мутантный термолабильный энтеротоксин e.coli

Формула изобретения

1. Выделенный полипептид для использования в качестве адъюванта, включающий мутантную А субъединицу термолабильного эндотоксина E.coli, причем мутантная А субединица термолабильного эндотоксина E.coli имеет только один мутированный остаток по сравнению с диким типом, представляющий собой K, R, Н или Y и локализованный в положении 61 SEQ ID NO:5, где термолабильный энтеротоксин E.coli, содержащий мутантную А субъединицу, имеет сниженную токсичность по сравнению с термолабильным эндотоксином E.coli дикого типа, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5.

2. Выделенный полипептид по п.1, где термолабильный эндотоксин E.coli, содержащий мутантную А субъединицу, имеет токсичность менее чем 10^-6 раз по сравнению с токсичностью термолабильного эндотоксина E.coli дикого типа.

3. Выделенный полипептид по п.1, где мутантная А субъединица имеет последовательность аминокислот, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, 4, 8 и 10.

4. Вакцина для индукции иммунного ответа, включающая антиген и адъювант, причем адъювантом является полипептид по п.1.

5. Вакцина по п.4, где антиген получают от бактерии или вируса.

6. Вакцина по п.5, где бактерию выбирают из группы, состоящей из Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Helicobacter pylori, Nesseria meningitidis и Haemophilus influenza b.

7. Вакцина по п.5, где вирус выбирают из группы, состоящей из вируса гриппа, вируса иммунодефицита человека, вируса гепатита А, вируса гепатита В, вируса гепатита С, человеческого папилломавируса, энтеровируса и ротавируса.

8. Вакцина по п.4, где термолабильный эндотоксин E.coli, содержащий мутантную А субъединицу, имеет токсичность менее чем 10^-6 раз по сравнению с токсичностью термолабильного эндотоксина E.coli дикого типа.

9. Вакцина по п.4, где мутант А субъединицы содержит K в положении, соответствующем положению 61 SEQ ID NO:5.

10. Вакцина по п.4, где мутант А субъединицы содержит R в положении, соответствующем положению 61 SEQ ID NO:5.

11. Вакцина по п.4, где мутант А субъединицы содержит последовательность аминокислот, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, 4, 8 и 10.

12. Вакцина по п.4, дополнительно включающая В субъединицу LT, где мутант А субъединицы и В субъединица образуют целый термолабильный энтеротоксин E.coli.

13. Выделенная нуклеиновая кислота, включающая последовательность нуклеотидов, кодирующую мутантную А субъединицу термолабильного энтеротоксина E.coli, которая имеет только один мутированный остаток по сравнению с диким типом, представляющий собой K, R, Н или Y и локализованный в положении 61 SEQ ID NO:5, где термолабильный энтеротоксин E.coli, содержащий мутантную А субъединицу, имеет сниженную токсичность по сравнению с термолабильным энтеротоксином E.coli дикого типа, содержащим SEQ ID NO:5.

14. Нуклеиновая кислота по п.13, где последовательность нуклеотидов выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, 3, 7 и 9.

15. Вектор экспрессии, включающий нуклеиновую кислоту по п.13.

16. Трансформированная клетка для размножения вектора, включающая вектор по п.15.

Описание изобретения к патенту

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет патентной заявки Соединенных Штатов № 11/779419, поданной 18 июля 2007, содержание которой полностью включено в настоящее описание в виде ссылки.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Энтеротоксигенные штаммы Escherichia coli вызывают диарею у людей и домашних животных, продуцируя два типа энтеротоксинов, т.е. термолабильный токсин (LT) и термостабильный токсин (ST) (Hofstra et al., 1984, J.Bio.Chem. 259:15182-15187). LT функционально, структурно и иммунологически связан с холерным токсином (СТ) (Clements et al., 1978, Infect. Immun. 21: 1036-1039). LT и CT синтезируются как молекулы голотоксина, состоящие из пяти одинаковых субъединиц В и ферментативно активной субъединицы А (АВ₅) (Spangler, 1992, Microbio. Rev. 56(4):622-647). Пентамер В связывает ганглиозид GM1 в мембране клеток эпителия кишечника или любых других клеток, которые содержат GM1 (van Heyningen, 1974, Science 183: 656-657). После связывания В субъединицы с GM1 на поверхности клеток, А субъединица встраивается в цитозоль и протеолитически отщепляется и восстанавливается по ее единственной дисульфидной связи с образованием ферментативно активного пептида А1 и более мелкого пептида А2 (Fishman PH, 1982, J.Membr.Biol. 69:85-97; Mekalanos et al., J.Biol.Chem. 254:5855-5861; Moss et al., 1981, J.Biol.Chem. 256:12861-12865). Пептид А1 способен связывать НАД и катализировать АДФ-рибозилирование Gs , ГТФ-связывающего регуляторного белка, ассоциированного с аденилатциклазой (Spangler, 1992, Microbio. Rev. 56(4):622-647). Возникающее повышение цАМФ в конечном счете приводит к высвобождению электролитов и жидкостей из пораженных клеток (Cheng et al., 2000, Vaccine 18:38-49).

Было показано, что LT действует как стимулятор слизистых оболочек и вызывает иммунный ответ против антигенов, вводимых совместно через слизистые (Clements et al., 1988, Vaccine 6:269-277; Elson CO. 1989, Immunol. Today 146:29-33; Spangler, 1992, Microbio. Rev. 56(4):622-647). Однако высокая токсичность LT дикого типа ограничивает его клиническое применение. Следовательно, желательно создать мутантные LT, имеющие сниженную токсичность при сохранении иммуногенности.

Термин «термолабильный энтеротоксин E.coli» или «LT», используемый в настоящем описании, относится к термолабильному энтеротоксину, продуцируемому любым энтеротоксигенным штаммом E.сoli. Термин «А субъединица термолабильного энтеротоксина E.coli» или «LT_A» относится к А субъединице LT. Она включает и предшественник LT_A, который содержит единственный пептид, и зрелую LT_A, в которой единственный пептид удален.

СУЩНОСТЬ

Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии, что LT, содержащий мутантную LT_A, проявляет сниженную токсичность по сравнению с его аналогом дикого типа при сохранении иммуногенности. Такая мутантная LT_A имеет замещение аминокислоты в положении, соответствующем положению 61 LT_A дикого типа, чья последовательность аминокислот SEQ ID NO:5 показана ниже.

Соответственно, в настоящем изобретении описан выделенный полипептид, включающий мутированную LT_A , которая содержит остаток аминокислоты, иной чем S, T и F, в положении, соответствующем положению 61 SEQ ID NO:5. Замещающим остатком аминокислоты может быть D, E, H, I, K, L, N, P, Q, R, Y, или W. Она может быть природной аминокислотой или неприродной аминокислотой, например D-аминокислотой или -аминокислотой. В одном примере LT_A имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:2, 4, 8 или 10. LT, содержащий такую мутированную LT_A, проявляет сниженную токсичность, т.е. в <10 ^-5 раз по сравнению с токсичностью LT дикого типа, содержащего SEQ ID NO:5.

В другом аспекте настоящее изобретение характеризует вакцину, содержащую антиген и мутированную LT _A, описанную выше. Вакцина может дополнительно включать В субъединицу LT, которая образует с мутированной LT_A цельный белок LT. Антиген может быть получен или от бактерии, или от вируса.

В еще одном аспекте настоящее изобретение характеризует выделенную нуклеиновую кислоту, включающую последовательность нуклеотидов, которая кодирует вышеописанный мутант LT_A. В одном примере последовательностью нуклеотидов является SEQ ID NO:1, 3, 7 или 9. Также в рамках настоящего изобретения находится вектор, включающий только что описанную нуклеиновую кислоту, и трансформированные клетки, содержащие вектор.

Подробности одного или более вариантов осуществления изобретения изложены в описании ниже. Другие характеристики, задачи и преимущества изобретения будут очевидны из описания и формулы изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Детоксифицированный LT, например, содержащий мутантную LT_A, представляет собой желаемый адъювант вакцины из-за его высокой иммуногенности. Мутантная LT_A по настоящему изобретению, созданная для достижения такой цели, получена путем введения замены аминокислоты в LT_A в положении, соответствующем положению 61 SEQ ID NO:5. LT_A, продуцируемые различными штаммами энтеротоксигенной E. Сoli, являются высоко гомологичными. Следовательно, при сравнении последовательности аминокислот LT_A с SEQ ID NO:5 опытный специалист может обнаружить, какое положение в этой LT_A соответствует положению 61 SEQ ID NO:5. Так же как LT_A SEQ ID NO:5, почти все LT_A дикого типа включают серин в положении, соответствующем положению 61 SEQ ID NO:5. Аминокислота, которая отличается от серина, например, размером или полярностью, может использоваться в качестве заместителя. Примеры заместителей аминокислот включают гидрофобные остатки аминокислот (например, I и L), заряженные остатки аминокислот (например, D, E, K, R, и H) или остатки аминокислот с крупными боковыми цепями (например, N, Q, Y или W). Пролин также может использоваться в качестве заместителя, так как он обычно изменяет локальную структуру полипептида. Такие заместители аминокислоты включают неприродные аминокислоты, например, D-аминокислоты или -аминокислоты.

Мутант LT_A по настоящему изобретению может быть получен способами, хорошо известными в области техники. Например, мутант получают рекомбинантными методами, как указано ниже. кДНК, которая кодирует LT_A дикого типа, выделяют из энтеротоксигенного штамма E.coli и подвергают сайт-направленному мутагенезу для получения кДНК, кодирующей желаемый мутант LT_A. См. Ho et al., Gene, 77:51-59, 1989. кДНК, несущую мутацию, затем вставляют в вектор экспрессии для трансформации клеток. Наконец, мутант LT_A , продуцируемый трансформированными клетками, очищают и объединяют с В субъединицей LT для получения цельного белка LT.

Токсичность LT, содержащего мутант LT_A, описанный выше, может быть оценена с использованием анализов, таких как исследование Y-1 надпочечниковых клеток. См. Cheng et al., Vaccine, 18:38-49, 2000.

Мутант LT_A по настоящему изобретению может быть использован в качестве адъюванта вакцины. Вакцина (т.е. человеческая вакцина или ветеринарная вакцина) может содержать антиген и сам мутант LT_A или LT, содержащий мутант LT_A. Антиген может быть получен от бактерий, например Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neiseria gonorrhoea, Neiseria meningitides, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumonia, Klebsiella ozaenae, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter jejuni, Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Salmonella typhimurium, Treponema pallidum, Borrelia vincentii, Borrelia burgdorferi, Mycobacterium tuberculosis, Pneumocystis carinii, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Chlamydia spp., Helicobacter pylori. Также он может быть получен из вируса, например гриппа, вируса простого герпеса, вируса иммунодефицита человека, цитомегаловируса, вируса гепатита С, вируса гепатита дельта, вируса полиомиелита, вируса гепатита А, вируса гепатита В, вируса Эпштейн-Барра, вируса ветряной оспы, респираторного синцитиального вируса, энтеровируса или вируса Японского энцефалита.

Вакцина может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель, такой как фосфатный буферный раствор или бикарбонатный раствор. Носитель выбирают на основе типа и пути введения, и стандартной фармацевтической практики. Подходящие фармацевтические носители и разбавители, а также основные фармацевтические составляющие для применения описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences.

Способы для получения вакцин в общем хорошо известны в данной области, что проиллюстрировано патентами США 4601903, 4599231; 4599230; и 4596792. Вакцины могут быть получены как инъекционные препараты, в виде жидких растворов или эмульсий. Антиген и мутант LT_A или LT, содержащий его, могут быть смешаны с физиологически приемлемыми вспомогательными веществами, которые могут включать воду, солевой раствор, декстрозу, глицерин, этанол и их комбинации. Вакцина может дополнительно включать небольшие количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие средства или средства, устанавливающие рН для повышения эффективности вакцин. Вакцины могут вводиться парентерально, подкожной или внутримышечной инъекцией. Альтернативно, могут быть желательны другие типы введения, включая суппозитории, пероральные или местные композиции. Для суппозиториев вяжущие средства и носители могут включать, например, полиалкаленгликоли или триглицериды. Пероральные композиции могут включать обычно используемые средства, такие как, например, фармацевтические виды сахарина, целлюлозы, карбоната магния и подобные. Такие композиции имеют форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, композиций длительного высвобождения или порошков.

Вакцины вводят образом, совместимым с лекарственной композицией, и в количестве, которое является терапевтически эффективным, защитным и иммуногенным. Количество для введения зависит от пациента, получающего лечение, включая, но не ограничиваясь, например, способность иммунной системы пациента синтезировать антитела и, если необходимо, продуцировать иммунный ответ, опосредованный клетками. Определенное количество активного ингредиента, требуемое для введения, зависит от мнения врача. Однако подходящие диапазоны доз легко определяются специалистом в данной области и могут быть порядка микрограмм полипептида по настоящему изобретению. Подходящие схемы для начального введения и реиммунизации также являются вариабельными, но могут включать исходное введение с последующими введениями. Дозировка вакцины также может зависеть от пути введения и варьирует в соответствии с размером организма-хозяина.

Специфические примеры ниже должны рассматриваться как по существу иллюстративные и не ограничивающие остальное описание каким-либо образом. Без дополнительных исследований считают, что специалист в данной области может, на основании настоящего описания, использовать настоящее изобретение наиболее полно. Все публикации, указанные в настоящем описании, таким образом полностью включены в настоящее описание в виде ссылки.

Пример 1: Создание генов, кодирующих LT_A дикого типа и LT с мутантной LT_A

Фрагмент ДНК 1,8 кб гена LT, включающий как А субъединицу, так и В субъединицу, выделяли из человеческой энтеротоксигенной E.сoli H10407 и клонировали в векторе pBluescript II KS(-) (pBluescript-LThWT). Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:6) гена LT (кодирующая и А и В субъединицы) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:5) А субъединицы этого LT показаны ниже:

Последовательность нуклеотидов (SEQ ID NO:6) LT (Субъединица А: 1-777; субъединица В: 774-1148)

Последовательность аминокислот (SEQ ID NO:5) зрелой LT_A

Различные мутанты LT_A создавали с использованием метода сайт-направленного мутагенеза (Ho et al., 1989, Gene 77, 51-59). В частности, мутанты LT _A, включая LT_A (S61K), LT_A (S61R), LT_A (S61H), LT_A (S61Y) и LT_A (S61F) создавали путем замены серина в положении 61 SEQ ID NO:5 K, R, H, Y и F, соответственно. Следующие олигонуклеотидное праймеры использовали для создания этих мутантов: LT_A (S61K) [5' TCT CAA ACT AAG AGA AGT TTT AAC ATA TCC GTC ATC ATA 3'] (SEQ ID NO:11), LT_A (S61R) [5' ACT TCT CAA ACT AAG AGA AGT TCT AAC ATA TCC GTC ATC 3'] (SEQ ID NO:12), LT _A (S61F) [5' ACT TCT CAA ACT AAG AGA AGT GAA AAC ATA TCC GTC ATC 3'] (SEQ ID NO:13), LT_A (S61Y) [5' ACT TCT CAA ACT AAG AGA AGT ATA AAC ATA TCC GTC ATC 3'] (SEQ ID NO:14), LT_A (S61H) [5' ACT TCT CAA ACT AAG AGA AGT ATG AAC ATA TCC GTC ATC 3'] (SEQ ID NO:15). Последовательности нуклеотидов и последовательности аминокислот этой LT_A показаны ниже:

Последовательность нуклеотидов (SEQ ID NO:1) LT_A (S61K)

Последовательность аминокислот (SEQ ID NO:2) LT_A (S61K)

Последовательность нуклеотидов (SEQ ID NO:3) LT_A (S61R)

Последовательность аминокислот (SEQ ID NO:4) LT_A (S61R)

Последовательность нуклеотидов (SEQ ID NO:7) LT_A (S61Н)

Последовательность аминокислот (SEQ ID NO:8) LT_A (S61Н)

Последовательность нуклеотидов (SEQ ID NO:9) LT_A (S61Y)

Последовательность аминокислот (SEQ ID NO:10) LT_A (S61Y)

Для сравнения другой мутант LT, LTp(S63K), полученный от EWD299 (Dallas et al., 1979, J.Bacteriol. 139, 850-859), также создавали путем замены серина в положении аминокислоты 63 А субъединицы лизином.

Пример 2: Получение LT дикого типа и LT, содержащего мутантную LT _A

Векторы pBluescript II KS(-), содержащие гены нативного или мутантного LT, включая гены для А субъединицы и В субъединицы, трансформировали в E. сoli HB101. Нативные и мутантные LT очищали из культур, выращиваемых в течение ночи в 3-литровой колбе, содержащей L-среду, дополненную 100 мкг ампициллина на мл. Клетки собирали центрифугированием, ресуспендировали в буфере TEAN (0,2 М NaCl, 50 мМ Tris, 1 мМ ЭДТА и 3 мМ NaN3, рН 7,4) и лизировали с помощью микрофлюидизатора (Microfluidics Corporation, USA). После этого лизаты осветляли центрифугированием, LT фракционировали добавлением твердого сульфата аммония до насыщения 65%. Затем препарат супендировали в буфере TEAN, тщательно диализировали таким же буфером и использовали в качестве сырого LT. Сырой LT подвергали хроматографии на колонках с иммобилизованной D-галактозой (Pierce, Rockford, IL), уравновешенных буфером TEAN при 4ºС (Uesaka et al., 1994, Microbial Pathogenesis 16:71-76). Нативные и мутантные LT элюировали 0,3 М галактозой в TEAN. Каждый очищенный токсин диализировали буфером PBS для биологических и иммунологических исследований.

Очищенные LT дикого типа и мутант разделяли SDS-PAGE, где молекулярная масса А субъединицы LT составила от около 28 до 29 кДа и молекулярная масса В субъединицы LT составила около 12-13 кДа. Выход цельного LT, содержащего LT_A (S61K), т.е. LTh(S61K) и LT _A (S61R), т.е. LTh (S61R) были сходным с LT, содержащим LT_A SEQ ID NO:5.

Гетерогексамеры АВ ₅ и пентамеры В₅ LT разделяли посредством рН 3-10 изоэлектрического фокусирующего геля (invitrogen). Интенсивность полос АВ5 и В5 оценивали с помощью программного обеспечения UVIBand (Uvitec Limited) для расчета процентного отношения гетерогексамеров АВ₅ и пентамеров В₅ (значение изоэлектрической точки (ИТ) АВ₅ составило между 8,0 и 7,8 и значение ИТ В₅ составило между 8,3 и 8,1), результаты перечислены в таблице 1.

Таблица 1 Получение LT дикого типа и LT, содержащего мутантную LTA
Термолабильный энтеротоксин (LT) E. coli	Соотношение АВ5/АВ5+В5 (%)
LTh(WT)	91(%)
LTh(S61K)	92(%)
LTh(S61R)	85(%)
LTh(S61H)	60(%)
LTh(S61F)	70(%)
LTh(S61Y)	57(%)
Процентные отношения АВ5 очищенного LTh(S61K) и LTh(S61R) составили около 90-100%.

Пример 3: Определение эффекта LT дикого типа и LT, содержащего мутантную LT_A, на внутриклеточный уровень цАМФ

Клетки Caco-2 (ATCC HTB-37) выдерживали в среде MEM- , дополненной 20% FBS, в 24-луночном планшете в концентрации 5×104 клеток на ячейку, выращенных почти до слияния, и инкубировали в MEM- , содержащей 1% FBS и 1 мМ 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX) в течение 30 мин в 5% СО2 перед добавлением токсинов (Grant et al., 1994, Infection and Immunity 62: 4270-4278). Нативный или мутантный LT добавляли к каждой ячейке и инкубировали в течение 4 часов. Затем клетки дважды промывали холодным PBS. Внутриклеточную цАМФ экстрагировали добавлением 200 мкл 0,1Н HCl к каждой ячейке и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. Надосадочную жидкость лизатов клеток собирали после добавления 0,1Н NaOH к каждой ячейке (Cheng et al., 2000, Vaccine 18: 38-49; Park et al., 1999, Experimental and Molecular Medicine 31: 101-107). ЦАМФ измеряли с помощью набора для иммуноферментного цАМФ (Assay designes; Correlate-EIA). Результаты, полученные в этом примере, показывают, что LTh(S61K) не увеличивает концентрации внутриклеточной цАМФ.

Пример 4: Определение токсичности LT, содержащего мутантную LT _A, с использованием анализа клеток опухоли надпочечников Y1

В этом исследовании образцы LT, включая LT дикого типа, мутант LT в активном сайте (h61K) и комплекс В субъединицы LT, В5, оценивали в отношении энтеротоксического эффекта. Мышиные клетки опухоли надпочечников Y-1 (ATCC CCL-79) выдерживали в среде Ham's F12, дополненной 15% лошадиной сыворотки, 2,5% эмбриональной сыворотки телят, 2 мМ L-глютамина и 1,5 г/л бикарбоната натрия, сеяли в 96-луночные плоскодонные планшеты в концентрации 2×10⁴ клеток на ячейку (200 мкл/ячейку) при 37°С в 5% СО2 в течение 48 час. Клетки в 96-луночных плоскодонных планшетах промывали дважды 1×PBS (рН 7,4) и затем обрабатывали серийно разведенными образцами LT (10 мкг/200 мкл ~ 10-10 мкг/200 мкл) при 37°С в 5% СО2 в течение ночи. Клетки исследовали световой микроскопией в отношении типичного округления клеток через 24 часа после обработки токсином. Активность определяли как минимальную концентрацию токсина, требуемую для стимуляции округления клеток (ECi) или концентрацию токсина, требуемую для округления 50% клеток (EC50). См. David et al., 1975, Infection and Immunity, 11: 334-336; Cheng et al., 1999, Vaccine 18: 38-49. Токсичность LTh(S61K), LTh(S61R), LTh(S61H) была существенно ниже по сравнению с LT дикого типа, т.е. 10 ^-6 по сравнению с 1. См. таблицу 2 ниже. Токсичность LTh(S61F) также была ниже (т.е. 10^-5), но снижение не было настолько существенным, как для других мутантов.

Таблица 2 Токсичность LT, содержащего LTA дикого типа или мутантную
Термолабильный энтеротоксин (LT) E.coli	Количество LT (пг/ячейку)	Интенсивность токсичности (LT дикого типа составляет 1)
LTh(WT)	0,1	1
LTh(S61K)	100000	10-6
LTh(S61R)	100000	10-6
LTh(S61H)	100000	10-6
LTh(S61F)	10000	10-5
LTh(S61Y)	100000	10-6
LTh(S61К)	10000	10-5

Пример 5: Определение токсичности LT, содержащего мутантную LT_A, исследованием петли подвздошной кишки кролика

Анализ проводили, как описано ранее (Gianelli et al., 1997, Infection and Immunity 65: 331-334; Guiliani et al., 1998, J.Exp.Med. 187: 1123-1132). Для этого исследования использовали взрослых Новозеландских кроликов, ~2,5 кг каждый. Петли, каждая длиной 5 см, получали начиная с конца тонкого кишечника кролика и продвигаясь в направлении желудка. 0,5 мл образцы различных количеств LT или мутантов LT вводили в каждую петлю и затем брюшную полость закрывали. Через 18 часов жидкость, накопившуюся в каждой петле, собирали и измеряли. Эксперимент проводили три раза и результаты выражали в миллилитрах на сантиметр. Результаты этого эксперимента показали, что 500 мкг LTh(S61K) накапливали только 1 мл жидкости в петле подвздошной кишки кролика, и объем накопленной жидкости был сходным с нативным контролем. Когда использовали 0,1 мкг LT дикого типа, объем накопившейся жидкости LT дикого типа был существенно больше, чем таковой LTh(S61K). Кроме того, накопление жидкости другого LTh(S63K) также было существенно больше, чем таковое LTh(S61K).

Пример 6: Определение адъювантного эффекта LT, содержащего мутантную LT_A, при интраназальной иммунизации

Деактивированный вирус гриппа, A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (PR8) (ATCC VR-95) использовали в этом примере. Вирусные частицы получали, как описано ранее в (Aitken et al., 1980, Eur.J.Biochem. 107:51-56; Gallagher et al., 1984, J.Clin.Microbiol , 20:89-93; Johansson et al., 1989, J.Virol. 63:1239-1246). Коротко, вирус размножали в аллантоисной полости 10-дневных эмбрионов куриных яиц при 35°С в течение двух дней. Аллантоисную жидкость из яиц, инфицированных PR8, сначала центрифугировали при низкой скорости и затем центрифугировали при 96000×g в течение 1 часа для осаждения вирусных частиц, которые ресуспендировали в фосфатном буферном растворе (PBS). Такие частицы нагружали в 30-60% градиент плотности сахарозы и центрифугировали в течение 5 часов при 96000×g. Фракцию, содержащую вирус, собирали и разводили PBS. Вирус дополнительно осаждали центрифугированием при 96000×g в течение 1 часа и ресуспендировали в PBS. Очищенный вирус обрабатывали 0,025% формалином при 4°С в течение недели. Концентрацию белка измеряли и стандартизировали на основании оптической плотности, Bio-Rad Protein Assay, и содержание гемагглютинина (НА) определяли электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле (Oxford et al., 1981, J.Biol.Stand.9:483-491).

Самок мышей BALB/c в возрасте от 6 до 8 недель получали из Taiwan National Laboratory Animal Center. Группы, состоящие из пяти мышей каждая, иммунизировали интраназально с помощью 25 мкл PBS, содержащего 20 мкг инактивированного вируса гриппа (flu.Ag) отдельно или в комбинации с 8 мкг нативного или мутантного LT под анестезией. Мышей ре-иммунизировали через 3 недели. Контрольным мышам давали PBS в таких же условиях. Через две недели после последней иммунизации мышей в каждой группе умерщвляли для получения сыворотки и проведения исследования ингибирования гемагглютинации (HI). Существенно увеличенные титры HI определяли у мышей, иммунизированных интраназально вакциной инактивированного вируса в комбинации с LTh(S61K) или LTh(S63K) при сравнении с мышами, иммунизированными интраназально отдельно вакциной инактивированного вируса. HI титр LTh(S61K) в комбинации с инактивированным вирусом был существенно повышен. HI титр LTh(S61K) в комбинации с вирусом составил 813, подобно таковому LTh(S63K) в комбинации с вирусом но больше, чем таковой вируса отдельно.

Пример 7: Определение адъювантного эффекта LT, содержавшего мутантную LT_A, при внутримышечной иммунизации

Методику, проводимую в примере 6, повторяли за исключением того, что при иммунизации использовали внутримышечное введение. Внутримышечные вакцины получали в 50 мкл PBS, содержащего 10 мкг вакцины инактивированного вируса отдельно или в комбинации с 4 мкг нативного или мутантного LT, и вводили в заднюю мышцу бедра. Схемы иммунизации и получения образцов проводили, как описано. HI титр LTh(S61K) в комбинации с инактивированным вирусом был существенно повышен. HI титр LTh(S61K) в комбинации с вирусом составил 512, что было существенно выше, чем таковой LT дикого типа в комбинации с вирусом или таковой вируса отдельно.

ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Все характеристики, описанные в настоящем описании, могут быть скомбинированы в любой комбинации. Каждая характеристика, описанная в настоящем описании, может быть заменена альтернативной характеристикой, служащей такой же, эквивалентной или сходной цели. Следовательно, если особым образом не указано иначе, каждая описанная характеристика является только примером характерной серии эквивалентов или сходных характеристик.

Из приведенного выше описания специалист в данной области может легко определить необходимые характеристики настоящего изобретения и без отклонения от его сущности и рамок может осуществлять различные изменения и модификации изобретения для адаптации его к различным применениям и условиям. Следовательно, другие варианты осуществления изобретения также находятся в рамках следующей формулы изобретения.