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения в моющих композициях по настоящему изобретению используют поверхностно-активное средство (то есть поверхностно-активное вещество), включая анионогенные, неионогенные и амфолитные поверхностно-активные вещества, применение которых в моющих композициях хорошо известно. Некоторые поверхностно-активные вещества, подходящие для применения в настоящем изобретении, описаны в британской патентной заявке № 2094826 A, включенной в данное описание посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения применяются смеси поверхностно-активных веществ. Например, ряд известных соединений представляет собой подходящие поверхностно-активные вещества, применимые в композициях, содержащих мутантные белки по изобретению. Они включают неионогенные, анионогенные, катионогенные, анионогенные или цвиттерионные моющие средства (см., например, патенты США № № 4404128 и 4261868).

Анионогенные поверхностно-активные вещества, подходящие для применения в композиции моющего средства по настоящему изобретению, включают алкилбензолсульфонаты с линейной или разветвленной цепью; сульфаты простых алкиловых или алкениловых эфиров, содержащих алкильные группы или алкенильные группы с линейной или разветвленной цепью; алкилсульфаты или алкенилсульфаты; олефинсульфонаты; алкансульфонаты и т.п. Подходящие противоионы для анионогенных поверхностно-активных веществ включают ионы щелочных металлов, таких как натрий и калий; ионы щелочноземельных металлов, таких как кальций и магний; ион аммония; алканоламины, содержащие от 1 до 3 алканольных групп с числом атомов углерода 2 или 3.

Амфолитные поверхностно-активные вещества, которые находят применение в настоящем изобретении, включают сульфонатные четвертичные соли аммония, амфолитные поверхностно-активные вещества типа бетаина и т.п. Такие амфолитные поверхностно-активные вещества имеют как положительно, так и отрицательно заряженные группы в одной и той же молекуле.

Неионогенные поверхностно-активные вещества, которые находят применение в настоящем изобретении, обычно содержат простые полиоксиалкиленовые эфиры, а также алканоламиды высших жирных кислот или их аддукты с алкиленоксидом, сложные глицериновые моноэфиры жирных кислот и т.п.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения поверхностно-активное вещество или смесь поверхностно-активных веществ, включенная в моющие композиции по настоящему изобретению, используют в количестве приблизительно от 1 мас.% до приблизительно 95 мас.% от общей массы композиции моющего средства и предпочтительно приблизительно от 5 мас.% до приблизительно 45 мас.% от общей массы композиции моющего средства. В различных вариантах осуществления изобретения в композиции по настоящему изобретению включены многочисленные другие компоненты. Считается, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными, приведенными выше примерами. Более того, считается, что в настоящем изобретении найдут применение дополнительные соединения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагаемые очищающие композиции содержат по меньшей мере одно хелатообразующее средство. Подходящие хелатообразующие средства включают, но не ограничиваются ими, хелатообразующие средства для меди, железа и/или марганца и их смеси. Если применяется хелатообразующее средство, очищающая композиция обычно содержит от приблизительно 0,1 до приблизительно 15% или даже от приблизительно 3,0 до приблизительно 10% хелатообразующего средства в расчете на массу испытуемой очищающей композиции.

В некоторых вариантах осуществления изобретения очищающие композиции по настоящему изобретению содержат добавку для осаждения. Подходящие добавки для осаждения включают, но не ограничиваются ими, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, поликарбоксилат, грязеотталкивающие полимеры, такие как политерефталевая кислота, глины, такие как каолинит, монтмориллонит, атапульгит, иллит, бентонит, галлоизит и их смеси.

В некоторых дополнительных вариантах осуществления изобретения очищающие композиции по настоящему изобретению также могут включать одно или несколько средств, ингибирующих перенос красителя. Подходящие полимерные средства, ингибирующие перенос красителя, включают, но не ограничиваются ими, поливинилпирролидоновые полимеры, полиамин-N-оксидные полимеры, сополимеры N-винилпирролидона и N-винилимидазола, поливинилоксазолидоны и поливинилимидазолы или их смеси. Если в испытуемой очищающей композиции присутствуют средства, ингибирующие перенос красителя, они обычно присутствуют в количестве от приблизительно 0,0001 до приблизительно 10%, от приблизительно 0,01 до приблизительно 5% или даже от приблизительно 0,1 до приблизительно 3% по массе в расчете на массу очищающей композиции.

В некоторых дополнительных вариантах осуществления изобретения очищающие композиции по настоящему изобретению также содержат диспергирующие средства. Подходящие водорастворимые органические материалы включают гомо- или сополимерные кислоты или их соли, в которых поликарбоновая кислота содержит по меньшей мере два карбоксильных радикала, отделенных друг от друга с помощью не более двух атомов углерода.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные моющие очищающие композиции дополнительно включают другие ферменты, которые обычно обеспечивают очищающие характеристики и/или гарантии ухода за тканью. Примеры подходящих ферментов включают, но не ограничиваются ими, гемицеллюлазы, пероксидазы, протеазы, целлюлазы, ксиланазы, липазы, фосфолипазы, эстеразы, кутиназы, пектиназы, пектатлиазы, кератиназы, редуктазы, оксидазы, оксидоредуктазы, фенолоксидазы, липоксигеназы, лигниназы, маннаназы, пуллуланазы, танназы, пентозаназы, пероксидазы, маланазы, -глюканазы, арабинозидазы, гиалуронидазу, хондроитиназу, лакказу, эндоглюкозидазы и амилазы или их смеси. Типичная комбинация представляет собой смесь из традиционно применяемых ферментов типа протеазы, липазы, кутиназы и/или целлюлазы совместно с амилазой.

Добавление белков к традиционным очищающим композициям не создает каких-либо особых ограничений для применения. Другими словами, любая температура и pH, подходящие для моющего средства, также подходят для настоящих композиций при условии, что pH находится в диапазоне, в котором фермент(ы) является активным, и температура ниже температуры денатурирования описанных белков. Кроме того, белки по изобретению находят применение в очищающих, отбеливающих и дезинфицирующих композициях без моющих средств, на этот раз либо в чистом виде, либо в комбинации с источником пероксида водорода, сложноэфирным субстратом (например, либо добавленным, либо свойственным применяемой системе, такой как система с пятнами, которые содержат сложные эфиры, пульпу, которая содержит сложные эфиры, и т.д.), другими ферментами, поверхностно-активными веществами, структурообразователями, стабилизаторами и т.д. Более того, считается, что настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным препаратом или применением.

В некоторых дополнительных вариантах осуществления изобретения очищающие композиции по настоящему изобретению включают каталитические комплексы металлов. Один из типов металлсодержащего катализатора отбеливания представляет собой каталитическую систему, содержащую катион переходного металла, определяющего каталитическую активность отбеливателя, такой как катионы меди, железа, титана, рутения, вольфрама, молибдена или марганца; дополнительный катион металла с меньшей каталитической активностью отбеливателя или без каталитической активности отбеливателя, такой как катионы цинка или алюминия, и комплексообразователь с определенными константами стабильности для катионов каталитических металлов и дополнительных металлов, в частности этилендиаминтетрауксусная кислота, этилендиаминтетра(метиленфосфоновая кислота) и их водорастворимые соли. Такие катализаторы описаны в патенте США № 4430243, включенном в данное описание посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления изобретения для катализа в применяемых композициях используется соединение марганца. Такие соединения и уровни их применения хорошо известны в данной области (см., например, патент США № 5576282). В некоторых альтернативных вариантах осуществления изобретения известны применимые в данном изобретении кобальтовые катализаторы отбеливания (см., например, патенты США № № 5597936, 5595967, 5597936 и 5595967).

В некоторых вариантах осуществления изобретения очищающие композиции дополнительно содержат комплекс переходных металлов с макрополициклическим жестким лигандом ("MRL"). На практике и без какого-либо ограничения композиции и очищающие процессы по настоящему изобретению можно регулировать, чтобы обеспечить содержание активного продукта MRL в водной моющей среде порядка по меньшей мере одной части на сто миллионов, и предпочтительно будет обеспечено содержание MRL в моющем растворе приблизительно от 0,005 ч./млн до приблизительно 25 ч./млн, более предпочтительно приблизительно от 0,05 ч./млн до приблизительно 10 ч./млн, и наиболее предпочтительно приблизительно от 0,1 ч./млн до приблизительно 5 ч./млн Предпочтительные переходные металлы в растворимом катализаторе отбеливания на основе переходных металлов включают марганец, железо и хром. Предпочтительными MRL являются особые типы сверхжесткого лиганда, который является поперечно-мостиковым, такие как 5,12-диэтил-1,5,8,12-тетраазабицикло[6.6.2]гексадекан. Подходящие MRL для переходных металлов легко получают с помощью известных в данной области способов (см., например, заявку WO 00/332601 и патент США № 6225464).

В некоторых вариантах осуществления изобретения очищающие композиции по настоящему изобретению содержат один или несколько детергентных структурообразователей или систем структурообразователей. Когда применяется структурообразователь, испытуемая очищающая композиция обычно содержит по меньшей мере приблизительно 1%, приблизительно от 3% до приблизительно 60% или даже приблизительно от 5% до приблизительно 40% структурообразователя в расчете на массу испытуемой очищающей композиции. Структурообразователи включают, но не ограничиваются ими, соли полифосфатов щелочных металлов, аммония и алканоламмония, силикаты щелочных металлов, карбонаты щелочноземельных и щелочных металлов, поликарбоксилатные соединения алюмосиликатных структурообразователей, гидроксиполикарбоксилаты простых эфиров, сополимеры малеинового ангидрида с этиленом или простым винилметиловым эфиром, 1,3,5-тригидроксибензол-2,4,6-трисульфоноваую кислоту и карбоксиметилоксиянтарную кислоту, соли различных щелочных металлов, аммония и замещенного аммония и полиуксусных кислот, таких как этилендиаминтетрауксусная кислота и нитрилотриуксусная кислота, а также поликарбоксилаты, такие как меллитовая кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, оксидиянтарная кислота, полималеиновая кислота, бензол-1,3,5-трикарбоновая кислота, карбоксиметилоксиянтарная кислота и их растворимые соли.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиция содержит приблизительно от 0 до приблизительно 50 мас.% одного или нескольких структурообразующих компонентов, выбранных из группы, состоящей из солей щелочных металлов и алканоламиновых солей следующих соединений: фосфатов, фосфонатов, фосфонокарбоксилатов, солей аминокислот, электролитов в виде высокомолекулярных аминополиацетатов, недиссоциирующих полимеров, солей дикарбоновых кислот и алюмосиликатных солей. Примеры подходящих двухвалентных соединений, связывающих ион металла в хелатный комплекс, описаны в британской заявке на патент № 2094826 A, описание которой включено в данное описание посредством ссылки.

В дополнительных вариантах осуществления изобретения композиции по настоящему изобретению содержат в качестве щелочей или неорганических электролитов приблизительно от 1 до приблизительно 50 мас.%, предпочтительно приблизительно от 5 до приблизительно 30 мас.%, в расчете на массу композиции, одной или нескольких солей щелочных металлов следующих соединений: силикатов, карбонатов и сульфатов, а также органических щелочей, таких как триэтаноламин, диэтаноламин, моноэтаноламин и триизопропаноламин.

В еще одних дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения композиции содержат в качестве средств против повторного осаждения приблизительно от 0,1 до приблизительно 5 мас.% одного или нескольких из следующих соединений: полиэтиленгликоль, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон и карбоксиметилцеллюлоза. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения применяется объединение карбоксиметилцеллюлозы и/или полиэтиленгликоля с композицией по настоящему изобретению в качестве полезных грязеудаляющих композиций.

В некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения отбеливающее средство(а), такое как перкарбонат натрия, перборат натрия, аддукт сульфата натрия/пероксида водорода и аддукт хлорида натрия/пероксида водорода и/или фоточувствительный отбеливающий краситель, такой как цинковая или алюминиевая соль сульфированного фталоцианина, дополнительно увеличивает моющие (детергентные) воздействия очищающих/отбеливающих композиций по настоящему изобретению. В дополнительных вариантах осуществления изобретения находят применение ускорители отбеливания (например, TAED и/или NOBS).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в композицию включены подсинивающие средства и/или флуоресцентные красители. Примеры подходящих подсинивающих средств и флуоресцентных красителей описаны в британской патентной заявке № 2094826 A, описание которой включено в данное описание посредством ссылки.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, в которых композиция является порошкообразной или твердой, в композицию включены ингибиторы комкования. Примеры подходящих ингибиторов комкования включают соли п-толуолсульфоновой кислоты, соли ксилолсульфоновой кислоты, соли уксусной кислоты, соли сульфоянтарной кислоты, тальк, мелко распыленный диоксид кремния, глину, силикат кальция (например, Mikro-Cell от компании Johns Manville Co.), карбонат кальция и оксид магния.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении находят применение антиокислители, включая, но не ограничиваясь ими, трет-бутилгидрокситолуол, 4,4'-бутилиденбис(6-трет -бутил-3-метилфенол), 2,2'-бутилиденбис(6-трет-бутил-4-метилфенол), моностиролсодержащий крезол, дистиролсодержащий крезол, моностиролсодержащий фенол, дистиролсодержащий и 1,1-бис-(4-гидроксифенил)циклогексан.

В еще одних дополнительных вариантах осуществления изобретения композиции по настоящему изобретению также включают солюбилизаторы, включая, но не ограничиваясь ими, низшие спирты (например, этанол, соли бензолсульфонатов и соли низших алкилбензолсульфонатов, такие как соли п-толуолсульфоната), гликоли, такие как пропиленгликоль, соли ацетилбензолсульфоната, ацетамиды, амиды пиридиндикарбоновой кислоты, соли бензоатов и мочевину.

В некоторых вариантах осуществления изобретения моющие композиции по настоящему изобретению применяются в широком диапазоне pH, от кислотного до щелочного pH. В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция моющего средства по настоящему изобретению применяется в умеренно кислотной, нейтральной или щелочной моющей среде с моющим средством, имеющим pH от более 4 до приблизительно не более 12.

В дополнение к описанным выше ингредиентам в настоящем изобретении также находят применение отдушки, буферы, консерванты, красители и т.п. Такие компоненты применяются в концентрациях и формах, известных специалистам в данной области.

В некоторых вариантах осуществления изобретения основы порошкообразных моющих средств по настоящему изобретению получают любыми известными способами получения, включая способ распылительной сушки и/или способ грануляции. В частности, основа моющего средства, полученная способом распылительной сушки и/или способом грануляции с распылительной сушкой, является предпочтительной. Основа моющего средства, полученная способом распылительной сушки, не ограничивается относительно условий получения. Основа моющего средства, полученная способом распылительной сушки, представляет собой пустотелые гранулы, которые получают распылением в горячем пространстве водной суспензии термостойких ингредиентов, таких как поверхностно-активные средства и структурообразователи. После распылительной сушки можно добавлять отдушки, ферменты, отбеливающие средства, неорганические щелочные структурообразователи. При использовании очень плотной, гранулированной основы моющего средства, полученной таким способом, как способ грануляции с распылительной сушкой, различные ингредиенты также можно добавлять после получения основы.

Когда основа моющего средства является жидкой, в некоторых вариантах осуществления изобретения она представляет собой гомогенный раствор, в то время как в некоторых альтернативных вариантах осуществления изобретения она представляет собой негомогенную дисперсию.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения моющие композиции по настоящему изобретению выдерживают с тканью (например, с загрязненными тканями), при промышленном применении и при применении для домашнего пользования, при температурах, времени реакции и модулях ванны, традиционно применяемых в данных окружающих условиях. Специалисты в данной области легко определят условия выдерживания (то есть условия, эффективные для обработки материалов с помощью моющих композиций согласно настоящему изобретению).

Как указано выше, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения моющие средства получают в предварительно замоченном в соответствующем растворе виде при промежуточном pH, где имеется достаточная активность, чтобы обеспечить требуемые улучшения в отношении мягчения, депиллинга, предотвращения пиллинга, удаления и/или очистки поверхностных волокон. В некоторых вариантах осуществления изобретения также применяется по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество. Остаток композиции содержит традиционные компоненты, применяемые в растворе для предварительного замачивания (например, растворитель, буферы, другие ферменты (протеазы) и т.д.) в их традиционных концентрациях.

В некоторых вариантах осуществления изобретения очищающие композиции по настоящему изобретению находят применение при стирке, очистке твердых поверхностей, применения при автоматическом мытье посуды, а также в косметических применениях, таких как очистка зубных протезов, зубов, волос и кожи. Ферменты по настоящему изобретению также находят применение в дополнительных продуктах для очистки. Дополнительный продукт в его простейшей форме может представлять собой один или несколько стабилизированных ферментов по настоящему изобретению. Такую добавку можно упаковать в дозированной форме для добавления во время процесса очистки. Стандартные дозированные формы включают, но не ограничиваются ими, брикеты, таблетки, гелевые капсулы или другие стандартные дозированные формы, такие как предварительно отмеренные порошки или жидкости. В некоторых вариантах осуществления изобретения для увеличения объема такой композиции включен материал наполнителя и/или носителя. Подходящие материалы наполнителя или носителя включают, но не ограничиваются ими, различные соли сульфатов, карбонатов и силикатов, а также тальк, глину и т.п. Материалы наполнителя или носителя для жидких композиций могут представлять собой воду или низкомолекулярные первичные и вторичные спирты, включая полиолы и диолы. Примеры таких спиртов включают, но не ограничиваются ими, метанол, этанол, пропанол и изопропанол. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции содержат приблизительно от 5% до приблизительно 90% таких материалов. В некоторых альтернативных вариантах осуществления изобретения применяются кислотные наполнители для уменьшения pH.

Очищающие композиции и очищающие добавки по настоящему изобретению требуют эффективного количества стабилизированных ферментов по настоящему изобретению. Обычно очищающие композиции по настоящему изобретению содержат по меньшей мере 0,0001 мас.%, приблизительно от 0,0001 до приблизительно 1, приблизительно от 0,001 до приблизительно 0,5 или даже приблизительно от 0,01 до приблизительно 0,1 мас.% по меньшей мере одного фермента по настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления изобретения очищающие композиции по настоящему изобретению содержат материал, выбранный из группы, состоящей из источника пероксидного кислорода, пероксида водорода и их смесей, указанный источник пероксидного кислорода выбирают из группы, состоящей из:

(i) приблизительно от 0,01 до приблизительно 50, приблизительно от 0,1 до приблизительно 20 или даже приблизительно от 1 до 10 мас.% персоли, органической пероксикислоты, соединения мочевины с пероксидом водорода и их смесей;

(ii) приблизительно от 0,01 до приблизительно 50, приблизительно от 0,1 до приблизительно 20 или даже приблизительно от 1 до 10 мас.% углевода и приблизительно от 0,0001 до приблизительно 1, приблизительно от 0,001 до приблизительно 0,5, приблизительно от 0,01 до приблизительно 0,1 мас.% оксидазы углевода и

(iii) их смесей.

В некоторых вариантах осуществления изобретения подходящие персоли включают соли, выбранные из группы, состоящей из пербората щелочного металла, перкарбоната щелочного металла, перфосфатов щелочных металлов, персульфатов щелочных металлов и их смесей.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения углевод выбирают из группы, состоящей из моноуглеводов, диуглеводов, триуглеводов, олигоуглеводов и их смесей. Подходящие углеводы включают углеводы, выбранные из группы, состоящей из D-арабинозы, L- арабинозы, D-целлобиозы, 2-деокси-D-галактозы, 2-деокси-D-рибозы, D-фруктозы, L-фукозы, D-галактозы, D-глюкозы, D-глицеро-D-гулогептозы, D-лактозы, D-ликсозы, L-ликсозы, D-мальтозы, D-маннозы, мелезитозы, L-мелибиозы, палатинозы, D-раффинозы, L-рамнозы, D-рибозы, L-сорбозы, стахиозы, сукрозы, D-трехалозы, D-ксилозы, L-ксилозы и их смесей.

В некоторых вариантах осуществления изобретения подходящая оксидаза углевода включает оксидазу углевода, выбранную из группы, состоящей из альдозооксидазы (по классификации IUPAC EC 1.1.3.9), галактозооксидазы (по классификации IUPAC EC 1.1.3.9), целлобиозооксидазы (по классификации IUPAC EC 1.1.3.25), пиранозооксидазы (по классификации IUPAC EC 1.1.3.10), сорбозооксидазы (по классификации IUPAC EC 1.1.3.11), гексозооксидазы (по классификации IUPAC EC 1.1.3.5) и/или глюкозооксидазы (по классификации IUPAC EC 1.1.3.4) и их смесей.

В некоторых альтернативных вариантах осуществления изобретения очищающие композиции по настоящему изобретению также включают приблизительно от 0,01 до приблизительно 99,9, приблизительно от 0,01 до приблизительно 50, приблизительно от 0,1 до приблизительно 20 или даже приблизительно от 1 до приблизительно 15 мас.% молекул, содержащих сложноэфирный фрагмент. Подходящие молекулы, которые содержат сложноэфирный фрагмент, включают, но не ограничиваются ими, полиуглеводы, которые содержат сложноэфирный фрагмент. Считается, что любой подходящий сложноэфирный фрагмент найдет применение в настоящем изобретении.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения предлагаемые настоящим изобретением очищающие композиции обычно должны составляться таким образом, чтобы во время применения в процессах очистки в водной среде вода для стирки имела pH приблизительно от 5,0 до приблизительно 11,5 или даже приблизительно от 7,5 до приблизительно 10,5. Препараты в виде жидких продуктов обычно получают таким образом, чтобы они имели pH приблизительно от 3,0 до приблизительно 9,0. Гранулированные продукты для стирки обычно получают таким образом, чтобы они имели pH приблизительно от 9 до приблизительно 11. Методы регулирования pH до рекомендованных применяемых уровней включают использование буферов, щелочей, кислот и т.д. и хорошо известны специалистам в данной области.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, когда фермент(ы) по настоящему изобретению используется в гранулированной или жидкой композиции, желательно, чтобы фермент(ы) находился в форме инкапсулированной частицы для защиты такого фермента от других компонентов гранулированной композиции во время хранения. Кроме того, инкапсуляция также является средством регулирования доступности фермента(ов) во время процесса очистки и может усиливать характеристики фермента(ов). Считается, что в настоящем изобретении найдет применение любой подходящий капсулирующий материал. В капсулирующем материале обычно инкапсулируется по меньшей мере часть фермента(ов). Обычно капсулирующий материал является водорастворимым и/или диспергируемым в воде. Более того, считается, что очищающие композиции по настоящему изобретению должны составляться в любой подходящей форме и получаться с помощью любого способа, выбранного разработчиком рецептур (см., например, патенты США № № 5879584, 5691297, 5574005, 5569645, 5565422, 5516448, 5489392 и 5486303; все из которых включены в данное описание посредством ссылки для неограничивающих примеров).

В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения предлагаемые настоящим изобретением очищающие композиции находят применение при очистке in situ (например, на поверхности ткани или твердой поверхности). Обычно по меньшей мере часть мест контактирует с вариантом осуществления предлагаемой настоящим изобретением очищающей композиции в чистой форме или в разбавленной в моющем растворе форме, и затем эти места необязательно промывают и/или ополаскивают. С точки зрения целей настоящего изобретения стирка включает, но не ограничивается ими, очищение и механическое перемешивание. Считается, что ткань включает любую подходящую ткань, способную подвергаться стирке в реальных условиях, применяемых потребителем. Описанные очищающие композиции обычно используют при концентрациях приблизительно от 500 ч./млн до приблизительно 15000 ч./млн в растворе. Когда растворителем при стирке является вода, температура воды обычно находится в диапазоне приблизительно от 5°C до приблизительно 90°C, и когда места стирки включают ткань, массовое отношение воды к ткани обычно составляет приблизительно от 1:1 до приблизительно 30:1.

Экспериментальная часть

Следующие примеры приведены для того, чтобы продемонстрировать и дополнительно проиллюстрировать некоторые предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения и его аспекты, и не должны интерпретироваться как ограничивающие его объем.

В экспериментальной части описания, которая следует ниже, используют следующие аббревиатуры: °C (градусы Цельсия); об/мин (оборотов в минуту); H ₂O (вода); HCl (хлористоводородная кислота); aa (аминокислота); п.н. (пара нуклеотидов); т.п.н. (тысяча пар нуклеотидов); кД (килодальтоны); г (граммы); мкг (микрограммы); мг (миллиграммы); нг (нанограммы); мкл (микролитры); мл (миллилитры); мм (миллиметры); нм (нанометры); мкм (микроны); M (молярная); мМ (миллимолярная); мкМ (микромолярная); Ед (единицы); В (вольты); M (молекулярная масса); сек (секунды); мин(ы) (минута/минуты); ч(ы) (час/часы); MgCl₂ (хлорид магния); NaCl (хлорид натрия); OD ₂₈₀ (оптическая плотность при 280 нм); OD₆₀₀ (оптическая плотность при 600 нм); EtOH (этанол); PBS (забуференный фосфатом солевой раствор [150 мМ NaCl, 10 мМ натрийфосфатного буфера, pH 7,2]); SDS (додецилсульфат натрия); Трис (трис(гидроксиметил)аминометан); TAED (N,N,N'N'-тетраацетилэтилендиамин); мас./об. (масса к объему); об./об. (объем к объему); GOX и GOx (глюкозооксидаза); AOX и AOx (спиртовая оксидаза); COX и Cox (холиноксидаза); HOX и HOx (гексозооксидаза); SOX и Sox (сорбитоксидаза); AATCC (Американская ассоциация специалистов по красителям для тканей); WFK (wfk Testgewebe GmbH, Bruggen-Bracht, Germany); TestFabric (TestFabric Inc, Pittston, PA); Warwick Equest (Warwick Equest Ltd., Warwick International, Flintshire, UK); ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA); Baker (J.T.Baker, Phillipsburg, NJ); NAEF (NAEF, Press и Dies, Inc., Bolton Landing, NY); Sigma (Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO) и Minolta (Konica Minolta. Glen Cove, NY).

Пример 1

Стабилизация глюкозооксидазы в стандартном моющем средстве AATCC в присутствии глюкозы и гидросульфита натрия

В данном примере описаны эксперименты, проведенные для оценки стабилизации глюкозооксидазы в присутствии ее субстрата (то есть глюкозы) и ингибитора (то есть гидросульфита натрия). В данных экспериментах применяли стандартное моющее средство AATCC (жидкое моющее средство American Association of Textile Chemists and Colorists Heavy Duty Liquid detergent, версия 2003, без оптического отбеливателя; ключевые компоненты включают линейный алкансульфонат, этоксилат спирта, пропандиол, лимонную кислоту, жирную кислоту, каустическую соду и воду; закупленное у компании TestFabrics).

В данных экспериментах в качестве положительного контрольного образца использовали 100 мМ Трис (pH 8,3) с 0,005% поверхностно-активного вещества TWEEN^®-100. Использование pH 8,3 было основано на измерении pH моющего средства AATCC. Взвешивали три двухмиллилитровые пробирки с 0,990 г моющего средства AATCC (серия # 01282004) и еще три другие пробирки с 0,990 г контрольного буфера. Затем во все пробирки добавляли 90 мг (500 мМ) глюкозного субстрата. Затем в каждую пробирку добавляли 100, 50 и 10 мМ гидросульфита натрия (ММ 106,1), соответственно, включая пробирки с контрольным буфером и контрольным моющим средством AATCC. Все пробирки на час помещали на ротационную плиту, чтобы обеспечить хорошее перемешивание и солюбилизацию глюкозы в моющем средстве. Затем в шесть 2-мл пробирок (три с контрольными буферами, содержащими глюкозу/бисульфит, и три пробирки с моющим средством AATCC, содержащим глюкозу/бисульфит) добавляли 500 ч./млн (0,5 мг, 14,88 мкл) глюкозооксидазы (OXYGO^TM L-5000, 5379 Ед/мл; 33,6 мг/мл; Genencor). Затем все пробирки устанавливали на ротационную плиту (60 об/мин) при комнатной температуре. Продуцирование пероксида водорода измеряли, используя экспресс-пробы (пероксидаза/ABTS - Baker Testrips; Baker) в различные моменты времени t=0+минуты, 12 минут и 30 минут. В пробирке, содержащей 100 мМ бисульфита с глюкозой, глюкозооксидазой в жидком моющем средстве, дополнительно контролировали преждевременное образование пероксида водорода на протяжении дополнительного периода времени 1 час, 12 часов, 7 дней, 12 дней и до 21 дня после начала. Результаты, полученные в данных экспериментах, приведены в таблице 1 (см. пример 2).

В момент времени 0+ контрольная буферная смесь, содержащая 10 мМ бисульфитного ингибитора, вырабатывала >1 ч./млн H₂O₂ , тогда как контрольная буферная смесь, содержащая 50 или 100 мМ бисульфита, вообще не вырабатывала пероксида водорода в течение различных периодов времени испытания (см. таблицу 1).

В момент времени 0+ моющие смеси, содержащие 10 мМ или 50 мМ бисульфитного ингибитора, вырабатывали >10 ч./млн H₂ O₂, тогда как контрольная буферная смесь, содержащая 100 мМ бисульфита, в течение периода испытания вообще не вырабатывала пероксида водорода (см. таблицу 1). Полученные результаты доказывают, что при концентрации 100 мМ бисульфита предотвращается образование пероксида водорода в жидком препарате моющего средства, содержащем 500 мМ глюкозы и 500 ч./млн глюкозооксидазы вследствие ингибирования оксидазы. Более того, в жидком препарате моющего средства, содержащем 100 мМ гидросульфита натрия, 500 мМ глюкозы и 500 ч./млн глюкозооксидазы, преждевременного образования пероксида водорода не наблюдалось более 21 дня.

Пример 2

Образование пероксида водорода глюкозооксидазой при стирке в моющем растворе в присутствии гидросульфита натрия

В данном примере описаны эксперименты, проведенные для оценки образования пероксида водорода глюкозооксидазой в присутствии гидросульфита натрия при стирке в моющем растворе. Как и в примере 1, в данных экспериментах применяли стандартное моющее средство AATCC.

В данных экспериментах в качестве положительного контрольного образца использовали 100 мМ Трис (pH 8,3) с 0,005% поверхностно-активного вещества TWEEN^®-100. Выбор pH 8,3 был основан на измерении pH моющего средства AATCC. Взвешивали три двухмиллилитровые пробирки, содержащие 0,990 г моющего средства AATCC (серия # 01282004), и еще три другие пробирки с 0,990 г контрольного буфера. Затем в каждую пробирку добавляли 90 мг (500 мМ) глюкозного субстрата. Затем в каждую пробирку добавляли 100, 50 и 10 мМ гидросульфита натрия (ММ 106,1) (обратимого ингибитора), соответственно (то есть как в пробирки с контрольным буфером, так и в пробирки, содержащие моющее средство AATCC). Все пробирки на час помещали на ротационную плиту, чтобы обеспечить хорошее перемешивание и солюбилизацию глюкозы в моющем средстве. Затем готовили 6 пробирок, содержащих по пять мл воды для стирки (5 мМ HEPES, жесткость 6 граммов на галлон, pH 8). Затем в шесть 2-мл пробирок (три с контрольными буферами, содержащими глюкозу/бисульфит, и три с моющим средством AATCC, содержащим глюкозу/бисульфит) добавляли 500 ч./млн (0,5 мг, 14,88 мкл) глюкозооксидазы (OXYGO ^TM L-5000, 5379 Ед/мл; 33.6 мг/мл; Genencor). Затем все пробирки устанавливали на ротационную плиту (60 об/мин) при комнатной температуре. Продуцирование H₂O₂ измеряли, используя экспресс-пробы (пероксидаза/ABTS), как описано в примере 1, для t=0+ минут, 12 минут и 30 минут. Непосредственно после добавления фермента к моющему средству и контрольной смеси извлекали 10 мкл смеси и смешивали с 5 мл воды для стирки. Затем все пробирки также проверяли на наличие пероксида водорода, используя экспресс-пробы, при продолжительности эксперимента 12 и 30 минут. В присутствии 5 мл моющего раствора конечная концентрация фермента глюкозооксидазы составляла 1 ч./млн, и концентрация глюкозы составляла 1 мМ.

Полученные результаты указывали на то, что моющий раствор, содержащий контрольный буфер, вырабатывал приблизительно 10 ч./млн пероксида водорода в присутствии препарата, содержащего 10 мМ бисульфитного ингибитора, ~10 ч./млн в присутствии 50 мМ бисульфита и ~3 ч./млн H₂O₂ в присутствии 100 мМ бисульфита при продолжительности эксперимента 12 минут. Таким образом, полученные результаты указывают на обратимый характер бисульфитных ингибиторов (для более подробного рассмотрения см. приведенную ниже таблицу).

Моющий раствор, содержащий моющее средство AATCC, при продолжительности эксперимента 12 минут вырабатывал >3 ч./млн для всех трех концентраций бисульфитного ингибитора, также доказывая обратимый характер бисульфитного ингибитора. Кроме того, моющий раствор с моющим средством AATCC при продолжительности эксперимента 30 минут вырабатывал ~10 ч./млн для всех трех концентраций бисульфитного ингибитора, опять доказывая обратимый характер бисульфитного ингибитора. Полученные результаты показывают, что бисульфит натрия является обратимым ингибитором, подходящим для сохранения глюкозооксидазы, ингибируемой в присутствии высокой концентрации субстрата. Однако при разведении моющего средства в воде для стирки ингибирование исчезает. Важно заметить, что бисульфит натрия является обратимым ингибитором глюкозооксидазы зависимым от концентрации образом.

Таблица 1 Определение образования пероксида водорода (мг/л, ч./млн)
Время (мин)	Контрольный буфер с глюкозооксидазой ч./млн Н2 О2	Моющее средство AATCC с глюкозооксидазой ч./млн Н 2О2
Т=0+ в случае 500 мМ глюкозы, 500 ч./млн оксидазы и 10 мМ бисульфита	1	>10
Т=0+ в случае 500 мМ глюкозы, 500 ч./млн оксидазы и 50 мМ бисульфита	0	10
Т=0+ в случае 500 мМ глюкозы, 500 ч./млн оксидазы и 100 мМ бисульфита	0	0
Т=12, моющий раствор, 1 мМ глюкозы и 1 ч./млн оксидазы	3	3
Т=12, моющий раствор, 1 мМ глюкозы, 1 ч./млн оксидазы и 0,02 мМ бисульфита	~10	3
Т=12, моющий раствор, 1 мМ глюкозы, 1 ч./млн оксидазы и 0,1 мМ бисульфита	3	3
Т=12, моющий раствор, 1 мМ глюкозы, 1 ч./млн оксидазы и 0,2 мМ бисульфита	~3	3
Т=30, моющий раствор, 1 мМ глюкозы, 1 ч./млн оксидазы и 0,02 мМ бисульфита	10	10
Т=30, моющий раствор, 1 мМ глюкозы, 1 ч./млн оксидазы и 0,1 мМ бисульфита	~10	~10
Т=12, моющий раствор, 1 мМ глюкозы, 1 ч./млн оксидазы и 0,2 мМ бисульфита	~3	~10
Т=12, моющий раствор, 1 мМ глюкозы и 1 ч./млн оксидазы	10	10

Пример 3

Стабилизация глюкозооксидазы в моющем средстве, содержащем глюкозу и метабисульфит натрия

В данном примере описаны эксперименты, проведенные для оценки образования пероксида водорода глюкозооксидазой в присутствии метабисульфита натрия (обратимого ингибитора оксидазы) при стирке в моющем растворе. Как и в примерах 1 и 2, в данных экспериментах использовали стандартное моющее средство AATCC.

В данных экспериментах использовали 100 мМ Трис (pH 8,3) с 0,005% поверхностно-активного вещества TWEEN^®-100 в качестве положительного контрольного образца. Как описано выше, выбор pH 8,3 основан на измерении pH моющего средства AATCC. Взвешивали три двухмиллилитровые пробирки с 0,990 г моющего средства AATCC (серия # 01282004) и еще три других пробирки с 0,990 г контрольного буфера.

Затем в каждую пробирку добавляли по 90 мг (500 мМ) глюкозного субстрата. Затем добавляли 100, 50 и 10 мМ метабисульфита натрия, соответственно (то есть как в пробирки, содержащие контрольный буфер, так и в пробирки, содержащие моющее средство AATCC). Все пробирки на час помещали на ротационную плиту, чтобы обеспечить хорошее перемешивание и солюбилизацию глюкозы в моющем средстве. Затем в шесть 2-миллилитровых пробирок (три с контрольными буферами, содержащими глюкозу/метабисульфит, и три с моющим средством AATCC, содержащим глюкозу/метабисульфит) добавляли 500 ч./млн (0,5 мг, 14,88 мкл) глюкозооксидазы (OXYGO^TM L-5000, 5379 Ед/мл; 33,6 мг/мл; Genencor). Затем все пробирки устанавливали на ротационную плиту (60 об/мин) при комнатной температуре. Продуцирование H ₂O₂ измеряли, используя экспресс-пробы (пероксидаза/ABTS), как описано в примерах 1 и 2, для времени эксперимента t=0+минут, 12 минут и 30 минут. В пробирке, содержащей 100 мМ бисульфита с глюкозой, глюкозооксидазой в жидком моющем средстве, дополнительно контролировали преждевременное образование пероксида водорода на протяжении дополнительного периода времени 1 час, 12 часов, 7 дней, 12 дней и до 21 дня после начала. Результаты приведены в приведенной ниже таблице 2.

В момент времени 0+ контрольная буферная смесь, содержащая 10 мМ метабисульфитного ингибитора, вырабатывала 1 ч./млн H₂O₂, тогда как контрольная буферная смесь, содержащая 50 или 100 мМ бисульфита, вообще не вырабатывала пероксида водорода в течение различных периодов времени испытания (см. таблицу 2).

В момент времени 0+ моющие смеси, содержащие 10 мМ или 50 мМ метабисульфитного ингибитора, вырабатывали >10 ч./млн H ₂O₂, тогда как контрольная буферная смесь, содержащая 100 мМ бисульфита, вообще не вырабатывала пероксида водорода в течение периодов времени испытания (см. таблицу 2). Полученные результаты доказывают, что при концентрации 100 мМ метабисульфита предотвращается образование пероксида водорода в жидком препарате моющего средства, содержащем 500 мМ глюкозы и 500 ч./млн глюкозооксидазы, вследствие ингибирования оксидазы. Более того, в жидком препарате моющего средства, содержащем 100 мМ метасульфита натрия, 500 мМ глюкозы и 500 ч./млн глюкозооксидазы, преждевременного образования пероксида водорода не наблюдалось более 21 дня.

Пример 4

Образование пероксида водорода глюкозооксидазой в моющем растворе для стирки в присутствии метабисульфита натрия

В данном примере описаны эксперименты, проведенные для оценки образования пероксида водорода глюкозооксидазой в присутствии метабисульфита натрия (обратимого ингибитора оксидазы) при стирке в моющем растворе. Как и в приведенных выше примерах, в данных экспериментах использовали стандартное моющее средство AATCC.

В данных экспериментах использовали 100 мМ Трис (pH 8,3) с 0,005% поверхностно-активного вещества TWEEN ^®-100 в качестве положительного контрольного образца. Выбор pH 8,3 основан на измерении pH моющего средства AATCC. Взвешивали три двухмиллилитровые пробирки, содержащие 0,990 г моющего средства AATCC (серия # 01282004), и еще три других пробирки с 0,990 г контрольного буфера. Затем в каждую пробирку добавляли по 90 мг (500 мМ) глюкозного субстрата. Затем в каждую пробирку (то есть как в пробирки, содержащие контрольный буфер, так и пробирки, содержащие моющее средство AATCC) добавляли по 100, 50 и 10 мМ метабисульфита натрия, соответственно. Все пробирки на час помещали на ротационную плиту, чтобы обеспечить хорошее перемешивание и солюбилизацию глюкозы в моющем средстве. Затем готовили 6 пробирок, содержащих по пять мл воды для стирки (5 мМ HEPES, жесткость 6 граммов на галлон, pH 8). Затем в шесть 2-миллилитровых пробирок (три с контрольными буферами, содержащими глюкозу/бисульфит, и три с моющим средством AATCC, содержащим глюкозу/бисульфит) добавляли 500 ч./млн (0,5 мг, 14,88 мкл) глюкозооксидазы (OXYGO^TM L-5000, 5379 Ед/мл; 33,6 мг/мл; Genencor). Затем все пробирки устанавливали на ротационную плиту (60 об/мин) при комнатной температуре. Продуцирование H₂O ₂ измеряли, используя экспресс-пробы (пероксидаза/ABTS), как описано в приведенных выше примерах, для времени эксперимента t =0+ минут, 12 минут и 30 минут. Непосредственно после добавления фермента к моющему средству и контрольным смесям извлекали 10 мкл смеси и смешивали с 5 мл воды для стирки. Затем все пробирки также проверяли на наличие пероксида водорода, используя экспресс-пробы, при продолжительности эксперимента 12 и 30 минут. В присутствии 5 мл моющего раствора конечная концентрация фермента глюкозооксидазы составляла 1 ч./млн, и концентрация глюкозы составляла 1 мМ.

Полученные результаты указывали, что моющий раствор, содержащий контрольный буфер, вырабатывал приблизительно 10 ч./млн H₂O₂ в присутствии 10 мМ метабисульфитного ингибитора, ~10 ч./млн в присутствии 50 мМ метабисульфита и ~3 ч./млн H₂O₂ в присутствии 100 мМ метабисульфита при продолжительности эксперимента 12 минут. Таким образом, полученные результаты указывают на обратимый характер метабисульфитного ингибитора (для более подробного рассмотрения см. приведенную ниже таблицу).

Моющий раствор, содержащий моющее средство AATCC, вырабатывал >3 ч./млн в присутствии всех трех концентраций метабисульфитного ингибитора при продолжительности эксперимента 12 минут, также доказывая обратимый характер метабисульфитного ингибитора. Кроме того, моющий раствор с моющим средством AATCC вырабатывал ~10 ч./млн в присутствии всех трех концентраций метабисульфитного ингибитора при продолжительности эксперимента 30 минут, опять доказывая обратимый характер метабисульфитного ингибитора. После 3 недель хранения в присутствии ингибитора при разведении в моющем растворе жидкие препараты моющего средства вырабатывали 3 ч./млн пероксида водорода в течение 12 минут. К 30 минутам образуется ~10 ч./млн пероксида водорода.

Полученные результаты показывают, что метабисульфит натрия является обратимым ингибитором, подходящим для сохранения глюкозооксидазы, ингибируемой в присутствии высокой концентрации субстрата. Однако при разведении моющего средства в воде для стирки ингибирование исчезает. Важно заметить, что метабисульфит натрия является обратимым ингибитором глюкозооксидазы зависимым от концентрации образом.

В дополнение к метабисульфиту натрия и бисульфиту натрия, описанным в данных примерах, для ингибирования глюкозооксидазы испытывали другие ингибиторы. Использовали способы, аналогичные описанным в приведенных примерах. Полученные результаты показали, что 1 M фторид или тиосульфат натрия ингибируют глюкозооксидазу в небольшой степени. Однако было определено, что 2 M гидроксиламин может стабилизировать преждевременное образование пероксида водорода в моющем средстве, содержащем 1 M глюкозу и 500 ч./млн глюкозооксидазы.

Таблица 2 Определение Н2О 2
Время (мин)	Контрольный буфер (глюкозооксидаза) Н2О 2 ч./млн	Моющее средство AATCC (глюкозооксидаза) Н2 О2 ч./млн
Т=0+, 12, 30 в случае 500 мМ глюкозы и 500 ч./млн фермента, 100 мМ метабисульфита натрия	0	0
Т=12, моющий раствор, 1 мМ глюкозы, 1 ч./млн глюкозооксидазы, без ингибитора	3	3
Т=12, моющий раствор, 1 мМ глюкозы и 1 ч./млн фермента, 0,2 мМ метабисульфита натрия	1	3
Т=30, моющий раствор, 1 мМ глюкозы и 1 ч./млн фермента, 0,2 мМ метабисульфита натрия	3	~10
Т=30, моющий раствор, 1 мМ глюкозооксидазы без ингибитора	10	10
Т=60, моющий раствор, 1 мМ глюкозы, 1 ч./млн глюкозооксидазы, 0,2 мМ метабисульфита натрия	10	>10

Пример 5

Стабилизация спиртовой оксидазы в моющем средстве, содержащем субстрат и ингибитор

В данном примере описаны эксперименты, проведенные для оценки стабилизации спиртовой оксидазы в присутствии ее субстрата (этанола) и ингибитора (например, метабисульфита, бисульфита или тиосульфата натрия). Как и в приведенных выше примерах, в данных экспериментах использовали стандартное моющее средство AATCC.

В данных экспериментах испытывали стабильность спиртовой оксидазы, полученной от Hansunela sp. (100 Ед/мл. 22 Ед/мг, 13 мг общего твердого вещества в ампуле, 7,7 Ед/мг твердого вещества; Sigma), в жидком моющем средстве AATCC. В данных экспериментах для каждого эксперимента использовали 10 Ед спиртовой оксидазы в маточном растворе жидкого моющего средства. Для испытания перемешивали 1 M этанол с моющим средством (46 мг этанола в 990 мг моющего средства). Присутствие 1 M этанола не влияло на общий внешний вид жидкого моющего средства. В качестве обратимых ингибиторов спиртовой оксидазы испытывали гидросульфит натрия (NaHSO ₃), метабисульфит натрия (Na₂S₂O ₅) и тиосульфат натрия (Na₂S₂O ₃). Эксперименты проводили, как описано выше в примерах 1 и 3.

Было обнаружено, что фермент спиртовая оксидаза является стабильным в жидком моющем средстве AATCC в течение периода времени (120 минут) испытания в присутствии этанола в качестве субстрата и ингибиторов. Было обнаружено, что тиосульфат является слабым ингибитором спиртовой оксидазы, в то время как гидросульфит и метабисульфит натрия являются обратимыми ингибиторами спиртовой оксидазы при испытании концентрации 100 мМ. При концентрациях 100 мМ гидросульфит и метабисульфит натрия способны останавливать преждевременное образование H₂O₂ в маточном растворе моющего средства AATCC в течение периода исследования (120 минут), как показано в таблицах 3 и 4.

Пример 6

Образование H₂ O₂ спиртовой оксидазой в моющих растворах для стирки, содержащих этанол и обратимый ингибитор

В данном примере описаны эксперименты, проведенные для оценки образования пероксида водорода спиртовой оксидазой в присутствии метабисульфита, бисульфита и тиосульфата натрия (обратимые ингибиторы спиртовой оксидазы) в моющем растворе для стирки. Как и в приведенных выше примерах, в данных экспериментах использовали стандартное моющее средство AATCC.

Стабильность и активность фермента спиртовой оксидазы (описанной в примере 5) в жидком моющем средстве AATCC (Sigma, 100 Ед/мл. 22 Ед/мг, 13 мг общего твердого вещества в ампуле, 7,7 Ед/мг твердого вещества) испытывали при разведении в моющем растворе. В данных экспериментах для каждого эксперимента применяли 10 Ед спиртовой оксидазы в маточном растворе жидкого моющего средства. Кроме того, 1 M этанол (субстрат) перемешивали с моющим средством (46 мг этанола в 990 мг моющего средства). При разведении 500× моющий раствор содержал 2 мМ этанола для образования максимальной концентрации 2 мМ H ₂O₂ и конечного количества спиртовой оксидазы в моющем растворе, равного 0,02 Ед. В качестве обратимых ингибиторов испытывали гидросульфит натрия (NaHSO₃), метабисульфит натрия (Na₂S₂O₅) и тиосульфат натрия (Na₂S₂O₃). В данных экспериментах к 5 мл моющего раствора добавляли 10 мкл конечной моющей смеси или контрольной смеси. В данных экспериментах использовали способы, аналогичные описанным в примерах 2 и 4.

При разведении в моющем растворе пероксид водорода образовывался в присутствии моющего средства, содержащего спиртовую оксидазу, этанол и ингибитор (например, гидросульфит натрия или метабисульфит натрия), как указано в таблицах 3 и 4.

Таблица 3 Определение концентрации пероксида водорода в жидком моющем средстве
Время (мин)	Контрольный буфер (спиртовая оксидаза) Н2 О2 ч./млн	Моющее средство AATCC (спиртовая оксидаза) Н2 О2 ч./млн
Т=0+ в случае 1 М этанола и 10 Ед фермента без ингибитора	10	10
Т=0+ в случае 1 М этанола, 10 Ед фермента, 100 мМ метабисульфита натрия (моющее средство сгущается)	0	0
Т=0+ в случае 1 М этанола, 10 Ед фермента, 100 мМ тиосульфата натрия	~10	3
Т=0+ в случае 1 М этанола, 10 Ед фермента, 100 мМ гидросульфита натрия	0	0
Т=12, в случае 1 М этанола и 10 Ед фермента без ингибитора	30	30
Т=12 в случае 1 М этанола, 10 Ед фермента, 100 мМ метабисульфита натрия	0	0
Т=12 в случае 1 М этанола, 10 Ед фермента, 100 мМ гидросульфита натрия	0	0
Т=30, в случае 1 М этанола и 10 Ед фермента без ингибитора	30	30
Т=30 в случае 1 М этанола, 10 Ед фермента, 100 мМ метабисульфита натрия	0	0
Т=30 в случае 1 М этанола, 10 Ед фермента, 100 мМ гидросульфита натрия	0	0
Т=120 в случае 1 М этанола и 10 Ед фермента без ингибитора	30	30
Т=120 в случае 1 М этанола, 10 Ед фермента, 100 мМ гидросульфита, метабисульфита или тиосульфата натрия	0	0 (для тиосульфата >10)

Таблица 4 Определение концентрации пероксида водорода в моющем растворе
Время (мин)	Контрольный буфер (спиртовая оксидаза) Н2 О2 ч./млн	Моющее средство AATCC (спиртовая оксидаза) Н2 О2 ч./млн
Т=0+, моющий раствор, 2 мМ этанола и 0,02 Ед фермента, без ингибитора	0
Т=0+, моющий раствор, 2 мМ этанола, 0,02 Ед фермента, 0,2 мМ метабисульфита натрия	0
Т=0+, моющий раствор, 2 мМ этанола, 0,02 Ед фермента, 0,2 мМ тиосульфата натрия	0	0
Т=0+, моющий раствор, 2 мМ этанола, 0,02 Ед фермента, 0,2 мМ гидросульфита натрия	0	0
Т=12, моющий раствор, 2 мМ этанола и 0,02 Ед фермента, без ингибитора	1	0
Т=12, моющий раствор, 2 мМ этанола, 0,02 Ед фермента, 0,2 мМ метабисульфита натрия	0	0
Т=12, моющий раствор, 2 мМ этанола, 0,02 Ед фермента, 0,2 мМ гидросульфита натрия	0	0
Т=30, моющий раствор, 2 мМ этанола и 0,02 Ед фермента, без ингибитора	0	0
Т=30, моющий раствор, 2 мМ этанола, 0,02 Ед фермента, 0,2 мМ метабисульфита или гидросульфита натрия	0	0
Т=30, моющий раствор, 2 мМ этанола, 0,02 Ед фермента, 0,2 мМ тиосульфата натрия	0	0
Т=120, моющий раствор, 2 мМ этанола и 0,02 Ед фермента, без ингибитора	~10	~10
Т=120, моющий раствор, 2 мМ этанола, 0,02 Ед фермента, 0,2 мМ метабисульфита, гидросульфита или тиосульфата натрия	1 (гидросульфит) 0 (метабисульфит)	>3(гидросульфит) 1(метабисульфит) >3 (тиосульфат)

В дополнительных экспериментах также оценивали способность 10 мМ CuSO₄ стабилизировать преждевременное образование H₂O₂ в моющем средстве, содержащем 1 М этанол и 10 Ед спиртовой оксидазы (Candida sp.; Sigma).

Пример 7

Стабилизация холиноксидазы в моющем средстве, содержащем холин и ингибитор

В данном примере описаны эксперименты, проведенные для оценки стабилизации холиноксидазы в присутствии ее субстрата (то есть холина) и ингибитора (то есть бисульфита натрия и 2-амино-2-метил-1-пропанола). В данных экспериментах использовали стандартное моющее средство AATCC.

Эксперименты проводили по примеру 1. Холиноксидаза вырабатывает два моля H₂O₂ на моль холина. Результаты, полученные в данных экспериментах, доказывают, что холиноксидаза была стабильна в моющем средстве AATCC более 24-часового периода испытаний в присутствии холина и ингибиторов. Ингибитор 2-амино-2-метил-1-пропанол (AMP) является обратимым ингибитором холиноксидазы и останавливает преждевременное восстановление H₂O₂ в моющем средстве, если применяется при концентрации 200 мМ. Было обнаружено, что гидросульфит натрия является обратимым ингибитором холиноксидазы при испытуемой концентрации 100 мМ. Гидросульфит натрия (при концентрации 100 мМ) также способен останавливать преждевременное образование H₂O₂ в маточном растворе моющего средства AATCC. При разведении в моющем растворе моющее средство, содержащее холиноксидазу, холинхлорид и ингибитор (например, гидросульфит натрия или 2-амино-2-метал-1-пропанол), с течением времени вырабатывает H₂O₂, как показано в таблице 5.

Таблица 5 Определение Н2О 2 в жидком моющем средстве и моющем растворе
Время (мин)	Контрольный буфер (холиноксидаза) Н2О2 ч./млн	Моющее средство AATCC (холиноксидаза) Н2О 2 ч./млн
Т=0+, 1 М холина и 1 Ед фермента, без ингибитора	10	10
Т=0+, 1 М холина, 1 Ед фермента, 100 мМ ингибитора АМР	0	0
Т=12, 1 М холина, 1 Ед фермента, 100 мМ ингибитора АМР	1	1
Т=12, 1 М холина, 1 Ед или 10 Ед фермента, 200 мМ ингибитора АМР(рН ~9,3)	0	0
Т=0+, 12, 30 и 60, моющий раствор, 2 мМ холинхлорида, 0,02 Ед фермента, 0,4 мМ ингибитора АМР	1,3,3,10	1,3,3,10
Т=0+, 12, 30 и 60, 1 М холинхлорид, 10 Ед холиноксидазы, 100 мМ ингибитора бисульфита натрия (рН 7)	0	0
Т=0+, 12, 30 и 60, моющий раствор, 2 мМ холинхлорид, 0,02 Ед холиноксидазы, 0,2 мМ ингибитора бисульфита натрия (рН 7)	1,10,>10,30	1,10,>10,30

Пример 8

Стабильность/эксплуатационные характеристики глюкозооксидазы и гексозооксидазы в моющем средстве, содержащем бисульфит натрия и глюкозу

В данном примере описаны эксперименты, проведенные для оценки стабильности глюкозооксидазы и гексозооксидазы в моющем средстве, содержащем бисульфит натрия и глюкозу. Также описаны дополнительные эксперименты для оценки характеристик указанных ферментов в отношении загрязненных образцов ткани.

В четырех 250 мл стеклянных бутылках смешивали 100 граммов жидкого моющего средства AATCC с 9 граммами глюкозы и перемешивали в течение 30 минут для того, чтобы растворить глюкозу в моющем средстве. Затем в две бутылки добавляли по 2,12 граммов бисульфита натрия для растворения в моющем средстве. Затем в две бутылки (одну с бисульфитом и одну без бисульфита) добавляли по 15000 единиц глюкозооксидазы и аналогично в две других бутылки (одну с бисульфитом и одну без бисульфита) добавляли по 15000 единиц гексозооксидазы. Все четыре жидких препарата моющего средства хранили при комнатной температуре и оценивали их эффективность в отношении удаления пятен, используя дискообразные образцы ткани в 12-луночных планшетах в течение 7 дней.

Образцы тканей, загрязненных черникой и чаем (CS 15-004, CS3; TestFabric), разрезали на 15 мм круги с помощью штанцевого пресса для ткани (модель 93046; NAEF), оборудованного 5/8" штанцевым ножом. Отдельные диски помещали в каждую лунку 24-луночного планшета (Costar). В каждую лунку добавляли по одному (1) мл моющего раствора (pH 10,0), содержащего в расчете на литр 1,5 мл моющего средства AATCC HDL, 10 мМ карбоната натрия, 75 мМ глюкозы, с жесткостью 6 граммов на галлон (получен разбавлением маточного раствора с жесткостью 15000 граммов на галлон, содержащего 1,735M хлорида кальция и 0,67 M хлорида магния) и 0,05% TAED (тетраацетилэтилендиамина, Fluka). В 4 лунки одной секции с помощью пипетки вытесняющего действия добавляли по пять (5) микролитров глюкозооксидазы, полученной 5-7 суток назад, с бисульфитом натрия или без бисульфита натрия. Контрольные лунки (8) не содержали фермента.

Микропланшет накрывали его пластиковой крышкой и выдерживали при 37°C и плавном вращении со скоростью 100 об/мин. Спустя 5 часов надосадочные жидкости извлекали путем отсасывания и каждую лунку дважды промывали 1,5 мл забуференного фосфатном солевого раствора Дульбекко (Dulbecco PBS, pH 7,3) и два раза 1,5 мл дистиллированной воды. Каждый диск извлекали из его лунки и сушили в течение ночи на воздухе.

Диски осматривали визуально и анализировали с помощью рефлектометра Minolta Reflectometer CR-200, откалиброванного по стандартной белой плитке. Рассчитывали усредненные значения L. Коэффициент отражения света поверхностью ткани измеряли как Ламбертовский коэффициент отражения, называемый "L-коэффициентом" (отношение количества отраженного света к падающему на поверхность свету, обычно выражаемое в процентах), на поверхности материала такой большой толщины, что отражение не изменяется с увеличением толщины (то есть собственный коэффициент отражения поверхности) независимо от других параметров, таких как коэффициент отражения задней поверхности. L-коэффициент измеряли путем измерения отражения, используя указанный выше рефрактометр, в качестве процента удаления пятен (%SR=100%×(конечный коэффициент отражения-начальный коэффициент отражения)/(коэффициент отражения белого стандарта-начальный коэффициент отражения)).

Спустя 5 дней глюкозооксидаза, приготовленная без бисульфита, становилась желтой, содержала значительное количество (>30 мг/л) пероксида водорода в полученном образце, показывала минимальную активность по продуцированию пероксида водорода (1 мг/л) во время испытания диска и обладала отбеливающими характеристиками, которые статистически не отличались от контрольного образца без фермента. В отличие от этого после 7 дней глюкозооксидаза, приготовленная с бисульфитом, была белой, показывала активное (>100 мг/л) продуцирование пероксида водорода во время испытания диска и проявляла эксплуатационные качества значительно лучшие, чем как у контрольного образца, так и у глюкозооксидазы без бисульфита. Такие же результаты наблюдали спустя 14 дней. Полученные результаты приведены в таблице 6 и 7 и на фигурах 1 и 2. Полученные результаты показывают, что глюкозооксидаза, стабилизированная бисульфитом, отбеливает диски, загрязненные черникой, и диски, загрязненные чаем, значительно лучше, чем контрольный образец (то есть без фермента) или нестабилизированная глюкозооксидаза.

Таблица 6 Эксплуатационные характеристики жидкого моющего средства, содержащего оксидазу, в отношении удаления пятен черники на 5 день для нестабилизированной глюкозооксидазы и на 7 день для глюкозооксидазы, стабилизированной бисульфитом
	5 дней	7 дней
	без глюкозооксидазы	глюкозооксидаза	глюкозооксидаза, стабилизированная бисульфитом
% удаления пятен (dL)	17,2	18,8	23,2
L-коэффициент	68,93	69,42	70,74
Среднеквадратичное отклонение	0,33	0,32	0,42

Таблица 7 Эксплуатационные характеристики жидкого моющего средства, содержащего оксидазу, в отношении удаления пятен чая на 14 день для нестабилизированной глюкозооксидазы и на 16 день для глюкозооксидазы, стабилизированной бисульфитом
	14 дней	16 дней
	без глюкозооксидазы	глюкозооксидаза	глюкозооксидаза, стабилизированная бисульфитом
% удаления пятен (dL)	6,9	12	32,2
L-коэффициент	75,14	76,2	80,2
Среднеквадратичное отклонение	0,37	0,36	0,35

Пример 9

Испытание в терготометре на стабильность/эксплуатационные характеристики глюкозооксидазы в моющем средстве, содержащем бисульфит натрия и глюкозу, в течение двух месяцев

В данном примере описаны эксперименты, проведенные для оценки стабильности глюкозооксидазы (GOX) в жидком моющем средстве, содержащем бисульфит натрия и глюкозу. Также описаны дополнительные эксперименты для оценки эксплуатационных характеристик указанных ферментов на образцах ткани с многочисленными загрязнениями.

В двух 250 мл стеклянных бутылках смешивали 100 граммов жидкого моющего средства AATCC с 9 граммами глюкозы и перемешивали в течение 30 минут для того, чтобы растворить глюкозу в моющем средстве. Затем в одну из бутылок добавляли 2,12 граммов бисульфита натрия (Sigma Aldrich # 243973) и растворяли в моющем средстве. Затем в обе бутылки (то есть в бутылку с бисульфитом и в бутылку без бисульфита) добавляли 15000 Единиц глюкозооксидазы (HPL5000, 5379 Ед/мл; Genencor). Оба жидких препарата моющего средства хранили при комнатной температуре в течение двух месяцев и оценивали их эффективность для удаления пятен, используя образцы тканей с многочисленными загрязнениями (Warwick-Equest) в терготометре.

При испытаниях в терготометре в сосуд 1 и 4 добавляли 950 мл воды MilliQ Water и 950 мл MilliQ Water добавляли в сосуд 2 и 3. В сосуд 1 и 4 добавляли пятьдесят мл 1,5 M раствора глюкозы. В сосуд 1 и 4 добавляли три мл свежего моющего средства AATCC, тогда как в сосуде 2 и 3 находилось моющее средство ATCC двухмесячной давности с GoX (то есть без бисульфита и с бисульфитом), как описано выше. Конечную концентрацию 2 мМ бисульфита поучали в сосуде 1 и 4 путем добавления маточного раствора бисульфита натрия (1 M). Жесткость воды поддерживали на уровне 6 граммов на галлон (то есть условия стирки в Северной Америке). Конечную концентрацию TAED во всех сосудах сохраняли на уровне 0,05% наряду с добавлением карбоната натрия для доведения pH до значения в интервале от 8,5 до 9,15. Предварительно готовили двадцать четыре образца ткани с многочисленными загрязнениями, в каждый сосуд добавляли по шесть образцов ткани и перемешивали при 125 об/мин. Затем в сосуд 4 добавляли 100 мк маточного раствора глюкозооксидазы, тогда как в сосуд 1 глюкозооксидазу не добавляли. Таким образом, сосуды 1 и 4, соответственно, использовали в качестве отрицательного и положительного контрольных образцов. Эксперимент проводили в течение 90 минут при 30°C. После испытания в терготометре образцы ткани промывали (3×) холодной водопроводной водой, выжимали и затем сушили в течение ночи при комнатной температуре. Все образцы ткани гладили под паром и затем оценивали, используя рефлектометр Minolta.

Исследования в терготометре доказывают стабильность GOX, полученной совместно с бисульфитом, и также доказывают преимущество ее отбеливающих характеристик по сравнению с GOX без бисульфита и контрольным образцом в отношении пятен от кофе, вина «мерло», черники, черной смородины и смеси ягод (см. таблицу 8 и фигуру 3).

Все патенты и публикации, приведенные в описании изобретения, являются показателем уровня техники для специалистов в данной области, которых касается изобретение. Все патенты и публикации включены в данное описание посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация была специально и отдельно указана для того, чтобы быть включенной посредством ссылки.

Имея описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения, специалисту в данной области будет очевидно, что для описанных вариантов осуществления можно получить различные модификации и что такие модификации должны быть включены в объем настоящего изобретения.

Специалистам в данной области легко понять, что настоящее изобретение хорошо адаптировано к тому, чтобы осуществить объекты и добиться конечных целей и указанных преимуществ, а также присущих ему преимуществ. Описанные в данном описании композиции и способы представляют собой предпочтительные варианты осуществления изобретения, являются иллюстративными и не считаются ограничивающими объем изобретения. Специалисту в данной области будет очевидно, что можно осуществить различные изменения и модификации представленного изобретения, не выходя за пределы объема и сущности изобретения.

Иллюстративно представленное изобретение подходящим образом можно осуществить на практике при отсутствии какого-либо элемента или элементов, ограничения или ограничений, которые конкретно не описаны в данном описании. Термины и выражения, которые использованы, применяются в качестве терминов описания и не являются ограничением, и нет намерения при применении таких терминов и выражений исключить любые эквиваленты указанных и описанных признаков или их частей, однако считается, что в пределах объема заявленного изобретения возможны различные модификации. Таким образом, следует понимать, что хотя изобретение конкретно описано с помощью предпочтительных вариантов осуществления и необязательных признаков, для модификации и вариации описанных в данном описании понятий можно прибегнуть к помощи специалистов в данной области, и что такие модификации и вариации должны рассматриваются в рамках объема настоящего изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения.

Изобретение описано в широком и общем смысле. Каждый из более узких видовых признаков и подгрупп, входящих в общее описание, также является частью изобретения. Это охватывает общее описание изобретения с условием или отрицательным ограничением, исключающим любой объект изучения из класса объектов, независимо от того, существует в данном описании конкретная ссылка на исключенный материал или нет.