способ окраски ядрышковых организаторов на гистологических препаратах и цитологических мазках

Формула изобретения

Способ окраски ядрышковых организаторов на гистологических препаратах и цитологических мазках, заключающийся в том, что готовят парафиновые срезы, фиксируют, наносят коллоидный проявитель, полученный смешиванием в равном количестве желатина 2%-ного в водном растворе на 1% муравьиной кислоты и 50%-ном водном растворе AgNO₃, инкубируют в течение 30-60 мин, промывают и контрастируют, отличающийся тем, что фиксацию материала осуществляют в 10%-ном растворе нейтрального формалина забуференном по Лили (рН 7,4) в течение 24 ч, проводку материала осуществляют в спиртах возрастающей концентрации, заливают в парафин и готовят срезы, которые обрабатывают в 2 н. растворе муравьиной кислоты на 96° этиловом спирте в течение 20 мин, дегидратацию осуществляют в двух порциях 96° этилового спирта, обрабатывают срезы в 0,1 н. NaOH в течение 2 мин 30 с, просушивают, наслаивают на препарат одну каплю 100%-ного раствора AgNO₃, затем инкубируют в термостате при 60°С в течение 1 мин 40 с во влажной камере, наносят 1 каплю 40%-ного раствора формальдегида и коллоидный проявитель, инкубируют в течение 20-50 с в термостате при той же температуре, промывают срезы в 4 порциях дистиллированной воды, обрабатывают срезы ацетатным буфером рН 2,4 в течение 1 мин, контрастируют препараты 0,2%-ным водным раствором метилового зеленого в течение 10-15 с, очищают хлороформом, дифференцируют 2-3 мин в n-бутиловом спирте, обрабатывают толуолом и заключают в полистирол.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, цитогенетике, а также может быть использовано в различных областях биологии, эмбриологии, цитологии и гистологии.

В настоящее время является актуальной проблема дифференциальной диагностики предраковых заболеваний и опухолевого роста, а также прогнозирования течения злокачественных новообразований. Одним из способов, позволяющим решить эту проблему, является способ окраски ядрышковых организаторов.

Известны следующие аналоги способа окраски ядрышковых организаторов.

Способ окрашивания по Goodpasture С., Bloom S.E. (Goodpasture С., Bloom S.E. // Chromosoma. - 1975. - Vol.53. - Р.37-50): 800 мг нитрата серебра (AgNO₃) растворяют в 2 мл ацетатного буфера Уолпола (0,1 М CH₃COONa и 0,1 М СН₃ СООН в соотношении 2:18) при рН 3,7 и титруют 25% раствором аммиака до исчезновения помутнения. Непосредственно перед окрашиванием препаратов смешивают три капли приготовленного раствора AgNOR ₃ с одной каплей 3% раствора нейтрально формалина (рН 7,0). Одну-две капли смеси наносят на препарат, покрывают покровным стеклом и выдерживают в течение 5-45 мин при +55 - +65°С. Время инкубации препаратов подбирают эмпирически; качество окраски контролируют под микроскопом.

Способ окрашивания основанного на связывании ионов висмута:

1. Готовят обычным способом парафиновые срезы толщиной 3 мкм из фиксированной нейтральным формалином ткани, депарафинируют их и регидрируют в чистой воде.

2. Промывают срезы в 0,2 М трис - HCl, рН 7,6.

3. Окрашивают в растворе висмута в течение 2,5 ч и более.

4. Промывают три раза по 10 мин 0,1 М трис - HCl, рН 7,6.

5. В вытяжном шкафу промывают срезы 0,1 М трис - HCl, рН 7,6, к которому добавлено несколько капель сульфида аммония.

6. Промывают срезы в чистой воде, дегидрируют и порывают под полистирол. Ядрышковые организаторы выглядят как черно-коричневые точки.

Недостатками известных способов являются:

1. Сложность приготовления растворов.

2. Длительность окраски.

3. Закрашивание хроматина ядра, что ухудшает подсчет ядрышковых организаторов.

4. Выпадение осадков металлического серебра.

5. Отклеивание срезов от стекла во время окраски.

6. Применение дорогостоящих и дефицитных реактивов.

7. Применение токсичного сульфида аммония.

Наиболее близким по достигаемому техническому результату является способ окрашивания ядрышковых организаторов по Howell W.M., Black D.A. (Howell W.M., Black D.A. // Experientia. - 1980 - Vol.36. - P.1014-1015).

Способ заключается в следующем.

1. Обычным способом готовят парафиновые срезы толщиной 3 мкм, замороженные срезы толщиной 4 мкм или цитологические мазки. Препараты фиксируют в 100% этаноле или 100% метаноле при комнатной температуре в течение 10 минут.

2. Смешивают в равных количествах следующие реактивы:

Желатина 2% в водном растворе муравьиной кислоты 1% и 50% водный раствор AgNO₃.

3. Заливают полученной смесью срезы и инкубируют их в течение 30-60 минут в защищенном от света месте при комнатной температуре. Тщательно промывают препараты в дважды дистиллированной и деионизированной воде.

4. При необходимости проводят контрастирование в стандартном растворе гемалауна Майера в течение 2-5 мин.

5. Дегидратируют срезы в батарее спиртов (например, в 50, 70 и 100% этаноле), просветляют в ксилоле и монтируют с использованием синтетической среды.

Недостатками известного способа являются:

1. Сложность получения деионизированной воды.

2. 3акрашивание хроматина ядра.

3. Не всегда стабильные результаты окраски.

4. Выпадение осадков металлического серебра.

Авторы предлагают способ окраски ядрышковых организаторов на гистологических срезах и цитологических мазках, позволяющий с высоким качеством оценивать активность ядрышковых организаторов, что позволяет улучшить дифференциальную диагностику и прогнозирование течения злокачественных новообразований.

Техническим результатом заявленного способа является повышение информативности выявления ядрышковых организаторов.

На фигуре 1 представлены результаты окраски ядрышковых организаторов при раке толстой кишки (от 10 до 18 четных точек в ядрах клеток). Гистологический препарат. Увеличение микроскопа ×1000.

На фигуре 2 представлены результаты окраски ядрышковых организаторов при раке желудка. Большое количество четких черных точек в ядрах клеток. Цитологический препарат. Увеличение микроскопа ×1000.

Предлагаемый способ имеет общие с прототипом признаки, а именно: готовят парафиновые срезы, фиксируют, наносят коллоидный проявитель, полученный путем смешивания в равном количестве 2% водного раствора желатина на 1% муравьиной кислоты и 50% водном растворе AgNO₃ и инкубируют в течение 30-60 минут, промывают в дистиллированной воде, контрастируют.

Отличие заявленного метода от прототипа состоит в том, что фиксацию материала осуществляют в 10% растворе нейтрального формалина, забуференного по Лилли (рН 7,4), в течение 24 часов, проводку материала осуществляют в спиртах возрастающей концентрации, заливают в парафин и готовят срезы, обрабатывают при 4°С в жидкости Карнуа (1 часть ледяной уксусной кислоты и 3 части 96° этилового спирта), затем обрабатывают срезы в 2 н. растворе муравьиной кислоты на 96° этиловом спирте в течение 20 минут, промывают срезы в двух порциях 96° этилового спирта, обрабатывают срезы в 0,1 н. NaOH, приготовленном на 500° этиловом спирте в течение 2 мин 30 с, просушивают срезы на воздухе, наслаивают на препарат одну каплю 100% раствора AgNO₃ и инкубируют в термостате, при 60°С в течение 1 мин 40 с во влажной камере (чашка Петри со смоченным фильтром), затем наносят 1 каплю 40% раствора формальдегида и 1 каплю коллоидного проявителя, инкубируют в течение 20-50 с в термостате при той же температуре, прополаскивают срезы в 4 порциях дистиллированной воды, потом обрабатывают срезы в ацетатном буфере (рН 2,4) в течение 1 минуты, контрастируют препараты 0,2% водным раствором метилового зеленого в течение 10-15 секунд, дифференцируют 2-3 минуты в n-бутиловом спирте, просветляют толуолом и заключают в полистирол.

Результат: на фоне окрашенной в зеленоватый цвет кариоплазмы определяются светло-коричневые ядрышки, в которых четко видны гранулы черного цвета.

Окрашивание цитологических препаратов проводится аналогичным образом.

Таким образом, преимуществами представленного способа по сравнению с существующими вариантами метода выявления ядрышковых организаторов являются: отсутствие дорогостоящих реактивов, быстрота окрашивания, стабильность и четкость выявления гранул серебра в ядрышках, отсутствие выпадения осадков металлического серебра, уменьшение закрашивания хроматина ядра, кроме этого даже толстые гистологические срезы не отклеиваются от предметного стекла во время окрашивания. При применении данного метода окрашивания на цитологических мазках не происходит смывания материала, в том числе и тканей, богатых слизью (желудок, эндометрий, шейка матки и др.) за счет того, что раствор муравьиной кислоты приготовлен на этиловом спирте, который является фиксатором для слизи. Заявленная методика эффективна и технически легко выполнима в любой морфологической лаборатории и патологоанатомическом отделении.