способ культивирования, благоприятствующий продуцированию к-витамина молочнокислыми бактериями, и его применение в производстве пищевых продуктов

Формула изобретения

1. Способ производства биомассы, обогащенной витамином К2, полученной культивированием, по меньшей мере, одного штамма молочнокислых бактерий, продуцирующих витамин К2, выбранных из видов Lactococcus lactis, Leuconostoc lactis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Enterococcus faecium и Propionibacterium sp.;

в котором указанный штамм культивируют в условиях покоящихся клеток и который включает, по меньшей мере:

(а) первичное культивирование указанного штамма в условиях поддержания дыхания на пригодной для получения первичной или предкультуры среде, содержащей, по меньшей мере, одно соединение, содержащее ядро гема, в конечной концентрации, по меньшей мере, около 0,5 мкг/мл;

(б) инокуляцию молочной культуральной среды, содержащей жир, живыми бактериальными клетками в количестве примерно от 10⁸ КОЕ/мл до 10¹¹ КОЕ/мл, и

(в) ферментацию инокулированной среды в течение примерно от 4 ч до 48 ч при температуре примерно от 4°С до 50°C с получением целевой биомассы с уровнем продуцирования витамина К2, который может достигать от около 30 мкг до примерно 75 мкг и выше витамина К2/100 г ферментированной культуральной среды.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная молочная культуральная среда содержит, по меньшей мере, около 0,5% жира.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанная молочная культуральная среда представляет собой молоко или молоко с повышенной буферной способностью.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанную предкультуру инкубируют при температуре примерно от 4°С до 40°С.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что снабжение кислородом указанной предкультуры осуществляют путем перемешивания или аэрации.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная предкультура сохраняется в течение, по меньшей мере, около 8 ч.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный штамм молочнокислых бактерий выбирают из следующих вариантов природных штаммов Lactococcus lactis subsp.cremoris, продуцирующих витамин К2:

Lactococcus lactis subsp.cremoris I-3557, зарегистрированного в Национальной коллекции культур микроорганизмов (Франция) (France's Collection Nationale de Culture des Microorganismes) (CNCM, Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France) 20.01.2006;

Lactococcus lactis subsp.cremoris 1-3558, зарегистрированного в CNCM (Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France) 20.01.2006; и

Lactococcus lactis subsp. cremoris I-3626, зарегистрированного в CNCM (Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France) 19.06.2006.

8. Биомасса, обогащенная витамином К2, полученная путем культивирования, по меньшей мере, одного штамма молочнокислых бактерий, выбранных из видов Lactococcus lactis, Leuconostoc lactis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Enterococcus faecium и Propionibacterium sp., продуцирующих витамин К2, в условиях покоящихся клеток согласно способу, включающему, по меньшей мере:

(а) первичное культивирование указанного штамма в условиях поддержания дыхания на пригодной для получения первичной или предкультуры среде, содержащей, по меньшей мере, одно соединение, содержащее ядро гема, в конечной концентрации, по меньшей мере, около 0,5 мкг/мл;

(б) инокуляцию молочной культуральной среды, содержащей жир, живыми бактериальными клетками в количестве примерно от 10⁸ КОЕ/мл до 10¹¹ КОЕ/мл, и

(в) ферментацию инокулированной среды в течение примерно от 4 ч до 48 ч при температуре примерно от 4°С до 50°C с получением целевой биомассы с уровнем продуцирования витамина К2, который может достигать от около 30 мкг до примерно 75 мкг и выше витамина К2/100 г ферментированной культуральной среды.

9. Применение биомассы по п.8 для производства молочного продукта, обогащенного витамином К2.

10. Способ производства молочного продукта, обогащенного витамином К2, который включает, по меньшей мере:

(а) культивирование, по меньшей мере, одного штамма молочнокислых бактерий, продуцирующих витамин К2, выбранных из видов Lactococcus lactis, Leuconostoc lactis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Enterococcus faecium и Propionibacterium sp., в условиях покоящихся клеток согласно способу, включающему, по меньшей мере:

(i) первичное культивирование указанного штамма в условиях поддержания дыхания на пригодной для получения первичной или предкультуры среде, содержащей, по меньшей мере, одно соединение, содержащее ядро гема, в конечной концентрации, по меньшей мере, около 0,5 мкг/мл;

(ii) инокуляцию молочной культуральной среды, содержащей жир, живыми бактериальными клетками в количестве примерно от 10⁸ КОЕ/мл до 10¹¹ КОЕ/мл, и

(iii) ферментацию инокулированной среды в течение примерно от 4 ч до 48 ч при температуре примерно от 4°С до 50°C с получением целевой биомассы с уровнем продуцирования витамина К2, который может достигать от около 30 мкг до примерно 75 мкг и выше витамина К2/100 г ферментированной культуральной среды,

(б) добавление биомассы, полученной из культуры на стадии (а), в указанный молочный продукт или в его полуфабрикат и

(в) получение указанного молочного продукта, обогащенного витамином К2.

11. Способ обогащения молочного продукта витамином К2, включающий, по меньшей мере:

(а) добавление биомассы по п.8 в указанный молочный продукт или в его полуфабрикат и

(б) получение указанного молочного продукта, обогащенного витамином К2.

12. Молочный продукт, обогащенный витамином К2, полученный способом по п.10 или 11.

13. Молочный продукт по п.12, отличающийся тем, что он представляет собой ферментированный продукт или свежий молочный продукт.

14. Молочный продукт, обогащенный витамином К2, содержащий биомассу по п.8.

15. Молочный продукт по п.14, отличающийся тем, что он представляет собой ферментированный продукт или свежий молочный продукт.

16. Применение не в лечебных целях молочного продукта по любому из предшествующих пп.12-15 для повышения прочности костей у потребителя.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к области пищевых продуктов, обогащенных нутриентами, витаминами и/или микроэлементами с целью улучшения состава и качественного и количественного баланса потребляемых нутриентов в организме человека.

Изобретение относится, в частности, к средствам обогащения пищевых продуктов витамином К.

Если говорить точнее, то настоящее изобретение относится к способу увеличения количества витамина K2, полученного культивированием, по меньшей мере, одного штамма молочнокислых бактерий, продуцирующих витамин K2, в котором указанный штамм культивируется в условиях "покоящихся клеток" таким образом, что количество витамина K2, продуцируемое культурой покоящихся клеток, превышает на коэффициент, равный, по меньшей мере, примерно 1,2, количество витамина K2, полученное культивированием указанного штамма при стандартных условиях ферментации.

Кроме того, настоящее изобретение относится к биомассе, полученной из культуры молочнокислых бактерий, продуцирующих витамин К2, описанным выше способом.

Изобретение относится также к способу продуцирования витамина K2, к способам производства пищевых продуктов, обогащенных витамином K2, в частности ферментированных продуктов и/или свежих молочных продуктов, а также к пищевым продуктам, полученным такими способами.

Витамин K - это жирорастворимый витамин, который встречается в природе в двух формах: витамин K1 (или филлохинон) и витамин K2 (или менахинон).

Витамин K1 синтезируется растениями. Он встречается, главным образом, в зеленых частях растений (листовые овощи) и соевом масле.

Витамин K1 участвует непосредственно в процессе свертывания крови.

Витамин K2 продуцируется бактериями кишечной флоры. В небольших количествах он присутствует также в некоторых пищевых продуктах, подвергаемых ферментации (сыр, типичные азиатские продукты, содержащие ферментированную сою, такие как японские мисо (ферментированная соевая паста) и натто (соевый сыр) и др.). Многие бактерии способны синтезировать витамин K2. Так, помимо бактерий кишечной флоры и особенно таких их видов, как Escherichia coli, Bacillus subtilis и Bacteroides spp, примерами могут служить некоторые виды или подвиды молочнокислых бактерий, такие как Lactococcus lactis spp.lactis, Lactococcus lactis spp.cremoris, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides и Propionibacterium sp. Количество витамина K2, синтезируемого этими бактериями, в большинстве случаев колеблется примерно от 29 мкг до 90 мкг/л ферментированного молока (Morishita et al., 1999). Важно подчеркнуть, что измерения продуцируемого количества витамина K2 в большинстве своем проводятся в образцах лиофилизированных культур клеток и что результаты этих измерений показывают значительный разброс уровней продуцирования в зависимости от тестируемых штаммов, среди которых некоторые штаммы способны продуцировать в три раза больше, чем другие (Morishita et al., 1999; Parker et al, 2003). В рамках биологической активности витамин К2 известен, сверх того, своим действием на отложение кальция в мягких тканях.

Впервые витамин K был описан как витамин, играющий важную роль в процессе свертывания крови. Так, значительный недостаток витамина K приводит к кровотечениям с аномальным увеличением продолжительности свертывания крови и к кровоизлияниям. Долгое время считалось, что значительный дефицит витамина K у взрослых встречается довольно редко и может быть с успехом покрыт как за счет разнообразного и сбалансированного питания, так и за счет эндогенного продуцирования витамина бактериями кишечника. В этом отношении к группе риска обычно относят:

- новорожденных, кишечник которых еще не содержит бактерий-продуцентов витамина K;

- людей с нарушениями функции печени, желчного пузыря или кишечника (как следствие гепатита, муковисцидоза, колита, дизентерии и др.) и

- индивидуумов, длительное время принимавших антибиотики.

Совсем недавно было открыто, что влияние витамина K на здоровье человека не ограничивается только его ролью в механизмах свертывания крови. Фактически с 1980-х годов было признано, что витамин K играет определенную роль и в метаболизме костной ткани (Hart et al., 1984; Hart et al,, 1985).

Этот витамин выполняет функцию кофактора в ферментативной реакции, которая обусловливает активность остеокальцина в рамках регуляции костеобразования (Hauschka P.V. et al., 1989; Ducy P. et al., 1996). Если говорить точнее, то его роль заключается в нормализации условий карбоксилирования остеокальцина - ключевого белка, регулирующего процесс костеобразования. В случае дефицита витамина К указанная реакция не происходит, в результате чего в крови увеличивается отношение декарбоксилированного остеокальцина к карбоксилированому остеокальциду (Väänänen et al., 1999).

Демографические тенденции в западных странах проявляются в прогрессирующем старении населения, последствием которого является повышение уровня распространения дегенеративных патологий, в частности остеопороза. По этой причине остеопороз сегодня рассматривается как основная проблема, угрожающая здоровью людей.

В демографических программах, разработанных в 1990-х годах, впервые прозвучал тревожный сигнал о том, что по прогнозам в последующие 50 лет будет наблюдаться значительный рост случаев указанной патологии, особенно среди людей старшего возраста. В связи с этим было срочно принято решение о необходимости и безотлагательности принятия мер по предупреждению указанной патологии, которая в те годы редко выявлялась на ранней стадии и лечение которой проводилось, как правило, в запущенной стадии.

В настоящее время повсеместно признается, что профилактика остеопороза должна начинаться еще в детском возрасте с контроля за оптимальным ростом костей и продолжаться в течение всей жизни за счет поддержания массы костной ткани. Известно, что питательные факторы играют важную роль в развитии и поддержании здоровой костной ткани. До настоящего времени стратегия питания, намеченная или предложенная для профилактики остеопороза, основывалась, главным образом, на двух ключевых факторах, а именно - на кальции и витамине D. Однако сегодня стало известно, что не менее важными могут быть и другие питательные факторы.

В литературе все чаще высказываются предположения, что витамин K благодаря своей важной роли в костеобразовании может служить многообещающим средством профилактики здоровья костей в течение всей жизни человека.

Рекомендуемая норма потребления вместе с пищей витамина K для человека (1,5 мкг/сутки/кг массы тела) была установлена с учетом только его роли в свертывании крови. Однако проведенные в последнее время исследования позволяют предположить, что указанная норма потребления занижена, поскольку в ней не учитывается активность витамина К в метаболизме костной ткани (Ronden et al., 1998).

Даже если потребность в витамине K остается недооцененной, но факт остается фактом - заниженная норма потребления связана со снижением массы костной ткани и с увеличением риска переломов у взрослых индивидуумов (Hart et ah, 1985; Knapen et al., 1989; Szulc et al., 1993; Booth et ah, 2000). Более того, интервенционные исследования среди женщин в периоде менопаузы показали, что витамин K сокращает случаи остеопороза в указанной группе населения (Shiraki et al., 2000; Braam et al., 2003). И, наконец, исследования на животных позволяют предположить, что витамин K может играть полезную роль в достижении пиковой массы костной ткани и что этот эффект проявляется даже в большей степени, чем ранее связываемое с витамином D синергитическое действие. Однако исследования, доказывающие четко выраженную связь витамина K с ростом костей, проводились только на животных.

Более того, недавно проведенные исследования позволили получить дополнительные аргументы в пользу влияния витамина K на метаболизм костной ткани, в частности на построение и сохранение массы костной ткани (Booth et al., 2000; Shiraki et al., 2000; Braam et al., 2003; Hirano and Ishi, 2002).

В отличие от действия витамина K на взрослых, мало имеется данных о полезном влиянии витамина K на метаболизм костной ткани у детей. Известно только, что крайне важно оптимизировать массу костной ткани в период роста с целью обеспечения максимально возможного костного резерва и предупреждения риска развития остеопороза во взрослом возрасте.

Но в любом случае на основании всех имеющихся на сегодня данных можно сделать вывод, что повышение содержания витамина K в пищевых продуктах является особенно важным и многообещающим средством обеспечения и поддержания у индивидуума нормального телосложения.

В рамках этого на рынке пищевых продуктов уже появились продукты промышленного производства, которые содержат повышенное количество витамина K. Достойные внимания примеры включают некоторые молочные продукты, содержащие молочнокислые бактерии, такие как "Petits Gervaix aux Fruits" (фруктовый детский йогурт/творожок), реализуемые во Франции заявителем. Тем не менее, следует заметить, что, с одной стороны, содержание витамина K в таких продуктах в большинстве случаев зависит от вида используемых заквасок, а с другой стороны, штаммы Lactococcus lactis, обычно применяемые в молочных продуктах, не продуцируют количества витамина K, достаточного для удовлетворения потребностей населения или хотя бы для некоторого покрытия возможного недостатка витамина K.

Таким образом, в существующем уровне техники отмечается потребность в пищевых продуктах, в частности в ферментированных продуктах и/или свежих молочных продуктах, которые содержат витамин K в количествах, достаточных для удовлетворения потребностей (а при необходимости и для покрытия его дефицита) детей и подростков, а также взрослых людей и людей старшего возраста.

В контексте описания термины "витамин K2" и "витамин K" употребляются как синонимы и обозначают витамин K2.

Поэтому настоящее изобретение нацелено на удовлетворение указанной потребности за счет впервые предлагаемого способа производства пищевых продуктов, таких как кисломолочные продукты и/или свежие молочные продукты, в котором закваски, способные продуцировать витамин K, используются в условиях, благоприятствующих весьма ощутимым образом продуцированию витамина K по сравнению с традиционными условиями производства.

Более того, в ходе своей работы авторами изобретения были получены новые природные варианты природных штаммов молочнокислых бактерий, продуцирующих витамин K в количестве, значительно превышающем его количество, продуцируемое исходными природными штаммами, из которых указанные варианты были получены (см. ниже раздел "Примеры"). Таким образом, вновь полученные варианты, которые "сверхпродуцируют" витамин K, предпочтительно могут использоваться при условиях осуществления способа изобретения, особенно благоприятных для продуцирования витамина K.

Согласно первому аспекту, настоящее изобретение относится к способу увеличения количества витамина K2, полученного культивированием, по меньшей мере, одного штамма молочнокислых бактерий, продуцирующих витамин K2, в котором указанный штамм культивируется в условиях покоящихся клеток и который включает, по меньшей мере:

(а) инокуляцию пригодной для данной цели культуральной среды живыми бактериальными клетками в количестве примерно от 10 ⁸ КОЕ/мл до 10¹¹ КОЕ/мл, и

(б) ферментацию инокулированной, как указано выше, среды в течение примерно от 4 ч до 48 ч, предпочтительно - примерно от 8 ч до 48 ч, при температуре примерно от 4°C до 50°C, предпочтительно - при температуре примерно от 4°C до 40°C, таким образом, что в конце стадии (б) количество витамина K2, продуцированное культурой покоящихся клеток, превышает на коэффициент, равный, по меньшей мере, примерно 1,2, количество витамина K2, полученное культивированием указанного штамма при стандартных условиях ферментации.

Выражения "культура покоящихся клеток" и "культура в условиях покоящихся клеток" являются частью общепринятой терминологии в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Поэтому понятие "покоящиеся клетки" прекрасно известно квалифицированному в данной области техники специалисту. Во Франции указанные выражения на английском языке хорошо известны и в большинстве случаев не переводятся на французский язык.

"Стандартные условия ферментации" в полной мере соответствуют, как свидетельствует их название, стандарту и хорошо известны квалифицированному в данной области техники специалисту (они обозначаются также как "лабораторные условия"). Предпочтительными "стандартными условиями ферментации" в контексте настоящего изобретения являются следующие: штамм предварительно выращивается на готовой агаровой среде М17 (агар Difco М17) или на эквивалентной среде с добавлением 20 мкл/мл 0,5 мг/мл раствора гемина в 0,1 М растворе соды. Для последующего культивирования проводится инокуляция с использованием 1% выращенной предкультуры. Температура инкубации составляет около 30°C. Аэрация обеспечивается простым перемешиванием. Условия ферментации могут при необходимости изменяться квалифицированным в данной области техники специалистом на основе собственных знаний и, разумеется, по результатам экспериментов по уточнению методики. Однако важно следить за систематическим соблюдением следующих трех основных критериев: (i) культуральная среда - это среда, пригодная для культивирования штаммов молочнокислых бактерий, в частности, штаммов Lactococcus spp.; (ii) по меньшей мере, одно соединение, содержащее ядро гема (например, гемин, каталаза или производные хлорофилла), добавляется в среду для получения предкультуры и/или в культуральную среду (предпочтительно и в среду для получения предкультуры, и в культуральную среду); (iii) процесс приготовления предкультуры и/или процесс культивирования (предпочтительно только процесс приготовления предкультуры) осуществляется в условиях перемешивания.

Частные варианты воплощения способа изобретения включают следующее:

- на стадии (а) культуральная среда инокулируется живыми бактериальными клетками в количестве примерно от 5×10⁸ КОЕ/мл до 10 ¹⁰ КОЕ/мл, более предпочтительно - примерно от 2×10 ⁹ КОЕ/мл до 6×10⁹ КОЕ/мл;

- на стадии (б) ферментация среды проводится в стандартных условиях в течение примерно от 12 ч до 36 ч, предпочтительно - примерно от 15 ч до 24 ч;

- на стадии (б) ферментация среды проводится в стандартных условиях при температуре примерно от 15°C до 35°C, предпочтительно - примерно от 20°C до 30°C.

Предпочтительно в конце стадии (б) количество витамина K2, продуцированное культурой покоящихся клеток, превышает на коэффициент, равный, по меньшей мере, примерно 1,5, количество витамина K2, полученное при культивировании указанного штамма в стандартных условиях ферментации. Указанный коэффициент более предпочтительно равен, по меньшей мере, примерно 1,7; еще более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 1,8; даже более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 1,9. Наиболее предпочтительными значениями указанного коэффициента являются значения, равные примерно 2, примерно 2,2, примерно 2,4, примерно 2,5, примерно 2,7, примерно, 2,8, примерно 2,9 и примерно 3.

Предпочтительно уровень продуцирования витамина K2, достигаемый с применением средств изобретения, составляет около 30 мкг витамина K2/100 г ферментированного молока при стандартных условиях ферментации. В лучшем случае уровень продуцирования может достигать примерно 40 мкг витамина K2/100 г ферментированного молока, более предпочтительно он может достигать или даже превышать примерно 45 мкг или 50 мкг витамина K2/100 г ферментированного молока. Так, предпочтительными, в частности, являются уровни продуцирования примерно 55 мкг, примерно 60 мкг, примерно 65 мкг, примерно 70 мкг или примерно 75 мкг витамина K2/100 г ферментированного молока либо даже выше.

Согласно одному из вариантов воплощения изобретения штамм молочнокислых бактерий, продуцирующих витамин K2, который используется в способе изобретения, выбирается из рода Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus и Propionibacterium. В частности, штамм молочнокислых бактерий выбирается из видов Lactococcus lactis, Leuconostoc lactis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Enterococcus faecium и Propionibacterium sp. Предпочтительно штамм молочнокислых бактерий выбирается из природных вариантов Lactococcus lactis subsp.cremoris-продуцента витамина K2, которые были получены авторами настоящего изобретения в ходе проведенной ими работы (см. ниже раздел "Примеры"), таких как: вариант I-3557, зарегистрированный в Национальной коллекции культур микроорганизмов (Франция) (France's Collection Nationale de Culture des Microorganismes) (CNCM, Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France) 20/01/2006; вариант I-3558, зарегистрированный в CNCM 20/01/2006, и вариант I-3626, зарегистрированный в CNCM 19/06/2006.

В контексте описания термин "вариант" охватывает:

- природные варианты, т.е. варианты, полученные спонтанно из стандартного штамма молочнокислых бактерий под воздействием давления отбора; поэтому эти природные варианты не являются продуктами генной инженерии, а получены преимущественно путем мутации и селекции из стандартного штамма, и

- мутанты, полученные одной или более мутациями в геноме, индуцированными генной инженерией, т.е. методами направленного мутагенеза, в частности, методом генетической трансформации с использованием векторов, применимых к стандартному штамму.

Во всех случаях "варианты" в контексте изобретения обозначают штаммы, способные продуцировать витамин K2. Если уровень продуцирования вариантом витамина K2 составляет, по меньшей мере, около 5,5 мкг/100 г ферментированного молока при стандартных условиях ферментации (называемые также "лабораторными условиями"), то такой вариант предпочтительно считается "сверхпродуцирующим" штаммом.

Следует заметить, что в некоторых странах (в частности, в Европе) производителям пищевой продукции предписано соблюдать меры предосторожности при разработке продуктов, предназначенных для потребления человеком и/или животным, в которые вводятся микроорганизмы, более конкретно - живые микроорганизмы, поскольку генетически модифицированные организмы (в данном случае микроорганизмы), обозначаемые как ГМО или мутанты, могут вызывать у потребителей страх и опасения.

Такое негативное представление, из-за которого в некоторых странах страдает репутация ГМО, приводит к тому, что потребители бойкотируют пищевые продукты, содержащие ГМО. Так, под давлением требований потребителей к большей прозрачности в обозначении уровней содержания и происхождения ингредиентов в предлагаемых им пищевых продуктах производители будут, вероятно, вынуждены поставлять на продажу квазиисключительно, даже эксклюзивно, такие продукты, которые не содержат ГМО. Поэтому в контексте настоящего изобретения может быть предпочтительным, чтобы выпускаемые промышленностью пищевые продукты, содержащие микроорганизмы, изготавливались исключительно с природными штаммами или природными вариантами природных штаммов.

Согласно одному из вариантов воплощения изобретения на стадии (а) пригодная для цели изобретения культуральная среда содержит жир. Она содержит предпочтительно, по меньшей мере, около 0,5% жира; более предпочтительно, по меньшей мере, около 1,5% жира; наиболее предпочтительно, по меньшей мере, около 3,5% жира. В одном из вариантов такая среда может содержать, например, молочные сливки или соевое молоко. Это может быть также обычное молоко или молоко с повышенной буферной способностью. Само собой разумеется, что могут использоваться и комбинации этих различных сред. Примеры "молока с повышенной буферной способностью" включают, в частности, молоко с добавлением -глицерофосфата, и/или цитрата, и/или молочных белков, и/или любого другого, пригодного для данной цели пищевого ингредиента с буферной способностью.

Например, полужирное молоко обычно содержит около 1,5% жира; цельное молоко - около 3,5% жира.

В одном из предпочтительных вариантов воплощения способ изобретения включает также, по меньшей мере, одну стадию, предваряющую стадию (а) и заключающуюся в первичном выращивании штамма в условиях поддержания дыхания на подходящей для этого питательной среде, содержащей, по меньшей мере, один порфирин в конечной концентрации, по меньшей мере, около 0,5 мкг/мл. Более предпочтительные концентрации и/или диапазоны концентраций порфирина составляют, по меньшей мере, около 1 мкг/мл; предпочтительнее, по меньшей мере, около 5 мкг/мл или, по меньшей мере, около 10 мкг/мл.

Предпочтительно полученная предкультура инкубируется при температуре примерно от 4°C до 40°C, более предпочтительно - при температуре примерно от 18°C до 35°C, наиболее предпочтительно - при температуре около 30°C.

Время инкубации предкультуры может варьировать в зависимости от штамма и от других условий. Предпочтительно оно составляет, по меньшей мере, около 12 ч; более предпочтительно, по меньшей мере, около 16 ч.

Снабжение кислородом предкультуры может осуществляться перемешиванием или аэрацией.

Промежуточная стадия может проводиться также между предварительной стадией первичного культивирования с получением предкультуры и стадией (а) способа изобретения. Эта промежуточная стадия предусматривает концентрирование биомассы, полученной в конце стадии первичного культивирования, например, путем центрифугирования предкультуры с последующим извлечением бактериального осадка.

Следует заметить, что с учетом применения предмета настоящего изобретения в пищевой промышленности условия осуществления способа должны быть (i) пригодными для выполнения в промышленном масштабе (в рамках реализуемости, выхода продукции, производственных затрат, оборудования и др.) и (ii) применимыми к пищевым продуктам (в рамках физических и органолептических показателей готовых продуктов (вкус, запах, консистенция, внешний вид и др.)).

Второй аспект настоящего изобретения относится к обогащенной биомассе, полученной путем культивирования, по меньшей мере, одного штамма молочнокислых бактерий, продуцирующих витамин K2 в условиях покоящихся клеток, описанным выше способом.

В третьем аспекте настоящего изобретения вышеупомянутая биомасса используется для производства пищевого продукта, обогащенного витамином K2.

Четвертый аспект настоящего изобретения относится к способу продуцирования витамина K2, который включает, по меньшей мере:

(а) осуществление способа увеличения количества витамина K2, получаемого культивированием, по меньшей мере, одного штамма молочнокислых бактерий, продуцирующих витамин K2, в соответствии с предыдущим описанием и

(б) извлечение полученного таким способом витамина K2.

Согласно пятому аспекту настоящее изобретение относится к способам производства пищевого продукта, обогащенного витамином K2, или к способам обогащения пищевого продукта витамином K2.

В первом варианте воплощения один такой способ включает, по меньшей мере:

(а) продуцирование витамина K2 способом согласно четвертому аспекту изобретения;

(б) добавление продуцированного таким способом витамина K2 в указанный пищевой продукт или в его полуфабрикат и

(в) получение указанного пищевого продукта, обогащенного витамином K2.

Во втором варианте воплощения способ производства пищевого продукта, обогащенного витамином K2, включает, по меньшей мере:

(а) культивирование, по меньшей мере, одного штамма молочнокислых бактерий, продуцирующих витамин K2, в условиях покоящихся клеток согласно способу увеличения количества витамина K2, полученного из культуры указанного штамма (первый аспект изобретения);

(б) добавление биомассы, полученной из культуры стадии (а), в указанный пищевой продукт или в его полуфабрикат и

(в) получение указанного пищевого продукта, обогащенного витамином K2.

Альтернативно он может предусматривать одновременное проведение описанных выше стадий (а) и (б):

(а) культивирование, по меньшей мере, одного штамма молочнокислых бактерий, продуцирующих витамин K2, в условиях покоящихся клеток согласно способу увеличения количества витамина K2, полученного из культуры указанного штамма (первый аспект изобретения), в указанном пищевом продукте или в его промежуточной основе и

(б) получение указанного пищевого продукта, обогащенного витамином K2.

В этом случае штамм или штаммы могут использоваться исключительно в виде концентратов бактерий, первично культивированных на месте, т.е. по месту производства пищевых продуктов, или бактерий, первично культивированных поставщиком заквасок, а затем расфасованных и доставленных к месту или местам производства пищевых продуктов. Поставщики могут фасовать бактерии в жидком или замороженном состоянии; альтернативно бактерии могут подвергаться сушке или лиофилизации. Во всех случаях бактерии добавляются в молочную массу полностью традиционным способом (как любая другая известная закваска молочнокислых бактерий). На последующей стадии культивирования при условиях, благоприятных для продуцирования витамина K2, применяются режимы согласно способу изобретения.

Еще один вариант воплощения способа обогащения пищевого продукта витамином K2 включает, по меньшей мере:

(а) добавление биомассы, полученной согласно настоящему изобретению, в указанный пищевой продукт или в его промежуточную основу и

(б) получение указанного пищевого продукта, обогащенного витамином K2.

В типичных случаях биомасса используется таким же путем, что и традиционная закваска молочнокислых бактерий.

Шестой аспект настоящего изобретения касается пищевого продукта, обогащенного витамином K2, полученным вышеописанным способом.

Альтернативно пищевой продукт, обогащенный витамином K2 способом настоящего изобретения, содержит описанную выше биомассу.

Изобретение относится к пищевым продуктам, предназначенным для человека и/или животных, предпочтительно - к продуктам, предназначенным для потребления человеком. Преимущественно такой пищевой продукт, обогащенный витамином K2, повышает прочность костей у индивидуума, потребляющего этот продукт. Предпочтительно этим индивидуумом является ребенок.

Предпочтительно пищевой продукт в контексте изобретения выбирается из ферментированных продуктов, ферментированных или неферментированных свежих молочных продуктов, ферментированных или неферментированных продуктов, содержащих сок растительного происхождения (фрукты, овощи, зерновые, соя и др.), и их комбинаций. Более предпочтительно пищевой продукт в контексте изобретения является ферментированным продуктом и/или свежим молочным продуктом.

В контексте изобретения "свежие молочные продукты" обозначают, в частности, свежие и ферментированные молочные продукты, готовые для употребления человеком, т.е. свежую и ферментированную молочную пищу. Более конкретно, настоящая заявка относится к ферментированному молоку и йогурту. Указанные свежие и ферментированные молочные продукты, альтернативно, могут представлять собой сыр коттедж (домашний сыр) или "petits-suisses" (франц. продукт типа творожной массы).

"Ферментированное молоко" и "йогурт" - это стандартные названия, используемые в молочной промышленности, т.е. продукты, предназначенные для человека и получаемые подкислением молочного субстрата за счет молочнокислого брожения. Эти продукты могут содержать дополнительные ингредиенты, такие как фрукты, растения, сахар и др. Можно сослаться, например, на стандарт Франции № 88-1203 (от 30 декабря 1988 г.) на ферментированное молоко и йогурт, опубликованный в Официальном журнале Французской Республики (Official Journal of the French Republic) 31 декабря 1988 г.

Можно сослаться также на "Кодекс Алиментариус" (стандарты на продовольственные товары) (составленный комиссией Кодекс Алиментариус под эгидой ФАО и ВОЗ и опубликованный отделом информации ФАО и доступный на сайте http://www.codexalimentarius.net; более конкретно см. том 12 Кодекса Алиментариуса "Codex standards for milk and milk products" (Стандарты Кодекса на молоко и молочные продукты) и стандарт "CODEX STAN A-11 (а) - 1975").

Выражение "ферментированное молоко" обозначает в настоящей заявке молочные продукты, изготавливаемые на молочном субстрате, подвергнутом обработке, эквивалентной, по меньшей мере, пастеризации, и сквашенном микроорганизмами, относящимися к видам, характерным для того или иного продукта. "Ферментированное молоко" не подвергается обработке, имеющей целью удаление какого-то составного элемента используемого молочного субстрата, в частности, не подвергается операции по удалению сыворотки из сгустка. Коагуляция "ферментированного молока" не должна проводиться никаким иным способом, кроме как за счет активности используемых микроорганизмов.

Термин "йогурт" обозначает ферментированное молоко, получаемое в результате жизнедеятельности локально и повсеместно используемых специфических термофильных молочнокислых бактерий, таких как Lactobacillus bulgaricus (болгарская палочка) и Streptococcus thermophilus (термофильный стрептококк), причем концентрация живых микроорганизмов в готовом продукте должна составлять, по меньшей мере, 10 млн бактерий в 1 г молочной части продукта.

В некоторых странах пищевым законодательством разрешается добавлять и другие молочнокислые бактерии в йогурт и преимущественно дополнительно использовать штаммы Bifidobacterium, и/или Lactobacillus acidophilus, и/или Lactobacillus casei. Эти дополнительные молочнокислые штаммы предназначаются для придания готовому продукту различных свойств, например для поддержания баланса кишечной флоры или для модуляции иммунной системы.

На практике выражение "ферментированное молоко" в большинстве случаев употребляется для обозначения ферментированных молочных продуктов, отличающихся от йогурта. В зависимости от страны это может быть, например, "кефир", "кумыс", "ласси" (индийский кисломолочный напиток), "дахи" (индийский кисломолочный продукт типа творога), "лебен" (египетский кисломолочный напиток типа кефира), "Filmjôlk" (финский кисломолочный напиток, употребляемый с кашами), "Villi" (финский кисломолочный напиток типа простокваши) или "ацидофильное молоко".

В случае ферментированного молока количество свободной молочной кислоты, содержащееся в ферментированном молочном субстрате, должно быть не ниже 0,6 г/100 г в период продажи потребителю, а содержание белка, обеспечиваемое молочной частью продукта, должно быть не ниже, чем в обычном молоке.

И, наконец, название "сыр коттедж" или "petit-suisse" (продукт типа домашнего сыра) в настоящей заявке относится к сыру, который не подвергается ни рафинированию, ни посолке и который подвергается только ферментации молочнокислыми бактериями (и никакой другой ферментации, кроме молочнокислого брожения). Количество сухих веществ в сыре коттедж может снижаться до 15 г или 10 г/100 г продукта, в соответствии с чем содержание жира в нем может превышать 20 г или большей частью равняться 20 г/100 г сыра коттедж после полного обезвоживания. Содержание сухих веществ в сыре коттедж составляет от 13% до 20%. Количество сухих веществ в "petit-suisse" составляет не ниже 23 г/100 г продукта. В большинстве случаев содержание сухих веществ в "petit-suisse" составляет от 25% до 30%. Сыры коттедж и "petit-suisse" обычно называются "свежими сырами", т.е. сырами без созревания, используемые традиционным путем в области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Нижеследующие фигуры иллюстрируют настоящее изобретение, но ни в коей мере не ограничивают его цели или масштаб.

Фиг.1. Гистограмма, показывающая влияние концентрации молочного жира на продуцирование витамина K2 молочнокислыми бактериями. Штаммы 1 и 2: примеры природных штаммов Lactococcus lactis ssp. cremoris.

Фиг 2. Примеры кинетики процесса продуцирования витамина K2 в цельном молоке и кинетики процесса нарастания кислотности (вставка вверху слева) при использовании природного штамма молочнокислых бактерий (штамм no. 1).

Фиг.3. Гистограмма, показывающая продуцирование витамина K2 культурами покоящихся клеток при различных температурах. Контроль: культивирование при стандартных условиях роста.

Фиг.4. Гистограмма, показывающая влияние условий получения первичной культуры или предкультуры на продуцирование витамина K2 в зависимости от штамма.

Фиг.5. График, показывающий влияние начальной популяции бактерий природного варианта I-3558 на продуцирование витамина K2 в фазе покоя клеток, проводившееся с использованием обычного молока или молока с повышенной буферной способностью. "Без поддержания дыхания": получение предкультуры традиционным методом и последующее культивирование в условиях покоящихся клеток в цельном молоке. "Лабораторные условия поддержания дыхания": получение предкультуры в условиях дыхания, проводившееся в пробирке с питательной средой, и последующее культивирование в условиях покоящихся клеток в цельном молоке. "Лабораторные условия поддержания дыхания в молоке с повышенной буферной способностью": получение предкультуры в условиях дыхания и последующее культивирование в условиях покоящихся клеток в молоке с повышенной буферной способностью за счет добавления -глицерофосфата. "Поддержание дыхания бактерий в ферментере": получение предкультуры в условиях поддержания дыхания, проводившееся в ферментере, с последующим культивированием в условиях покоящихся клеток в традиционном молоке.

Фиг.6. Гистограмма, показывающая влияние жизнеспособности бактерий природного варианта I-3558 на продуцирование витамина K2 в фазе покоя клеток. VitK STZ: получение предкультуры в условиях поддержания дыхания с обработкой стрептозотоцином и последующее культивирование в условиях покоящихся клеток в цельном молоке с добавлением эритромицина. VitK R+: получение предкультуры в условиях поддержания дыхания, проводившееся в пробирке с питательной средой, и последующее культивирование в условиях покоящихся клеток в цельном молоке.

Само собой разумеется, что настоящее изобретение не ограничивается только вышеприведенным описанием. Другие варианты воплощения и преимущества изобретения станут очевидными из примеров, приведенных ниже в чисто иллюстративных целях.

Примеры

Часть А. Получение природных вариантов природных штаммов молочнокислых бактерий, способных продуцировать повышенные количества витамина K

В качестве предварительного замечания следует сказать, что методики получения природных вариантов, описанные ниже, применимы к любому виду исходного штамма молочнокислых бактерий. В зависимости от исходных штаммов, используемых квалифицированным в данной области техники специалистом, может быть желательным, в первую очередь из практических соображений, изменение некоторых из экспериментальных условий, разработанных авторами изобретения. В любом случае изменения, которые квалифицированный в данной области техники специалист сочтет необходимым внести в описанные ниже методики, будут, по всей вероятности, незначительными и потребуют только простых и рутинных операций, не включающих изобретательскую стадию.

A-I- Получение и применение природных вариантов, устойчивых к бацитрацину

Хотя известно, что подвергание воздействию таких агентов, как бацитрацин или пероксид, делает возможным отбор бактериальных штаммов с повышенной устойчивостью к этим агентам, но связь между устойчивостью к бацитрацину или пероксиду и уровнями продуцирования бактериями витамина K2 до настоящего времени не освещалась в литературе.

В ходе своей работы авторам изобретения совершенно неожиданным путем удалось открыть, что бактерии способны создавать оригинальный механизм устойчивости к некоторым агентам, таким как бацитрацин или пероксид, который включает увеличение продуцирования витамина K2. Авторы изобретения попытались применить свое открытие для получения природных вариантов штаммов молочнокислых бактерий (преимущественно Lactobacillus lactis), способных к сверхпродуцированию витамина K2, используя бацитрацин или пероксид, например, в качестве агента для отбора таких вариантов.

A-I-1 Методика получения вариантов, устойчивых к бацитрацину

Приготовление предкультуры проводилось из кристалла природного штамма Lactobacillus lactis в 2 мл традиционной готовой питательной среды M17 (M17 агар, Difco ) с добавлением 5 г/л лактозы (далее по тексту - M17 Lac) и гемина (20 мкл/мл; далее по тексту - M17 Lac+гемин). Инкубация проводилась в условиях перемешивания при 30°C.

Предкультура использовалась для инокуляции 2 мл среды (Ml7 Lac+гемин) с добавлением бацитрацина (4 мкг/мл). Норма инокуляции составила 1%. Затем культура инкубировалась в течение 48 ч в условиях перемешивания при 30°C.

На следующей стадии 100 мкл полученной суспензии наносились на агаровую среду М17 Lac. В центр чашки Петри помещался кружок бумаги, пропитанный 2,5 мг бацитрацина. Инкубация проводилась в течение 48 ч при 30°C. Клоны вблизи от кружка бумаги культивировались в присутствии бацитрацина (4 мкг/мл) в 2 мл среды (M17 Lac+гемин). Инкубация продолжалась в течение 24 ч в условиях перемешивания при 30°C.

Клетки выделялись на агар M17 Lac в присутствии бацитрацина (2 мкг/мл) после инкубации в течение 48 ч при 30°C. Выделенные клоны культивировались в (M17 Lac+ гемин), а затем инкубировались в течение 24 ч в условиях перемешивания при 30°C. Полученная суспензия использовалась для приготовления замороженной маточной закваски.

Эти эксперименты позволили авторам изобретения отобрать природный вариант Lactococcus lactis subsp.cremoris -I-3557, зарегистрированный в CNCM 20/01/2006.

A-I-2- Пример способа производства молочного продукта с использованием варианта, устойчивого к бацитрацину

Получение предкультуры проводилось из кристалла штамма в 2 мл Ml7 Lac.

Предкультура использовалась для инокуляции (в количестве 1%) 50 мл цельного молока УВТ (ультравысокотемпературной) обработки с последующей инкубацией при 30°C в течение 24 ч.

В табл.1 приводится результат анализа количества витамина K2, выраженного в мкг/эквивалентах МК-4/100 г продукта, продуцированного вариантом, устойчивым к бацитрацину, и соответствующим диким (некультивированным) штаммом.

Таблица 1
Штамм	I-3557	Дикий
Витамин K (в мкг/100 г)	8,90	3,32

Устойчивый к бацитрацину вариант показал способность к сверхпродуцированию витамина K на коэффициент 3 по сравнению с исходным диким штаммом.

A-II- Получение и применение природных вариантов, устойчивых к пероксиду

Дыхание Lactococcus lactis было продемонстрировано совсем недавно (Duwat et al., 2001). Секвенирование генома штамма L. lactis (IL1403) подтвердило наличие в нем генов, кодирующих функции, необходимые для аэробного дыхания (Bolotin et al., 2001). Бактерии L. lactis действительно содержат men и cytABCD опероны, кодирующие белки, необходимые для синтеза менахинона и биогенеза цитохрома D. Указанные виды бактерий содержат также три гена, участвующих в последних стадиях синтеза гема (hemH, hemK и hemN, которые требуются в окислении порфирина для соединения железа с гемом), но не имеют генов, участвующих в первых стадиях этого процесса. Однако бактерии L.lactis способны выполнять окислительное фосфорилирование в присутствии протопорфириногена.

Было показано также, что дыхание L.lactis может иметь место при наличии кислорода и гема в питательной среде. Дыхание благоприятствует образованию клетками большего количества биомассы и достижению более высокого конечного pH, чем это обычно наблюдается. Культуры в присутствии кислорода и/или гема показали сравнимые кривые роста в течение первых примерно 6 или 7 часов ферментации. После этого потребление глюкозы снижалось в случае культур с наличием кислорода и гема в питательной среде, в результате чего сокращалось и продуцирование лактата. Это отражает сдвиг в метаболизме, который происходит довольно поздно в процессе культивирования. Таким образом, дыхание L. lactis наблюдается к концу экспоненциальной фазы роста (Duwat et al, 2001).

Роль дыхания L.lactis еще не столь хорошо известна, как роль витамина K2 в этих видах бактерий со скорее ферментативным метаболизмом. Авторы изобретения наблюдали также, что витамин K2 продуцировался штаммами L.lactis и в то время, когда дыхание не индуцировалось в тестируемых условиях (при отсутствии гема в питательной среде и без перемешивания среды, способствующего ее хорошей оксигенации).

В белках цитоплазмы меньше дисульфидных мостиков, чем во внеклеточных белках. Существует широко распространенная ферментативная система, которая ограничивает количество дисульфидных мостиков. Функции S-S-связей сокращаются до функций HS ферментом тиоредоксином. Этот фермент регенерируется тиоредоксин-редуктазой. Vido et al. (2005) создали путем генной инженерии мутант L.lactis, который они назвали trxB1. Ген trxBl кодирует тиоредоксин-редуктазу. Изучение с применением электрофореза белков, синтезируемых этим мутантом, показало, что он сверхпродуцирует некоторые из ферментов, участвующие в синтезе витамина K2, а именно - MenB и MenD ферменты.

На основании этих данных, а также собственных наблюдений, авторы изобретения выдвинули предположение, что одним из возможных путей увеличения продуцирования витамина K2 бактериями L.lactis может стать индуцирование их дыхания. Другим путем может стать попытка мобилизации ответной реакции витамина K2 на окислительный стресс.

В связи с этим авторами изобретения была предпринята попытка выделить природные варианты, устойчивые к окислительному стрессу.

A-II-1- Методика получения вариантов, устойчивых к окислительному стрессу

В качестве примера пригодного для использования окисляющего агента был выбран пероксид. Само собой разумеется, что при подобных условиях можно использовать и другие окисляющие агенты, такие как гиперхлорированные ионы, ионы железа, менадион, паракват, кислород или любое другое подходящее окисляющее соединение.

После получения предкультуры на среде Ml7 Lac природные исходные штаммы повторно высевались уколом на эту же среду, но содержащую повышенные концентрации пероксида (например, по меньшей мере, примерно от 20 мг/л до, по меньшей мере, примерно 25 мг/л, примерно 27 мг/л и примерно 28,5 мг/л). Культуры инкубировались при 30°C. Спустя 24 ч не показавшие роста культуры бактерий в пробирках с питательной средой, содержащей пероксид в названной первой концентрации указанного диапазона, инкубировались в течение последующих 24 ч. Затем клоны клеток выделялись путем обеднения агаровой среды. Был отобран клон при концентрации пероксида 27 мг/л. Авторы изобретения отметили отсутствие роста при концентрации пероксида выше 28,5 мг/л.

Таким образом, эти эксперименты позволили авторам изобретения отобрать природный вариант Lactococcus lactis subsp.cremoris I-3558, зарегистрированный в CNCM 20/01/2006.

A-II-2- Пример способа производства молочного продукта с применением варианта, устойчивого к пероксиду

Отобранный клон выращивался в цельном молоке в течение 24 часов. Затем отбирались образцы и замораживались при -80°C для последующего анализа витамина K.

Табл. II (см. ниже) показывает количество витамина К2, продуцированное устойчивым к пероксиду вариантом, по сравнению с количеством витамина K2, продуцированным исходным штаммом (количества выражены в мкг-эквивалентах МК-4/100 г ферментированного молока).

Таблица II
Штамм	Витамин K (мкг/100 г)
Дикий	2,92±0,45
I-3558	5,94±0,76

Как показывает табл.II (выше), вариант продуцировал примерно в два раза больше витамина К2 по сравнению соответствующим диким штаммом.

А-III - Получение и применение природных вариантов, устойчивых к структурным аналогам ароматических аминокислот

Ароматические аминокислоты показывают отрицательную обратную связь на пути их собственного синтеза по отношению к уровню стадии, общей для процессов синтеза витамина K и фолатов. Если эти аминокислоты присутствуют в питательной среде, то указанные процессы не активизируются. Поэтому авторами изобретения была предпринята попытка устранить эту отрицательную регуляцию.

А-III-1- Методика получения вариантов, устойчивых к структурным аналогам ароматических аминокислот

Природный штамм L.Lactis высевался на агаровую среду определенного химического состава (Cocaign-Bousquet, М., et al., 1995), которая не содержала ни триптофана, ни фенилаланина или тирозина. Термин "определенного химического состава" абсолютно понятен квалифицированному в данной области техники специалисту. Это среда, содержащая только простые и строго определенные соединения (например, витамин B9, витамин B12, аденин, тирозин и др.), в отличие от полусинтетической среды, которая содержит комплексные соединения (например, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина и др.).

Кружок бумаги для блоттинга помещался в центр чашек Петри и пропитывался 80 мкл раствора, содержащего 50 мМ следующих соединений: m-фторофенилаланин, p-фторофенилаланин, m-фторотирозин и фенилаланинамид. Указанные соединения являются структурными аналогами ароматических аминокислот. Чашки инкубировались при 30°C. Вокруг бумажных кружков образовалась зона ингибирования роста. Спустя 48 часов в этой зоне появились устойчивые клоны. Эти клоны выращивались на питательной среде определенного химического состава, не содержащей ароматических аминокислот. В среду был добавлен раствор, содержащий структурные аналоги указанных аминокислот. Конечная концентрация каждого из этих соединений составила 1 мМ.

А-III-2 - Пример способа производства молочного продукта с устойчивыми к ароматическим аминокислотам клонами

Предкультуры, полученные, как описано в разделе A-III-1 (выше), использовались для инокуляции 50 мл среды Ml7 Lac (количество инокулята 1%) с добавлением 1 мл раствора гемина (500 мг/л). Эти же предкультуры использовались и для инокуляции среды, не содержащей гемина, но с перемешиванием. Был получен последний вид культуры. Среда M17 Lac инокулировалась и поддерживалась при 30°C без перемешивания. Культуры в течение ночи поддерживались при 30°C в условиях перемешивания (250 об/мин). Затем эти культуры центрифугировались в течение 5 мин при 6000g. Супернатант удалялся и заменялся 50 мл цельного молока. Спустя 24 часа ферментированное молоко помещалось при -80°C для последующего анализа витамина K2 (см. ниже раздел B-VI).

Эксперименты с анализом витамина K2 позволили авторам изобретения отобрать один из клонов в качестве природного варианта, способного сверхпродуцировать витамин K2 (см. ниже раздел B-VI): этот природный вариант Lactococcus lactis subsp.cremoris I-3626 был зарегистрирован в CNCM 19/06/2006.

Часть B. Подбор условий, благоприятствующих продуцированию витамина K молочнокислыми бактериями

B-I- Влияние жира, содержащегося в среде

В ходе анализов различных продуктов авторами изобретения было замечено, что наибольшее количество витамина K2 содержал такой продукт, как ферментированные сливки (русск. сметана). Более того, витамин K2 в этом продукте был сильно выраженным гидрофобным. Поэтому авторами изобретения была выдвинута гипотеза, что присутствие жира или, по меньшей мере, гидрофобного окружения может благоприятствовать продуцированию витамина K2.

В соответствии с этим ферментацию проводили на молоке, содержащем различные концентрации жира. Предкультуры для инокуляции получали на среде M17 Lac. Молоко инокулировалось 1% инокулята. Ферментация поддерживалась при 30°C в течение 24 часов. Затем образцы замораживались для последующего анализа.

На фиг.1 представлены результаты, полученные для двух природных штаммов L.lactis subsp.cremoris (штаммы no.1 и no.2).

Если результаты, полученные с одним из двух изучаемых природных штаммов, рассматривать как примеры, то использование полужирного молока (около 1,5% жира) вместо обезжиренного приводило к увеличению продуцирования витамина K2 на коэффициент 4. Переход с полужирного молока на цельное молоко (около 3,5% жира) приводил к увеличению продуцирования на коэффициент 2.

Эта тенденция отмечалась в случае всех изучаемых природных штаммов.

Однако увеличение количества витамина K2, продуцируемого в среде с таким содержанием жира, было, по-видимому, асимптотическим, поскольку ферментация сливок с содержанием жира 40% не давала столь высокого количества витамина K2, как ферментация цельного молока (данные не показаны).

B-II - Влияние скорости роста молочнокислых бактерий

В процессе роста в молоке природного штамма L.lactis subsp.cremoris (природный штамм no. 1) авторами изобретения проводилось регулирование кинетики продуцирования витамина K2.

Как показано на фиг.2, продуцирование витамина начиналось только тогда, когда рост замедлялся. Скорость роста можно определить путем регулирования кинетики нарастания кислотности. При достижении максимальной скорости нарастания кислотности бактерии вступали в фазу замедления роста.

Такой тип поведения является относительно стандартным в процессе синтеза вторичных метаболитов. Это дает возможность изучить различные параметры, снижающие скорость роста: субоптимальные физико-химические условия (pH, температура и др.), бактериостатические соединения (антибиотики), культивирование в условиях покоящихся клеток. Последнее предусматривает проведение инокуляции количеством клеток, соответствующим, по меньшей мере, их количеству, достигаемому обычно в конце традиционной ферментации. В этом случае бактериального роста не происходит, скорость роста нулевая.

Поэтому авторами изобретения была предпринята попытка комбинированного использования культуры покоящихся клеток и температурного воздействия.

Цельное молоко инокулировалось методом прямой инокуляции закваской, содержащей 10¹¹ КОЕ/г при концентрации 10 г/л. Затем молоко инкубировалось при различных температурах.

Как показано на фиг.3, понижение температуры не оказывало положительного влияния на продуцирование витамина K2. С другой стороны, культивирование бактерий в состоянии покоящихся клеток приумножало продуцирование на коэффициент, равный примерно 2:20 мкг/100 г против 10 мкг/г при стандартной ферментации с ростом.

B-III - Влияние получения предкультуры в условиях поддержания дыхания

Витамин K2 участвует в дыхательной цепи. Бактерии L.lactis способны к дыханию, но это дыхание наблюдается только в конце ферментации, т.е. когда метаболический поток замедляется. Это их свойство может быть сравнимо со способностью, наблюдавшейся в кинетике продуцирования витамина K2.

Важно отметить, что производство пищевого продукта при условии поддержания дыхания затруднительно реализовать, как представляется, в промышленном масштабе. Практически проблемы аэрации, перемешивания, ценообразования и др. довольно трудно решить без пересмотра традиционных оборудования и производственных процессов, а это потребует очень крупных инвестиций и дополнительных производственных затрат, что неприемлемо для пищевой промышленности.

С другой стороны, если такая необходимость возникнет, то получение предкультуры можно проводить в условиях поддержания дыхания, не создавая при этом слишком много трудностей для производственников.

В рамках этого авторами изобретения изучалось влияние получения предкультуры в условиях дыхания на продуцирование витамина K2 молочнокислыми бактериями.

С этой целью предкультуры приготавливались на среде M17 Lac с добавлением 20 мкл/мл 0,5 мг/мл раствора гемина в 0,1 М растворе соды. Инокуляция проводилась 1% предкультуры, температура инкубации составила 30°C. Аэрация обеспечивалась простым перемешиванием.

Сначала приготовленными предкультурами инокулировалось цельное молоко при количестве инокулята 1%, как это обычно принято при традиционной ферментации. Однако в этих условиях положительного влияния на продуцирование витамина K2 не наблюдалось (данные не показаны).

Поэтому решено было использовать предкультуры для осуществления ферментации в условиях покоящихся клеток. Предкультуры приготавливались, как описано выше, и инкубировались в течение ночи. Затем образцы по 50 мл центрифугировались при 6000g в течение 5 мин. Супернатант удалялся и заменялся цельным молоком. Молоко инкубировалось при 30°C в течение 24 часов. Образцы замораживались при -80°C для последующего анализа.

Как показано на фиг.4, наблюдавшееся поведение было различным в зависимости от штамма. Предкультура, приготовленная в условиях поддержания дыхания, не оказывала влияния на продуцирование витамина K2 природным штаммом no.1 L.lactis subsp.cremoris. С другой стороны, она увеличивала на коэффициент 2 количество витамина K2, продуцируемое природным вариантом I-3558.

Таким образом, подход с использованием предкультуры, полученной в условиях поддержания дыхания, является предпочтительным, но, по всей видимости, в случае некоторых штаммов, по меньшей мере.

Однако на практике важно иметь в наличии не свежеприготовленные предкультуры, а замороженные закваски. Более того, для проведения ферментации в условиях покоящихся клеток рекомендуется иметь концентрированные закваски.

B-IV - Дополнительные результаты в отношении стимулирующего эффекта дыхания на продуцирование витамина K2

Эти результаты следует соотнести с результатами, изложенными в разделе A-III (см. выше).

Как указано выше в параграфе A-III-2, культура отобранного природного варианта I-3626, содержащая структурные аналоги ароматических аминокислот, использовалась для инокуляции 50 мл питательной среды М17 Lac (количество инокулята 1%) с добавлением 1 мл раствора гемина (500 мг/л). Эта же культура использовалась и для инокуляции питательной среды, не содержащей гемина, но поддерживаемой в условиях перемешивания. Был получен последний вид культуры. Среда М17 Lac инокулировалась и поддерживалась при 30°C без перемешивания. Культуры содержались в течение ночи при 30°C в условиях перемешивания (250 об/мин). Затем эти культуры центрифугировались в течение 5 минут при 6000g. Супернатант удалялся и заменялся 50 мл цельного молока. Спустя 24 часа ферментированное молоко помещалось при -80°C для последующего анализа витамина K2.

Табл.III (см. ниже) показывает результаты продуцирования витамина К2 природным вариантом I-3626 в описанных условиях. Количество витамина K2 выражено в мкг-эквивалентах МК-4/100 г ферментированного молока.

Таблица III
Способ получения предкультуры	Без перемешивания, без гемина	С перемешиванием, с гемином
Витамин K2	0,77	25,77

Эти результаты показывают, что дыхание (присутствие гемина в условиях перемешивания) оказывает очень большое влияние на продуцирование витамина K2. При этих условиях продуцирование витамина увеличилось на коэффициент 5. Исходный штамм продуцировал 21,5 мкг/100 г после предварительного выращивания предкультуры без поддержания дыхания (данные не показаны). Когда же приготовление предкультуры проводилось в условиях поддержания дыхания, то продуцирование витамина падало до 10,3 мкг/100 г (данные не показаны). Таким образом, в случае исходного штамма получение предкультуры в условиях поддержания дыхания оказывало отрицательное влияние на продуцирование витамина K2.

B-V - Влияние дозы инокуляции, конечной популяции бактерий и pH молока

В условиях покоящихся клеток, описанных выше применительно к получению предкультуры при поддержании дыхания, начальная популяция бактерий возрастала примерно до 10¹⁰ КОЕ/мл.

Поскольку указанная доза инокуляции едва ли применима в рамках промышленного способа, авторами изобретения изучалось точное влияние начального количества клеток на продуцирование витамина K2 в процессе фазы ферментации молока.

В дополнение к этому, поскольку количество клеток в предкультуре, полученной в условиях поддержания дыхания, превышало их количество в предкультуре, полученной традиционным методом, авторы изобретения попытались выяснить, вызвано ли увеличение продуцирования витамина, наблюдавшееся при использовании предкультур, полученных в условиях поддержания дыхания, простым увеличением дозы инокуляции или конкретным влиянием процесса дыхания.

Авторы изобретения попытались также определить, играет ли конечная популяция бактерий после фазы покоя клеток определяющую роль в количестве продуцируемого витамина K2. Зная, что определенное число бактерий погибает из-за снижения pH в ходе ферментации, наряду с другими причинами, авторы изобретения изучали влияние использования молока с повышенной буферной способностью на уровень продуцирования витамина K2.

Чтобы найти ответы на эти разные вопросы, ими были проведены тесты в условиях покоящихся клеток в традиционном молоке или молоке с повышенной буферной способностью с использованием в качестве инокулята предкультур, полученных традиционным методом или в условиях поддержания дыхания, при дозах инокуляции примерно от 10⁶ КОЕ/мл до 10 ¹⁰ КОЕ/мл.

Приготовление предкультур штамма I-3558 проводилось на среде Ml7 Lac при 30°C. В экспериментах с поддержанием дыхания указанная среда дополнялась 20 мкл/мл 0,5 мг/мл раствора гемина (в 0,1 М растворе соды), а полученные предкультуры перемешивались в процессе инкубации, продолжавшейся всю ночь. Затем различные объемы этих предкультур (см. ниже табл.IV) центрифугировались при 10000g в течение 10 минут.

Таблица IV
Инокуляция	Объем предкультуры (R+)	Объем предкультуры (R-)
100%	40 мл	160 мл
75%	30 мл	120 мл
50%	20 мл	80 мл
30%	12 мл	48 мл
20%	8 мл	32 мл
10%	4 мл	16 мл
5%	2 мл	8 мл
1%	0,4 мл	1,6 мл
0,01%	0,04 мл	0,16 мл

Супернатант удалялся и либо заменялся 40 мл традиционного цельного молока (в случае предкультур R+ и R-), либо -глицерофосфатом в конечной концентрации 0,075 М (только в случае предкультуры R+). Затем образцы инкубировались при 30°C в течение 24 часов. Отбирались аликвоты для определения количества, после чего образцы замораживались при -80°C для последующего анализа. Результаты анализов и определения количества витамина до и после фазы покоя клеток представлены в табл.V (см. ниже). Эта таблица показывает результаты анализа витамина K2 и определения его количества до (T0) и после фазы покоя клеток (Tf) при использовании традиционных предкультур и предкультур, полученных в условиях поддержания дыхания.

Таблица V
Доза	T0 R-	Tf R-	VitK R-	T0 R+	Tf R+	VitK R+	T0 R+TP	Tf R+TP	VitK R+TP
100%	1.08Е+10	9.70Е+09	44.47	3.40Е+09	2.65Е+09		3.40E+09	5.30E+09	35,9
75%	8.10Е+09	4.30Е+09	29.01	2.55Е+09	2.40Е+09		2.55E+09	5.80E+09
50%	5.40Е+09	4.15Е+09	18.58	1.70Е+09	1.64Е+09	19.82	1.70E+09	6.40E+09	26.7
30%	3.24Е+09	4.25Е+09	13.72	1.02Е+09	1.20Е+09	16.75	1.02E+09	7.70E+09
20%	2.16Е+09	2.10Е+09	9.13	6.80Е+08	1.60Е+09	14.09	6.80E+08	6.40E+09	18.55
10%	1.08Е+09	2.10Е+09		3.40Е+08	1.17Е+09		3.40E+08	4.60E+09
5%	5.40Е+08	1.10E+09	6.4	1.70Е+08	1.29Е+09	9.41	1.70E+08	3.60E+09	13.666
1%	1.08Е+08	2.15E+09	6.88	3.40Е+07	1.25Е+09	6.35	3.40E+07-	4.20E+09
0,1%	1.08Е+07	1.50E+09	6.26	3.40Е+06	2.7Е+09	6.19	3.40E+06-	4.80E+09
R- = предкультура, полученная традиционным методом;
R+ = предкультура, полученная в условиях поддержания дыхания;
TP = ферментация в молоке с повышенной буферной способностью за счет -глицерофосфата;
Т0 = начальная популяция бактерий в КОЕ/мл культуры;
Tf = конечная популяция бактерий в КОЕ/мл культуры;
VitK = концентрация витамина K2 в мкг-эквивалентах МК-4/100 г продукта.

Полученные результаты представлены на фиг.5. Также в целях иллюстрации представлены и результаты, полученные в случае приготовления предкультуры в условиях поддержания дыхания, проводившегося в ферментере, с последующей фазой покоя клеток в традиционном молоке (кривая "дыхания в ферментере"). Результаты сравнимы с результатами, полученными при приготовлении предкультур в пробирках с питательной средой (кривая "дыхания в лабораторных условиях").

Полученные результаты (табл.V и фиг.5) указывают на то, что:

- содержание витамина K2 зависело от дозы инокуляции;

- наклон кривой в случае предкультуры, полученной в условиях поддержания дыхания, был больше, чем в случае предкультуры, полученной традиционным методом. Так, для данной популяции бактерий продуцирование витамина K2 было выше в случае приготовления предкультуры в условиях поддержания дыхания. Поэтому польза от поддержания дыхания обусловлена, как представляется, скорее конкретным влиянием процесса дыхания, чем простым увеличением дозы инокуляции, что подтверждает преимущество такого подхода;

- продуцирование витамина K2 было выше в том случае, когда фаза покоя клеток проводилась в молоке с повышенной буферной способностью. Это можно объяснить либо лучшей выживаемостью бактерий в этой среде, поскольку при одинаковой начальной популяции конечная популяция бактерий была от 2 до 6 раз выше в молоке с повышенной буферной способностью, чем в традиционном молоке (см. табл.V), либо лучшей "экстракцией" витамина K2 в молоке с повышенной буферной способностью.

Список литературы

- Bolotin et al., 2001. Genome Research 11, 731-753.

- Duwat et al., 2001. J. Bacteriol. 183 (15), 4509-16.

- Morishita et al., 1999. J. Dairy Sci. 82, 1897-1903.

- Parker et al., 2003. Journal of Food Science 68 (7), 2325-2330.

- Vido et al, 2005. J. Bact. 187. 601-10.

- Hart JP, et al., [letter]. Lancet. 1984; 2:283.

- Hart JP, et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 1985; 60:1268-9.

- Hauschka PV, et al., Physiol. Rev. 1989; 69: 990-1047.

- Ducy P, et al., Nature. 1996; 382:448-52.

- Väänänen HK, et al., Calcif. Tissue Int. 1999; 64: S79.

- Ronden JE, et al., Biochim. Biophys. Acta. 1998; 1379: 16-22.

- Knapen MH, et al., Ann. Intern. Med. 1989 Dec 15; 111 (12):1001-5.

- Szulc P, et al., J. Clin. Invest. 1993 Apr; 91 (4):1769-74.

- Booth SL, et al. Am. J. Clin. Nutr. 2000; 71: 1201-8.

- Shiraki M, et al., J. Bone Miner. Res. 2000; 15: 515-21.

- Braam LAJLM, et al., Calcif. Tissue Int. 2003 Jul; 73 (1):21-6.

- Hirano J. and Ishii Y. J. Orthop.Sci. 2002; 7:364-369.

- Cocaign-Bousquet M., et al. Journal of Applied Bacteriology 1995; 79, 108-116.