антимикробные агенты
Классы МПК: | A61K33/34 медь; ее соединения C08K3/22 металлов A61P31/04 антибактериальные средства B82B3/00 Изготовление или обработка наноструктур |
Автор(ы): | Глущенко Наталья Николаевна (RU), Богословская Ольга Александровна (RU), Рахметова Алла Александровна (RU), Алексеева Татьяна Павловна (RU), Овсянникова Маргарита Николаевна (RU), Ольховская Ирина Павловна (RU), Лейпунский Илья Овсеевич (RU), Жигач Алексей Николаевич (RU), Дымникова Наталья Сергеевна (RU), Галашина Валентина Николаевна (RU) |
Патентообладатель(и): | Учреждение Российской академии наук Институт энергетических проблем химической физики РАН Российская Федерация (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2010-07-06 публикация патента:
10.04.2012 |
Изобретение относится к антимикробным агентам, обладающим антибактериальной активностью в отношении тест-культур грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, которые представляют собой наночастицы меди и наночастицы оксида меди. Антимикробные агенты по изобретению характеризуются конкретными размерами частиц и фазовыми составами. Наночастицы меди имеют размер 33,8-103 нм и содержат 67-96% меди и 4-33% CuO. Наночастицы оксида меди имеют размеры 77-124 нм и содержат 3,3-23% кристаллической меди, 27,1-90% CuO и 9,05-69,5% Cu2O. Изобретение обеспечивает получение антимикробных агентов, которые при введении в состав нетканого льняного полотна обеспечивают его антибактериальные и сохраняют его эстетические и эксплуатационные свойства. 2 н.п. ф-лы, 8 ил., 12 табл., 6 пр.
![антимикробные агенты, патент № 2446810](/images/patents/12/2446810/2446810-20.jpg)
![антимикробные агенты, патент № 2446810](/images/patents/12/2446810/2446810-21.jpg)
![антимикробные агенты, патент № 2446810](/images/patents/12/2446810/2446810-22.jpg)
![антимикробные агенты, патент № 2446810](/images/patents/12/2446810/2446810-23.jpg)
![антимикробные агенты, патент № 2446810](/images/patents/12/2446810/2446810-24.jpg)
![антимикробные агенты, патент № 2446810](/images/patents/12/2446810/2446810-25.jpg)
![антимикробные агенты, патент № 2446810](/images/patents/12/2446810/2446810-26.jpg)
![антимикробные агенты, патент № 2446810](/images/patents/12/2446810/2446810-27.jpg)
![антимикробные агенты, патент № 2446810](/images/patents/12/2446810/2446810-28.jpg)
Формула изобретения
1. Антимикробный агент, обладающий высоким антибактериальным действием в отношении тест-культур грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, отличающийся тем, что в качестве активного вещества используются наночастицы меди, имеющие следующие характеристики: размер частиц 33.8÷103 нм; толщина оксидной пленки 6÷10 нм; фазовый состав: кристаллическая медь 67÷96%, меди оксид CuO 4÷33%.
2. Антимикробный агент, обладающий высоким антибактериальным действием в отношении тест-культур грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, отличающийся тем, что в качестве активного вещества используются наночастицы меди, имеющие следующие физико-химические характеристики: размер частиц 77÷124 нм; фазовый состав: кристаллическая медь 3,3÷23%, CuO 27,1÷90% и Cu2О 9,05÷69,5% или размер частиц 119,0±1,0 нм, фазовый состав: кристаллическая медь 0,50±0,02%, Cu 2O 9,05%, CuO остальное.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к медицине, в частности к агентам, обладающим антимикробным действием.
Одной из актуальных проблем современной медицины является поиск агентов, компонентов или факторов, обеспечивающих антимикробное действие. Это связано с широким распространением микроорганизмов и ростом их в различных средах, в том числе в питьевой воде, почве, продуктах питания, косметике, средствах личной гигиены, пластмассовых, медицинских изделиях (резиновых и синтетических шлангах, хирургических инструментах, пластырях, шовных материалах, повязках, хирургических масках, респираторах, одежде медицинского персонала и т.д.), причиняя не только материальный вред, но, главное, угрожая здоровью человека. Требования к окружающей среде и материалам медицинского назначения становятся все выше. Поэтому поиск новых антимикробных агентов, безопасных для человека, не прекращается, учитывая постоянный рост резистентности бактерий к действию сульфаниламидных препаратов, антибиотиков, антисептиков. В настоящее время в качестве антимикробных агентов могут выступать различные вещества органической и неорганической природы. Однако использование антимикробных агентов той или иной природы в медицине и фармации ограничено их безопасностью. В этом отношении более предпочтительны неорганические соединения, например металлы и их композиции. Разработаны антимикробные агенты на основе, например, соединений кобальта [15], серебра [29, 31, 32], сложных металлических оксидов (цинка оксида в СаО), смесей соединений металлов. Возрастает интерес исследователей к наночастицам индивидуальных металлов, композиций металлов с общей формулой MnXy, где Mn может быть Al, Si, Zn, Ni, Ti; Xy - кислород, углерод, сера; наночастицам смешанного состава типа C-H-Ag-Zn, C-Si-Ag-Zn, C-W-Ti-B, монодисперсным коллоидным наночастицам металлов [16] и т.д.
Существует ряд работ, посвященных использованию наночастиц металлов, обладающих антимикробными и антивирусными свойствами, для совершенствования средств защиты от микробной и вирусной инфекций [17, 30]. Поэтому дальнейший поиск антимикробных агентов, безопасных для здоровья человека, является актуальным.
Наше внимание привлекла медь - эссенциальный элемент, который в организме животных и человека имеет строго скоординированную систему регуляции, позволяющую в случае увеличенной нагрузки металла поддерживать его содержание в биосистемах на уровне, обеспечивающем оптимальную жизнедеятельность. С другой стороны, медь обладает выраженным антибактериальным действием [4, 14, 19, 24, 26]: на металлических медных пластинах гибнут дифтерийная и тифозная палочки [3], высокодисперсные порошки меди вызывают гибель клеток E.coli [8, 25]. В медицинской практике в качестве антисептического, вяжущего, прижигающего средства при конъюнктивитах, ангинах, кожных инфекционных заболеваниях, ожогах, ранах, пролежнях используют меди цитрат, при трахоме, конъюнктивите - меди нитрат, при конъюнктивите, ларингите, уретрите, кожных инфекционных заболеваниях - меди сульфат; в качестве бактерицидного, прижигающего средства используют гидроокись меди-кальция и т.д. [1, 3, 5].
В настоящее время рассматривается несколько механизмов, посредством которых медь оказывает антимикробное действие:
1. Медь ингибирует и нарушает синтез белка и нуклеиновых кислот. Медь обладает способностью взаимодействовать с аминокислотами и SH-группами ферментов, активно участвующих в синтезе белка, что может нарушать этот процесс. Известно, что медь селективно связывается с N(1) и N(7) аденина, N(7) гуанина, N(3)-цитозина. В результате связывания с отрицательными фосфатными группами нуклеиновых кислот электростатическими силами и частично координационно через амино- и оксигруппы с азотистыми основаниями образуется прочный хелатный комплекс [2, 22].
2. Медь снижает уровень восстановленных тиолов и глутатиона в клетках. Глутатион относится к числу метаболитов, активно увеличивающихся при осмотическом стрессе. Одна из функций глутатиона связана с удержанием ионов калия в цитоплазме через регуляцию калий-выходных каналов [11, 23].
3. Медь влияет на энергетические процессы, протекающие на мембране, и нарушает ее барьерные функции [9, 12, 13, 25, 27, 33].
4. Медь изменяет структурно-функциональные свойства мембран прокариотических клеток [8, 10, 13].
Развитие современных нанотехнологий позволяет получать наноструктурные металлы, в том числе и медь с заданными биологическими свойствами, посредством регулирования физико-химических характеристик наноразмерных материалов. Основными особенностями действия наночастиц при введении их в организм эукариотов является их низкая токсичность, пролонгированное действие, способность в биотических дозах оказывать стимулирующее действие на обменные процессы, активность ферментов, рост и развитие организма в целом [7, 20]. В то же время показано, что наночастицы меди обладают более высокой антимикробной активностью по сравнению с наночастицами серебра [8-13, 25].
Среди аналогов представленного изобретения можно назвать металлический медный порошок (в составе гомеопатических лекарственных средств) в качестве антимикробного, иммунозащитного действия при воспалительных заболеваниях, в комплексном лечении коклюша, бронхиальной астмы и азиатской холеры (Россия) [3].
Наиболее близкой к предлагаемому нами изобретению является композиция, описанная в патенте US 534 4636 Anti-microorganism agent and anti-microorganism resin or rubber composition [18], где в качестве антимикробного агента используется сложная металлическая гидроокись [(M1 2+)1-x(M2
2+)x(ОН)2] в виде частиц размером 0.1 до 2.0 мкм, в которой M1
2+ - один из элементов Mg2+ и/или Са2+, М2
2+ - один из элементов Cu2+ и/или Zn2+. Такая композиция может быть введена в состав резины, каучука, смолы и т.д., является слаботоксичной и обладает антибактериальным действием по отношению к тест-культурам E.coli и St.yellow.
Целью данного изобретения является установление антимикробного действия наночастиц меди и наночастиц меди оксида, имеющих разные физико-химические характеристики, на рост тест-культур грамположительных и грамотрицательных бактериальных клеток.
Цель достигается тем, что в качестве агентов, оказывающих антимикробное действие, используются наночастицы меди и наночастицы меди оксида, имеющие следующие физико-химические характеристики:
- НЧ меди: размер частиц 33.8÷103 нм; толщина оксидной пленки 6÷10 нм; фазовый состав: кристаллическая медь 67÷96%, меди оксида CuO - 4÷33%.
- НЧ меди оксида: размер частиц 77÷124 нм; фазовый состав: кристаллическая медь 0.5÷3.3÷23%, CuO - 27.1÷90%. и Cu2O - 9.05÷69.5.
Наночастицы меди оксида с характеристиками: размер частиц 119,0±1,0; фазовый состав: кристаллическая медь 0.50±0.02, CuO
90% и Cu2O
9.05, взятые в качестве антимикробного агента и введенные в состав нетканого льняного полотна, обеспечивают антибактериальные свойства льноволокна и сохраняют его эстетические и эксплуатационные свойства.
Пример 1. Физико-химические характеристики наночастиц меди и наночастиц меди оксида.
Для установления антимикробной активности наночастиц меди и наночастиц меди оксида в условиях контролируемого синтеза наночастиц методом высокотемпературной конденсации [6] при воздействии факторов: воздуха, паров воды и кислорода - были получены наночастицы меди и наночастицы меди оксида. Всего восемь образцов, которые были аттестованы по показателям: размер частиц, фазовый состав, толщина оксидной пленки (Таблица 1).
Просвечивающая электронная микроскопия наночастиц меди показала, что наночастицы меди изученных образцов представляют собой монокристаллические структуры, покрытые полупрозрачной пленкой меди оксида, как представлено на (Фиг. 1).
Однако наночастицы меди отличаются по форме. Наночастицы меди, модифицированные кислородом (образцы № 2, № 4) и воздухом (образцы № 5, № 6), имеют сферическую форму, у наночастиц меди, модифицированных парами воды (образец № 1), на поверхности видны четкие грани (Фиг. 2). Средний размер наночастиц меди колеблется от 33.8 нм (образец № 6) до 103 нм (образец № 2). Наночастицы меди различаются по фазовому составу. Так, содержание кристаллической меди в ядре наночастиц колеблется от 67% (образец № 6) до 96% (образец № 2), меди оксида CuO - от 4% (образец № 2) до 33% (образец № 6). Размер наночастиц меди оксида колеблется от 77 нм (образец № 3) до 124 нм (образец № 8). При этом содержание в них кристаллической меди мало и составляет от 0.50% (образец № 7) до 23% (образец № 8), содержание оксидов: Cu(II) меняется от 27.1 (образец № 3) до 90% (образец № 7), Cu(I) - от 9.05 (образец № 7) до 69.5% (образец № 3). Толщина оксидной пленки на поверхности модифицированных наночастиц меди меняется в пределах 6-10 нм в зависимости от типа образца (Таблица 1).
Следовательно, синтезированные образцы наночастиц меди и наночастиц меди оксида различаются по размеру, форме и структуре.
Пример 2. Оценка антимикробной активности наночастиц меди и наночастиц меди оксида диффузно-дисковым методом.
В стерильные чашки Петри одинакового диаметра с ровным плоским дном разливается среда, пригодная для выращивания тест-микробов: Staphylococcus albus и Escherichia coli AB1157. Состав среды роста микроорганизмов (в г): на 1 л дистиллированной воды: пептон - 10, дрожжевой экстракт - 5, натрия хлорида - 5, агар-агар - 20. После застывания агар-агара в чашки Петри высевают тест-культуру микроорганизмов. Посев проводят равномерно и одинаково во все чашки из предварительно подготовленной суспензии. Плотность засева должна быть достаточной для роста сплошного газона. Чашки растирают стерильным шпателем. Исследуемые наночастицы меди и наночастицы меди оксида с разными физико-химическими характеристиками помещали в количестве 5 мг на бумажные глицериновые диски. Диски раскладывали на поверхности агаризованной среды в предварительно подготовленные чашки Петри, засеянные тест-культурами. Готовые чашки Петри на сутки ставят в термостат при температуре 37°С. Через сутки чашки вынимают из термостата и фотографируют. Если испытуемый образец оказывает влияние на рост тест-микроба, то образуется зона задержки роста. По площади зоны задержки роста (мм2) можно судить об интенсивности влияния испытуемого образца на тест-микробы [24]. Эталоном сравнения служил стрептомицин в дозе 100 мкг/диск.
Результаты приведены в таблице 2. Наши исследования показали, что все изученные образцы наночастиц меди и наночастиц меди оксида обладают антибактериальной активностью в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных штаммов микроорганизмов. Однако существуют различия в эффективности действия наночастиц. Видно, что площади зон задержки роста бактерий более выражены при действии наночастиц меди в отношении клеток St.albus по сравнению с клетками Е.coli AB1157. Причем наночастицы образцов меди по-разному влияют на бактерии: наибольшее антимикробное действие на St.albus оказывают наночастицы меди образцов № 5 и № 6, а на Е.coli AB1157 - наночастицы меди образца № 4. Наименее выраженным антибактериальным действием в отношении St.albus обладают наночастицы меди образцов № 1 и № 2, а в отношении Е.coli AB1157 - образца № 1.
Наночастицы меди оксида образцов № 3 и № 7 обладают одинаковым антимикробным действием в отношении Е.coli AB1157. Наночастицы меди оксида образца № 8 более активны (на 69%) в отношении St.albus по сравнению с действием на клетки Е.coli AB1157.
В качестве эталона сравнения использован классический антибиотик - стрептомицин в концентрации 100 мкг/диск. Антимикробная активность антибиотика в этой концентрации соизмерима с антимикробным действием наночастиц меди и наночастиц меди оксида.
Следовательно, наночастицы меди и наночастицы меди оксида (8 образцов) не зависимо от их размеров и структуры обладают антимикробным действием, незначительно отличаясь друг от друга по эффективности.
Пример 3. Оценка антимикробной активности наночастиц меди оксида диско-диффузионным методом в зависимости от концентрации металла в диске.
Исследуемые наночастицы меди оксида в количестве 2, 5 и 10 мг помещали на бумажные глицериновые диски. Диски раскладывали на поверхности агаризованной среды в предварительно подготовленные чашки Петри, засеянные тест-культурами Е.coli AB1157 и St.albus. Готовые чашки Петри на сутки ставят в термостат при температуре 37°С. Через сутки чашки вынимают из термостата и фотографируют. Если испытуемый образец оказывает влияние на рост тест-микроба, то вокруг диска образуется зона задержки роста бактерий. По площади зоны задержки роста (мм2) можно судить об интенсивности влияния испытуемого образца на тест-микробы [24]. Эталоном сравнения служил стрептомицин в дозах 10, 20, 50 и 100 мкг/диск. Результаты экспериментов были обработаны статистически (Statistica 6). Для оценки эффективности действия исследуемых образцов использовали следующие формулы:
1) Отклонение di - случайное отклонение i-й варианты от среднего:
2) Стандартное отклонение (или среднее квадратичное отклонение) sd - характеристика рассеяния вариант относительно среднего:
,
где f=n-1 - число степеней свободы.
3) Стандартное отклонение среднего (средняя квадратичная ошибка среднего арифметического) se:
4) Доверительный интервал (доверительный интервал среднего) - интервал, в котором с заданной доверительной вероятностью Р находится действительное значение определяемой величины (генеральное среднее):
,
где - полуширина доверительного интервала.
5) Доверительная вероятность Р - вероятность нахождения действительного значения определяемой величины а в пределах доверительного интервала.
В анализе доверительную вероятность принимали равной 95%, Р=0,95.
6) Полуширина доверительного интервала :
,
где tp,f - коэффициент нормированных отклонений (коэффициент Стьюдента, функция Стьюдента, критерий Стьюдента), который зависит от доверительной вероятности Р и числа степеней свободы f=n-1, т.е. от числа n проведенных определений.
Численные значения tp,f брали из справочника.
7) Относительная (процентная) ошибка среднего результата :
Результаты исследований представлены в таблице 3, 4, на фиг.3 и фиг.4. Проведенные нами исследования показали, что вокруг дисков с наночастицами меди оксида образца № 7 в концентрациях 2, 5, 10 мг образуются зоны задержки роста грамположительных (St.albus) и грамотрицательных бактерий (E.coli АВ1157). Так, вокруг дисков с наночастицами меди оксида в концентрациях 2, 5, 10 мг образуются зоны задержки роста площадью 733,3; 912,8; 1153,6 мм2 культуры клеток St.albus соответственно и 604,2; 689,8; 829,2 мм2 культуры клеток E.coli АВ1157 соответственно (таблица 3). В качестве эталона сравнения выбран антибиотик - стрептомицин. Стрептомицин в зависимости от концентрации также обладает ингибирующим действием на поверхностный рост тест-культур. Вокруг дисков со стрептомицином в концентрациях 10, 20, 50, 100 мкг образуются зоны задержки роста St.albus и вокруг дисков со стрептомицином в концентрации 50, 100 мкг образуются зоны задержки роста E.coli АВ1157 (Таблица 4). В качестве контроля использовали 50% раствор глицерина, которым пропитывали диски. Установлено, что вокруг дисков с глицерином не образуется зона задержки роста ни представителя грамположительных (St.albus), ни грамотрицательных (E.coli АВ1157) бактерий (Фиг.3). Анализ изменений зон задержки роста бактерий наночастицами меди оксида в зависимости от концентрации показал, что существует прямая зависимость между площадями зон задержки роста клеток и содержанием наночастиц меди оксида в диске, как показано на Фиг.4.
Пример 4. Оценка влияния различных концентраций наночастиц меди на рост клеток тест-культуры Е.coli K12 в зависимости от фазы роста бактерий в питательной среде (М-9).
О влиянии наночастиц меди на фазы роста тест-культуры в жидкой питательной среде судили по изменению плотности клеток по отношении к контролю - питательной среде без добавления наночастиц меди по значению светорассеяния при длине волны =450 нм (среда М-9) на спектрофотометре Sp200 - 20 фирмы "Hitachi" (Япония) [24].
Результаты исследований приведены в таблице 5. Установлено, что при добавлении в среду наночастиц меди образца № 2 в диапазоне концентраций от 0.1 до 10 мкг/мл в течение первых 3 часов (инкубационная фаза роста) различий в изменении биомассы бактериальных клеток Е.coli K12 не происходит по сравнению с контролем. Далее следует логарифмическая фаза роста, которая характеризуется активным увеличением биомассы бактерий в контроле и отсутствием значимых изменений в опытных пробах не зависимо от концентрации наночастиц меди. Через 24 часа (стационарная фаза роста) видны различия в эффективности действия разных концентраций наночастиц меди на рост микроорганизма Е.coli K12. В пробах, содержащих наночастицы меди в концентрации 0.1 мкг/мл и 0.2 мкг/мл, наблюдается стимуляция роста тест-микроба, приводящая к увеличению биомассы бактерий на 6.6±3% и 29.6±5% соответственно по сравнению с контролем. В пробах, содержащих наночастицы меди в более высоких концентрациях в диапазоне от 1 до 10 мкг/мл, роста микроорганизмов не происходит.
Пример 5. Оценка влияния различных концентраций наночастиц меди и наночастиц меди оксида на рост тест-микробов в разных питательных средах (М9 и МПБ).
О влиянии наночастиц меди на фазы роста тест-культур в питательной среде (по сравнению с контролем) судили по изменению биомассы, которую регистрировали по значению светорассеяния при длине волны =450 нм (среда М-9) и 630 нм (МПБ) на спектрофотометре Sp200 - 20 фирмы "Hitachi" (Япония) [24]. Оценку эффекта действия наночастиц меди, наночастиц меди оксида, эталона сравнения - стрептомицина оценивали по метрологическим параметрам, описанным в примере 3 (Statistica 6).
Оценка влияния наночастиц меди (образцы № 4, № 5, № 6) в зависимости от концентрации на рост тест-культуры Е.coli K12 в питательной среде (М9) представлена в таблице 6, наночастиц меди оксида (образец № 7) в зависимости от концентрации на тест-культуры Е.coli AB1157 в питательной среде (МПБ) в таблице 7, на тест-культуры Е.coli K12 в питательной среде (МПБ) в таблице 9, на тест-культуры St.albus в питательной среде (МПБ) в таблице 11, стрептомицина (эталон сравнения) на тест-культуры Е.coli AB1157, Е.coli K12 и St.albus в питательной среде (МПБ) в зависимости от концентрации в таблицах 8, 10 и 12.
Из данных таблицы 6 видно, наночастицы меди образцов № 4, № 5 и № 6 подавляют рост Е.coli K12. В наименьшей концентрации (0.2 мкг/мл) наночастицы меди в среднем ингибируют рост клеток на 65-80%, а в концентрации 0.5 мкг/мл на 90-95%. Дальнейшее увеличение концентрации наночастиц меди в среде не приводит к увеличению эффекта. Существуют различия в действии наночастиц меди разных образцов. В концентрации 0.2 мкг/мл наночастицы образца № 4 подавляют рост клеток на 65%, № 5 на 45%, № 6 на 79%. Такие различия в действии наночастиц меди разных образцов сглаживаются при добавлении в среду больших концентраций металла. Это может быть связано с тем, что при концентрациях, превышающих 0.5 мкг/мл, приходится более 250 частиц на клетку, что не совместимо с нормальным функционированием ее жизненно важных систем. Следовательно, наибольшим ингибирующим действием на рост тест-микроба обладают наночастицы меди образца № 6, подавляя рост Е.coli K12 в 2.5 раза более эффективно, чем наночастицы меди образца № 5.
При добавлении наночастиц меди оксида образца № 7 в среду роста культуры E.coli АВ 1157 в концентрациях от 0.5 до 20 мкг/мл в среде МПБ наблюдается ингибирование роста микробных клеток, имеющее прямую зависимость от концентрации (Таблица 7). При концентрации 20 мкг/мл происходит максимальное ингибирование роста, составляющее 35%. Эталон сравнения - стрептомицин в концентрациях от 0.01 до 20 мкг/мл также ингибирует рост культуры. Максимальное ингибирование наблюдается при его концентрации 20 мкг/мл и составляет 45%, т.е. ингибирующее действие антибиотика соизмеримо с действием наночастиц меди (Таблица 8, фиг. 5).
При добавлении наночастиц меди оксида (образец № 7) в среду роста культуры E.coli K-12 в концентрациях от 0.05 до 20 мкг/мл также происходит ингибирование роста микробных клеток. Между степенью ингибирования и концентрацией наночастиц меди оксида существует прямая зависимость (Таблица 9). Ингибирование роста на 62.9% наблюдается уже при концентрации наночастиц 0.5 мкг/мл, в то же время стрептомицин в этой же концентрации ингибирует рост только на 28.4% (Таблица 10). Следовательно, ингибирующее действие наночастиц меди оксида соизмеримо с влиянием стрептомицина на рост данной культуры, достигая 98% ингибирования в концентрации 20 мкг/мл.
При добавлении наночастиц меди оксида (образец № 7) в среду роста культуры St.albus в концентрациях от 1 до 20 мкг/мл наблюдается ингибирование роста микробных клеток (Таблица 11). При концентрации 5 мкг/мл ингибирование роста составляет 59%. Стрептомицин в концентрациях от 0.5 до 20 мкг/мл резко ингибирует рост культуры вплоть до 100% (Таблица 12).
Следовательно, исследуемые образцы наночастиц меди образцов № 4, № 5, № 6 и наночастиц меди оксида образца № 7 обладают антимикробным действием на разные штаммы грамотрицательных бактерий E.coli K-12 и E.coli AB1157 и тест-культуру грамположительных бактерий St.albus в широком диапозоне концентраций, начиная с 0.05 мкг/мл. Причем действие наночастиц меди на E.coli AB1157 соизмеримо с действием стрептомицина в одинаковом диапазоне концентраций.
Пример 6. Оценка влияния наночастиц меди оксида как антимикробного агента на состояние нетканого льняного полотна.
Представленные выше примеры (2-5) доказывают, что наночастицы меди и наночастицы меди оксида обладают антимикробной активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий. Учитывая высокую потребность в эффективных и нетоксичных антимикробных агентах, эти свойства наночастиц меди и наночастиц меди оксида могут найти применение в создании устойчивых к действию бактерий материалов технического и медицинского назначения. В связи с этим нетканое льняное полотно было обработано наночастицами меди оксида.
Для оценки влияния наночастиц меди оксида как антимикробного агента на свойство ткани использовали наночастицы меди оксида образца № 7 и нетканый материал с поверхностной плотностью 70 г/м 2 на основе отбеленных льноволокон. Жидкостную обработку льноволокон осуществляли после ультразвукового диспергирования водных систем, содержащих наночастицы меди в концентрации 0.1-0.5 мг/мл. Оценку антибактериальной активности наночастиц меди проводили методом диффузии в агар на твердой среде. На подготовленный бактериальный газон, засеянный тест-культурами E.coli AB1157 и St.albus, помещали кусочки нетканого полотна льна размером 10×10 мм, обработанного наночастицами меди оксида. В качестве контроля использовали нетканое полотно льна без наночастиц меди. Готовые чашки Петри на сутки вносили в термостат при температуре 37°С. Через сутки чашки вынимали из термостата и фотографировали (Фиг.6).
На Фиг. 7 представлены электронно-микроскопические изображения наночастиц меди оксида, сорбированных на микроволокнах нетканого полотна. Частицы находятся в микронеровностях поверхности волокон как в виде небольших агрегатов, размерами до нескольких десятков частиц, так и отдельных частиц. Частицы наблюдаются как на волокнах внешних слоев, так и на волокнах внутренних слоев ткани.
На Фиг.8 представлены результаты эксперимента. Видно, что под нетканым полотном льна, не обработанного наночастицами меди оксида, наблюдается рост изученных тест-культур. При этом по краю образцов ткани наблюдается выраженная стимуляция роста микроорганизмов. Исследование роста тест-культур под нетканым полотном льна с наночастицами меди оксида показало наличие отдельных колоний микроорганизмов под тканью и отсутствие стимуляции роста микроорганизмов по краю льна.
Кроме того, был проведен анализ превращений, происходящих в льняной матрице при создании оптимальных условий для развития естественного комплекса микрофлоры (рост грибов, бактерий, актиномицетов) без наночастиц меди оксида и с наночастицами меди оксида. Внешним проявлением жизнедеятельности микробных культур, их адаптации к существованию на льноволокнистом материале является «колонизация» его поверхности, появление паутинообразных пленок, пигментации, нарушение целостности структуры. Нами установлено, что после длительного (10-14 дней) выдерживания нетканого материала в термостате ТС-80 при 29±0.2°С и влажности 100% у нетканого полотна, обработанного наночастицами меди оксида, не наблюдалось видимых повреждений льнонанокомпозитов. В этих же условиях у нетканого полотна, не обработанного наночастицами меди оксида, эстетические и эксплуатационные свойства ухудшались в значительной степени. Показано, что при введении в льняную матрицу наночастиц меди оксида в концентрации 0.3-0.5 мг/г волокна коэффициент устойчивости нетканого материала к микробиологическому разрушению составлял 60-90%, а нетканого материала без наночастиц меди оксида - всего лишь 2-5%.
Следовательно, нетканое полотно льна, обработанное наночастицами меди оксида, обладает антимикробным действием при контактном взаимодействии полотно - бактериальные клетки. Кроме того, обработка ткани наночастицами меди оксида значительно повышает эстетические и эксплутационные характеристики льноволокна.
Литература:
1. Биоэлементы и здоровье человека: Учебно-методическое пособие. - Самара: СамГМУ, 1996. - 32 с.
2. Бородулин В.Б. Биохимические основы антибактериального действия комплексов переходных металлов: Автореф. дис. доктора мед. наук. - Саратов, 1996. - 40 с.
3. Вельховер Е.С., Ромашов Ф.Н., Селюкова В.В. Применение меди и ее солей в лечебной практике. Методические рекомендации. - М.: Университет дружбы народов, 1982. - 44 с.
4. Веселовский А.В. Исследование механизма взаимодействия ионов меди с бактериями Escherihia coli: Автореферат дис. канд. биол. наук. - М.: Биофизика, 1994. - 20 с.
5. Войченков С.А. Современные проблемы диагностики и лечения нарушения функций репродуктивных органов. - М.: 1994. - 194 с.
6. Ген М.Я., Миллер А.В. Авторское свидетельство СССР № 814432 // Бюллетень изобретений. - 1981. - № 11. - С.25.
7. Глущенко Н.Н., Богословская О.А., Ольховская И.П. Физико-химические закономерности биологического действия высокодисперсных порошков металлов // Химическая физика. - 2002. - Т.21(4). - С.79-85.
8. Кузовникова Т.А., Лебедев B.C., Володина Л.А., Федоров Ю.И. Чувствительность к высокодисперсному порошку меди мутантов Escherihia coli. В, резистентных к CuCl2 // Серия биологическая. - 1987. - № 2. - С.286-289.
9. Лебедев B.C. Индуцированный медью обмен катионов в бактериях Escherihia coli // Журнал физической химии. - 1989. - № 2. - С.459-466.
10. Лебедев B.C., Веселовский А.В., Федоров Ю.И. О первичном механизме токсического действия меди на мембрану Escherihia coli // Биологические мембраны. - 1991. - Т.8. - № 3. - С.261-264.
11. Лебедев B.C., Володина Л.А., Федоров Ю.И. Анализ мест связывания меди с интактными и модифицированными N-этилмалеимидом бактериями Е.coli методом ЭПР // Биофизика. - 1991. - Т.36. - № .1. - С.91-96.
12. Лебедев B.C., Кузовникова Т.А., Корнев А.П., Федоров Ю.И. Закономерности индуцированного медью транспорта стрептомицина в Escherichia coli // Биофизика. - 1987. - Т.32. - № 4. - С.638-641.
13. Лебедев B.C., Володина Л.А., Дейнега Е.Ю., Федоров Ю.И. Структурные изменения поверхности бактерий Escherihia coli и медьиндуцированная проницаемость плазматической мембраны // Биофизика. - 2005. - Т.50. - № 1. - С.107-113.
14. Левина Э.Н. Общая токсичность металлов. - Л.: Медицина, 1972. - 184 с.
15. Патент US 20030180381 А1. Use of metal compounds to treat gastrointestinal infections / Bruggraber A., Powell J. // 2003.
16. Патент US20030069279. Antimicrobial agent / Sato Masaru, Hadano Makoto // 2003.
17. Патент US 201000406 55 A1. Anti-viral formulations nanomaterial and nanoparticales / Ren G., Oxford J., Oxford J. // 2010.
18. Патент US 5344636. Anti-microorganism agent and anti-microorganism resin or rubber composition / Kabushiki Kaisha Kaisui Kagaku Kenkyujo //1994.
19. Попова Л.Ф. Медь. - M.: Просвещение, 1989.
20. Публикации 1977-2007 г. на интернет-сайте: http//www.nanobiology.narod.ru.
21. Рахметова А.А., Алексеева Т.П., Богословская О.А. и др. Ранозаживляющие свойства наночастиц меди в зависимости от их физико-химических характеристик // Российские нанотехнологии. - 2010. - Т.5. - № .3-4. - С.62-67.
22. Реутова Н.В. Изучение патогенного потенциала соединений меди и модификация эффектов йодистым серебром // Генетика. - 2001. - Т.37. - № 5. - С.617-623.
23. Смирнова Г.В., Красных Т.А., Октябрьский О.Н. Роль глутатиона при ответе Escherihia coli на осмотический шок // Биохимия. - 2001. - Т.66. - № 9. - С.1195-1201.
24. Справочник по микробиологическим и вирусологическим исследованиям / Под ред. Биргера М.О. - М.: Медицина, 1973. - 455 с.
25. Федорина А.П. Чувствительность разных видов микроорганизмов к солям железа, меди и кобальта// II Всесоюзная конференция. Актуальные вопросы клинической микробиологии в неинфекционной клинике. - Барнаул. - 1988. - Часть 1. - С.221-223.
26. Федоров Ю.И., Володина Л.А., Кузовникова Т.А., Лебедев B.C. О механизме влияния высокодисперсного порошка меди на энергетические процессы у Е.coli // Изв. АН СССР. Серия биологическая. - 1984. - № 1, - С.153-156.
27. Федоров Ю.И., Володина Л.А., Кузовникова Т.А., Лебедев В.С. Сравнительное изучение влияния металлов Ag, Cu, Zn, Al в виде высокодисперсного порошка и соли на рост Е.coli // Изв. АН СССР. Серия биологическая. - 1983. - № 6. - С.948-950.
28. Domek M.J., Robbins J.E., Anderson M.E., McFeters G.A. Metabolism of escherichia coli injured by copper // Can. J. Microbiol. - 1987. - V.33. - № 1. - P.57-62.
29. Elechiguerra J.L., Burt L.L., Jose R Morones L.R., et al. Interaction of silver nanoparticles with HIV-1 // Journal of Nanobiotechnology. - 2005. - V.3(6). - P.1186-1196.
30. Fumo F., Morley K., Wong B. et al. Silver nanoparticles and polymeric medical devices: a new approach to prevention of infection? // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. - 2004. - V.54(6). - P.1019-1024.
31. Gui F., Zhang Z., Zheng C., et al. Study of nanometer catalyst on antiviral action // Virologica Sinica. - 2005. - V.20(1). - P.70-74.
32. Taylor P.L., Ussher A.L., Burrell R.E. Impact of heat on nanocrystalline silver dressings. Part I: Chemical and biological properties // Biomaterials. - 2005. - V.26(35). - P.7221-7229.
33. Taylor P.L., Omotoso O., Wiskel J.B. et al. Impact of heat on nanocrystalline silver dressings. Part II: Physical properties // Biomaterials. - 2005. - V.26(35). - P.7230-7240.
34. White С., Cadd G.M. Inhibition of H+ efflux and K+ uptake, and induction of K+ efflux in yeast by heavy metals // Toxicity Assessment. - 1987. - V.2. - № 4. - P.437-447.
Таблица 2 | ||
Площади зон задержки роста (мм2) тест-культур St.albus и Е.coli АВ1157 при действии наночастиц меди и наночастиц меди оксида в концентрации 5 мг/диск, стрептомицина 100 мкг/диск | ||
Образец НЧ меди | Зона задержки роста St.albus, мм2 | Зона задержки роста Е.coli AB1157, мм2 |
Образец № 1 | 1004+42 | 805±57 |
Образец № 2 | 1014±72 | 857±15 |
Образец № 3 | 1001±88 | 868±33 |
Образец № 4 | 1054±79 | 940±44 |
Образец № 5 | 1210±32 | 839±10 |
Образец № 6 | 1207±40 | 835±60 |
Образец № 7 | 1103±59 | 868±25 |
Образец № 8 | 1168±17 | 689±19 |
Эталон сравнения - стрептомицин | 794±16 | 361±14 |
Таблица 3 | ||||||
Метрологические параметры результатов измерения площадей зон задержки роста при нанесении на бумажный диск наночастиц меди оксида (образец № 7) | ||||||
Метрологические параметры | Концентрация, мг/диск | |||||
St.albus | E.coli AB1157 | |||||
2 | 5 | 10 | 2 | 5 | 10 | |
n | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
площади зон задержки роста | 716,0 | 918,2 | 1151,5 | 576,5 | 651,1 | 824,1 |
865,3 | 896,8 | 1175,7 | 585,1 | 735,0 | 829,2 | |
798,3 | 923,5 | 1133,5 | 651,1 | 683,1 | 834,3 | |
| 733,3 | 912,8 | 1153,6 | 604,2 | 689,8 | 829,2 |
sd | 74,8 | 14,1 | 21,1 | 48,0 | 42,4 | 5,1 |
185,7 | 35,0 | 52,4 | 119,2 | 105,3 | 12,7 | |
25,3 | 3,8 | 4,5 | 19,7 | 15,3 | 1,5 |
Таблица 5 | ||||||||
Влияние наночастиц меди образца № 2 в разных концентрациях на рост (A450, О/К, %) тест-культуры Е.coli K12 в питательной среде (М-9) по фазам роста | ||||||||
Время, час | Изменение биомассы бактерий в процессе роста (A450 , О/К, %) | |||||||
Концентрация наночастиц меди, мкг/мл | ||||||||
10 | 4 | 2 | 1 | 0,5 | 0,2 | 0,1 | контроль | |
1 | 10,9 | 11,1 | 8,9 | 8,9 | 9,5 | 10,2 | 10,7 | 11,4 |
1,5 | 11,3 | 11,2 | 10,8 | 12,1 | 13,2 | 14,0 | 14,4 | 15,9 |
2 | 11,2 | 10,6 | 10,2 | 12,7 | 14,2 | 16,8 | 18,6 | 19,5 |
2,5 | 12,0 | 10,9 | 11,8 | 17,2 | 16,5 | 20,5 | 21,0 | 26,0 |
3 | 13,7 | 12,5 | 12,0 | 16,5 | 16,6 | 20,1 | 21,2 | 32,7 |
3,5 | 13,5 | 12,4 | 12,1 | 16,6 | 17,3 | 21,2 | 20,8 | 41,4 |
4 | 13,5 | 12,6 | 12,9 | 17,3 | 18,1 | 22,1 | 21,1 | 50,9 |
4,5 | 13,6 | 12,4 | 12,0 | 18,1 | 19,1 | 23,1 | 22,2 | 63,8 |
5 | 14,0 | 12,0 | 11,9 | 17,7 | 21,0 | 26,1 | 23,6 | 72,3 |
24 | 13,9 | 12,3 | 11,9 | 14,6 | 17,0 | 129,6 | 106,6 | 100 |
Таблица 6 | |||||
Влияние наночастиц меди образцов № 4, № 5 и № 6 в зависимости от концентрации на рост тест-культуры Е.coli K12 (A450, O/K, %) в питательной среде (М-9) через 48 часов выращивания | |||||
Образцы наночастиц меди № | Концентрация НЧ меди в питательной среде (М-9), мкг/мл | ||||
0 | 0.2 | 0.5 | 1.0 | 2.0 | |
4 | 100 | 35.0±1.47 | 9.0±0.15 | 9.4±0.15 | 8.4±1.19 |
5 | 100 | 55.1±0.96 | 9.2±0.15 | 8.5±0.45 | 8.2±0.10 |
6 | 100 | 21.1±0.47 | 9.0±0.15 | 8.6±0.30 | 11.1±0.45 |
Таблица 7 | |||||
Метрологические параметры результатов ( | |||||
Метрологические параметры | Концентрация, мкг/мл | ||||
0 | 0,5 | 5 | 10 | 20 | |
sd | 0 | 0,88 | 2,43 | 1,64 | 1,36 |
100 | 97,49 | 85,71 | 76,9 | 65,57 | |
0 | 2,19 | 6,05 | 1,64 | 3,39 | |
0 | 2,25 | 7,06 | 5,3 | 5,17 |
Таблица 11 | |||||
Метрологические параметры результатов исследования влияния наночастиц меди оксида (образец № 7) в различных концентрациях на рост тест-культуры St.albus в питательной среде (МПБ), при n=3 | |||||
Метрологические параметры | Концентрация, мкг/мл | ||||
0 | 1 | 5 | 10 | 20 | |
sd | 0 | 0,75 | 5,37 | 7,95 | 2,36 |
100 | 43,36 | 41,00 | 62,41 | 58,92 | |
0 | 1,87 | 13,37 | 19,8 | 5,88 | |
0 | 4,31 | 32,6 | 31,7 | 9,97 |
Класс A61K33/34 медь; ее соединения
Класс A61P31/04 антибактериальные средства
Класс B82B3/00 Изготовление или обработка наноструктур