рекомбинантные аттенуированные микроорганизмы clostridium и вакцина

Формула изобретения

1. Аттенуированный микроорганизм Clostridium perfringens для приготовления вакцины для иммунной защиты домашних животных и птиц от инфекций, вызванных штаммом Clostridium, включая Clostridium perfringens, сконструированный путем интегрирования молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей в основном нетоксичный мутеин альфа-токсина Clostridium perfringens, в хромосому неаттенуированного микроорганизма Clostridium perfringens, причем указанный нетоксичный мутеин альфа-токсина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, за исключением, по меньшей мере, 9 последовательных аминокислотных остатков, причем одним из удаленных аминокислотных остатков является His₆₈.

2. Аттенуированный микроорганизм Clostridium perfringens по п.1, который является в основном нетоксичным.

3. Аттенуированный микроорганизм Clostridium perfringens по п.1, в котором молекула нуклеиновой кислоты расположена в хромосоме в положении, гомологичном положению молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей альфа-токсин дикого типа, присутствующей в неаттенуированном Clostridium perfringens.

4. Аттенуированный микроорганизм Clostridium perfringens по п.1, который представляет собой Clostridium perfringens типа А.

5. Аттенуированный микроорганизм Clostridium perfringens по п.1, причем неаттенуированный Clostridium perfringens, из которого он был получен, выделен из животного, являющегося либо млекопитающим, либо птицей.

6. Аттенуированный микроорганизм Clostridium perfringens по п.5, причем указанное млекопитающее выбрано из группы, состоящей из крупного рогатого скота, овец и свиней.

7. Аттенуированный микроорганизм Clostridium perfringens по п.5, причем указанная птица представляет собой курицу, индейку, гуся, утку, лебедя, горлицу, голубя, тетерева или куропатку.

8. Аттенуированный микроорганизм Clostridium perfringens для приготовления вакцины для иммунной защиты домашних животных и птиц от бактериальных и небактериальных инфекций, сконструированный путем интегрирования молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей в основном нетоксичный мутеин альфа-токсина Clostridium perfringens, в хромосому неаттенуированного микроорганизма Clostridium perfringens, причем указанный нетоксичный мутеин альфа-токсина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, за исключением, по меньшей мере, 9 последовательных аминокислотных остатков, причем одним из удаленных аминокислотных остатков является His ₆₈ и дополнительно содержащий, по меньшей мере, один ген, кодирующий полипептид, отличный от полипептида Clostridium perfringens.

9. Аттенуированный микроорганизм Clostridium perfringens по п.8, причем указанный полипептид, отличный от полипептида Clostridium perfringens, представляет собой небактериальный полипептид.

10. Аттенуированный микроорганизм Clostridium perfringens по п.9, причем небактериальный полипептид представляет собой полипептид птицы или млекопитающего.

11. Аттенуированный микроорганизм Clostridium perfringens по п.10, причем небактериальный полипептид представляет собой полипептид птицы.

12. Аттенуированный микроорганизм Clostridium perfringens по п.10, причем небактериальный полипептид представляет собой цитокин.

13. Аттенуированный микроорганизм Clostridium perfringens по п.12, причем цитокин представляет собой куриный IL-18.

Описание изобретения к патенту

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка является непредварительной заявкой, по которой испрашивается приоритет согласно 35 U.S.C. § 119(е) в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США № 60/792553, поданной 17 апреля 2006 года, содержание которой включено в настоящее описание в полном объеме посредством ссылки.

Область, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к аттенуированным микроорганизмам Clostridium, способам их получения и применения и мутеинам альфа-токсина и кодирующим их нуклеиновым кислотам.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Анаэробные бактериальные патогены представляют собой серьезную экономическую проблему для сельского хозяйства. Особую проблему представляют бактерии семейства Clostridium, поскольку эти бактерии вызывают серьезные заболевания домашней птицы и других экономически ценных домашних животных. Предыдущие попытки борьбы с этими микроорганизмами основывались на санитарных мерах и введении в корм для животных антибиотиков.

В частности, Clostridium perfringens («С.perfringens») представляет собой анаэробную бактерию, наблюдаемую в почве, разлагающемся органическом веществе и в составе кишечной флоры людей и животных. Различные штаммы С.perfringens обозначены как биотипы А-Е в зависимости от спектра продуцируемых токсинов [Justin et al., Biochemistry 41, 6253-6262 (2002); McDonel (1986) PHARMACOLOGY OF BACTERIAL TOXINS: F. Dorner and J. Drews (Eds.) Pergamon Press, Oxford]. Штаммы биотипа А имеют особую значимость как этиологические агенты различных типов гангрены и кишечных заболеваний. Особенно серьезным кишечным заболеванием, вызываемым С.perfringens, является enteritis necroticans (также известный как «некротический энтерит»), гангрена кишечника, приводящая к некрозу, сепсису и гемолизу как у людей, так и у домашних животных [см. Pearson et al., J. Am. Vet. Med. 188(11):1309-10 (1986); Al-Sheikhy and Truscott, Avian Dis. 21 (2):256-63 (1977)]. Для птиц, например кур (Gallus gallus), некротический энтерит является существенной проблемой. С.perfringens типа А или типа С могут быть причиной крупных потерь, особенно в производстве цыплят-бройлеров [Ficken and Wages, Necrotic Enteritis, In Diseases of Poultry, 10th Ed. p.261-264 (1997)]. Помимо потерь, связанных со вспышками некротического энтерита, сообщается, что в стадах, страдающих заболеванием, связанным с С.perfringens, продуктивность снижается [Lovl and Kaldhusdal, Avian Pathology 30:73-81 (2001)]. Как отмечено выше, самым распространенным способом борьбы являются антибактериальные средства, вносимые в корм для животных. Однако антибактериальные средства, например антибиотики, дорогостоящи и вызывают все большую озабоченность, связанную с развитием бактериальной резистентности.

Позднее были сделаны попытки приготовить вакцины против патогенных штаммов Clostridium. Например, Lovland et al. [Avian Pathology 33(1):83-92 (2004)] продемонстрировали кандидатные вакцины на основе анатоксинов С.perfringens типа А и типа C с гидроксидом алюминия в качестве адъюванта. Сообщалось, что вакцинация несушек обеспечивала наработку специфичных антител для защиты потомства от поражений кишечника путем субклинического заражения С.perfringens. Известны другие вакцины на основе анатоксинов, приготовленные на основе обезвреженных токсинов С.perfringens [см., например, патент США № 4292307, в котором описаны анатоксины С.perfringens типов А, В и D, Cl. oedematiens и Cl. septicum].

Также были предложены препараты рекомбинантных анатоксинов. Например, Titball et al. [патенты США № 5851827, 6403094 и 5817317] описывают нуклеиновые кислоты, которые кодируют антигенные пептиды С.perfringens, a также сами пептиды и вакцины, приготовленные на основе этих пептидов. Например, описаны пептиды, содержащие аминокислотные остатки 261-300 нативного альфа-токсина С.perfringens, но не содержащие доменов фосфолипазы С и гидролизинов сфингомиелина нативного токсина. Далее сообщалось, что эти пептиды индуцируют иммунную защиту от нативного токсина. Кроме того, в патенте США № 6610300 описана вакцина на основе антигенного фрагмента мутеина бета-токсина С.perfringens.

Однако независимо от того, получена ли анатоксинная вакцина из нативного микроорганизма или она получена рекомбинантными методами, считается экономически обременительным получать и вводить анатоксинные белки животным, нуждающимся в иммунизации, за исключением особых случаев (например, лечения людей, у которых могут быть аллергические реакции или которые чувствительны к другим компонентам цельноклеточных вакцин). Кроме того, для наступления полного эффекта обычно требуются повторные ревакцинации вакцинами на основе белка/анатоксина.

Другим предложенным решением было конструирование антигенно активного вируса, который будет продуцировать мутантный альфа-токсин вместо токсина дикого типа. Например, Bennett et al. [Viral Immunol. 12(2):97-105 (1999)] описали рекомбинантный вектор на основе вируса коровьей оспы, который экспрессирует нетоксичный С-домен альфа-токсина С.perfringens. К сожалению, хотя за последние 20 лет было предложено несколько рекомбинантных вакцин на основе вируса коровьей оспы, по-прежнему остается опасение, связанное с безопасностью выпуска живых инфекционных вирусов коровьей оспы в окружающую среду, где они могут передаваться людям, которые не резистентны к этому вирусу.

Известно, что альфа-токсин (ген plc) С.perfringens обладает несколькими биологическими активностями, в том числе гемолитической активностью, фосфорилазной С, сфингомиелиназной, фосфодиэстеразной и летальной активностями. В предшествующем уровне техники имеется целый ряд сообщений, касающихся мутаций этого альфа-токсина, которые снижают токсичность. Schoepe et al. [Infect. and Immun. 69(11):7194-7196 (2001)] описывают природный штамм С.perfringens, который продуцирует нетоксичный альфа-токсин. Однако модифицировать этот штамм для индукции иммунной защиты против варианта, отличного от токсичных штаммов С.perfringens дикого типа, сложно.

Williamson и Titball [Vaccine 11(12):1253-1258 (1993)] показали, что участка токсина, содержащего только аминокислотные остатки 247-370, было достаточно для иммунизации мышей против газовой гангрены, индуцированной в эксперименте С.perfringens. Alape-Girón et al. [Eur. J. Biochem. 267:5191-5197 (2000)] сообщили, что замены в Asp269, Asp336, Tyr275, Tyr307 и Tyr331 снижали токсичность альфа-токсина. Nagahama et al. [Infect. and Immun. 65:3489-3492 (1997)] сообщили, что замены Asp-56, Asp-130 или Glu-152 приводили к снижению токсичности альфа-токсина. Nagahama et al. [J. Bacteriology 177:1179-1185 (1995)] сообщили, что замена гистидина в положении 68 альфа-токсина С.perfringens нейтральной аминокислотой, такой как глицин, приводит к полной потере гемолитической, фосфолипазной С, сфингомиелиназной и летальной активностей мутантного альфа-токсина. Было высказано мнение о том, что такая замена одной аминокислоты инактивирует один из трех цинксвязывающих доменов этого белка. Этот цинксвязывающий домен, инактивируемый заменой His₆₈, впоследствии был обозначен как Zn2 [Justin et al., Biochemistry 41:6253-6262 (2002)].

Несмотря на вышесказанное в данной области техники остается потребность в безопасном, экономичном и эффективном способе защиты интенсивно выращиваемых домашних животных, включая птицу, такую как куры, от заражения штаммами Clostridium, включая С.perfringens.

Цитирование любой ссылки в настоящем описании не должно рассматриваться как признание того, что такая ссылка может восприниматься как часть «предшествующего уровня техники» для настоящей заявки.

Краткое раскрытие сущности изобретения

Устраняя описанные выше недостатки решений, известных из предшествующего уровня техники, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют по существу нетоксичный мутеин альфа-токсина Clostridium perfringens. В соответствии с одним вариантом выполнения молекула нуклеиновой кислоты кодирует мутеин альфа-токсина, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, за исключением, по меньшей мере, 18 последовательных аминокислотных остатков, причем одним из удаленных аминокислотных остатков является His ₆₈. В соответствии с другим вариантом выполнения молекула нуклеиновой кислоты кодирует мутеин альфа-токсина, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, за исключением, по меньшей мере, 12 последовательных аминокислотных остатков, причем одним из удаленных аминокислотных остатков является His ₆₈. В соответствии с еще одним вариантом выполнения молекула нуклеиновой кислоты кодирует мутеин альфа-токсина, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, за исключением, по меньшей мере, 9 последовательных аминокислотных остатков, причем одним из удаленных аминокислотных остатков является His ₆₈. В соответствии с еще одним вариантом выполнения молекула нуклеиновой кислоты кодирует мутеин альфа-токсина, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, за исключением, по меньшей мере, 6 последовательных аминокислотных остатков, причем одним из удаленных аминокислотных остатков является His ₆₈. В соответствии с еще одним вариантом выполнения молекула нуклеиновой кислоты кодирует мутеин альфа-токсина, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, за исключением, по меньшей мере, 3 последовательных аминокислотных остатков, причем одним из удаленных аминокислотных остатков является His ₆₈.

В соответствии с одним вариантом выполнения молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует мутеин, в котором удалено не более 48 последовательных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3. В соответствии с другим вариантом выполнения молекула нуклеиновой кислоты кодирует мутеин, в котором удалено не более 36 последовательных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3. В соответствии с еще одним вариантом выполнения молекула нуклеиновой кислоты кодирует мутеин, в котором удалено не более 24 последовательных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3. В соответствии с еще одним вариантом выполнения молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует мутеин, в котором удалено не более 18 последовательных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3.

В соответствии с конкретным вариантом выполнения настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей мутеин, в котором из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 удалено девять последовательных аминокислотных остатков, одним из которых является His₆₈. В соответствии с конкретным вариантом выполнения этого типа молекула нуклеиновой кислоты кодирует мутеин, в котором девять удаленных последовательных аминокислотных остатков находятся в интервале от Tyr₆₂ до Trp₇₀ SEQ ID NO: 3. В соответствии с более конкретным вариантом выполнения молекула нуклеиновой кислоты кодирует мутеин, в котором эти девять удаленных последовательных аминокислот заменены одним остатком лейцина.

В соответствии с другим вариантом выполнения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, в которой удалены нуклеотиды 268-294. В соответствии с конкретным вариантом выполнения этого типа нуклеотиды 268-294 нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2 заменены тремя нуклеотидами, которые кодируют один остаток лейцина.

Настоящее изобретение также относится к по существу нетоксичным мутеинам альфа-токсина Clostridium perfringens. В соответствии с одним таким вариантом выполнения мутеин альфа-токсина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, за исключением, по меньшей мере, 18 последовательных аминокислотных остатков, причем одним из удаленных аминокислотных остатков является His₆₈. В соответствии с другим вариантом выполнения мутеин содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, за исключением, по меньшей мере, 12 последовательных аминокислотных остатков, причем одним из удаленных аминокислотных остатков является His₆₈. В соответствии с еще одним вариантом выполнения мутеин содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, за исключением, по меньшей мере, 9 последовательных аминокислотных остатков, причем одним из удаленных аминокислотных остатков является His₆₈. В соответствии с еще одним вариантом выполнения мутеин содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, за исключением, по меньшей мере, 6 последовательных аминокислотных остатков, причем одним из удаленных аминокислотных остатков является His₆₈. В соответствии с еще одним вариантом выполнения мутеин содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, за исключением, по меньшей мере, 3 последовательных аминокислотных остатков, причем одним из удаленных аминокислотных остатков является His₆₈.

В соответствии с одним вариантом выполнения из мутеина согласно настоящему изобретению удалено не более 48 последовательных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3. В соответствии с другим вариантом выполнения из мутеина согласно настоящему изобретению удалено не более 36 последовательных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3. В соответствии с еще одним вариантом выполнения из мутеина согласно настоящему изобретению удалено не более 24 последовательных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3. В соответствии с еще одним вариантом выполнения из мутеина согласно настоящему изобретению удалено не более 18 последовательных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3.

В соответствии с конкретным вариантом выполнения настоящее изобретение относится к по существу нетоксичному мутеину, в котором из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 удалено девять последовательных аминокислотных остатков, одним из которых является His₆₈ . В соответствии с более конкретным вариантом выполнения этого типа девять удаленных последовательных аминокислотных остатков находятся в интервале от Tyr₆₂ до Trp₇₀ SEQ ID NO: 3. В соответствии с еще более конкретным вариантом выполнения эти девять удаленных последовательных аминокислот заменены в аминокислотной последовательности мутеина одним остатком лейцина.

Изобретение дополнительно относится к аттенуированным микроорганизмам Clostridium perfringens, содержащим интегрированную в их хромосомы молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует по существу нетоксичный мутеин альфа-токсина Clostridium perfringens. Эта интегрированная молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно расположена в положении в хромосоме, которое гомологично локализации молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует альфа-токсин дикого типа в микроорганизме Clostridium perfringens дикого типа. Таким образом, аттенуированный микроорганизм Clostridium perfringens согласно настоящему изобретению может быть по существу нетоксичным благодаря отсутствию функционального гена plc дикого типа. Как проиллюстрировано примерами в настоящем описании, аттенуированный микроорганизм Clostridium perfringens может представлять собой Clostridium perfringens типа А.

В соответствии с конкретным вариантом выполнения настоящего изобретения аттенуированный микроорганизм Clostridium perfringens представляет собой Clostridium perfringens CPERF/ Toxin 365-054 (АТСС деп. № РТА7364). В соответствии с другим конкретным вариантом выполнения настоящего изобретения аттенуированный микроорганизм Clostridium perfringens представляет собой Clostridium perfringens CPERF/ Toxin 365-053 (АТСС деп. № РТА7365).

Микроорганизм Clostridium perfringens, который подвергается аттенуации в соответствии со способами согласно настоящему изобретению, может быть выделен из организма животного-хозяина, которое представляет собой либо млекопитающее, либо птицу. Такие млекопитающие могут включать в себя крупный рогатый скот, овец и свиней. Примеры подходящих птиц включают в себя кур, индеек, уток, голубей, гусей, горлиц, лебедей, куропаток и рябчиков.

Настоящее изобретение также относится к вакцинам. Такие вакцины могут содержать аттенуированные микроорганизмы Clostridium perfringens согласно настоящему изобретению. Вакцины согласно настоящему изобретению также могут содержать фармакологически приемлемые буферы, наполнители и/или адъюванты.

Кроме того, изобретение относится к способам индукции иммунного ответа на Clostridium perfringens у животных. Один такой вариант выполнения предусматривает введение животному иммунологически эффективной дозы вакцины согласно настоящему изобретению Вакцины согласно настоящему изобретению могут быть введены с помощью ряда способов, включая пероральное, внутримышечное, внутривенное, внутрикожное, подкожное и интраназальное введение. Вакцина согласно настоящему изобретению может быть нанесена на корм для животного и/или распылена на животных для обеспечения перорального введения. Настоящее изобретение дополнительно относится к корму для животных, который содержит вакцину согласно настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к аттенуированому микроорганизму Clostridium perfringens согласно настоящему изобретению, который дополнительно экспрессирует, по меньшей мере, один ген, кодирующий полипептид, отличный от полипептида Clostridium perfringens. В соответствии с одним таким вариантом выполнения один или несколько полипептидов, отличных от полипептидов Clostridium perfringens, представляют собой бактериальные полипептиды, такие как антигенные белки E.coli, сальмонеллы, лавсонии или кампилобактера и т.д., или их комбинации. Альтернативно или в сочетании с ними полипептид, отличный от полипептида Clostridium perfringens, может представлять собой небактериальный полипептид. Примеры таких небактериальных полипептидов включают в себя белки млекопитающих или птиц, например цитокины, такие как куриный IL-18; вирусов, таких как ротавирус или коронавирус; и паразитов, таких как эймерия, изоспора и криптоспоридии.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к антителу, которое селективно связывается с эпитопом, отсутствующим в по существу нетоксичном мутеине альфа-токсина Clostridium perfringens. Такие антитела могут различать по существу нетоксичный мутеин альфа-токсина от альфа-токсина Clostridium perfringens дикого типа.

Также предложены тест-наборы, которые содержат антитела согласно настоящему изобретению, применимые для определения того, было ли данное животное вакцинировано или, альтернативно, было ли оно естественным путем инфицировано микроорганизмом Clostridium perfringens.

Соответственно, также предложены способы идентификации и/или распознавания животного, которое было инфицировано микроорганизмом Clostridium perfringens естественным путем, от животного, вакцинированного аттенуированным микроорганизмом Clostridium perfringens. В соответствии с одним таким вариантом выполнения способ предусматривает взаимодействие жидкого образца, полученного от животного, с антителом, которое селективно связывается с эпитопом, присутствующим в альфа-токсине Clostridium perfringens дикого типа, который удален из по существу нетоксичного мутантного альфа-токсина Clostridium perfringens согласно настоящему изобретению. Таким образом, антитело может обеспечить различение животных, которые были вакцинированы по существу нетоксичным мутеином альфа-токсина Clostridium perfringens согласно настоящему изобретению (и/или аттенуированным микроорганизмом Clostridium perfringens, экспрессирующим мутеин), от животных, которые инфицированы или были инфицированы альфа-токсином Clostridium perfringens дикого типа. Следующая стадия предусматривает определение того, вступает ли антитело во взаимодействие с жидким образцом, например связывается ли оно с антигеном, содержащимся в жидком образце. Животное идентифицируют как животное, которое инфицировано/было инфицировано естественным путем микроорганизмом Clostridium perfringens, в том случае, если антитело вступает во взаимодействие с жидким образцом.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показана геномная карта области, кодирующей альфа-токсин С.perfringens. Показаны локализации двух крупных (1182 пар нуклеотидов и 1746 пар нуклеотидов) фрагмента соответственно, которые были использованы для конструирования CPERF001. Также указана локализация полученной в результате делеции 27 пар нуклеотидов. «Yplc» обозначает ген yplc (CPE0035); «plc» обозначает ген, кодирующий альфа-токсин (фосфолипазу С), a «CobW» обозначает правее расположенный ген.

На фиг.2А показана последовательность части гена plc из штамма С.perfringens CP6 [SEQ ID NO: 4; это часть последовательности SEQ ID NO: 22 (т.е. нуклеотиды 262-300) фрагмента гена plc из CP6] и соответствующая пептидная последовательность (SEQ ID NO: 5), где подчеркивание обозначает сайт рестрикции эндонуклеазы BamHI, используемый при создании делеции.

На фиг.2В показана последовательность праймера (SEQ ID NO: 6), используемого для создания делеции в исходном штамме С.perfringens 1240 с получением несущего делецию CPERF001. Подчеркивание обозначает сайт рестрикции BamHI, включенный в праймер для облегчения создания делеции. Также показан соответствующий пептид (SEQ ID NO: 7).

На фиг.2С показана последовательность полученной в результате делеции в CPERF001 (SEQ ID NO: 8; нуклеотиды 103-117) и в соответствующем пептиде (SEQ ID NO: 9). Подчеркивание указывает на восстановленный сайт рестрикции эндонуклеазы BamHI.

На фиг.3А вновь показана последовательность части гена plc из штамма С.perfringens CP6 [SEQ ID NO: 4, нуклеотиды 262-300] и соответствующая пептидная последовательность (SEQ ID NO: 5), где подчеркивание указывает на сайт рестрикции эндонуклеазы BamHI, используемый при создании делеции.

На фиг.3В показана последовательность праймера (SEQ ID NO: 10), используемого для создании делеции в исходном штамме С.perfringens 29, с получением несущего делецию CPERF002. Также показан соответствующий пептид (SEQ ID NO: 11).

На фиг.3C показана последовательность полученной в результате делеции в CPERF002 (SEQ ID NO: 12) и соответствующий пептид (SEQ ID NO: 13).

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Таким образом, изобретение относится к модифицированным микроорганизмам Clostridia и культурам, которые экспрессируют один или несколько токсинов Clostridia, например альфа-токсины, в виде мутеинов, которые не обладают определяемой токсичностью и/или обладают по существу низкой токсичностью по сравнению с нативными токсинами Clostridia или токсинами Clostridia дикого типа. Предпочтительно, мутантные микроорганизмы С.perfringens согласно изобретению легко вводятся животным в виде живой вакцины. Также предлагается мутеин альфа-токсина С.perfringens согласно изобретению наряду с кодирующими мутеины молекулами нуклеиновой кислоты, векторами для экспрессии альфа-токсинов и способами их применения.

Для предоставления понятного описания изобретения некоторые термины определены следующим образом. Вакцина представляет собой композицию, которая включает в себя иммуноген и другие необязательные фармацевтически приемлемые ингредиенты, включая в соответствии с некоторыми вариантами выполнения подходящие адъюванты. Используемый в настоящем описании термин «иммуноген» описывает композицию, вещество или вектор, которые при введении животному стимулируют иммунный ответ. Для целей настоящего изобретения подразумевается, что иммуноген включает в себя любой вектор, способный экспрессировать или вводить мутеин альфа-токсина согласно изобретению иммунизируемому животному. Вектор включает в себя, например, С.perfringens согласно изобретению или другой подходящий микроорганизм, который экспрессирует мутеин альфа-токсина согласно изобретению при введении животному этого вектора. Вектор также включает в себя известные из предшествующего уровня техники молекулы нуклеиновой кислоты, например плазмиды и т.п., которые экспрессируют мутеин альфа-токсина согласно изобретению при непосредственном введении животному, например проникая в клетку животного и экспрессируя в организме животного мутеин альфа-токсина. Иммуногеном также является белок, такой как альфа-токсин согласно изобретению, используемый как таковой или как часть подходящей вакцинной композиции.

Если иное не оговорено особо, используемые в настоящем описании термины «иммунизировать» и «вакцинировать» являются синонимами и используются взаимозаменяемо для описания введения иммуногена животному для индукции иммунного ответа у этого животного. Индуцированный иммунный ответ обеспечивает защитный иммунитет иммунизированному животному, который ограничивает или уменьшает клинические симптомы заболевания, например газовой гангрены, и/или смертность, у вакцинированных животных, которые впоследствии заражаются вирулентной дозой микроорганизмов С.perfringens, против которых вакцина согласно изобретению обладает защитными свойствами.

Термин «адъювант» определяется как одно или несколько веществ, которые вызывают стимуляцию иммунной системы. В этом контексте адъювант используют для усиления иммунного ответа на один или несколько антигенов/изолятов в составе вакцины. Адъювант может быть введен целевому животному до введения вакцины, в сочетании с вакциной или после введения вакцины. Адъюванты согласно настоящему изобретению могут быть получены из любого из ряда источников, включая природные источники, рекомбинантные источники, и/или могут быть синтезированы химически и т.д. Примеры химических соединений, используемых в качестве адъювантов, включают в себя без ограничения соединения алюминия; метаболизируемые и неметаболизируемые масла; блок-сополимеры; ISCOM (иммуностимулирующие комплексы); витамины и минералы (включая без ограничения витамин Е, витамин А, селен и витамин B₁₂ ); Quil А (сапонины); сшитые полимеры на основе акриловой кислоты (например, полимеры проп-2-еновой кислоты), сшитые на различных уровнях с полиалкенильным полиэфиром, распространяемые под товарным знаком CARBOPOL®; и/или равномерно диспергированные капли масла микронного размера в виде водной эмульсии, например распространяемые под товарным знаком Emulsigen®.

Дополнительные примеры адъювантов, которые иногда особо указывались в качестве иммунных стимуляторов, включают в себя компоненты клеточной стенки бактерий и грибов (например, липополисахариды, липопротеиды, гликопротеиды, мурамилпептиды, бета-1,3/1,6-глюканы), различные сложные углеводы растительного происхождения (например, гликаны, ацеманнан), различные белки и пептиды животного происхождения (например, гормоны, цитокины, костимулирующие факторы) и новые нуклеиновые кислоты, полученные из вирусов и других источников (например, двухцепочечная РНК, CpG). Кроме того, любое количество комбинаций упомянутых выше веществ может обеспечить адъювантный эффект и, таким образом, может образовывать адъювант согласно настоящему изобретению.

Подразумевается, что используемый в настоящем описании термин «антитело» охватывает поликлональные антитела, моноклональные антитела и/или их фрагменты или рекомбинантные производные, включая сконструированные связывающие белки, содержащие вариабельные домены антител.

Используемая в настоящем изобретении нумерация остатков и положения аминокислотных остатков белков альфа-токсина согласно изобретению основана на системе нумерации, описанной для штамма 13 Clostridium perfringens. Альфа-токсин штамма 13 С.perfringens включен в GenBank под кат. № NC 003366, представленным последовательностью SEQ ID NO: 1. Полноразмерный белок содержит 398 аминокислот. Альфа-токсин, кодируемый мутантными векторами, проиллюстрированными приведенными ниже примерами, соответствует белку SEQ ID NO: 1, содержащему делецию аминокислотных остатков 90-98. Имеется сигнальная последовательность размером 28 аминокислот, которая отщепляется в процессе созревания белка. Таким образом, проиллюстрированная примером делеция соответствует аминокислотным остаткам 62-70 зрелого белка, который содержит 370 аминокислот (SEQ ID NO: 3).

Нумерация кодонов ДНК, кодирующей белки альфа-токсина согласно изобретению, основана на таковой гена plc штамма 13 Clostridium perfringens, включенного в GenBank под кат. № NP 560952 и представленного последовательностью SEQ ID NO: 2. Последовательность, кодирующая альфа-токсин, находится между нуклеотидами 48590 и 49786 в штамме 13 С.perfringens. Делеция кодона в двух проиллюстрированных в настоящем описании конструкциях соответствует нуклеотидам 48857-48883 (включительно) гена NP 560952. Эта делеция находится в гене альфа-токсина и соответствует нуклеотидам 268-294 кодирующей последовательности SEQ ID NO: 2.

Далее, использование терминов в единственном числе для удобства описания никоим образом не предназначено для ограничения. Таким образом, например, ссылка на композицию, содержащую клетку С.perfringens, включает в себя ссылку на одну или несколько таких клеток. Также следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными описанными в настоящем описании конфигурациями, стадиями способов и веществами, поскольку такие конфигурации, стадии способов и вещества могут несколько различаться. Также следует понимать, что используемая в настоящем описании терминология используется исключительно с целью описания конкретных вариантов выполнения и не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

В соответствии с конкретным аспектом настоящего изобретения предусмотрены необратимые мутанты С.perfringens, являющиеся «по существу нетоксичными», т.е. организмы, которые экспрессируют иммуногенный альфа-токсин низкой или нулевой токсичности, что делает их подходящими для использования в качестве защитных вакцин. Таким образом, микроорганизмы С.perfringens согласно изобретению характеризуются достаточно сниженной токсичностью по сравнению с микроорганизмами С.perfringens дикого типа для того, чтобы быть переносимыми в качестве вакцины или антигена при использовании в условиях, эффективных для индукции у надлежащим образом вакцинированных животных иммунного ответа против альфа-токсина или против С.perfringens. Таким образом, микроорганизм С.perfringens согласно изобретению является «аттенуированным» по сравнению с C.perfringens дикого типа.

Выражение «по существу нетоксичный» также предназначено для применения к вышеуказанным иммуногенным мутеинам альфа-токсина, которые имеют достаточно низкую или нулевую токсичность, что также делает их подходящими для использования в защитной вакцине.

Снижение токсичности измеряется, например, с помощью одного из следующих анализов, известных из предшествующего уровня техники: анализа гемолитической активности, анализа активности фосфорилазы C, анализа активности сфингомиелиназы, анализа активности фосфодиэстеразы и анализа общей летальной активности в группе экспериментальных животных. Как правило, этими стандартными исследованиями остаточная токсичность не определяется. Тем не менее, наличие минимального уровня одной или нескольких этих активностей, например от около 10^-4 до около 10^-2, по сравнению с токсичностью эквивалентного числа инфицирующих единиц альфа-токсина С.perfringens дикого типа, из которого был получен мутеин, может оказаться приемлемым в ветеринарной практике.

В соответствии с одним вариантом выполнения изобретение осуществляют на практике с использованием штаммов С.perfringens биотипа А, которые представляют особую важность как этиологические факторы гангрены и кишечных заболеваний различных типов. В частности, альфа-токсин С.perfringens является мишенью для аттенуирующей делеции, поскольку аттенуации этого токсина достаточно для того, чтобы сделать С.perfringens в достаточной степени нелетальными по сравнению со штаммами дикого типа.

В общих чертах, ген plc C.perfringens согласно изобретению экспрессирует мутеин альфа-токсина. Мутеин альфа-токсина содержит делецию, которая содержит His в петле Zn2 вместе с фланкирующими остатками, что резко уменьшает возможность любой обратной мутации в токсическую форму. В настоящее время известно, что делеция остатка His петли Zn2, например His₆₈ последовательности SEQ ID NO: 3, вместе с делецией дополнительных остатков, фланкирующих остаток His петли Zn2, приводит к образованию альфа-токсина, сохраняющего достаточную иммуногенность для индукции защитного иммунитета у животных, вакцинированных С.perfringens согласно изобретению, в то же время характеризующегося малой вероятностью претерпеть обратную мутацию в альфа-токсин дикого типа. Дополнительные остатки, которые могут быть удалены, удаляются в С-концевом направлении и/или N-концевом направлении относительно His₆₈ и могут составлять от около 4 до около 60 остатков в любом из этих направлений. Альтернативно, аналогичным образом могут быть удалены His₁₄₈ и фланкирующие остатки.

В соответствии с одним вариантом выполнения мутеин альфа-токсина согласно изобретению также содержит, помимо делеции His₆₈, делецию, по меньшей мере, 30 аминокислотных остатков с любой стороны (в C-концевом или N-концевом направлении) от положения His₆₈ по сравнению с SEQ ID NO: 3. В соответствии с другим вариантом выполнения мутеин альфа-токсина согласно изобретению содержит, помимо делеции His₆₈, делецию, по меньшей мере, 20 аминокислотных остатков с любой стороны от His₆₈ по сравнению с SEQ ID NO: 3. В соответствии с одним альтернативным вариантом выполнения мутеин альфа-токсина согласно изобретению содержит, помимо делеции His₆₈, делецию, по меньшей мере, 5 аминокислотных остатков с любой стороны от His₆₈ по сравнению с SEQ ID NO: 3. В соответствии с еще одним вариантом выполнения мутеин альфа-токсина согласно изобретению содержит, помимо делеции His ₆₈, делецию примерно от остатка 62 примерно до остатка 70, по сравнению с SEQ ID NO: 3. Удаленные аминокислотные остатки необязательно заменены одним или несколькими другими остатками, например одним остатком лейцина.

В соответствии с еще одним вариантом выполнения мутеин альфа-токсина С.perfringens получают и выделяют из С.perfringens или из альтернативного рекомбинантного микроорганизма, используемого в качестве реагента для исследования и/или в диагностических наборах или аналитических наборах, например, в качестве мишени для антител против альфа-токсина. Еще одним применением мутеинов альфа-токсина С.perfringens является применение в специализированных вакцинах для животных, например, людей, которые могут не перенести вакцинации аттенуированным микроорганизмом С.perfringens согласно изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу, которое специфично связывается с альфа-токсином дикого типа в отличие от мутеинов альфа-токсина согласно настоящему изобретению.

В соответствии со следующим вариантом выполнения представлено антитело, которое предпочтительно связывается с белком альфа-токсина С.perfringens дикого типа, демонстрируя минимальное или нулевое связывание с мутеином альфа-токсина согласно изобретению, например, не связывающееся с мутеином альфа-токсина, который содержит делецию, подробно описанную выше. Таким образом, представленное антитело применимо для отличия несущего делецию мутеина альфа-токсина от альфа-токсина дикого типа и за счет этого также применимо для различения животных, вакцинированных вакциной согласно настоящему изобретению, от животных, которые были инфицированы С.perfringens дикого типа. Способы индукции и скрининга таких селективных антител известны из предшествующего уровня техники. Аналогично, также могут быть получены антитела, которые распознают мутеин альфа-токсина согласно настоящему изобретению, но не белок дикого типа. Антитела согласно настоящему изобретению могут быть поликлональными, моноклональными («mAb»), или фрагментами, или сконструированными фрагментами, или производными таких антител, сохраняющими свойства селективного связывания.

Методики получения и скрининга моноклональных антител были подробно описаны [см., например, Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, California (1988); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988); Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2nd ed.), Academic Press, New York (1986); и Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975), каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки].

Например и без ограничения, иммунный ответ индуцируют у подходящих животных, таких как мышь или курица, путем вакцинации очищенным альфа-токсином С.perfringens дикого типа, например, в сочетании с подходящим адъювантом. Например, во избежание проявления токсичности альфа-токсина дикого типа иммуноген представляет собой пептид, соответствующий удаленным остаткам, и при необходимости иммуногенность пептида усиливают объединением с подходящим адъювантом или путем сочетания с подходящим белком-переносчиком. Сочетание с белком-переносчиком известно из предшествующего уровня техники и может быть проведено, например, с использованием пептида с концевым цистеином и его соединением с гемоцианином фиссуреллы (KLH) или бычьим сывороточным альбумином (BSA), используя либо реакцию присоединения малеимидной группы, либо сульфосукцинимидил-4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилатный) линкер (производства Pierce). Также может быть использован карбодиимидный линкер, что снимает необходимость концевого цистеина.

Для получения моноклональных антител могут быть получены лимфоциты селезенки иммунизированного животного, из этих лимфоцитов получают гибридомы, и могут быть получены одна или несколько потенциально подходящих гибридом, экспрессирующих антитело против альфа-токсина. Гибридомы подвергают скринингу как против мутеина, так и против альфа-токсина дикого типа, и гибридому, экспрессирующую антитело, которое связывается только с альфа-токсином дикого типа, идентифицируют, клонируют и используют для получения моноклональных антител, которые связываются только с альфа-токсином дикого типа. Необязательно, получают кДНК из идентифицированной гибридомной клональной линии, и рекомбинантные антитела или фрагменты антител могут быть получены в других экспрессионных системах, известных из предшествующего уровня техники.

Как обсуждалось выше, одним потенциальным недостатком вакцинации в целом является то, что у вакцинированных животных могут наблюдаться ложноположительные реакции при тестировании на инфекцию с использованием антител, полученных против природного штамма, тем самым затрудняя идентификацию инфицированных животных. Таким образом, настоящее изобретение относится к тест-набору для отличия исследуемого животного, которое было инфицировано природным микроорганизмом С.perfringens, от животного, вакцинированного мутеином альфа-токсина согласно настоящему изобретению.

Один такой тест-набор содержит некоторое количество селективных антител против альфа-токсина дикого типа, которые характеризуются минимальным или нулевым связыванием с мутеином альфа-токсина согласно настоящему изобретению. Набор также может содержать другие подходящие реагенты, достаточные для проведения, по меньшей мере, одного диагностического исследования. В соответствии с дополнительным вариантом выполнения антитело помечено легкодетектируемой маркерной молекулой, например любым известным из предшествующего уровня техники ферментным маркером, например пероксидазой; флуоресцентной меткой, например флуоресцеином, бусами, в том числе магнитными бусами, и т.п. Необязательно, набор может дополнительно содержать меченое антитело, которое селективно связывается с селективным антителом против альфа-токсина дикого типа. Иммунологические исследования хорошо известны из предшествующего уровня техники и включают в себя сэндвич-иммуноанализ, конкурентные иммуноанализы, твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), радиоиммуноанализы (RIA) и другие.

Также представлены способы идентификации и различения животного, которое было инфицировано природным микроорганизмом С.perfringens, т.е. микроорганизмом дикого типа, от животного, вакцинированного вакциной, содержащей аттенуированный микроорганизм С.perfringens согласно изобретению, которые предусматривают, например, следующие стадии:

(a) взаимодействие жидкого образца, полученного от животного, с описанным выше селективным антителом против альфа-токсина дикого типа, которое характеризуется минимальным или нулевым связыванием с мутеином альфа-токсина согласно настоящему изобретению; и

(b) определение того, взаимодействует ли антитело с жидким образцом; причем, если антитело взаимодействует с жидким образцом, животное идентифицируют как инфицированное природным микроорганизмом С.perfringens.

Получение аттенуированных штаммов С.perfringens

Процесс преобразования изолята С.perfringens дикого типа в аттенуированный, или по существу нетоксичный, штамм, подходящий для введения в качестве вакцины, может быть проведен следующим образом. Ген альфа-токсина (plc) может быть заменен в бактериальной хромосоме геном, кодирующим только мутеин альфа-токсина, не оставляя микроорганизму С.perfringens возможности продуцировать альфа-токсин дикого типа. Очень приблизительно, методика получения вакцинного организма включает в себя без ограничения следующие основные стадии, не обязательно в представленном порядке.

(1) Идентификация типа животного, подлежащего защите вакцинацией, и одного или нескольких клинических изолятов, полученных для целей скрининга. Как правило, эта стадия является необязательной в случае альфа-токсина, поскольку изоляты из одних видов животных скорее обеспечивают, чем не обеспечивают защиту другим видам животных.

(2) Амплификация гена plc из изолята или изолятов С.perfringens, например, с помощью ПЦР или других известных из предшествующего уровня техники методик амплификации нуклеиновых кислот с помощью подходящих фланкирующих праймеров и использование амплификации с помощью подходящих праймеров для создания желаемой делеционной мутации. Альтернативно, может быть зондирована подходящая библиотека.

(3) Создание суицидного вектора, содержащего несущий делецию ген plc, из которого удалена точка начала репликации С.perfringens, и/или точка начала репликации, которая может функционировать в С.perfringens, просто отсутствует; и в любом случае содержащего подходящие селективные маркеры, например маркеры устойчивости к антибиотикам, смежные с мутантным геном plc. Затем такой вектор может быть введен в микроорганизмы С.perfringens, например, путем электропорации или в соответствии с другими известными из предшествующего уровня техники методами.

(4) Селекция микроорганизмов С.perfringens, в которых мутантный ген plc успешно интегрировался в бактериальную хромосому. Это делается путем культивирования микроорганизмов С.perfringens со стадии (3) в присутствии селективного агента, например антибиотика(ов), соответствующего(их) селективным маркерам. Например, единственными микроорганизмами С.perfringens, которые смогут расти в условиях селективного давления антибиотиков, будут такие микроорганизмы, которые за счет гомологичной рекомбинации непосредственно интегрировали в свою бактериальную хромосому суицидный вектор, содержащий ген(ы) устойчивости к антибиотикам. Эти растущие микроорганизмы С.perfringens, таким образом, будут содержать два смежных гена plc, один дикого типа, а другой с делеционной мутацией.

(5) Селекция микроорганизмов С.perfringens, которые подверглись дальнейшей рекомбинации, в ходе которой были удалены селективные маркеры, например маркеры устойчивости к антибиотикам, наряду с геном plc дикого типа. Это выполняется путем культивирования микроорганизмов со стадии (4) в отсутствие селективного агента, например антибиотика, и селекцией негемолитических клонов на кровяном агаре.

Поскольку встраивание мутантной нуклеиновой кислоты осуществляется путем гомологичной рекомбинации, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую мутеин альфа-токсина, встраивают в положение хромосомы, которое гомологично локализации молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей альфа-токсин дикого типа, который присутствует у неаттенуированных Clostridium perfringens.

Более подробно, полевые изоляты С.perfringens получают от больных животных или из других источников. Сначала геномную ДНК, полученную из представляющих интерес полевых изолятов, встраивают в подходящий бифункциональный челночный вектор, например челночную плазмиду с селективными маркерами, например маркерами устойчивости к антибиотикам, для оценки их трансформируемости. В общих чертах, подходящий челночный вектор содержит один, два, три или более следующих признаков, сайт клонирования, точку начала репликации С.perfringens, точку начала репликации E.coli и ген устойчивости к антибиотикам и/или селективный маркер. Известные из предшествующего уровня техники векторы, подходящие для этой цели или легко адаптируемые для этой цели, включают в себя, например, рекомбинантную челночную плазмиду pHR106, описанную Roberts et al. [Appl Env Mircobiol 54: 268-270 (1988)]; плазмиды pJIR 750 и pJIR 751, описанные Bannam et al. [Plasmid 29:233-235 (1993)]; беспромоторный вектор pPSV для отбора промоторов, описанный в Matsushita et al., 1994, Plasmid 31, 317-319; челночные плазмиды pJIR1456 и pJIR1457, описанные Lyras et al., 1988. Plasmid 39, 160-164; и челночный вектор рАК201, описанный Kim et al., 1989. Appl Environ Microbiol 55, 360-365, содержание которых в полном объеме включено в настоящее описание посредством ссылки. Удаление точки начала репликации С.perfringens превращает челночный вектор в суицидный вектор.

Например, одна челночная плазмида представляет собой pJIR418, описанную в Sloan et al., 1992, Plasmid 27, 207-219, включенной в настоящее описание посредством ссылки.

Изоляты позволяют 10⁴ трансформантов на микрограмм плазмидной ДНК, и те трансформанты, которые восприимчивы к маркеру устойчивости к антибиотику, например хлорамфениколу или эритромицину, являются потенциальными кандидатами для делеции. Геномную ДНК штаммов-кандидатов затем используют в качестве матрицы для ПЦР длинных фрагментов гена plc (альфа-токсина) и фланкирующих последовательностей штаммов-кандидатов. Например, как проиллюстрировано ниже, хромосому штамма 13 С.perfringens использовали для идентификации праймеров для амплификации гена, кодирующего альфа-токсин. Эти праймеры затем использовали для клонирования гена альфа-токсина из другого штамма, который представлял собой изолят СР6 из домашней птицы.

После субклонирования продуктов ПЦР ген альфа-токсина и фланкирующие области секвенировали и картировали рестриктазами. Новые олигонуклеотидные праймеры синтезировали с фланкирующими сайтами рестрикции и продукты двух отдельных амплификации клонировали в подходящую суицидную плазмиду (точка начала репликации С.perfringens была удалена), например, проиллюстрированную ниже как плазмида 1192-23.1 для создания желаемого вакцинного штамма, несущего делецию.

Полученный(ые) суицидный(ые) вектор(ы), специфичный(ые) к изоляту(ам), встраивают в соответствующий полученный от животных штамм С.perfringens в соответствии со стандартной известной из предшествующего уровня техники методикой. Например, это осуществляют путем электропорации. Когда суицидный вектор вводят в С.perfringens (без точки начала репликации С.perfringens он не способен реплицироваться в цитоплазме и не может сохраняться без интеграции в бактериальную хромосому). Успешными интегрантами являются только организмы, которые будут расти в присутствии антибиотика, соответствующего вновь введенному маркерному гену устойчивости к антибиотику.

Может быть использован любой селективный маркерный ген, известный из предшествующего уровня техники, хотя в векторах, проиллюстрированных в приведенных ниже примерах, используют маркеры устойчивости к хлорамфениколу и/или эритромицину.

Эти рекомбинантные явления являются результатом гомологии гена plc дикого типа с несущим делецию геном plc плазмидной ДНК. Полученная в результате рекомбинантная бактерия называется интегрантом. Интегрант содержит копию введенного гомологичного вектора, который интегрирован в локус гена plc. Таким образом, полученный в результате интегрант содержит две копии гена plc, исходную нормальную копию и введенный несущий делецию вариант. Введенные гены устойчивости к антибиотикам расположены между двумя копиями гена plc. Редкие случайные события рекомбинации могут происходить между двумя копиями гена plc. Такая рекомбинация может привести к одному из двух результатов. В обоих случаях ДНК, расположенная между двумя копиями гена plc (включая гены устойчивости), была удалена. В первом результате нормальный ген plc, или ген plc дикого типа, восстанавливается, приводя к восстановлению исходного родительского штамма без маркеров устойчивости к антибиотикам. Во втором результате ген plc дикого типа заменяется несущей делецию копией, продуцирующей желаемую несущую делецию конструкцию альфа-токсина без маркеров устойчивости к антибиотикам.

Удаление антибиотика из культуральной среды позволяет бактериям, которые подверглись рекомбинации, выживать и размножаться. Несущие делецию рекомбинантные клоны затем идентифицируют выращиванием на кровяном агаре по отсутствию гемолиза, обычно наблюдаемого при культивировании С.perfringens, которые экспрессируют альфа-токсин дикого типа.

Вакцинируемые животные

Животные, для которых может быть получена вакцина на основе аттенуированной С.perfringens и у которых может быть выделен подходящий штамм С.perfringens дикого типа, включают в себя, вообще говоря, любых животных, которые подвержены инфекции С.perfringens. Представляющие интерес позвоночные включают в себя птиц, млекопитающих и рыб и, в частности, животных, имеющих экономическое и/или сельскохозяйственное значение. В следующий перечень вошли те животные, которым предположительно вакцина против С.perfringens может принести пользу и/или от которых могут быть получены подходящие изоляты С.perfringens дикого типа. Хотя в некоторых случаях возможно, что любая такая вакцина содержит компонент (живой или неживой), который был исходно выделен у животного того же рода или вида, что и вакцинируемое животное, это не является необходимым условием.

Неограничивающий перечень таких животных включает в себя семейства птиц, крупного рогатого скота, овец и т.д., а также водных животных, например которые могут быть выращены в аквакультуре и/или собраны в дикой природе и содержащиеся живыми в емкостях в течение периода времени до продажи. Такие животные включают в себя рыб, таких как форель или лосось, и другие виды, выращенные или выловленные для извлечения экономической выгоды.

Беспозвоночные водные животные включают в себя омаров, крабов, моллюсков, например кальмаров, осьминогов, двустворчатых моллюсков, устриц, мидий, гребешков и т.п. Подразумевается, что птицы включают в себя, например, кур, индеек, гусей, уток и т.д. Подразумевается, что крупный рогатый скот включает в себя, например, быков, коров, телят и т.д. Подразумевается, что овцы включают в себя, например, ягнят и т.д.

Для целей настоящего изобретения должно быть понятно, что термин «рыба» включает в себя без ограничения рыб надотряда Teleostei, т.е. костистых рыб. К надотряду Teleostei принадлежат как отряд Salmoniformes (который включает в себя семейство Salmonidae), так и отряд Perciformes (который включает в себя семейство Centrarchidae).

Примеры потенциальных рыб-реципиентов включают в себя семейство Salmonidae, семейство Serranidae, семейство Sparidae, семейство Cichlidae, семейство Centrarchidae, трехполосая ронка (Parapristipoma trilineatum) и плекостомусы (Plecostomus spp).

В соответствии с дополнительным вариантом выполнения животное является сопутствующим животным или человеком. Для целей настоящего изобретения под термином «сопутствующее животное» подразумеваются все животные - лошади (лошадиные), кошки (кошачьи), собаки (псовые) и грызуны, включая мышей, крыс, морских свинок, породы кроликов и птиц, таких как голуби, попугаи и т.п.

Птицы, подвергающиеся такой вакцинации, могут быть связаны либо с коммерческим, либо с некоммерческим разведением птицы. Они включат в себя, например, Anatidae, таких как лебеди, гуси и утки, Columbidae, например горлицы и голуби, например домашние голуби, Phasianidae, например куропатки, рябчики и индейки, Thesienidae, например домашние курицы, Psittacines, например длиннохвостые попугаи, ара и другие попугаи, например, разводимые для рынка домашних питомцев или для рынка коллекционирования. В приведенных ниже примерах речь идет о курах.

Источники изолятов дикого типа

Как правило, аттенуированные микроорганизмы С.perfringens согласно изобретению могут быть получены из С.perfringens дикого типа, которые изначально были выделены из любого представляющего интерес инфицированного животного, что обсуждалось выше, и/или из окружающей среды. Окружающая среда включает в себя любой материал, который содержит жизнеспособные микроорганизмы С.perfringens и/или жизнеспособные споры С.perfringens, включая, например, зараженную пищу, почву, воду, подстилки животных, экскременты и т.п.

Justin et al. [Biochemistry 41, 6253-6262 (2002)] охарактеризовали альфа-токсины из различных штаммов С.perfringens, которые почти идентичны по последовательностям и биохимическим свойствам. Однако Justin et al. также описали штамм, который был выделен из птицы (лебедя), альфа-токсин которого характеризовался высокой степенью вариабельности последовательности и измененной субстратной специфичностью по сравнению с другими штаммами. По этой причине считается, что большинство изолятов, преобразованных в аттенуированную форму, будет индуцировать защитный иммунитет против альфа-токсина многих других природных штаммов С.perfringens. Тем не менее, принимая во внимание возможность изменчивости альфа-токсина между изолятами, зачастую предпочтительно выделять и аттенуировать микроорганизмы С.perfringens из видов животных, для которых желательно получить вакцину против С.perfringens. Обсуждающийся в примерах, приведенных ниже, изолят был выделен из курицы и исследован на том же виде.

Вакцины

Аттенуированные микроорганизмы С.perfringens согласно изобретению, как правило, включают в состав фармацевтически приемлемых вакцинных композиций. Вакцинные композиции приготавливают в соответствии с путем введения и совместимыми с активным антигенным агентом. Активный антигенный агент представляет собой, например, один или несколько штаммов аттенуированных микроорганизмов С.perfringens типа А согласно изобретению. Необязательно, вакцинная композиция также может содержать один или несколько типов нетоксичного альфа-белка в сочетании с аттенуированными микроорганизмами С.perfringens типа А.

Например, по существу все аттенуированные микроорганизмы С.perfringens типа А, входящие в состав вакцинной композиции, являются живыми и жизнеспособными, хотя в некоторых особых ситуациях, например для иммунизации некоторых людей или иммунодефицитных животных, вакцина должна содержать исключительно убитые аттенуированные микроорганизмы С.perfringens типа А.

Вакцинная композиция содержит физиологически совместимые буферы и/или соли в необязательном сочетании с адъювантами и/или необязательными иммунными энхансерами или стимуляторами (вводимые совместно или вводимые последовательно, например, до или после вакцинации).

Подходящие иммуностимуляторы включают в себя без ограничения цитокины, факторы роста, хемокины, супернатанты клеточных культур лимфоцитов, моноцитов, клеток лимфоидных органов, препараты клеток или клеточные экстракты (например, Staphylococcus aureus или препараты липополисахаридов), митогены или адъюванты, в том числе низкомолекулярные фармацевтические агенты. Иммуностимулятор может быть введен in ovo в любой момент инкубации. В соответствии с конкретным аспектом иммуностимулятор вводят в среду, содержащую аттенуированные микроорганизмы С.perfringens типа А.

Способы введения вакцины

Описанные выше вакцины согласно изобретению вводят, например, путем инъекции или инокуляции одним или сочетанием следующих путей введения: пероральным, интраназальным, парентеральным, подкожным, скарификационным и/или внутримышечным путем в составе любого подходящего известного из предшествующего уровня техники состава, например совместимого буфера и/или физиологически приемлемого солевого раствора, необязательно в сочетании с адъювантами и/или иммунными энхансерами или стимуляторами (вводимыми совместно или вводимыми последовательно, например, до или после вакцинации). Для вводимых перорально вакцин/способов вакцинации может быть легко использован любой из физиологически приемлемый буфер или суспендирующий агент, которые известны из предшествующего уровня техники. Кроме того, композиция может быть включена в состав, например смешана с питьевой водой или распылена на кормовые гранулы, посыпана или распылена на кукурузу или другое зерно и т.п.

Желудочно-кишечный тракт является типичной локализацией инфекции С.perfringens, и, таким образом, пероральное введение рассматривается как один из способов инокуляции. Предполагается, что наличие в желудочно-кишечном тракте живых аттенуированных микроорганизмов С.perfringens согласно изобретению индуцирует местные защитные иммунные реакции в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, а также может оказывать конкурентное действие для профилактики последующей колонизации С.perfringens дикого типа.

Для птиц, таких как домашняя птица, включая кур, уток, гусей и т.д., пероральный способ или инъекции in ovo являются одними из подходящих путей вакцинации. Путь in ovo ниже проиллюстрирован примерами и обеспечивал активную иммунизацию и защиту от заражения у вылупившихся цыплят.

Экспрессия чужеродного гена микроорганизмами С.perfringens

В соответствии с методиками, разработанными в предыдущих примерах, любой неприродный, т.е. чужеродный для С.perfringens, ген может быть необязательно встроен в хромосомную ДНК С.perfringens. Для экспрессии чужеродных белков могут быть произведены слияния генов с сохранением последовательностей, фланкирующих ген альфа-токсина, промотора гена альфа-токсина и его сигнальной последовательности. В соответствии с одним вариантом выполнения большая часть кодирующей последовательности гена plc заменена чужеродным геном. Оставшиеся нуклеотиды гена plc правее встроенного гена находятся вне рамки считывания, и, таким образом, функциональный альфа-токсин не продуцируется. Альтернативно, чужеродный ген может быть встроен в одной рамке считывания с нуклеотидной последовательностью, кодирующей мутантный альфа-токсин, образуя слитый белок альфа-токсин-чужеродный белок.

Могут быть синтезированы олигонуклеотидные праймеры для чужеродного гена, например, с N-концевой последовательностью метки FLAG и соответствующими сайтами рестрикции. Продукты ПЦР могут быть клонированы в суицидный вектор; метка FLAG и чужеродный ген встраивают в одной рамке считывания с сигнальной последовательностью альфа-токсина. Чужеродный белок экспрессируется под контролем промотора гена альфа-токсина, а секреция задается сигнальной последовательностью plc. Секретированный чужеродный белок может быть обнаружен в супернатанте с помощью вестерн-блоттинга, используя анти-FLAG антитело.

Таким образом в геном С.perfringens может быть встроен любой подходящий чужеродный ген. Эти гены включают в себя, например, ДНК, кодирующую антигены возбудителей заболеваний желудочно-кишечного тракта, включая, например, антигенные белки бактерий, таких как E.coli, сальмонеллы, кампилобактеры, лавсонии и т.п.; антигенные белки паразитов, например эймерий, изоспор, криптоспоридий и т.п.; и антигенные белки вирусов, таких как ротавирусы, коронавирусы и т.п., для иммунизации животного, получающего такие рекомбинантные С.perfringens. Другие белки, которые могут экспрессироваться такими рекомбинантными С.perfringens, включают в себя терапевтические белки или пептиды. Необязательно, они включают в себя пептиды, которые являются эндогенными для желудочно-кишечного тракта, включая trefoil фактор, или любой тип цитокина, известного из предшествующего уровня техники, например куриный IL-18 и т.п.

Одна такая конструкция С.perfringens экспрессирует куриный IL-18. Введение живой бактерии, содержащей слияние генов, даст возможность осуществлять доставку терапевтических доз IL-18 в кишечник, при этом являясь относительно безвредным для животного-хозяина благодаря отсутствию продукции альфа-токсина. Другие терапевтические средства также могут быть экспрессированы с использованием этой системы.

В настоящем описании процитированы многочисленные ссылки, содержание каждой из которых включено сюда в полном объеме посредством ссылки. Следующие конкретные примеры приведены в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения объема изобретения, если иное не оговорено особо.

Пример 1. Гомологичный вектор для получения делетантов С.perfringens по альфа-токсину

Получали гомологичный плазмидный вектор 1162-55-20, применимый для конструирования альфа-токсина С.perfringens. Плазмида содержала несколько важных элементов: репликационную область плазмиды pUC18 E.coli, гены С.perfringens устойчивости к хлорамфениколу (catP) и эритромицину (ermBP) (каждый из которых также экспрессируется в E.coli); и ген альфа-токсина С.perfringens (plc), инактивированный специфичной делецией 9 аминокислот. Плазмиду 1162-55-20 получали следующим образом в несколько стадий.

Сначала ген plc клонировали из недавно выделенного из птицы изолята С.perfringens (штамма СР6). Для конструирования олигонуклеотидных праймеров, применяемых для клонирования гена plc, использовали последовательность штамма 13 С.perfringens (Genbank NC 003366; SEQ ID NO: 2). Эти и все последующие праймеры приобретали у Sigma Genosys, Woodlands, TX. Расположенный левее праймер, входящий в состав гена yplc (СРЕ0035), 5'-AGCTGCATAAGCAAAAGTTCCAACTC-3' (SEQ ID NO: 14), соответствует нуклеотидам 47675-47700 штамма 13 (SEQ ID NO: 2). Расположенный правее праймер, входящий в состав гена cobW (CPE0037), 5'-GCAGAAACTCTTCTTAGACCTATTCTTTTAGGC-3' (SEQ ID NO: 15), комплементарен нуклеотидам 50597-50629 штамма 13. Эти праймеры использовали в полимеразной цепной реакции (ПЦР) длинных фрагментов совместно с геномной ДНК штамма СР6 С.perfringens. Продукт 2955 пар нуклеотидов от расположенного левее гена yplc до расположенного правее гена cob W предсказывали на основании известной последовательности штамма 13 (как показано на фиг.1). Промотор, сигнальная последовательность и кодирующая последовательность гена plc альфа-токсина (СРЕ0036) входят в состав этого токсина, т.е. расположены между расположенным левее геном yplc и расположенным правее геном cob W. Полученный с помощью ПЦР фрагмент размером 2955 пар нуклеотидов затем клонировали в вектор клонирования pCR-Blunt (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) с получением плазмиды 1162-52.1. Нуклеотидную последовательность кодирующей области plc фрагмента размером 2955 пар нуклеотидов штамма СР6 определяли путем исследования этого фрагмента (SEQ ID NO: 22; а соответствующим полипептидом является SEQ ID NO: 23), и было показано, что она по существу гомологична таковой гена plc штамма 13 С.perfringens (SEQ ID NO: 2).

Затем репликационную область E.coli и гены устойчивости к антибиотикам С.perfringens клонировали из челночной плазмиды pJIR418 (Sloan et al., 1992, Plasmid 27, 207-219; Genebank M77169). Плазмиду pJIR418 расщепляли рестриктазами Bam HI и Spe I, а концы достраивали с помощью полимеразы Кленова. Лигирование большого фрагмента позволяло получить плазмиду 1162-45.1 и восстанавливало сайт рестрикции Bam HI. Эта плазмида сохраняла репликационную область E.coli, но в отличие от pJIR418 она не содержала точку начала репликации С.perfringens. Таким образом, плазмида способна к автономной репликации в E.coli, но не в С.perfringens.

На следующей стадии С-концевую часть гена plc субклонировали в промежуточную плазмиду 1162-45.1. Расщепление плазмиды 1162-52.1 Bam HI и Eco RI высвобождало фрагмент размером 1742 пар нуклеотидов, содержащий С-концевую часть гена альфа-токсина от уникального сайта Bam HI, входящего в состав расположенного правее гена plc, включая ген cob W, до сайта Eco RI, расположенного в сайте множественного клонирования исходной плазмиды. Фрагмент размером 1742 пар нуклеотидов клонировали между сайтами Bam HI и Eco RI, расположенными в сайте множественного клонирования плазмиды 1162-45.1. В полученной плазмиде 1162-53.7 С-концевая часть гена plc находится в такой же транскрипционной ориентации, что и гены catP и ermBP исходной плазмиды.

На последней стадии N-концевую часть гена plc клонировали в уникальный сайт Bam HI плазмиды 1162-53.7. Это выполняли путем получения ПЦР-фрагмента, происходящего из гена альфа-токсина, субклонированного в плазмиду 1162-52.1. Расположенный левее праймер 5'-ggatccAGCTGCATAAGCAAAAGTTCCAACTC-3' (SEQ ID NO: 16) был идентичен ранее упомянутому праймеру yplc (SEQ ID NO: 4) за исключением включенного фланкирующего сайта Bam HI (указан строчными буквами). Расположенный правее праймер, входящий в состав гена альфа-токсина, 5'-ggatccaATGCATTCTTATCATAATCTGGATAAGTAGAACC-3' (SEQ ID NO: 17), был комплементарен нуклеотидам 48824-48857 штамма 13 и содержал фланкирующий сайт рестрикции Bam HI и спейсерный нуклеотид для сохранения рамки считывания (указаны строчными буквами). Полученный в результате проведения ПЦР с использованием этих праймеров и матричной ДНК плазмиды 1162-52-1 Bam HI-фрагмент клонировали в уникальный сайт Bam HI плазмиды 1162-53.7. Выделяли плазмиду, содержащую две области гена plc в той же транскрипционной ориентации. Эта плазмида 1162-55.20 содержала ген plc с желаемой делецией девяти аминокислот и добавлением остатка leu между ala 61 и asp 71 токсина дикого типа (см. фиг.2). Секвенирование ДНК плазмиды подтвердило функциональность рамки считывания и делецию в общей сложности 24 кодонов (кодирующих восемь аминокислотных остатков).

Пример 2. Конструирование рекомбинанта Clostridium perfringens CPERF001

Делетированный вариант гена plc, сконструированный в примере 1, вводили в состав С.perfringens в соответствии со следующей стратегией. Гомологичный вектор 1162-55.20 называют "суицидной плазмидой" С.perfringens, поскольку его точка начала репликации С.perfringens удалена.

Когда этой плазмидой трансформировали С.perfringens, она оказывалась неспособна реплицироваться и не сохранялась. Однако, если трансформированные бактерии помещали под селективное давление хлорамфеникола и/или эритромицина, может быть вызвана рекомбинация плазмидной ДНК в бактериальный геном за счет гомологии с геном plc. Полученные рекомбинантные бактерии называются интегрантами. Интегрант содержал копию введенного гомологичного вектора, интегрированного в локус гена plc. Таким образом, полученный интегрант содержал две копии гена plc, исходную нормальную копию и введенный делетированный вариант. Введенные гены устойчивости располагались между двумя копиями гена plc. Когда с интегранта снимали селективное давление антибиотиков, происходила рекомбинация между двумя копиями гена plc. Это событие рекомбинации может приводить к одному из двух результатов. В обоих случаях ДНК, расположенная между двумя копиями гена plc (включая гены устойчивости), была удалена. В соответствии с первым результатом восстанавливался нормальный ген plc, что приводило к восстановлению исходного родительского штамма. В соответствии со вторым результатом нормальный ген plc заменялся делетированной копией, что позволяло получить желаемую конструкцию, несущую делецию по альфа-токсину. Поскольку альфа-токсин несущего делецию штамма инактивирован, этот штамм был негемолитическим. Таким образом, желаемый несущий делецию интегрант идентифицировали методом скрининга негемолитических клонов на чашках с кровяным агаром.

Поскольку ожидается низкая частота события рекомбинации, приводящего к возникновению желаемого интегранта, было принципиально важным использовать исходные штаммы С.perfringens, характеризующиеся высокой эффективностью трансформации. Таким образом, несколько недавно выделенных из птицы изолятов С.perfringens анализировали на предмет эффективности трансформации. Изоляты трансформировали челночной плазмидой pJIR418, как описано Allen и Blaschek (Applied and Environmental Microbiology 54:2322 (1988)) с небольшими модификациями (описанными ниже). Штамм 1240 характеризовался наивысшей эффективностью трансформации (см. таблицу 1), 9,2×10 ⁶ трансформантов/мкг плазмидной ДНК pJIR418. Этот штамм избирали в качестве исходного штамма для конструирования делетанта CPERF001. Штамм 29 избирали в качестве исходного штамма для конструирования CPERF002.

Таблица 1
Эффективность трансформации изолятов С.perfringens, полученных из птицы
Штамм С.perf. A	Трансформантов/мкг pJIR418
29	3,6×10 4
23	5,6×10 2
1220	4,0×10 6
1240	9,2×10 6
СР-2	Нет
1230	7,1×103
5227	Нет
5230	Нет
Указанные выше штаммы дикого типа были получены от д-ра Glenn Songer, Dept. of Veterinary Sciences and Microbiology, University of Arizona, Tucson, Arizona 85721.

Клетки штамма 1240 С.perfringens из ночной анаэробной культуры в среде TSYC (30 г/л трипсинизированного соевого бульона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 0,5 г/л цистеина) разбавляли 1:25 и выращивали до А₆₀₀=0,5436. После центрифугирования 100 мл клеток при 18000×g в течение 10 минут электрокомпетентные клетки получали путем двукратного ресуспендирования клеток в равном объеме предварительно восстановленного буфера сахароза-фосфат магния ("SMP" содержал 270 мМ сахарозы, 1 мМ MgCl₂, 7 мМ NaPO₄, рН 7,3) с последующим окончательным ресуспендированием 0,5 мл SMP. Это приводило к получению конечного объема ~2,0 мл.

Аликвоты клеток объемом 100 мкл подвергали электропорации 4 мкг плазмиды 1162-55.20 в 0,2 см кюветах. Использовали Bio-Rad Gene Pulser II при 1,37 киловольт, сопротивлении 100 Ом и емкости 50 микрофарад. Сразу после электропорации клетки разбавляли 2,0 мл предварительно восстановленной среды, содержащей трипсинизированный соевый бульон, дрожжевой экстракт и цистеин ("TSYC" содержала 30 г трипсинизированного соевого бульона, 5 г дрожжевого экстракта, 0,5 г цистеина, 950 мл воды), и инкубировали в течение трех часов при 37°C в анаэростате. По прошествии периода восстановления разведения клеток высевали на чашки с TSYC + 25 мкг/мл хлорамфеникола. Эти чашки инкубировали в анаэростате при 37°C в течение ночи.

По окончании роста в течение ночи наблюдали в среднем 50 устойчивых к хлорамфениколу колоний на микрограмм ДНК 1162-55.20. Отдельные колонии семи предполагаемых интегрантов выращивали на неселективной среде TSYC в течение четырех последовательных циклов роста и высевали на чашки с неселективным кровяным агаром. В одной из не подвергшихся отрицательной селекции маточных культур, 1192-31.7, наблюдалось несколько негемолитических колоний. Двадцать одну из этих негемолитических колоний переносили на неселективные основные чашки, а реплики высевали на чашки с TSYC + хлорамфеникол. Две из 21 колонии проявляли чувствительность к хлорамфениколу.

Один из чувствительных к хлорамфениколу предполагаемых делетантов, 1192-32.14, выращивали совместно со штаммом 1240 дикого типа и интегрантом 1192-31.7 и высевали на чашки с кровяным агаром. У штамма 1240 дикого типа наблюдались прозрачные зоны бета-гемолиза, тогда как делетант 1192-32.14 представлял собой чистую культуру негемолитических колоний и был переименован в CPERF001.

Остальные чашки с кровяным агаром использовали как основные, а реплики высевали на неселективную и селективную среды. Штамм 1240 дикого типа и CPERF001 проявляли чувствительность к хлорамфениколу и эритромицину. Интегрант 1192-31.7, как и ожидалось, был невосприимчив и к хлорамфениколу, и к эритромицину.

Для исключения возможности того, что гены устойчивости к антибиотикам присутствовали, но не экспрессировались в CPERF001, для использования в ПЦР-реакциях синтезировали ПЦР-праймеры, специфичные в отношении генов устойчивости к хлорамфениколу и эритромицину. Геномные ДНК получали штаммов дикого типа, интегранта и CPERF001 использовали в качестве матриц для ПЦР-реакций с праймерами генов устойчивости к антибиотикам. Результаты ПЦР-анализа свидетельствовали о положительной реакции только со стороны суицидной плазмиды и интегранта, но не исходного штамма 1240 или делетанта CPERF001. Это подтвердило предсказанную утрату последовательностей генов устойчивости.

Для подтверждения делеции в гене альфа-токсина область размером 1086 п.н., окружающую делецию, амплифицировали методом ПЦР с использованием подходящих специфичных в отношении гена альфа-токсина праймеров. Амплифицированный фрагмент клонировали и секвенировали. Результаты секвенирования подтверждали делецию девяти аминокислот от tyr62 до trp70 альфа-токсина и инсерцию одного leu (см. фиг.2А-2С).

CPERF001 анализировали на предмет экспрессии инактивированного белка альфа-анатоксина. По прошествии 6 часов анаэробного роста аликвоты клеток объемом 1 мл собирали и центрифугировали. Пятнадцать микролитров неконцентрированного супернатанта среды анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле и подвергали вестерн-блоттингу с использованием поликлональных антител кролика против рекомбинантного белка альфа-токсина (Vaccine 11(12): 1253-1258 (1993)). Результаты свидетельствовали о реактивности специфичных антител в отношении белка, характеризующегося ожидаемым для белка альфа-анатоксина размером.

CPERF001 представляет собой генно-инженерный несущий делецию штамм С.perfringens типа А. Этот штамм секретирует инактивированную анатоксинную форму альфа-токсина С.perfringens. Поскольку этот штамм больше не экспрессирует активный альфа-токсин, сохраняя при этом значительную часть антигенности токсина, он может быть применим в качестве вакцины для защиты от заболевания, вызываемого С.perfringens.

Пример 3. Конструирование рекомбинантного штамма Clostridium perfringens CPERF002

Чтобы компенсировать более низкую эффективность трансформации штамма 29 С.perfringens (см. таблицу 1 выше), был сконструирован новый гомологичный вектор. Новый вектор содержал последовательности С.perfringens, клонированные непосредственно из генома штамма 29. Было предсказано, что это приведет к более эффективной стадии рекомбинации. Новым вектором являлся 1192-38.3, полученный следующим образом.

На первой стадии репликационную область E.coli и гены устойчивости к антибиотикам С.perfringens клонировали из челночной плазмиды pJIR418 (Sloan et al., 1992, Plasmid 27, 207-219; Genebank M77169). Плазмиду pJIR418 расщепляли рестриктазой NdeI. Лигирование большого фрагмента позволяло получить плазмиду 1192-23.1. Эта плазмида не содержала точку начала репликации С.perfringens, но в отличие от плазмиды 1162-45.1, сконструированной, как описано в примере 1, сохраняла полноразмерный сайт множественного клонирования pJIR418.

На следующей стадии С-концевую часть гена plc субклонировали в промежуточную плазмиду 1192-23.1. В качестве матрицы для ПЦР длинных фрагментов использовали геномную ДНК штамма 29. Амплифицировали область гена plc (альфа-токсина) от сайта Bam HI до части гена СРЕ0038. Расположенный левее праймер plc, 5'-CTGGGATCCTGATACAGATAATAATTTCTCAAAGGAT-3' (SEQ ID NO: 18), соответствовал нуклеотидам 48880-48916 штамма 13 (Genbank NC 003366). Расположенный правее в гене СРЕ0038 праймер, 5'-actctgcagTTGTCATATCAATTAAATTAACTATAATCCC-3' (SEQ ID NO: 19), был комплементарен нуклеотидам 51244-51275 штамма 13 и содержал фланкирующие нуклеотиды, включая сайт рестрикции Pst I (указан строчными буквами). Продукт размером 2402 пар нуклеотидов получали и расщепляли рестриктазами Bam HI и Pst I. Этот фрагмент лигировали с большим фрагментом расщепленной Bam HI и Pst I 1192-23.1 с получением плазмиды 1192-36.10.

На последней стадии N-концевую часть гена plc клонировали методом ПЦР. Расположенный левее праймер, 5'-actgagctcCTAGACACTTTGCTTCAATATTTGGGAA-3' (SEQ ID NO: 20), соответствовал нуклеотидам 46513-46540 штамма 13 и содержал фланкирующие нуклеотиды и сайт Sac I (указан строчными буквами). Расположенный правее праймер, 5'-actggatccGCATTCTTATCATAATCTGGATAAGTAGAACC-3' (SEQ ID NO: 21), был комплементарен нуклеотидам 48824-48855 штамма 13 и содержал фланкирующие нуклеотиды и сайт Bam HI. Продукт размером 2363 пар нуклеотидов получали и расщепляли рестриктазами Sac I и Bam HI. Расщепленный фрагмент лигировали с большим фрагментом расщепленной Sac I и Bam HI 1192-36.10 с получением плазмиды 1192-38.3. Результаты последующего секвенирования области, фланкирующей сайт Bam HI гена plc в 1192-38.3, подтверждали делецию девяти аминокислот от tyr62 до trp70.

Плазмиду 1192-38.3 использовали для электропорации клеток штамма 29 С.perfringens. Ранее было показано, что штамм 29 трансформируется с эффективностью 3,6×10⁴ трансформантов/мкг плазмидной ДНК pJIR418.

Клетки штамма 29 выращивали и подвергали электропорации, как описано в примере 2, за исключением того, что по прошествии трехчасового периода восстановления была использована методика селекции в жидкости. Вместо посева на чашки аликвоты клеток объемом 0,67 мл разбавляли 12 мл TSYC + 25 мкг/мл хлорамфеникола и выращивали в течение ночи при 37°C в анаэростате. Эту модификацию задействовали по причине более низкой эффективности трансформации и посева штамма 29 по сравнению со штаммом 1240. По окончании роста в течение ночи клетки вновь разбавляли селективной средой. Клетки, прошедшие второй цикл роста, затем пять раз культивировали без селективного давления, а затем высевали на чашки с кровяным агаром. Ни одна из колоний на чашках с кровяным агаром не была негемолитической. Затем реплики двух чашек с кровяным агаром были посеяны на чашки с TSYC, TSYC + 25 мкг/мл хлорамфеникола и TSYC + 50 мкг эритромицина. Все колонии проявляли чувствительность к эритромицину, но лишь одна из 130 колоний была чувствительна к хлорамфениколу. Эту колонию, 1192-45.4В, переименовали в CPERF002. В результате ПЦР-анализа геномной ДНК CPERF002 с использованием специфичных в отношении гена альфа-токсина праймеров получали положительную полосу, соответствующую альфа-токсину. Эта полоса была меньше, чем соответствующая полоса при использовании ДНК штамма 29 дикого типа. Праймеры, специфичные к генам устойчивости к хлорамфениколу и эритромицину, не амплифицировали ДНК CPERF002, но приводили к образованию строго положительных полос при использовании плазмиды 1192-38.3. Результаты секвенирования альфа-токсина CPERF002 подтверждали делецию девяти аминокислот (см. фиг.3).

CPERF002 анализировали на предмет экспрессии инактивированного белка альфа-анатоксина. По прошествии 6 часов анаэробного роста аликвоты клеток объемом 1 мл собирали и центрифугировали. Пятнадцать микролитров неконцентрированного супернатанта среды анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле и подвергали вестерн-блоттингу с использованием поликлональных антител кролика против рекомбинантного белка альфа-токсина (Vaccine 11: 1253 (1993)). Результаты свидетельствовали о реактивности специфичных антител в отношении белка, характеризующегося ожидаемым для белка альфа-анатоксина размером.

CPERF002 представляет собой генно-инженерный несущий делецию штамм С.perfringens типа А. Этот штамм секретирует инактивированную анатоксинную форму альфа-токсина С.perfringens. Поскольку этот штамм больше не экспрессирует активный альфа-токсин, сохраняя при этом значительную часть антигенности токсина, он может быть применим в качестве вакцины для защиты от заболевания, вызываемого С.perfringens.

Пример 4. Вакцины на основе несущей делению С.perfringens

Вакцинные штаммы делетантов CPERF001 и CPERF002, описанные в примерах 2 и 3, оценивали на предмет их способности обеспечивать защиту от заражения С.perfringens дикого типа. Первая часть исследования была смоделирована с тем, чтобы определить, оказывает ли введение живых вакцинных штаммов какой-либо нежелательный эффект на вылупляемость из оплодотворенных яиц. Распределение по экспериментальным группам и результаты исследования безопасности описаны в таблице 2.

Таблица 2
Результаты исследования безопасности
Группа*	Вакцина (доза)**	Число вылупившихся птенцов (%)
1	CPERF001 (0,8×10 2)×	18 (90%)
2	CPERF001 (0,8×10 3)	17 (85%)
3	CPERF001 (0,8×104)	11 (55%)
4	CPERF001 (0,8×10 5)	16 (80%)
5	CPERF002 (1,9×102)	16 (80%)
6	CPERF002 (1,9×10 3)	17 (85%)
7	CPERF002 (1,9×104)	14 (70%)
8	CPERF002 (1,9×10 5)	12 (60%)
9	Штамм 1240 (1,5×103)	16 (80%)
10	Штамм 29 (3,7×10 3)	13 (65%)
11	Инокулированные средой контроли	19 (95%)
12	Неинокулированные контроли	18 (90%)
* 20 яиц в группе
** Дозу объемом 100 мкл вводили in ovo на 18 сутки развития зародыша (IM)
× Титр на дозу измеряли в колониеобразующих единицах (КОЕ)

При дозе 10³ или менее (группы 1, 2, 5 и 6) вылупляемость в этих группах не была значимо ниже, чем в группе, инокулированной только средой (группа 11), или в неинокулированной группе (группа 12). При использовании самой низкой дозы CPERF001 наблюдалась такая же вылупляемость, как и в контроле, инокулированном средой, и лучше, чем в неинокулированной контрольной группе.

Поскольку более высокие дозы делетантов могли оказывать нежелательный эффект на вылупляемость птенцов из яиц, в часть исследования, посвященную определению эффективности, включали только две группы с наименьшей дозой для каждого делетанта. Эти группы вместе с птицами, инокулированными средой (группа 11), заражали штаммом СР6 С.perfringens (дикого типа), который вводили перорально в концентрации около 10⁸ КОЕ/мл на птицу в возрасте 20, 21 и 22 суток. Всех птиц вскрывали в возрасте 25 суток и поражения тонкого кишечника оценивали по оценочной шкале некротического энтерита, приведенной ниже.

Оценку проводили с небольшими изменениями по Charles Hofacre, D.V.M., М.А.М., Ph.D., University of Georgia, Poultry Diagnostic and Research Center, 953 College Station Road, Athens, GA 30602,

В конце исследования вскрывали пять (5) птиц из невакцинированной контрольной группы (не зараженной) для подтверждения того, что в ходе исследования контакт с C.perfringens отсутствовал. Результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3
	Группы лечения относительно защиты*	Результаты
Группа*	Вакцина	Доза вакцины in ovo (КОЕ)	Возраст в сутках при заражении С.perfringens	N	Среднее
1	CPERF001	1×10 2	20, 21 и 22	9	0,67
2	CPERF001	1×103	20, 21 и 22	13	0,46
5	CPERF002	1×102	20, 21 и 22	12	1,33
6	CPERF002	1×103	20, 21 и 22	12	1,08
11	Инокулированный средой контроль	Нет	20, 21 и 22	15	1,80
12	Нет	Нет	Не заражена	5	0,00
* вскрытие в возрасте 25 суток

Оценки групп 1 и 2 были статистически значимо ниже оценки группы 11 (точный критерий суммы рангов Уилкоксона p 0,0250). Средние значения в группах 5 и 6 были ниже, чем в группе 11, но статистически не различимы (точный критерий суммы рангов Уилкоксона p 0,2177). Оценку эффективности вакцины проводили в соответствии с методикой, описанной David Siev [Journal of Modern Applied Statistical Methods Vol.4, № 2, 500-508 (2005)]. Эффективность вакцины в уменьшении тяжести заболевания оценивали по сравнению с группой 11 на уровне 54% для группы 1, 65% для группы 2, 20% для группы 5 и 27% для группы 6.

Пример 5. Конструирование делетанта С.perfringens, выделенной из свиней

Стратегии, использованные, как описано в примерах 1 и 2 выше, использовали для конструирования делеционных мутантов альфа-токсина из выделенных из свиней штаммов С.perfringens. Первоначально полевые изоляты, выделенные из больных свиней, подвергали электропорации плазмидой pJIR418 для оценки их трансформируемости. Кандидатами для получения делеций признавали изоляты, позволявшие получать 10⁴ трансформантов на микрограмм плазмидной ДНК и чувствительные либо к хлорамфениколу, либо к эритромицину.

Геномную ДНК из штаммов-кандидатов использовали в качестве матрицы для ПЦР длинных фрагментов гена plc (альфа-токсина) и фланкирующих последовательностей. После субклонирования ПЦР-продуктов ген альфа-токсина и фланкирующие области секвенировали и проводили рестрикционное картирование. Синтезировали новые олигонуклеотидные праймеры с фланкирующими сайтами рестрикции и продукты двух различных амплификаций клонировали в суицидную плазмиду 1192-23.1 с получением делеции 27 пар нуклеотидов, как описано в примере 1.

Суицидный вектор из выделенного из свиньи штамма методом электропорации вводили в соответствующий выделенный из свиньи штамм С.perfringens и делеционные мутанты выделяли в соответствии с методами, описанными выше в примере 2. Получение делеционных мутантов подтверждали отсутствием бета-гемолиза на чашках с кровяным агаром и секвенированием ДНК гена альфа-токсина.

Эта конструкция представляет собой генно-инженерный несущий делецию штамм С.perfringens типа А. Этот штамм секретирует инактивированную анатоксинную форму альфа-токсина С.perfringens. Поскольку этот штамм больше не экспрессирует активный альфа-токсин, сохраняя при этом значительную часть антигенности токсина, он может быть применим в качестве вакцины для защиты свиней от заболевания, вызываемого С.perfringens.

Депонирование биологического материала

Культуры следующих биологических материалов были депонированы следующим международным депозитарием:

American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, U.S.A., в соответствии с условиями, удовлетворяющими требованиям Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.

Организм	Депозитарный №	Дата депонирования
Clostridium perfringens CPERF/ Toxin 365-054	PTA7364	7 февраля 2006 года
Clostridium perfringens CPERF/ Toxin 365-053	PTA7365	7 февраля 2006 года