аттенуированный штамм mycoplasma gallisepticum, вакцинная композиция и способ вакцинации

Формула изобретения

1. Живой аттенуированный штамм бактерий Mycoplasma gallisepticum, депонированный в Американской коллекции типовых культур (АТСС) с регистрационным номером РТА-8485, для получения вакцины против микоплазменной инфекции.

2. Вакцинная композиция против микоплазменной инфекции, содержащая живой аттенуированный штамм бактерий Mycoplasma gallisepticum по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.

3. Способ вакцинации животного против инфекции Mycoplasma gallisepticum, включающий введение животному иммунологически эффективного количества вакцинной композиции по п.2.

4. Способ по п.3, где указанную вакцинную композицию вводят указанному животному прямой инъекцией, распылением или с питьевой водой.

Описание изобретения к патенту

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к областям микробиологии и иммунологии. Более конкретно изобретение относится к новым вакцинам против бактериальных патогенов.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Микоплазмы представляют собой мелкие прокариотические микроорганизмы (0,2-0,3 мкм), принадлежащие к классу Mollicutes, члены которого лишены клеточной стенки и имеют геном маленького размера. Mollicutes включают по меньшей мере 100 видов Mycoplasma. Виды Mycoplasma представляют собой возбудителей некоторых заболеваний человека и животных, не являющихся человеком, а также растений. М. gallisepticum, например, ответственна за существенные болезненные состояния домашней птицы. М. gallisepticum связывают с острым респираторным заболеванием куриц и индюков, а также она может вызывать заболевание верхних дыхательных путей охотничье-промысловых птиц. Кроме этого признано, что М. gallisepticum представляет собой причину конъюнктивита мексиканских чечевиц в Северной Америке.

Эффективная стратегия предупреждения и лечения заболеваний, вызываемых инфекцией М. gallisepticum, представляет собой вакцинацию живыми аттенуированными штаммами бактерий М. gallisepticum. Преимущества живых аттенуированных вакцин в общем включают представление всех релевантных иммуногенных детерминант инфекционного агента в их естественной форме иммунной системе хозяина и необходимость сравнительно небольших количеств иммунизирующего агента в соответствии со способностью агента к размножению в вакцинированном хозяине.

Живые аттенуированные вакцинные штаммы часто создают серийным многократным пассированием вирулентного штамма в средах. Хотя живые аттенуированные вакцинные штаммы против М. gallisepticum были получены серийным пассированием, такие штаммы в большинстве случаев недостаточно охарактеризованы на молекулярном уровне. Предполагают, что аттенуированные штаммы, полученные серийным пассированием, аккумулировали мутации, которые приводят микроорганизмы в менее вирулентное состояние, но сохраняют способность к репликации. Что касается аттенуированных штаммов М. gallisepticum, то последствия мутаций, которые приводят к аттенуации (например, идентичность белков, картину экспрессии которых изменили в аттенуированном штамме), однако, обычно неизвестны.

Таким образом, существует необходимость создания новых живых аттенуированных бактерий М. gallisepticum, которые охарактеризованы на белковом уровне и которые безопасны и эффективны в вакцинных композициях.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано, в частности, на неожиданном открытии того, что бактерии М. gallisepticum, которые проявляют пониженную экспрессию полипептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, являются и безопасными, и эффективными при использовании в качестве вакцины против инфекции М. gallisepticum у птиц. Полипептид SEQ ID NO: 1 также назван "MGA_0621" и имеет регистрационный номер NCBI NP_852784.

Соответственно настоящее изобретение относится к живым аттенуированным бактериям М. gallisepticum, которые проявляют пониженную экспрессию MGA_0621 относительно М. gallisepticum дикого типа. В конкретном неограничивающем типичном воплощении согласно изобретению предложен живой аттенуированный штамм М. gallisepticum, который проявляет пониженную экспрессию MGA_0621 и дополнительно проявляет пониженную экспрессию одного или более чем одного белка, выбранного из группы, состоящей из пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы и рибосомального белка L35, относительно бактерий М. gallisepticum дикого типа. Согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения живые аттенуированные бактерии М. gallisepticum по изобретению характеризуют с помощью белкового анализа как имеющие пониженную экспрессию одного или более чем одного из вышеупомянутых белков. Согласно одному типичному воплощению настоящего изобретения живой аттенуированный штамм М. gallisepticum представляет собой штамм, который проявляет пониженную экспрессию MGA_0621, пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы и рибосомального белка L35 относительно бактерий М. gallisepticum дикого типа и который депонировали в Американской коллекции типовых культур (АТСС), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 19 июня 2007, и ему присвоен регистрационный номер РТА-8485. Этот штамм альтернативно называют здесь "штамм М. gallisepticum MGx+47" или "MG-P48".

Согласно настоящему изобретению также предложены вакцинные композиции, содержащие живые аттенуированные бактерии М. gallisepticum по изобретению, а также способы вакцинации животного против инфекции М. gallisepticum.

В дополнение, согласно настоящему изобретению предложены способы создания и/или идентификации аттенуированных клонов М. gallisepticum. Согласно этому аспекту изобретения способы включают помещение исходной популяции бактерий М. gallisepticum в аттенуирующие условия, анализ отдельных клонов в отношении пониженной экспрессии MGA_0621 относительно М. gallisepticum дикого типа и тестирование клонов в отношении вирулентности. Клоны М. gallisepticum, созданные способами по этому аспекту изобретения, будут проявлять пониженную экспрессию MGA_0621 и, возможно, могут проявлять пониженную экспрессию одного или более чем одного дополнительного белка, выбранного из группы, состоящей из пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы и рибосомального белка L35. Предпочтительно, штаммы, которые проявляют пониженную экспрессию по меньшей мере одного из вышеупомянутых белков, также проявляют пониженную вирулентность относительно бактерии М. gallisepticum дикого типа.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг.1 представлена фотография "двумерного" (2-D) полиакриламидного геля, показывающего белковые пятна аттенуированного штамма М. gallisepticum MGx+47. Обведенные пятна с номерами 19, 49, 74, 108, 114, 127, 147, 166, 175 и 225 соответствуют белкам, которые позитивно регулируются в MGx+47 относительно штамма дикого типа R-980. Обведенные пятна с номерами 40, 68, 98, 99, 130, 136 и 217 соответствуют белкам, которые отрицательно регулируются в MGx+47 относительно штамма дикого типа R-980.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к живым аттенуированным бактериям М. gallisepticum, подходящим для применения в вакцинных композициях. Бактерии М. gallisepticum по настоящему изобретению проявляют пониженную экспрессию белка, названного MGA_0621. В некоторых воплощениях бактерии М. gallisepticum по изобретению дополнительно проявляют пониженную экспрессию одного или более чем одного дополнительного белка, выбранного из группы, состоящей из пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы и/или рибосомального белка L35, относительно экспрессии этих белков в бактерии М. gallisepticum дикого типа того же вида.

MGA_0621 идентифицирован под регистрационным номером NCBI NP_852784 и имеет следующую последовательность из 162 аминокислот: MTRTMKNKKAKKKERRFTDLSADLDEEVEKIDPEYEDFKEIKIEKNKDNQVIDKNDP FFYSESFEEARIQLIKDKKVEVKKEEEKVQETTVKNKISEAKKEEAKDVYIDSSLEIAS QEPLTKGMHFYTNSRIIRKVRECAKNKGLSISRLITMILDKSIKEE (SEQ ID NO: 1).

ПОНИЖЕННАЯ ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКОВ MYCOPLASMA GALLISEPTICUM

Специалист в данной области сможет определить, используя стандартные молекулярно-биологические методы, проявляет ли аттенуированная бактерия М. gallisepticum пониженную экспрессию одного или более чем одного белка, который в норме экспрессируют бактериальные клетки М. gallisepticum дикого типа. Определение того, проявляет ли аттенуированная бактерия пониженную экспрессию определенного белка (например, MGA_0621, пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы, рибосомального белка L35 и так далее) относительно бактерии дикого типа, можно выполнить с помощью нескольких способов, известных в данной области. Типичные способы включают, например, основанные на антителах количественные способы, такие как вестерн-блоттинг, радиоиммуноанализы (RIA) и твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), в которых используют антитело, выявляющее и связывающее интересующий белок. В дополнение, поскольку уровни матричной РНК (мРНК) обычно отражают количество белка, кодируемого с нее, основанные на нуклеиновых кислотах количественные способы также можно использовать для определения, проявляет ли аттенуированная бактерия М. gallisepticum пониженную экспрессию одного или более чем одного белка. Например, количественные способы, основанные на полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (RT-PCR), можно использовать для измерения количества мРНК, соответствующей определенному интересующему белку. Многочисленные основанные на нуклеиновых кислотах количественные способы хорошо известны в данной области.

Нижеследующее представляет собой неограничивающий типичный способ, который можно использовать для определения, проявляет ли аттенуированная бактерия М. gallisepticum пониженную экспрессию такого белка, как, например, MGA_0621.

Сначала популяцию аттенуированных клеток М. gallisepticum и популяцию клеток М. gallisepticum дикого типа выращивают в по существу идентичных условиях на по существу одинаковой культуральной среде. Далее эти две популяции клеток помещают в условия, разрушающие клетки. Разрушенные клетки (или их содержащие белок фракции) параллельно подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), а затем вестерн-блоттингу, используя антитело, которое связывает белок MGA_0621 М. gallisepticum (такие антитела можно получить, используя стандартные способы, хорошо известные в данной области). Затем меченое вторичное антитело используют, чтобы обеспечить измеримый сигнал, который пропорционален количеству белка, извлеченному из клеток. Если величина сигнала, показанного аттенуированным штаммом М. gallisepticum, меньше величины сигнала, показанного штаммом М. gallisepticum дикого типа, то можно сделать вывод о том, что аттенуированный штамм проявляет пониженную экспрессию MGA_0621 относительно штамма дикого типа. Вариации этого типичного способа, а также его альтернативы будут очевидны для специалистов в данной области.

Настоящее изобретение включает аттенуированные бактерии М. gallisepticum, которые проявляют любую степень понижения экспрессии белка (например, MGA_0621, пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы, рибосомального белка L35 и так далее) по сравнению с экспрессией этого белка, наблюдаемой в штамме дикого типа. В некоторых воплощениях аттенуированная бактерия проявляет по меньшей мере приблизительно на 5% меньшую экспрессию белка относительно бактерии дикого типа. В качестве примера: если данное количество штамма М. gallisepticum дикого типа проявляет 100 единиц экспрессии определенного белка, а такое же количество аттенуированного штамма-кандидата М. gallisepticum проявляет 95 единиц экспрессии белка, то делают вывод о том, что аттенуированный штамм проявляет на 5% меньшую экспрессию белка относительно бактерии дикого типа (дополнительные примеры вычисления "процента уменьшения экспрессии" изложены далее здесь). В некоторых других воплощениях аттенуированная бактерия проявляет по меньшей мере приблизительно на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% меньшую экспрессию белка относительно бактерии М. gallisepticum дикого типа. В других воплощениях аттенуированный штамм М. gallisepticum не проявляет экспрессию (то есть проявляет на 100% меньшую экспрессию) белка относительно бактерии М. gallisepticum дикого типа.

В некоторых типичных воплощениях настоящему изобретения аттенуированные бактерии проявляют по меньшей мере на 5% меньшую экспрессию MGA_0621 и, возможно, по меньшей мере на 5% меньшую экспрессию одного или более чем одного белка, выбранного из группы, состоящей из пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы и рибосомального белка L35, относительно бактерии М. gallisepticum дикого типа.

Использованный здесь термин "процент уменьшения экспрессии" определенного белка, показанный аттенуированным штаммом М. gallisepticum относительно штамма дикого типа, вычисляют по следующей формуле: (А-В)/А×100; где А = относительный уровень экспрессии белка в штамме М. gallisepticum дикого типа; и В = относительный уровень экспрессии белка в аттенуированном штамме. Только с целью иллюстрации, если штамм М. gallisepticum дикого типа проявляет 0,2500 единиц экспрессии белка "Y", а аттенуированный штамм М. gallisepticum проявляет 0,1850 единиц экспрессии белка "Y", то говорят, что аттенуированный штамм проявляет на [(0,2500-0,1850)/0,2500×100]=26% меньшую экспрессию белка "Y" относительно штамма дикого типа. В таблице 5 в Примере 3 здесь представлены дополнительные иллюстративные примеры процента уменьшения экспрессии, вычисленного для типичного аттенуированного штамма М. gallisepticum относительно штамма М. gallisepticum дикого типа.

ВАКЦИННЫЕ КОМПОЗИЦИИ

Настоящее изобретение также включает вакцинные композиции, содержащие живую аттенуированную бактерию М. gallisepticum по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Использованное здесь выражение "живая аттенуированная бактерия М. gallisepticum по изобретению" охватывает любую живую аттенуированную бактерию М. gallisepticum, описанную и/или заявленную здесь. Фармацевтически приемлемым носителем могут быть, например, вода, стабилизатор, консервант, культуральная среда или буфер. Вакцинные композиции, содержащие аттенуированные бактерии М. gallisepticum по изобретению, можно приготовить в форме суспензии, или в лиофилизированной форме, или альтернативно в замороженной форме. Если форма замороженная, можно добавлять глицерин или другие подобные агенты для увеличения стабильности при заморозке.

СПОСОБЫ ВАКЦИНАЦИИ ЖИВОТНОГО

Настоящее изобретение также включает способы вакцинации животного против инфекции М. gallisepticum. Способы по этому аспекту изобретения включают введение животному иммунологически эффективного количества вакцинной композиции, содержащей живую аттенуированную бактерию М. gallisepticum по изобретению. Использованное здесь выражение "живая аттенуированная бактерия М. gallisepticum по изобретению" охватывает любую живую аттенуированную бактерию М. gallisepticum, описанную и/или заявленную здесь. Выражение "иммунологически эффективное количество" означает такое количество вакцинной композиции, которое необходимо для вызова продукции защитных уровней антител у вакцинированного животного. Вакцинную композицию можно вводить животному любым способом, известным в данной области, включая пероральный, интраназальный, через слизистые оболочки, местный, трансдермальный и парентеральный (например, внутривенный, внутрибрюшинный, внутрикожный, подкожный или внутримышечный) пути. Введение также можно выполнять, используя безыгольные устройства для доставки. Введение также можно выполнять, используя комбинацию путей, например первое введение, используя парентеральный путь, а следующее введение, используя путь введения через слизистые оболочки и так далее.

Животное, которому вводят аттенуированный штамм М. gallisepticum, предпочтительно представляет собой птицу, например курицу или индюка. Если животное представляет собой птицу, вакцинные композиции по изобретению можно вводить так, что композиции немедленно или со временем входят в контакт со слизистыми оболочками дыхательных путей птицы. Таким образом, вакцинные композиции можно вводить птицам, например, интраназально, перорально и/или в глаза. Вакцинные композиции для введения птицам можно изготавливать, как описано выше и/или в форме, подходящей для введения распылением, включая аэрозоль (для интраназального введения), или в питьевой воде (для перорального введения).

Вакцинные композиции по настоящему изобретению, которые вводят распылением или аэрозолем, можно изготовить путем включения живых аттенуированных бактерий М. gallisepticum в маленькие частицы жидкости. Частицы могут иметь исходный размер капель от примерно 10 мкм до примерно 100 мкм. Такие частицы можно создать с помощью, например, обычного распылителя или аэрозольных генераторов, включая имеющиеся в продаже распылители для "ранцевого" распыления (knapsack spray), "инкубаторного" распыления (hatchery spray) и "пульверизаторного" распыления (atomist spray).

СПОСОБЫ СОЗДАНИЯ АТТЕНУИРОВАННЫХ КЛОНОВ М. GALLISEPTICUM

В другом аспекте настоящего изобретения согласно изобретению предложены способы идентификации и/или создания аттенуированных клонов М. gallisepticum. Способы по этому аспекту изобретения включают помещение исходной популяции бактерий М. gallisepticum в аттенуирующие условия, создание посредством этого предположительно аттенуированной бактериальной популяции. Затем отдельные клоны предположительно аттенуированной бактериальной популяции анализируют в отношении пониженной экспрессии MGA_0621 относительно бактерии М. gallisepticum дикого типа. Клоны, которые идентифицируют как имеющие пониженную экспрессию MGA_0621, затем тестируют в отношении вирулентности. Клоны, которые проявляют и пониженную экспрессию MGA_0621, и пониженную вирулентность относительно бактерии М. gallisepticum дикого типа, идентифицируют как аттенуированные клоны М. gallisepticum.

Согласно этому аспекту изобретения "исходная популяция бактерий М. gallisepticum" может представлять собой любое количество бактерий М. gallisepticum. Бактерии в некоторых воплощениях представляют собой бактерии дикого типа. В качестве альтернативы бактерии могут содержать одну или более чем одну мутацию. Предпочтительно, однако, бактерии в исходной популяции являются клонально идентичными или по существу клонально идентичными; то есть предпочтительно все бактерии имеют происхождение из одной родительской бактериальной клетки М. gallisepticum, и/или они имеют идентичные или по существу идентичные генотипические и/или фенотипические характеристики.

Использованный здесь термин "аттенуирующие условия" означает любое условие или комбинацию условий, которое(ая) имеет возможность вносить одно или более чем одно генетическое изменение (например, нуклеотидные мутации) в геном бактерии М. gallisepticum. Типичные неограничивающие аттенуирующие условия включают, например, пассирование бактерий в культуре, трансформацию бактерий встраиваемым в геном генетическим элементом, таким как транспозон (например, транспозон, который случайным образом встраивается в геном М. gallisepticum), воздействие на бактерии одним или более чем одним мутагеном (например, химическими мутагенами или ультрафиолетовым излучением) и так далее. Если бактериальные клетки аттенуируют пассированием in vitro, клетки можно пассировать любое количество раз, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 или более раз in vitro.

Исходную популяцию клеток М. gallisepticum после воздействия аттенуирующих условий называют здесь предположительно аттенуированной бактериальной популяцией. Отдельные клоны предположительно аттенуированной бактериальной популяции можно получить стандартными микробиологическими методами, включая, например, серийное разведение клеток и выделение отдельных клеток на подходящих средах. Полученные отдельные клоны предположительно аттенуированной бактериальной популяции анализируют в отношении пониженной экспрессии MGA_0621 и/или одного или более чем одного дополнительного конкретного белка. Способы определения того, проявляет ли аттенуированная бактерия М. gallisepticum пониженную экспрессию одного или более чем одного белка, который в норме экспрессируют бактериальные клетки М. gallisepticum дикого типа, описаны здесь. Типичные способы включают, например, способы, основанные на RT-PCR, вестерн-блоттинг и так далее.

Отдельные клоны, которые идентифицируют как имеющие пониженную экспрессию MGA_0621, можно тестировать в отношении вирулентности путем введения этих клонов животному, которое восприимчиво к заражению вариантом бактерии дикого типа (неаттенуированным). Использованный здесь термин "животное, которое восприимчиво к заражению бактерией М. gallisepticum дикого типа" представляет собой животное, которое показывает по меньшей мере один клинический симптом после заражения бактерией М. gallisepticum дикого типа. Такие симптомы известны специалистам в данной области. Например, в случае предположительно аттенуированного штамма М. gallisepticum, который проявляет пониженную экспрессию, например MGA_0621, штамм можно вводить, например, индюкам или курицам (которые в норме восприимчивы к заражению М. gallisepticum дикого типа). Клинические симптомы заражения домашней птицы М. gallisepticum включают, например, острые респираторные симптомы, перикардит, перигепатит, воспаление воздушных мешков, утолщение трахеи, понижение прироста массы тела, децилиация, аномальные бокаловидные клетки, расширение капилляров, увеличенное количество лимфоцитов, плазматических клеток и/или гетерофилов и в некоторых случаях понижение яйценоскости. Таким образом, если предположительно аттенуированный штамм М. gallisepticum при введении курице или индюку приводит к меньшему количеству и/или менее тяжелым симптомам по сравнению с индюком или курицей, которых заразили штаммом М. gallisepticum дикого типа, то предположительно аттенуированный штамм М. gallisepticum считают имеющим "пониженную вирулентность". Любая степень уменьшения симптомов будет определять предположительно аттенуированный штамм как имеющий пониженную вирулентность. В некоторых воплощениях предположительно аттенуированный штамм будет авирулентным.

Согласно настоящему изобретению клон М. gallisepticum, который проявляет пониженную экспрессию MGA_0621 (и/или одного или более чем одного дополнительного конкретного белка) и который проявляет пониженную вирулентность относительно бактерии М. gallisepticum дикого типа, представляет собой аттенуированный клон М. gallisepticum. Типичный живой аттенуированный клон М. gallisepticum по настоящему изобретению, который проявляет пониженную экспрессию MGA_0621 (наряду с пониженной экспрессией пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы и рибосомального белка L35) представляет собой штамм, обозначенный MGx+47. MGx+47 депонировали в Американской коллекции типовых культур, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 19 июня 2007, и ему был присвоен регистрационный номер РТА-8485.

Следующие примеры способа и композиций по настоящему изобретению являются иллюстративными, но не ограничивающими. Другие подходящие модификации и адаптации многообразия условий и параметров, в норме встречающихся в молекулярной биологии и химии, которые очевидны специалистам в данной области с учетом настоящего описания, находятся в пределах сущности и объема данного изобретения.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

СОЗДАНИЕ ЖИВОГО АТТЕНУИРОВАННОГО ШТАММА М. GALLISEPTICUM

Новый живой аттенуированный штамм Mycoplasma gallisepticum создали многократным пассированием штамма М. gallisepticum дикого типа R980 in vitro. В частности, 0,1 мл посевного материала штамма М. gallisepticum дикого типа R980 вносили в 20 мл модифицированной среды Фрея (Frey et al., Am. J. Vet. Res. 29:2163-2171 (1968)) (также названной здесь "культуральная среда MG"). Клетки дикого типа выращивали до тех пор, пока цвет среды не изменился на ярко-желтый. Ярко-желтые культуры затем использовали для пересева на свежие культуральные среды MG, как описано выше. Культуру пассировали таким образом в общей сложности 47 раз. Полученный штамм тестировали в отношении аттенуации путем вакцинирования групп птиц и последующего их заражения М. gallisepticum дикого типа. Всех птиц вскрывали через две недели после заражения и наблюдали патологии, связанные с микоплазмой. Многократно пассированный штамм (х+47) обеспечил защиту от клинических признаков, связанных с заражением Mycoplasma gallisepticum. Этот аттенуированный штамм М. gallisepticum, обозначенный MGx+47, депонировали в Американской коллекции типовых культур, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 19 июня 2007, и ему был присвоен регистрационный номер РТА-8485.

ПРИМЕР 2

ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ЖИВОЙ АТТЕНУИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ М. GALLISEPTICUM У КУРИЦ

В этом примере безопасность и эффективность нового вакцинного штамма М. gallisepticum MGx+47, полученного в Примере 1, оценивали у куриц.

Семьдесят одну свободную от патогенных микробов (SPF) белую курицу леггорн разделили на семь групп следующим образом:

Таблица 1
План исследования
Группа	# Куриц	Вакцинированные	Зараженные
1	11	Нет	Да
2	10	Да	Нет
3	11	Да	Да
4а	10	Да	Нет
4б	11	Да	Нет
4в	9	Да	Нет
5	9	Нет	Нет

Куриц в группах 2, 3, 4а, 4б и 4в вакцинировали аттенуированным штаммом MGx+47 в количестве 3,62×10⁷ CCU/мл/птица, введенным грубым распылением в возрасте 4 недель. Куриц в группах 1 и 3 заражали интратрахеально (IT) в возрасте 7 недель 0,5 мл штамма Mycoplasma gallisepticum R в количестве 7,74×10⁵ CCU/мл. На курицах из групп 1, 2, 3 и 5 аутопсию выполняли в возрасте 9 недель, а на курицах из групп 4а, 4б и 4в аутопсию выполняли на 7, 14 и 21 день после вакцинации (DPV) соответственно. У куриц оценивали средний прирост массы тела, перикардит, перигепатит, воспаление воздушных мешков и трахеит. Результаты обобщены в таблице 2.

КЛЮЧ К ТАБЛИЦАМ БЕЗОПАСНОСТИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ (ТАБЛИЦЫ 3 И 4):

- Всех "вакцинированных" птиц вакцинировали грубым распылением вакцинного штамма MGx+47 в количестве 3,62×10⁷ CCU/мл/птица.

- Всех "зараженных" птиц заражали интратрахеально (IT) 0,5 мл штамма Mycoplasma gallisepticum R в количестве 7,74×10 ⁵ CCU/мл.

- Момент времени (в Таблице 3: Таблица безопасности) означает количество дней после вакцинации, когда обследовали куриц, выражено как # дней после вакцинации (DPV).

- Реснички: "N" = нормальные реснички; "-" = децилиация.

- Бокаловидные клетки/М ("-" = нормальные бокаловидные клетки; "+" = слизь на дыхательной поверхности).

- Расширение капилляров ("-" = нет расширения или воспаления; "+" = умеренное расширение или воспаление капилляров; "++" = тяжелое расширение или воспаление капилляров).

- LC/PC = лимфоциты и плазматические клетки ("-" = нет; "+" = незначительное количество; "++++" = многочисленные).

- PMN = гетерофилы = полиморфноядерные нейтрофилы ("-" = нет; "+" = незначительное количество; "++++" = многочисленные).

Гистологическое исследование 2 группы куриц (вакцинированных, но незараженных) было по существу похоже на гистологическое исследование 5 группы куриц (невакцинированных, незараженных), показывая безопасность нового созданного вакцинного штамма MGx+47. (См., например, Таблицу 2 выше.)

Что касается эффективности, 3 группа куриц (вакцинированных и зараженных) показала значительное уменьшение воспаления воздушных мешков по сравнению с 1 группой куриц (невакцинированных и зараженных). (См., например, Таблицы 2 и 4.) В дополнение, как показано в Таблице 4, 3, группа куриц показала меньшее количество гистологических признаков заражения М. gallisepticum относительно ресничек, бокаловидных клеток, расширения капилляров, лимфоцитов и плазматических клеток (LC/PC), гетерофилов (PMN) и толщины трахеи. (См. Таблицу 4.)

Таким образом, этот Пример показывает, что MGx+47 представляет собой безопасный и эффективный живой аттенуированный вакцинный штамм М. gallisepticum.

ПРИМЕР 3

БЕЛКОВАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВАКЦИННОГО ШТАММА MGx+47

При попытке более точно охарактеризовать вакцинный штамм MGx+47 (см. Примеры 1 и 2) на молекулярном уровне проводили белковый анализ этого штамма.

В этом Примере из штамма М. gallisepticum дикого типа R-980 и из нового идентифицированного вакцинного штамма MGx-47 выделяли общий белок. Белки каждого штамма разделяли двумерным электрофорезом в полиакриламидном геле, а затем компьютерным анализом изображений геля. (См. Фиг.1.) Идентифицировали белковые пятна, которые характерно экспрессировал вакцинный штамм. Белковые пятна, которые отсутствовали или которые были экспрессированы в значительно более низких уровнях в вакцинном штамме по сравнению со штаммом дикого типа, вырезали из геля.

Идентифицировали пять пятен, которые были экспрессированы в значительно более низких уровнях в вакцинном штамме MGx+47 по сравнению с М. gallisepticum дикого типа. Каждое из этих белковых пятен вырезали из геля и гидролизовали ферментами. Затем проводили массовое картирование пептидов, используя времяпролетную масс-спектрометрию с ионизацией методом лазерной десорбции из матрицы (MALDI-TOF MS). Масс-спектры, определенные для каждого белкового пятна, сравнивали с базой данных масс пептидов, чтобы идентифицировать белки и соответствующие гены, которые их кодируют. Результаты этого анализа обобщены в Таблице ниже:

Таблица 5
Результаты белкового анализа MGx+47
Ген	Продукт	Функция	Уровень экспрессии в MG дикого типа	Уровень экспрессии в MGx+47	Процент снижения экспрессии
асоА	Пируватдегидрогеназа	Необходим для получения и преобразования энергии (цикл Кребса)	0,1872	0,0858	54,2%
eno	Фосфопируватгидра- таза	Катализирует образование фосфоенолпирувата	0,0683	0,0173	74,7%
deoC	2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолаза	Необходим для метаболизма нуклеотидов	0,0525	0,0309	41,1%
rpml	Рибосомальный белок L35	Трансляция, структура и биогенез рибосом	0,1171	0,0259	77,9%
MGA_0621	Гипотетический белок	Неизвестна	0,4534	0,0835	81,6%

Снижение экспрессии генных продуктов также можно выразить в показателях "кратное снижение экспрессии". Например, в Таблице 5 про штамм MGx+47 можно сказать, что он проявляет 2,2-, 3,9-, 1,7-, 4,5- и 5,4-кратное снижение экспрессии асоА, eno, deoC, rpml и MGA_0621 соответственно относительно MG дикого типа.

Как указано в Таблице 5, определили, что пять генных продуктов имели значительно пониженную экспрессию в живом аттенуированном вакцинном штамме MGx+47 по сравнению со штаммом дикого типа R-980: АсоА, Eno, DeoC, Rpml и MGA_0621 (гипотетический белок, идентифицированный под регистрационным номером NCBI NP_852784). Наибольшее снижение экспрессии наблюдали для MGA_0621. Таким образом, мутации или условия роста, которые вызывают снижение экспрессии MGA_0621, вероятно, приводят к аттенуации М. gallisepticum. Следовательно, отрицательная регуляция MGA_0621, по-видимому, является эффективной стратегией для создания аттенуированных штаммов М. gallisepticum.

Хотя вышеизложенное изобретение описано довольно подробно с помощью иллюстраций и примеров в целях ясности понимания, это изобретение не ограничено конкретными раскрытыми воплощениями, а предназначено для рассмотрения всех изменений и модификаций, которые находятся в пределах сущности и объема изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения.

Все публикации и патенты, упомянутые в этом описании, служат признаком уровня квалификации специалистов в данной области, к которой относится это изобретение. Все публикации и патенты включены сюда посредством ссылки в такой же степени, как если бы каждую отдельную публикацию или патентную заявку специально и отдельно указали для включения посредством ссылки.