связывающее вещество патологического прионного белка и способ обнаружения патологического прионного белка

Формула изобретения

1. Связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка, включающее лактоферрин.

2. Связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка по п.1, где лактоферрин иммобилизован на связывающем материале.

3. Связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка по п.1 или 2, которое представляет собой агент для обнаружения патогенной изоформы прионного белка.

4. Способ обнаружения патогенной изоформы прионного белка, включающий стадии:

контактирование образца со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка по п.2;

отделение связанного компонента от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, приведенного в контакт с образцом; и

обнаружение патогенной изоформы прионного белка, содержащейся в компоненте, отделенной от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка.

5. Способ по п.4, где на стадии обнаружения патогенной изоформы прионного белка, содержащейся в компоненте, отделенной от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, обнаружение патогенной изоформы прионного белка осуществляют посредством иммуноанализа.

6. Способ выделения патогенной изоформы прионного белка, включающий стадии:

контактирование образца со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка по п.2; и

отделение связанного компонента от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, приведенного в контакт с образцом.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

[0001] Настоящее изобретение относится к связывающему веществу патогенной (патологической) изоформы прионного белка и к способу обнаружения патогенной (патологической) изоформы прионного белка.

Предшествующий уровень развития данной области

[0002] Так называемые «прионные заболевания» являются серьезной социальной проблемой. Примеры прионных заболеваний включают трансмиссивные губчатые заболевания головного мозга (энцефалопатии, ТГЭ), такие как скрейпи, губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (БГЭ) и болезнь Крейцфельда-Якоба (БКЯ).

[0003] На основании различных данных стало ясно, что такие прионные заболевания вызываются инфекционными прионными белками (патогенная изоформа прионного белка) (PrP ^Sc).

[0004] Для предотвращения распространения прионных заболеваний у людей и животных и для того, чтобы обеспечить безопасность лекарственных средств и пищи, предпринимались различные попытки обнаружить в образцах инфекционный прионный белок (патогенная изоформа прионного белка).

[0005] Однако в человеческом организме и организмах животных уже содержится неинфекционный прионный белок (нормальный прионный белок) (PrP^c), который не вызывает прионные заболевания. Удивительно, что обычный прионный белок имеет такую же аминокислотную последовательность (первичную структуру), что и патогенная изоформа прионного белка, и единственное различие между нормальной и патогенной изоформами прионных белков, имеющих одинаковую последовательность аминокислот, заключается в их более высокой структуре.

[0006] Обычно в случае обнаружения двух типов белков отдельно друг от друга можно использовать специфическое антитело, с помощью которого можно провести различие между данными двумя типами белка. Однако специфическое антитело, которое может отличить патогенную форму прионного белка от нормального патогенного белка, пока еще получено не было, вероятно, вследствие идентичности их последовательности аминокислот, как описано выше. То есть все еще нет возможности практического применения способа обнаружения инфекционного прионного белка (патогенной изоформы прионного белка), содержащегося в образце, с использованием специфического антитела.

[0007] Ввиду указанного способ обнаружения патогенной изоформы прионного белка ограничен, главным образом, следующими двумя типами способов.

[0008] Первый способ представляет способ, в котором образец, в котором, как предполагается, содержится патогенная изоформа прионного белка (инфекционный прионный белок), вводят в мозг тест-животных и тест-животных содержат в течение продолжительного периода времени для контроля нейропатологических изменений в образцах мозга, взятых у них.

[0009] Этот способ является надежным, но, к сожалению, является времязатратным и дорогостоящим. Соответственно такой способ используют только для калибровки других различных способов обнаружения, и он не стал общепринятым стандартным способом.

[0010] Другой способ представляет собой способ, в котором используется протеаза К. Известно, что нормальный прионный белок легко деградирует (т.е. является чувствительным) под действием протеазы К, но, с другой стороны, патогенная изоформа прионного белка трудно деградирует под действием (т.е. является устойчивой) протеазы К, возможно, из-за своей структуры более высокого порядка. Таким образом, патогенная изоформа прионного белка может быть обнаружена при использовании различия между нормальной и патогенной изоформами прионных белков в отношении чувствительности (устойчивости) к деградации протеазой К. Например, образец обрабатывают и не обрабатывают протеазой К, а затем анализируют с помощью, например, иммуноблоттинга с использованием поликлонального антитела. В том случае, если полосы белка обнаруживаются с помощью иммуноблоттинга в образце, не обработанном протеазой К, делают вывод, что полосы белка представляют собой патогенную изоформу прионного белка. С другой стороны, в том случае, когда полосы белка, обнаруживаемые с помощью иммуноблоттинга в образце, не обработанном протеазой К, исчезают (т.е. не обнаруживаются) при иммуноблоттинге образца, обработанного протеазой К, то делают вывод о том, что полосы белка относятся к нормальному прионному белку.

[0011] Этот способ с использованием протеазы К широко распространен в настоящее время, и были предложены его многочисленные варианты (см., например, патентные документы 1-3).

[0012] Однако при таком способе необходима ферментативная обработка и соответственно требуется время для проведения ферментативной реакции, и он осложнен тем, что необходимо создать условия, подходящие для ферментативной реакции. Таким образом, в принципе, этот способ имеет недостатки, связанные с недостаточной быстротой и простотой определения и с необходимостью применения в качестве реагента относительно дорогого фермента.

Патентный документ 1: выложенная патентная заявка Японии № 10-267928

Патентный документ 2: выложенная патентная заявка Японии № 11-32795

Патентный документ 3: выложенная патентная заявка Японии № 2003-121448

Описание изобретения

Задачи, решаемые настоящим изобретением

[0013] Ввиду вышеизложенного существует необходимость в способе обнаружения патогенной изоформы прионного белка независимо от нормального прионного белка, который был бы быстрым, простым и количественным, с высокой чувствительностью без предварительной ферментативной обработки с использованием протеазы К.

[0014] Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в создании способа обнаружения патогенной изоформы прионного белка независимо от нормального прионного белка, который был бы быстрым, простым и количественным, с высокой чувствительностью без предварительной ферментативной обработки с использованием протеазы К, и создании средства для обнаружения, которое могло бы использоваться в данном способе.

[0015] Кроме того, также имеется необходимость в реагенте (связующем веществе), который не связывается с нормальным прионным белком, но специфически связывается с патогенной изоформой прионного белка и который мог бы использоваться в таком способе обнаружения.

[0016] Таким образом, другая задача настоящего изобретения заключается в создании реагента (связывающего вещества), который не связывается с нормальным прионным белком, но специфически связывается с патогенной изоформой прионного белка.

Способы решения проблемы

[0017] Для достижения вышеуказанных задач авторы настоящего изобретения проводили интенсивное исследование способа специфического обнаружения патогенной изоформы прионного белка и в результате установили, что лактоферрин, который представляет собой белок, полученный из молока млекопитающих, не связывается с нормальным прионным белком, но специфически связывается с патогенной изоформой прионного белка. Данное открытие привело к осуществлению настоящего изобретения.

[0018] Таким образом, лактоферрин является долгожданным реагентом (т.е. связующим агентом, связывающим агентом, осуществляющим связывание агентом), который не связывается с нормальным прионным белком, но специфически связывается с патогенной изоформой прионного белка. Использование лактоферрина делает возможным обнаружить патогенную изоформу прионного белка независимо от нормального прионного белка без предварительной ферментативной обработки с использованием протеазы К.

[0019] Кроме того, использование свойства лактоферрина специфически связываться с патогенной изоформой прионного белка делает возможным не только специфически обнаруживать патогенную изоформу прионного белка, но также проводить специфическое разделение (включая выделение, очистку и концентрирование) патогенной изоформы прионного белка, специфическую иммобилизацию патогенной изоформы прионного белка и специфическое ингибирование самосборки патогенной изоформы прионного белка, тем самым обеспечивая возможность новому применению, которое не возможно с помощью обычного способа, включающего ферментативную обработку протеазой К. То есть связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка по настоящему изобретению обладает таким полезным действием.

[0020] Таким образом, настоящее изобретение относится к:

(1) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка (связывающий агент), включающему лактоферрин.

(2) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка (связывающий агент), имеющему фрагмент, связывающий патогенную изоформу прионного белка, состоящий из лактоферрина.

[0021] Кроме того, лактоферрин может быть иммобилизован на связующем веществе (т.е. носителе, субстрате, материале носителя, материале основы). При использовании такого связывающего материала с иммобилизованным лактоферрином возможно особенно эффективно проводить отделение патогенной изоформы прионного белка от нормального прионного белка (включая выделение, очистку и концентрирование патогенной изоформы прионного белка) с получением только патогенной изоформы патогенного белка, связывания и иммобилизации патогенной изоформы прионного белка с лактоферрином и обнаружения патогенной изоформы прионного белка.

[0022] Таким образом, настоящее изобретение также относится к:

(3) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка в соответствии с вышеуказанными пунктами (1) и (2), где лактоферрин иммобилизуют на связывающем материале (носителе).

(4) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка в соответствии с вышеуказанными пунктами (1) и (2), где лактоферрин иммобилизуют в качестве фрагмента, связывающего патогенную изоформу прионного белка, на связывающем материале (носителе).

(5) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка в соответствии с вышеуказанными пунктами (3) и (4), где связывающий материал представляет собой бусы.

(6) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка в соответствии с вышеуказанным пунктом (5), где бусы представляют собой намагничиваемые бусы.

[0023] Такое связывающее вещество патогенной формы прионного белка можно использовать для обнаружения патогенной изоформы прионного белка.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к:

(7) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка в соответствии с любым из вышеуказанных пунктов (1)-(6), которое представляет собой агент для обнаружения патогенной изоформы прионного белка.

(8) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка в соответствии с любым из вышеуказанных пунктов (1)-(6), которое представляет собой агент для обнаружения патогенной изоформы прионного белка, имеющий связывающий агент патогенной изоформы прионного белка, состоящий из лактоферрина.

(9) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка в соответствии с любым из вышеуказанных пунктов (1)-(6), которое представляет собой агент для обнаружения патогенной изоформы прионного белка, имеющий связывающий агент патогенной изоформы прионного белка, состоящий из лактоферрина и меченого фрагмента.

[0024] Настоящее изобретение также относится к способу обнаружения патогенной изоформы прионного белка, способу связывания патогенной изоформы прионного белка, способу выделения патогенной изоформы прионного белка (включая способ очистки патогенной изоформы прионного белка, способ отделения патогенной изоформы прионного белка и способ концентрирования патогенной изоформы прионного белка), способу иммобилизации патогенной изоформы прионного белка, или способу ингибирования самосборки патогенной изоформы прионного белка, каждый из которых включает использование связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка или агента обнаружения патогенной изоформы прионного белка.

[0025] Соответственно, настоящее изобретение также относится к:

(10) Способу обнаружения патогенной изоформы прионного белка, включающему следующие стадии:

стадию контактирования образца со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка в соответствии с любым из пунктов (3)-(6);

стадию отделения связанного компонента от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, приведенного в контакт с образцом; и

стадию обнаружения патогенной изоформы прионного белка, содержащейся в компоненте, отделенной от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка.

(11) Способу в соответствии с вышеуказанным пунктом (10), где на стадии обнаружения патогенной изоформы прионного белка, содержащейся в компоненте, отделенной от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, обнаружение патогенной изоформы прионного белка осуществляют с использованием иммуноанализа.

(12) Способу в соответствии с вышеуказанным пунктом (11), где иммуноанализ представляет собой метод вестерн-блоттинга, метод ELISA (метод твердофазного иммуноферментного анализа) или метод иммуноосаждения.

(13) Способу обнаружения патогенной изоформы прионного белка, включающему следующие стадии:

стадию контактирования образца со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка в соответствии с любым из пунктов (3)-(6);

стадию отделения связанного компонента от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, приведенного в контакт с образцом.

(14) Способу в соответствии с любым из пунктов (10)-(13), где связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка, полученное иммобилизацией лактоферрина на связывающем материале, представляет собой бусы с иммобилизованным лактоферрином.

(15) Способу в соответствии с любым из пунктов (10)-(13), где связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка представляет собой бусы с иммобилизованным лактоферрином, с использованием намагничиваемых бус.

(16) Способу в соответствии с любым из пунктов (10)-(15), где образец представляет собой жидкий образец, полученный гомогенизацией смеси животной ткани и поверхностно-активного вещества.

(17) Способу в соответствии с вышеуказанным пунктом (16), где животная ткань представляет собой одну или несколько из тканей мозга млекопитающего, спинного мозга, глаза и тонкого кишечника.

(18) Способу в соответствии с любым из пунктов (10)-(17), где стадию отделения связанного компонента проводят путем элюирования раствором, содержащим лактоферрин.

[0026] Кроме того, настоящее изобретение также относится к:

(19) Способу обнаружения патогенной изоформы прионного белка, включающему стадии:

стадию связывания лактоферрина с патогенной изоформой прионного белка; и

обнаружение лактоферрина, связанного с патогенной изоформой прионного белка.

(20) Способу обнаружения патогенной изоформы прионного белка, включающему стадии:

стадию связывания лактоферрина, имеющего меченый фрагмент, с патогенной изоформой прионного белка; и

обнаружение меченого фрагмента лактоферрина, связанного с патогенной изоформой прионного белка.

(21) Способу ингибирования самосборки патогенной изоформы прионного белка за счет связывания лактоферрина с патогенной изоформой прионного белка.

(22) Ингибитору для ингибирования самосборки патогенной изоформы прионного белка, включающему лактоферрин.

[0027] Настоящее изобретение также относится к применению лактоферрина, лактоферрина, имеющего меченый фрагмент, или лактоферрина, иммобилизованного на связывающем материале, для связывания патогенной изоформы прионного белка.

[0028] Настоящее изобретение также относится к применению лактоферрина, лактоферрина, имеющего меченый фрагмент, или лактоферрина, иммобилизованного на связывающем материале, для обнаружения патогенной изоформы прионного белка.

[0029] Настоящее изобретение также относится к применению лактоферрина, лактоферрина, имеющего меченый фрагмент, или лактоферрина, иммобилизованного на связывающем материале, для выделения патогенной изоформы прионного белка.

[0030] Настоящее изобретение также относится к применению лактоферрина, лактоферрина, имеющего меченый фрагмент, или лактоферрина, иммобилизованного на связывающем материале, для ингибирования самосборки патогенной изоформы прионного белка.

Результаты изобретения

[0031] Как описано выше, в настоящем изобретении впервые описано, что лактоферрин не связывается с нормальным прионным белком, но специфически связывается с патогенной изоформой прионного белка. В соответствии с настоящим изобретением, основанным на этом обнаружении, можно просто, быстро и количественно обнаруживать патогенную изоформу прионного белка независимо от нормального прионного белка с высокой чувствительностью без осуществления ферментативной обработки с использованием протеазы К.

[0032] То есть согласно настоящему изобретению можно отличить патогенную изоформу прионного белка от нормального прионного белка, не проводя ферментативной обработки с использованием протеазы К. Это исключает необходимость проведения сложных операций для создания условий, подходящих для ферментативной реакции, и времени, требуемого для проведения ферментативной реакции. В результате, в принципе, способ по настоящему изобретению не имеет недостатков, связанных с ферментативной обработкой с использованием протеазы К, таких как низкая скорость, плохая воспроизводимость и необходимость использования относительно дорогого фермента в качестве реагента.

[0033] Следовательно, согласно настоящему изобретению можно анализировать пищу, напитки и лекарства, в которых используются полученные от животных исходные вещества, на загрязнение патогенной изоформой прионного белка (инфекционный прионный белок) более просто, быстро и количественно с высокой чувствительностью при более низкой стоимости, чем когда-либо ранее. Кроме того, также можно диагностировать прионные заболевания людей и животных более просто, быстро и количественно с высокой чувствительностью при более низкой стоимости, чем когда-либо ранее. Это отвечает потребности общества в профилактике инфекции и ранней диагностике прионных заболеваний у людей или животных.

[0034] Кроме того, согласно настоящему изобретению можно собирать патогенную изоформу прионного белка отдельно от нормального прионного белка. Это дает возможность выделения, отделения, концентрирования и очистки патогенной изоформы прионного белка. Соответственно, при комбинировании вышеуказанных аспектов настоящего изобретения можно более эффективно проводить вышеуказанное инспектирование на предмет загрязнения патогенной изоформой прионного белка (инфекционный прионный белок) и диагностику прионных заболеваний у людей и животных.

Краткое описание рисунков

[0035] Фиг.1 представляет собой фотографию, показывающую результаты иммуноблоттинга, демонстрирующую, что патогенная изоформа прионного белка специфически связывается с бусами с иммобилизованным лактоферрином.

Фиг.2 представляет собой фотографию, показывающую результаты иммуноблоттинга, демонстрирующую, что обычный способ обнаружения, включающий ферментативную обработку протеазой К, может отличать патогенную изоформу прионного белка от нормального прионного белка.

Лучший способ осуществления изобретения

[0036] Далее будут подробно описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Однако настоящее изобретение не ограничено следующими предпочтительными вариантами и могут быть сделаны любые изменения в рамках объема настоящего изобретения. Следует отметить, что в данном описании «процент (%)» относится к «проценту (%) по массе», если не указано другого.

[0037] Предпочтительный вариант осуществления способа обнаружения патогенной изоформы прионного белка по настоящему изобретению включает стадии:

контактирование образца со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка, полученным иммобилизацией лактоферрина на связующем веществе; отделение связанного компонента от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, приведенного в контакт с образцом; и обнаружение патогенной изоформы прионного белка, содержащегося в компоненте, отделенном от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка.

[0038] В соответствии с данным способом обнаружения патогенная изоформа прионного белка, содержащаяся в образце, может быть собрана при предоставлении патогенной изоформе прионного белка возможности специфически связываться (адсорбироваться) с лактоферрином, иммобилизованным в связующем веществе патогенной изоформы прионного белка, а затем отделения патогенной изоформы прионного белка, связанного с лактоферрином, иммобилизованным в связующем веществе патогенной изоформы прионного белка, и соответственно может быть обнаружена по отдельности от нормального прионного белка путем обнаружения патогенной изоформы прионного белка, отделенной от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка.

[0039] На стадии обнаружения патогенной изоформы прионного белка, содержащегося в компоненте, отделенном от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, обнаружение патогенной изоформы прионного белка предпочтительно осуществляют с помощью иммуноанализа.

[0040] Предпочтительные примеры такого иммуноанализа включают метод вестерн-блоттинга, метод ELISA и метод иммуноосаждения.

[0041] Способ, используемый при обнаружении патогенной изоформы прионного белка на стадии обнаружения патогенной изоформы прионного белка, содержащегося в компоненте, отделенном от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, включая указанный выше иммуноанализ, не ограничен конкретно до тех пор, пока с его помощью может быть обнаружена патогенная изоформа прионного белка, и, соответственно, способ, с помощью которого нельзя различить патогенную изоформу прионного белка и нормальный прионный белок, конечно, можно использовать. Это возможно, поскольку в соответствии с настоящим изобретением специфичность патогенной изоформы прионного белка гарантирована ранее при предоставлении возможности патогенной изоформе прионного белка связываться с лактоферрином перед стадией обнаружения патогенной изоформы прионного белка. Следовательно, в вышеуказанном иммуноанализе можно, конечно, использовать антитело, которое не способно отличать патогенную изоформу прионного белка и нормальный прионный белок.

[0042] Лактоферрин (далее иногда сокращаемый как «ЛФ») представляет собой связанный с железом гликопротеин с молекулярной массой примерно 80 кДа, главным образом присутствующий в молоке молочной железы, и он известен как молочный белок, обладающий различной активностью, такой как антибактериальная активность в отношении вредных бактерий, таких как Escherichia coli, Candida, Clostridium и Staphylococcus, иммуномодулирующая активность и противоопухолевая активность. Как описано выше, лактоферрин представляет собой гликопротеин на основе молока и, следовательно, является высокобезопасным и его можно непрерывно принимать в течение длительного промежутка времени. Кроме того, лактоферрин сам по себе практически не имеет вкуса и запаха и соответственно широко используется в качестве добавки для различных пищевых продуктов, лекарственных средств и кормов животных. Однако способность лактоферрина специфически связываться с патогенной изоформой прионного белка ранее известна не была.

[0043] Лактоферрин для использования в настоящем изобретении может быть коммерчески доступным или может быть получен путем выделения из исходного вещества, такого как молозиво, молоко (промежуточное молоко, зрелое молоко или молоко при поздней лактации) млекопитающих (например, человек, корова, коза, овца и лошадь), или продукта, полученного при переработке такого молока, такого как снятое молоко или сыворотка, посредством обычной обработки, такой как ионообменная хроматография. В частности, предпочтительно используют коммерчески доступный лактоферрин, получаемый в промышленном масштабе (например, лактоферрин, производимый Morinaga Milk Industry Co., Ltd.). Альтернативно, также можно использовать лактоферрины, продуцируемые с использованием микроорганизмов, животных клеток, трансгенных животных или тому подобного с помощью методов генной инженерии. В качестве исходного вещества для лактоферрина, используемого в настоящем изобретении, особенно предпочтительной является сыворотка, полученная из коровьего молока, поскольку ее можно стабильно получать в больших количествах в качестве побочного продукта производства молочных продуктов.

[0044] Далее будет описан один пример способа получения лактоферрина (выделение лактоферрина из исходного вещества, такого как молоко, и его очистка). Первоначально ионообменник (например, СМ-сефароза FF, получаемая от Amersham Pharmacia) упаковывают в колонку. Через колонку пропускают соляную кислоту и колонку промывают водой для уравновешивания ионообменника. Затем снятое молоко, имеющее рН 6,9 и охлажденное до 4°С, пропускают через колонку, выделяют эффлюент с колонки и эффлюент снова пропускают через колонку таким же образом. Затем через колонку пропускают дистиллированную воду, а после этого раствор соли пропускают через колонку для получения элюата, содержащего основной белок, адсорбированный на ионообменнике. Затем к элюату добавляют 80%-ный насыщенный раствор сульфата аммония для осаждения белка и после этого элюат центрифугируют для получения осадка. Полученный осадок промывают 80%-ным насыщенным раствором сульфата аммония и затем к промытому осадку добавляют деионизированную воду для получения раствора. Затем раствор обессоливают с использованием ультрафильтрационного мембранного модуля (например, SLP0053 производства Asahi kasi Corporation) и после этого подвергают лиофильной сушке для получения порошкообразного коровьего лактоферрина. Таким образом можно получать коровий лактоферрин с чистотой 95% по массе или выше. Следует отметить, что в данном описании чистота лактоферрина представляет собой показатель, измеренный методом жидкостной хроматографии.

[0045] Как и многие белки, лактоферрин также обычно содержит мутацию, такую как замещение, делеция, вставка, дополнение или инверсия одного или нескольких оснований в одном или нескольких положениях, вследствие разницы в видах или генах или различия между индивидами, и аминокислоты белка, кодируемого геном, имеющим такую мутацию, также могут содержать мутацию. В настоящем изобретении лактоферрин, содержащий такую мутацию, также можно использовать до тех пор, пока не нарушается его способность специфически связываться с патогенной изоформой прионного белка.

[0046] Иммобилизацию лактоферрина на связывающем материале для получения связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка можно проводить с помощью обычно используемого способа иммобилизации до тех пор, пока не ухудшается способность лактоферрина специфически связываться с патогенной изоформой прионного белка. Примеры такого способа иммобилизации включают способ, в котором ковалентная связь непосредственно образуется с первичной аминогруппой полипептида, и способ, в котором ковалентная связь непосредственно образуется с сульфгидрильной группой (тиольной группой) полипептида.

[0047] Связывающий материал (т.е. носитель, субстрат, материал носителя, материал основы), используемый для иммобилизации лактоферрина для получения связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, не является особо ограниченным до тех пор, пока он представляет собой обычно используемый связывающий материал и может функционировать в качестве твердой фазы при желательных условиях и иммобилизовывать белок. Примеры такого связывающего материала включают таковые, имеющие на своей поверхности гидрофильную или гидрофобную смолу, и такому связывающему материалу можно придать различную форму, такую как частицы (бусы), пленки, волокна, полые волокна и сетки. Среди них предпочтительными являются связывающие материалы в форме бус (макрочастиц). Конкретный размер (диаметр) бус (частицы) может быть выбран подходящим образом в соответствии с целью применения, но составляет, например, обычно от 0,5 до 200 мкм, предпочтительно от 1,0 до 100 мкм, более предпочтительно от 1,0 до 50 мкм, еще более предпочтительно от 1,0 до 20 мкм, еще более предпочтительно от 1,0 до 10 мкм, особенно предпочтительно от 1,0 до 5,0 мкм.

[0048] Как описано выше, бусы (частица), имеющие на своей поверхности гидрофобную или гидрофильную смолу, предпочтительно используют в качестве связывающего материала (т.е. носителя субстрата, материала носителя, материала основы). В таком случае связывающий материал, активный в отношении связывания патогенной изоформы прионного белка, получают путем иммобилизации лактоферрина на связывающем материале, упоминаемом как бусы с иммобилизованным лактоферрином. Данные бусы, используемые в качестве связывающего материала, могут быть суспендированы и диспергированы в жидкости, и, если это необходимо в процессе эксплуатации, их легко можно осадить и собрать.

[0049] Более предпочтительно в качестве связывающего материала используют бусы, имеющие на своей поверхности гидрофобную или гидрофильную смолу и намагничиваемый материал внутри (в центре). В таком случае связывающий материал, активный в отношении связывания патогенной изоформы прионного белка, получают путем иммобилизации лактоферрина на связывающем материале, упоминаемом как бусы с иммобилизованным лактоферрином на основе намагничиваемых бус. Данные бусы, используемые в качестве связывающего материала, могут быть суспендированы и диспергированы в жидкости, и, если это необходимо в процессе эксплуатации, их легко можно осадить и собрать с использованием магнита. Если это необходимо в процессе эксплуатации, такую операцию специалист в данной области может провести во время, перед или после стадии контактирования образца с бусами с иммобилизованным лактоферрином или на стадии отделения компонента, связанного с бусами с иммобилизованным лактоферрином.

[0050] Образец не является особо ограниченным до тех пор, пока он представляет собой жидкий образец, в котором, как подозревают, содержится патогенная изоформа прионного белка (инфекционный прионный белок). Однако предпочтительно, чтобы в том случае, когда образец содержит патогенную изоформу прионного белка, патогенная изоформа прионного белка была бы в достаточной мере диспергирована в образце. В том случае, когда тестируемым объектом является животная ткань, образец предпочтительно получают с помощью солюбилизирования в достаточной мере животной ткани. Пример такого солюбилизированного образца включает жидкий образец, полученный гомогенизацией смеси животной ткани и поверхностно-активного вещества. рН такого жидкого образца не является особо ограниченным, но предпочтительно он близок к нейтральному. Более конкретно, рН обычно составляет от 5,5 до 7,8, предпочтительно от 6,0 до 7,7, особенно предпочтительно от 6,5 до 7,6. Поверхностно-активное вещество, используемое при получении такого жидкого образца, не является особо ограниченным до тех пор, пока оно представляет собой поверхностно-активное вещество, обычно используемое для солюбилизации животной ткани, но предпочтительно представляет собой неионное поверхностно-активное вещество с позиций солюбилизации животной ткани и поддержания структуры высшего порядка прионного белка. Предпочтительные примеры поверхностно-активного вещества включают Tween 20, тритон Х-100 и NP-40. Среди данных поверхностно-активных веществ Tween 20, тритон Х-100 и NP-40 являются предпочтительными, и Tween 20 и NP-40 являются особенно предпочтительными. Для того чтобы гарантировать специфическое связывание между лактоферрином и патогенной изоформой прионного белка, образец предпочтительно получают в виде жидкого образца, который можно привести в контакт с материалом, активным в отношении связывания с патогенной изоформой прионного белка, в следующих условиях.

[0051] Для того чтобы гарантировать специфическое связывание между лактоферрином и патогенной изоформой прионного белка, образец предпочтительно приводят в контакт с материалом, активным в отношении связывания с патогенной изоформой прионного белка, при рН, обычно составляющем от 5,5 до 7,8, предпочтительно от 6,0 до 7,7, особенно предпочтительно от 6,5 до 7,6, при температуре, обычно составляющей от 3 до 30°С, предпочтительно от 3 до 20°С, особенно предпочтительно от 3 до 5°С, обычно в течение от 5 до 300 минут, предпочтительно от 10 до 180 минут, особенно предпочтительно от 15 до 90 минут. Однако условия для контактирования материала, активного в отношении связывания с патогенной изоформой прионного белка, не ограничены указанным.

[0052] Животная ткань для солюбилизации не ограничена особо до тех пор, пока подозревается, что она содержит патогенную изоформу прионного белка (инфекционный прионный белок), но с позиций ранней диагностики предпочтительными являются одна или несколько из тканей мозга млекопитающего, спинного мозга, глаза и тонкого кишечника, поскольку известно, что патогенная изоформа прионного белка присутствует главным образом в данных тканях.

[0053] На стадии отделения связанного компонента от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, приведенного в контакт с образцом, связанный компонент может быть отделен и элюирован путем его диссоциации со связывающим веществом патогенной изоформы прионного белка при относительно жестких условиях диссоциации в ряду различных условий, обычно используемых для диссоциации взаимодействий белок-белок. Например, отделение связанного компонента может быть осуществлено с использованием раствора, содержащего поверхностно-активное вещество, при рН, близком к нейтральному, и температуре от 3 до 30°С. Альтернативно, отделение связанного компонента может быть осуществлено путем диссоциации специфического связывания между лактоферрином и патогенной изоформой прионного белка при элюировании с использованием раствора, содержащего лактоферрин.

[0054] Предпочтительный вариант осуществления способа обнаружения патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению может дополнительно включать, после стадии контактирования образца со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка, полученным иммобилизацией лактоферрина на связывающем материале, но перед стадией отделения связанного компонента от связывающего вещества патогенной формы прионного белка, приведенного в контакт с образцом, стадию промывки связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, приведенного в контакт с образцом. Стадию промывки обеспечивают главным образом в целях удаления компонента, неспецифически адсорбированного на связующем веществе патогенной изоформы прионного белка, приведенном в контакт с образцом, когда такой компонент присутствует. Стадию промывки можно проводить с помощью метода, обычно используемого для достижения описанной выше цели. Такой метод не ограничен конкретно, но, например, стадию промывки можно проводить путем промывания связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка раствором, который использовался для приготовления образца, предназначенного для контактирования со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка, но который не содержит солюбилизированной животной ткани или тому подобного.

[0055] Кроме того, настоящее изобретение также относится к способу выделения патогенной изоформы прионного белка. Предпочтительный вариант осуществления способа выделения патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению включает следующие стадии: контактирование образца, полученного солюбилизацией животной ткани со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка (связующий агент), полученным иммобилизацией лактоферрина на соединительном материале (т.е. носителе, субстрате, материале носителя, материале основы); и отделение связанного компонента от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка (связывающего агента), которое было введено на стадию контактирования образца со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка.

[0056] В соответствии с данным способом выделения патогенная изоформа прионного белка, содержавшаяся в образце, может быть собрана при предоставлении возможности патогенной изоформе прионного белка специфически связываться (адсорбироваться) с лактоферрином, иммобилизованным в связующем веществе патогенной изоформы прионного белка, и последующем отделении патогенной изоформы прионного белка, связанного с лактоферрином, иммобилизованным в связующем веществе патогенной изоформы прионного белка, что дает возможность выделять, отделять, концентрировать и очищать патогенную форму прионного белка.

[0057] Как описано выше, вариант осуществления способа выделения патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению может быть осуществлен путем проведения тех же стадий, как и в предпочтительном варианте осуществления способа обнаружения патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению, отличающимся на стадии обнаружения патогенной изоформы прионного белка, содержащегося в компоненте, отделенном от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка. Соответственно приведенное выше описание, сделанное со ссылкой на предпочтительный вариант осуществления способа обнаружения патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению, также применимо к варианту осуществления способа выделения патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению.

[0058] Связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению, включающее лактоферрин, можно использовать не только в вышеуказанных вариантах осуществления в качестве связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, полученного путем иммобилизации лактоферрина на соединительном материале, но также и в следующих вариантах осуществления.

[0059] То есть предпочтительный вариант осуществления использования связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению относится к способу обнаружения патогенной изоформы прионного белка, включающему стадии: предоставление возможности лактоферрину связываться с патогенной изоформой прионного белка и обнаружение лактоферрина, связанного с патогенной изоформой прионного белка.

[0060] В соответствии с данным способом обнаружения патогенной изоформы прионного белка лактоферрин можно использовать в качестве связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка без особой модификации. Обнаружение патогенной изоформы прионного белка можно проводить путем обнаружения лактоферрина, связанного с патогенной изоформой прионного белка.

[0061] Обнаружение лактоферрина может быть осуществлено с помощью любого обычно используемого способа обнаружения. Например, можно использовать иммуноанализ с использованием антитела к лактоферрину.

[0062] Кроме того, другой предпочтительный вариант осуществления с использованием связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению представляет собой способ обнаружения патогенной изоформы прионного белка, включающий стадии: предоставление возможности лактоферрину, имеющему меченый фрагмент, связываться с патогенной изоформой прионного белка и обнаружение меченого фрагмента лактоферрина, связанного с патогенной изоформой прионного белка.

[0063] В соответствии с данным способом обнаружения патогенной изоформы прионного белка лактоферрин, имеющий ранее присоединенный к нему меченый фрагмент, используют в качестве связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка. Обнаружение патогенной изоформы прионного белка может быть осуществлено путем обнаружения меченого фрагмента, присоединенного к лактоферрину.

[0064] Меченый фрагмент не ограничен особо до тех пор, пока он является одним из обычно используемых для биополимеров. Примеры такого меченого фрагмента включают флуоресцентный маркер, радиоактивный маркер и ферментативный маркер. Примеры флуоресцентного маркера включают красители Alexa Fluor (зарегистрированная торговая марка) (производитель Becton, Dickinson and Company) и красители CyDye (зарегистрированная торговая марка) (производитель Becton, Dickinson and Company). Среди данных флуоресцентных маркеров предпочтительно используют Alexa Fluor 488 (зарегистрированная торговая марка), Alexa Fluor 647 (зарегистрированная торговая марка), Cy3, Cy5.5 и Cy7. Примеры радиоактивного маркера включают ¹⁴С-меченные маркеры и ³⁵S-меченные маркеры. Примеры ферментативного маркера включают маркеры HRP (пероксидаза хрена) и маркеры ALP (щелочная фосфатаза).

[0065] Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования самосборки патогенной изоформы прионного белка путем использования связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка и ингибитора для ингибирования самосборки патогенной изоформы прионного белка. В настоящее время предполагается, что множество молекул патогенной изоформы прионного белка претерпевают самосборку с образованием мультимерного комплекса и что патогенность прионных заболеваний усиливается, вероятно, вследствие самосборки патогенной изоформы прионного белка. Связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению может ингибировать самосборку патогенной изоформы прионного белка посредством специфического связывания с патогенной изоформой прионного белка. Следует отметить, что не имеется риска того, что связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению будет неблагоприятно воздействовать на неизвестные биологические функции, которые, как ожидается, будет проявлять нормальный прионный белок, поскольку связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению не связывается с нормальным прионным белком.

Примеры

[0066] Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие примеры, но оно ими не ограничивается

[0067] Пример 1

Обнаружение патогенной изоформы прионного белка инфицированного мозга с использованием бус с иммобилизованным лактоферрином

Обнаружение патогенной изоформы прионного белка инфицированного мозга с использованием бус с иммобилизованным лактоферрином проводили следующим образом с использованием мозга мыши, зараженной патогенной изоформой прионного белка.

[0068] Получение бус с иммобилизованным лактоферрином

1 мл тозилактивированных бус Dynabeades M-280 промывали дважды 1 мл PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) и затем добавляли к бусам Dynabeades раствор, полученный при растворении 1 мг лактоферрина в 1 мл 0,1 М буфера борной кислоты, для смешивания с помощью инверсии в течение 24 часов при 37°С. Затем супернатант удаляли и бусы Dynabeades промывали дважды по 1 мл PBS. Затем к бусам Dynabeades добавляли 1 мл 0,2 М буфера Трис-хлористоводородная кислота (рН 8,5), содержащего 0,1% лактоферрина, для смешивания путем инверсии в течение 4 часов при 37°С.

Затем супернатант удаляли и бусы Dynabeades промывали один раз 1 мл PBS, содержащим 0,1% лактоферрина, и дополнительно промывали один раз PBS, содержащим 0,1% Tween.

Затем супернатант удаляли и бусы Dynabeades промывали один раз 1 мл PBS, содержащим 0,1% лактоферрина. Затем супернатант удаляли и полученные таким образом бусы Dynabeades со связанным лактоферрином (далее также упоминаемые как «бусы со связанным лактоферрином» или «бусы с иммобилизованным лактоферрином») хранили в 1 мл PBS, содержащего 0,1% лактоферрина.

[0069] Получение образца солюбилизированной ткани мозга (гомогенат мозга)

Мозг получали от мышей, инфицированных патогенной изоформой прионного белка. Мозг мыши, инфицированной патогенной изоформой прионного белка (далее для простоты упоминаемый также как «инфицированный мозг»), помещали в BioMasher и центрифугировали при 10000·g в течение 2 минут для получения осадка. Затем к осадку добавляли NP-40 RIPA для получения 10% (вес./об) гомогената мозга. Гомогенат мозга инкубировали в течение 15 минут при 4°С, перемешивали и центрифугировали при 10000·g в течение 2 минут для получения супернатанта. Затем к супернатанту добавляли NP-40 RIPA для получения 2% (вес./об) гомогената мозга (т.е. солюбилизированного образца ткани мозга). Таким образом получали гомогенат инфицированного мозга (далее также упоминаемый как «гомогенат инфицированного мозга»).

[0070] Выделение патогенной изоформы прионного белка с помощью бус с иммобилизованным лактоферрином

20 мкл бус Dynabeades со связанным лактоферрином добавляли к 500 мкл гомогената мозга и смешивали путем инверсии в течение 1 часа при 4°С. Затем бусы Dynabeades промывали 1 мл NP-40 RIPA в течение 10 минут три раза и дополнительно промывали 1 мл NP-40 RIPA в течение ночи.

Промытые бусы Dynabeades со связанным лактоферрином собирали и добавляли к ним 20 мкл нейтрального буфера (буфер для образцов NuPAGE LDS (4×) производитель Invitrogen). Полученную смесь нагревали в течение 10 минут при 95°С для получения тест-образца.

Следует отметить, что бусы Dynabeades являются магнитными и, соответственно, если необходимо с точки зрения эксплуатации, бусы Dynabeades собирали с помощью магнита во время проведения процесса.

[0071] Обнаружение с помощью иммуноблоттинга

Прионный белок, содержащийся в полученном тест-образце, обнаруживали с помощью иммуноблоттинга.

Более конкретно, тест-образец подвергали электрофорезу на геле NuPAGE (при постоянном токе 40 мА в течение 70 минут) и затем белки в геле переносили на мембрану PVDF c помощью резервуарного блоттера (при постоянном токе 220 мА в течение 60 минут).

После завершения переноса мембрану PVDF блокировали с помощью BlockAce (производства Dainippon Pharmaceutial Co., Ltd.) в течение 30 минут при 4°С. Затем к мембране PVDF добавляли раствор, содержащий моноклональное антитело (T2-HRP) против прионного белка, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP), разведенное в соотношении 1/5000 с использованием BlockAce, содержащего 0,1% Tween 20, и мембрану PVDF инкубировали в течение 1 часа при 4°С.

Мембрану PVDF после взаимодействия с антителом промывали PBS, содержащим 0,1% Tween 20, в течение 10 минут три раза и затем проявляли реагентом для обнаружения хемолюминесценции для обнаружения хемолюминесценции с использованием анализатора изображения.

[0072] Сравнительный пример 1

Обнаружение патогенной изоформы прионного белка из неинфицированного мозга с использованием бус с иммобилизованным лактоферрином

Обнаружение патогенной изоформы прионного белка с использованием бус с иммобилизованным лактоферрином проводили следующим образом с использованием мозга нормальной мыши (далее также упоминаемого как «нормальный мозг» или «неинфицированный мозг»).

[0073] Получение бус с иммобилизованным лактоферрином

Бусы с иммобилизованным лактоферрином получали таким же образом, как описано в примере 1.

[0074] Получение образца солюбилизированной ткани мозга (гомогенат мозга)

Гомогенат нормального мозга (далее также упоминаемый как «гомогенат нормального мозга» или «гомогенат неинфицированного мозга») получали таким же образом, как в примере 1, за исключением того, что использовали мозг, полученный от нормальной мыши (неинфицированной мыши), вместо мозга мыши, инфицированной патогенной изоформой прионного белка.

[0075] Выделение патогенной изоформы прионного белка с помощью бус с иммобилизованным лактоферрином

Тест-образец получали таким же образом, как в примере 1, за исключением того, что использовали гомогенат неинфицированного мозга вместо гомогената инфицированного мозга.

[0076] Обнаружение с помощью иммуноблоттинга

Обнаружение прионного белка проводили таким же образом, как в примере 1, за исключением того, что использовали тест-образец, полученный из гомогената неинфицированного мозга, вместо тест-образца, полученного из гомогената инфицированного мозга.

[0077] Результаты

Фиг.1 представляет собой фотографию, показывающую результаты иммуноблоттинга, проведенного в примере 1 и сравнительном примере 1. Все полосы представляют образцы, не обработанные протеазой К (РК-).

[0078] Дорожки 1, 2 и 3 относятся к тест-образцу, полученному в примере 1, при проведении разделения патогенной изоформы прионного белка с помощью бус с иммобилизованным лактоферрином на гомогенате инфицированного мозга. Более конкретно, дорожка 2 относится к тест-образцу, разведенному в 10 раз по сравнению с дорожкой 1, а дорожка 3 относится к тест-образцу, разведенному в 100 раз по сравнению с дорожкой 1. С другой стороны, дорожка 4 относится к тест-образцу, полученному в сравнительном примере 1, при проведении разделения патогенной изоформы прионного белка с помощью бус с иммобилизованным лактоферрином на гомогенате неинфицированного мозга.

[0079] В дорожках 1-3 наблюдались концентрационно-зависимые полосы прионного белка. Даже в дорожке 3, представляющей собой тест-образец, разведенный в 100 раз по сравнению с образцом дорожки 1, четко наблюдались полосы прионного белка. Как описано выше, поскольку тест-образец, использованный в дорожках 1-3, был получен из гомогената инфицированного мозга, полосы прионного белка, наблюдавшиеся в дорожках 1-3, относятся к полосам патогенной изоформы прионного белка. Это показывает, что патогенная изоформа прионного белка, полученного из инфицированного мозга, была выделена и обнаружена с помощью связывания с бусами с иммобилизованным лактоферрином.

[0080] С другой стороны, в дорожке 4 полосы прионного белка не наблюдались, несмотря на тот факт, что концентрация тест-образца в дорожке 4 при проведении анализа была на том же уровне, что и в тест-образце дорожки 1. Это показывает, что нормальный прионный белок, полученный из неинфицированного мозга, не связывался с бусами с иммобилизованным лактоферрином и соответственно не был собран и обнаружен.

[0081] На основании описанных выше результатов было установлено, что патогенная изоформа прионного белка, полученная из инфицированного мозга, специфически связывается с бусами с иммобилизованным лактоферрином, но нормальный прионный белок, полученный из неинфицированного мозга, не связывается с бусами с иммобилизованным лактоферрином. Кроме того, также было установлено, что патогенная изоформа прионного белка может быть собрана отдельно от нормального прионного белка при использовании бус с иммобилизованным лактоферрином, тем самым предоставляя возможность обнаружения патогенной изоформы прионного белка.

[0082] Сравнительный пример 2

Обнаружение патогенной изоформы прионного белка с использованием протеазы К

Эксперимент, цель которого заключалась в обнаружении патогенной изоформы прионного белка отдельно от нормального прионного белка, проводили общепринятым способом с использованием протеазы К следующим образом.

[0083] Получение гомогената мозга

Получали мозг мыши, инфицированной патогенной изоформой прионного белка (далее также упоминаемый как «инфицированный мозг»), и мозг неинфицированной мыши (нормальная мышь) (далее также упоминаемый как «неинфицированный мозг» или «нормальный мозг») и каждый мозг мыши помещали в BioMasher и центрифугировали при 10000·g в течение 2 минут для получения осадка. Затем к осадку добавляли NP-40 RIPA для получения 10% (вес./об) гомогената мозга. Гомогенат мозга инкубировали в течение 15 минут при 4°С, перемешивали и центрифугировали при 10000·g в течение 2 минут для получения супернатанта. Затем к супернатанту добавляли NP-40 RIPA для получения 0,5% (вес./об) гомогената мозга. Таким образом получали гомогенат инфицированного мозга и гомогенат неинфицированного мозга.

[0084] Ферментативное разложение с помощью протеазы К

Протеиназу К добавляли к 500 мкл каждого из гомогенатов мозга таким образом, что конечная концентрация протеиназы К составляла 20 мкг/мл, и затем полученную смесь инкубировали в течение 30 минут при 37°С. После завершения реакции к смеси добавляли 5 мкл ингибитора протеиназы К (Pefablock) и затем 250 мкл раствора бутанол-метанол, перемешивали и центрифугировали при 20000·g в течение 10 минут для получения осадка. После завершения центрифугирования к осадку добавляли 50 мкл нейтрального буфера (буфер для образцов NuPAGE LDS (4×) производитель Invitrogen) и полученную смесь нагревали в течение 10 минут при 95°С. Таким образом получали образец, полученный из гомогената инфицированного мозга, и образец, полученный из гомогената неинфицированного мозга.

[0085] Обнаружение с помощью иммуноблоттинга

Обнаружение прионного белка проводили с помощью иммуноблоттинга для полученных таким образом четырех видов образцов, т.е. гомогенат инфицированного мозга, подвергнутый ферментативному разложению с использованием протеазы К (обработанный протеазой К гомогенат инфицированного мозга), гомогенат неинфицированного мозга, подвергнутый ферментативному разложению с использованием протеазы К (обработанный протеазой К гомогенат неинфицированного мозга), гомогенат инфицированного мозга, не подвергнутый ферментативному разложению с использованием протеазы К (первоначальный гомогенат инфицированного мозга), и гомогенат неинфицированного мозга, не подвергнутый ферментативному разложению с использованием протеазы К (первоначальный гомогенат неинфицированного мозга).

Более конкретно, образцы подвергали электрофорезу на геле NuPAGE (при постоянном токе 40 мА в течение 70 минут) и затем белки в геле переносили на мембрану PVDF c помощью резервуарного блоттера (при постоянном токе 220 мА в течение 60 минут).

После завершения переноса мембрану PVDF блокировали с помощью BlockAce (производства Dainippon Pharmaceutial Co., Ltd.) в течение 30 минут при 4°С. Затем к мембране PVDF добавляли раствор, содержащий моноклональное антитело (T2-HRP) против прионного белка, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP), разведенное в соотношении 1/5000 с использованием BlockAce, содержащего 0,1% Tween 20, и мембрану PVDF инкубировали в течение 1 часа при 4°С.

Мембрану PVDF после взаимодействия с антителом промывали PBS, содержащим 0,1% Tween 20, в течение 10 минут три раза и затем проявляли реагентом для обнаружения хемолюминесценции для обнаружения хемолюминесценции с использованием анализатора изображения.

[0086] Результаты

Фиг.2 представляет собой фотографию, показывающую результаты иммуноблоттинга, проведенного в сравнительном примере 2. Дорожки 1 и 2 относятся к образцам, не подвергнутым ферментативному разложению с помощью протеазы К (РК-), а дорожки 3 и 4 относятся к образцам, подвергнутым ферментативному разложению с помощью протеазы К (РК+).

[0087] Более конкретно, дорожка 1 относится к гомогенату инфицированного мозга, который не подвергали ферментативному разложению с помощью протеазы К (т.е. первоначальный гомогенат инфицированного мозга), и дорожка 2 относится к гомогенату неинфицированного мозга, который не подвергали ферментативному разложению с помощью протеазы К (т.е. первоначальный гомогенат неинфицированного мозга). С другой стороны, дорожка 3 относится к гомогенату инфицированного мозга, подвергнутому ферментативному разложению с помощью протеазы К (т.е. обработанный протеазой К гомогенат инфицированного мозга), и дорожка 4 - к гомогенату неинфицированного мозга, подвергнутому ферментативному разложению с помощью протеазы К (т.е. обработанный протеазой К гомогенат неинфицированного мозга).

[0088] Как показано на фиг.2, в обоих дорожках 1 и 2 полосы прионного белка были обнаружены с помощью иммуноблоттинга. Это показывает что, когда не проводят ферментативную обработку с помощью протеазы К, обнаруживаются как патогенная изоформа прионного белка (дорожка 1), так и нормального прионного белка (дорожка 2). С другой стороны, в дорожках 3 и 4 полосы прионного белка (патогенная изоформа прионного белка) были обнаружены посредством иммуноблоттинга только в дорожке 3, и полосы прионного белка (нормальный прионный белок) не обнаружены в дорожке 4. Это указывает на то, что ферментативная обработка протеазой К дает возможность различать патогенную изоформу прионного белка и нормальный прионный белок и обнаруживать только патогенную изоформу прионного белка.

[0089] Результаты, показанные на фиг.2 (сравнительный пример 2), сравнивали с результатами, показанными на фиг.1 (пример 1 и сравнительный пример 1), и в результате было установлено, уровень точности и достоверности при распознавании патогенной изоформы прионного белка и нормального прионного белка с использованием бус с иммобилизованным лактоферрином такой же или выше, чем достигаемый общепринятым способом с использованием протеазы К.

Промышленная применимость

[0090] В соответствии с настоящим изобретением можно инспектировать продукты питания, напитки и лекарственные средства с использованием исходных материалов животного происхождения для обнаружения загрязнения патогенной изоформой прионного белка (инфекционный прионный белок) более просто, быстро и количественно с более высокой чувствительностью при более низкой стоимости, чем когда-либо ранее. Кроме того, также возможно диагностировать прионные заболевания у людей и животных более просто, быстро и количественно с более высокой чувствительностью при более низкой стоимости, чем когда-либо ранее. Это предоставляет возможность удовлетворения социальных требований в области предотвращения инфекции и ранней диагностики прионных заболеваний у людей и животных. Как описано выше, настоящее изобретение обладает промышленной применимостью.