рентгеноконтрастное средство

Формула изобретения

Рентгеноконтрастное средство, характеризующееся тем, что оно представляет собой масляное контрастное вещество с вязкостью 15-30 сПз, получаемое из олеиновой кислоты путем ее этерификации и последующего йодирования с выделением целевого продукта, содержащего в своем составе не менее 65% этиловые эфиры йод - и дийодоктадекановых кислот, из оставшихся 35% не более 18% - этиловые эфиры олеиновой, линолевой, лауриновой, миристиновой и пальмитиновой кислот и не более 17% - неидентифицированные примеси.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к новым лекарственным препаратам, а именно к средствам контрастирования внутренних органов, и может найти применение в лучевой диагностике при ангиографии, компьютерной томографии и лимфографии для диагностики и лечения опухолей паренхиматозных органов.

Возможности лучевой диагностики увеличиваются при использовании рентгеноконтрастных средств (РКС), но при этом необходимо, чтобы такие препараты обладали способностью поглощать рентгеновские лучи, были бы фармакологически инертны, химически стабильны и органоспецифичны, а также они должны иметь низкую вязкость и токсичность, минимальную осмотическую активность и быстро выводиться из организма. Всем этим требованиям в наибольшей степени удовлетворяют йодированные масляные РКС, поскольку они

- не являются солями и не диссоциируют на ионы в водной среде,

- обладают продолжительным действием,

- легко ассимилируются организмом,

- за счет прочного связывания йода в молекуле РКС не вызывают отравления организма свободным йодом,

- характеризуются низкой всасываемостью стенками сосудов, что снижает их токсическое действие на организм.

В последние годы методы исследования с использованием масляных рентгеноконтрастных веществ нашли широкое применение в экспериментальной и клинической медицине. Традиционными областями их применения стали лимфография, сиалография, рентгеноэндоваскулярная окклюзия и химиоэмболизация злокачественных новообразований различных локализаций и пр.

Однако количество пригодных для этих целей масляных РКС в настоящее время недостаточно. Необходимо создание новых йодсодержащих рентгеноконтрастных препаратов, обладающих хорошим качеством визуализации, низкой токсичностью и вязкостью для снижения вероятности потенциальных осложнений, которые могут возникать при их использовании.

Йодированные масла известны с 1896 года, когда было получено йоднокунжутное масло, названное йодипином. В 1901 г. было изготовлено йодированное маковое масло, получившее название липиодол. Известно около 20 аналогичных препаратов, полученных йодированием растительных масел: рафинированного подсолнечного масла (йодолипол), сурепкового (кампиодол), вышеназванных кунжутного (йодипин), макового (липиодол) и многих других.

С 1961 г. началось широкое использование масляных РКС для прямой клинической лимфографии, при этом преимущественное применение получил липиодол [C.Maiorovici et al., Pharmazie, 1956, v.4, N2, p.126-130]. Его получают из макового масла, представляющего собой смесь стеариновой, пальмитиновой, олеиновой и линолевой кислот. Масло подвергают йодированию, после чего длительно и тщательно очищают. В клинической практике широкое применение нашел сверхжидкий липиодол (липиодол-флюид), рентгеноконтрастность которого (денситометрическая плотность по шкале Хаунсфилда) равна 2984. Вязкость липиодола составляет 34-70 сПз, уд.вес. - 1.268-1.290 г/мл, содержание йода - 37-39%. [Сертификат соответствия № РОСС FR 02.А 36863 (сертифицировано в Госстандарте России Липиодол Ультра-Флюид)]. Препарат широко применяется для контрастирования внутренних органов, лимфатического русла и лимфатических узлов.

Однако использование липиодола ввиду его высокой вязкости может приводить к жировым эмболиям, а также к уменьшению капиллярного объема легочных артерий - опасного сопутствующего явления. Кроме того, достаточно высокая вязкость препарата приводит к длительной по времени инъекции и требует электрических инжекторов для его введения. Препарат также не дает четких изображений некоторых групп лимфатических узлов. Серьезным недостатком липиодола является сложный состав и высокое содержание в нем неидентифицируемых примесей.

Наиболее близким к предлагаемому является рентгеноконтрастное средство [Патент РФ № 2336904 от 27.10.2008 г. на «Рентгеноконтрастное средство], содержащее в своем составе в качестве действующего вещества этиловый эфир дийодлинолевой кислоты, а в качестве стабилизатора - этиловый эфир линолевой кислоты при следующем соотношении компонентов, мас.%:

этиловый эфир дийодлинолевой кислоты	95%
этиловый эфир линолевой кислоты	5%

Этот препарат имеет более низкую вязкость (15-30 сПз) по сравнению с липиодолом. Это обеспечивает большую текучесть препарата по катетеру и сосудам паренхиматозных органов. Препарат обладает высокой рентгеноконтрастностью, умеренным аллергизирующим действием, в диагностических дозах не приводит к иммунотоксическому действию.

Исходным сырьем для получения этого препарата служила линолевая кислота, которую этерифицируют этиловым спиртом в присутствии концентрированной серной кислоты. Полученный этиловый эфир, находящийся в верхнем слое смеси, отделяют и промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции, после чего сушат прокаленным сульфатом натрия. Полученное масло подвергают вакуумной разгонке - фракция с температурой кипения 160-170°C представляет собой чистый этиловый эфир линолевой кислоты. Эфир затем иодируют в петролейном эфире водным 57% раствором йодистоводородной кислоты в присутствии фосфорного ангидрида. При взаимодействии фосфорного ангидрида с водой выделяется много тепла, требующего большого количества хладагента, что усложняет и удлиняет процесс. Полученную реакционную массу выдерживают до расслоения: верхний слой содержит эфир дийодлинолевой кислоты, который после отгонки петролейного эфира промывают и сушат. В полученный продукт добавляют 5% исходного этилового эфира линолевой кислоты, в результате получают искомое РКС. Препарат обладает высокой рентгеноконтрастностью, достаточно низкой вязкостью и пригоден для внутрисосудистого введения. Однако процесс получения его трудоемок, энергоемок, но, главное, препарат содержит большое количество (более 50%) неидентифицируемых примесей. На момент создания этого препарата хроматографический анализ его не проводился и высокое содержание в нем неидентифицируемых примесей обнаружено нами после регистрации его хроматограммы для необходимости сопоставления ее с таковыми вновь создаваемых РКС.

На рис.1 представлена хроматограмма РКС прототипа и из таблицы с результатами расчета площадей регистрируемых пиков видно, что сумма неидентифицируемых примесей равна более 50% (см. пики 5.87, 6.11, 6.29, 6.48, 8.09, 8.31, 8.66, 10.65, 10.96 и 11.43, которым соответствуют площади 1.4, 1.39, 1.03, 0.58, 2.36, 1.29, 17.35, 2.80, 2.99 и 23.50, сумма которых составляет 54.69%) и лишь около 45% приходится на идентифицируемые, которые приведены под хроматограммой (см. пики 4.89, 5.43, 7.21, 7.42, 9.15, 9.47, 10.07, которым соответствуют площади 0.13, 0.48, 1.45, 2.75, 19.92, 13.73, 5.96. Сумма этих площадей составляет 44.42%).

Техническая задача настоящего изобретения состояла в получении РКС, представляющего собой легкоидентифицируемое соединение с высокой рентгеноконтрастностью, низкой вязкостью и минимальным содержанием неидентифицируемых примесей за счет использования в качестве исходного сырья для его получения олеиновой кислоты.

Анализ зарубежной литературы свидетельствует об интенсивных исследованиях в области создания более совершенных масляных рентгеноконтрастных препаратов. В нашей стране производство РКС отсутствует и в клинической практике используются только импортные средства. В связи с этим создание отечественных РКС чрезвычайно актуально и явилось задачей настоящего изобретения.

Эта задача решена получением масляного РКС, которое характеризуется тем, что оно представляет собой масляное контрастное вещество с вязкостью 15-30 сПз, получаемое из олеиновой кислоты путем ее этерификации и последующего йодирования с выделением целевого продукта, содержащего не менее 65% этиловых эфиров йод- и дийодоктадекановых кислот, из оставшихся 35% не более 18% - этиловые эфиры олеиновой, линолевой, лауриновой, миристиновой и пальмитиновой кислот и не более 17% - неидентифицированные примеси.

На рис.2 представлена хроматограмма одной из серии получаемого РКС. В соответствии с результатами расчета площадей пиков йодированные эфиры составляют не менее 65% (см. пики 9.44 и 10.73, которым соответствуют площади 27.92 и 37.57, т.е. 66%). Другие идентифицированные продукты представляют собой этиловые эфиры олеиновой, линолевой, лауриновой, миристиновой и пальмитиновой кислот и незначительные количества олеиновой и линолевой кислот (см. приведенные на хроматограмме пики 4.97, 6.62, 6.85, 15.17, 4.05, 5.33, 5.73, 10.08, 7.27, 10.33) и составляют не более 18%. Неидентифицируемые примеси (пики от 7.57 до 9.08) составляют не более 17% (см. пики 7.57, 7.70, 7.82, 7.97, 8.18, 8.37, 8.57, 8.85, 9.08 и соответствующие им площади 3.7, 3.10, 2.37, 3.45, 0.79, 0.19, 1.48, 0.92, 0.32, сумма которых равна 16.32%).

Содержащиеся в предлагаемом РКС неидентифицируемые примеси, количество которых невелико (не более 17%, в то время как в прототипе их более 50%), не оказывают значительного влияния на вязкость препарата в целом, которая равна 15-30 сПз, т.е. сопоставима с вязкостью прототипа и значительно меньше по сравнению с липиодолом. Это делает данное РКС пригодным для безопасного внутрисосудистого введения - в артерии паренхиматозных органов.

Получают заявляемое РКС следующим образом.

Исходным сырьем является олеиновая кислота extra pure (по ЕС- № 204-007-1, Чехия) - доступный недорогой продукт (стоимость 1 кг линолевой кислоты составляет 10221 руб., олеиновой - 2200 руб.). Она содержит в своем составе С18 (олеиновая кислота) - не менее 60%, С18 (линолевая кислота) - не более 25%, С12 (лауриновая кислота) - не более 2%, С14 (миристиновая кислота) - не более 2-5%, С16 (пальмитиновая кислота) - не более 9-15%. Торговую олеиновую кислоту предварительно очищают от предельных кислот с С12, С14, С16 вымораживанием при температуре 0-5°C, снижая их количество примерно до 10%. Очищенную таким образом олеиновую кислоту этерифицируют этиловым спиртом в присутствии концентрированной серной кислоты при температуре 80°C при перемешивании в течение 2-3 часов. Реакционную смесь выдерживают до разделения на 2 слоя: верхний слой - смесь этиловых эфиров со спиртом - отделяют, промывают от серной кислоты до нейтральной реакции и подвергают вакуумной (при остаточном давлении 2-3 мм рт.ст.) разгонке - фракция при 190-205°C представляет собой смесь этиловых эфиров олеиновой и линолевой кислот. Полученные этиловые эфиры йодируют газообразным йодистым водородом - предварительно вся технологическая система продувается аргоном до вытеснения воздуха. Газообразный йодистый водород получают реакцией йода с красным фосфором - для этого суспензию красного фосфора в воде по каплям добавляют к водной суспензии порошкообразного йода. Получающийся газообразный йодистый водород током аргона подается барботажем через слой этиловых эфиров олеиновой и линолевой кислот. Реакцию проводят при температуре 4-10°C в течение 2 часов и контролируют по привесу навески, которая должна соответствовать расчетному количеству присоединенного йодистого водорода по непредельным связям этиловых эфиров олеиновой и линолевой кислот. Полученные йодированные этиловые эфиры промывают до нейтральной реакции, обрабатывают насыщенным водным раствором тиосульфата и сушат центрифугированием.

Для получения лекарственной формы из этого препарата (субстанции), который и составил предмет настоящего изобретения и получил торговое название ЛИНОЙОДОЛ, к нему добавляют этиловый эфир олеиновой кислоты из расчета 5 мас.ч. эфира на 100 мас.ч. линойодола.

Состав РКС контролируется хроматографически. Оно имеет следующие свойства (в соответствии с требованиями проекта ФСП предприятия): количество связанного йода - 0.3-0.45 г/мл, плотность - 1.2-1.3 г/см ³ (при 20°C), динамическая вязкость - 15-30 сПз (при 20°C), денситометрическая плотность - 2100-3100, неидентифицированные примеси - не более 17%, свободный йод и йодиды отсутствуют.

Приводим результаты доклинического изучения заявляемого РКС.

Объем проводимых испытаний определялся «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (МЗ РФ, М., 2000, 398 с.) и «Правилами доклинической оценки безопасности фармакологических средств (Good Laboratory Practice - GLP)» Дозы препарата в мг/кг брались из расчета на этиловые эфиры йод - и дийодоктадекановых кислот. В качестве препарата сравнения использовался широко применяемый в клинической практике липиодол-флюид.

Изучение безопасности препарата

1. Острая токсичность

Острую токсичность лекарственной формы препарата изучали на половозрелых белых мышах и белых крысах линии Wistar.

В экспериментах на грызунах животных методом рандомизации разбивали на группы. В качестве критерия приемлемости рандомизации считали отсутствие у животных признаков заболеваний и гомогенность групп (по 5 животных) по полу и массе тела (±20%).

Белым мышам препарат вводился внутрибрюшинно, крысам - внутривенно в возрастающих дозах по Литчфолду-Уилкоксону (точность дозирования достигалась изменением объема вводимого препарата). Дозы вещества при внутрибрюшинном введении составили 2000, 3500 и 5000 мг/кг, при внутривенном - 1 000, 2000 и 3000 мг/кг. Объем вводимого препарата не превышал 0,2 мл для мышей и 1,2 мл для крыс.

После острого опыта грызуны наблюдались в течение 14 дней (1-й день - непрерывное наблюдение). Оценивали интегральные показатели:

внешний вид животных (состояние волосяного и кожного покровов, места инъекции), поведение, симптомы интоксикации, прирост массы тела (определение исходной массы, на 7 и 14 сутки), потребление пищи и воды за сутки (определение исходного потребления, на 7 и 14 сутки). Проводили оценку выделительной системы (частота мочеиспускания, цвет мочи), сердечно-сосудистой и дыхательной системы (частота дыхательных движений, частота сердечных сокращений - определение исходной частоты, на 7 и 14 сутки), пищеварительной системы (количество и консистенция фекальных масс - определение исходного количества за сутки, на 7 и 14 сутки), центральной и периферической нервной системы (поведенческие реакции, интенсивность и характер двигательной активности, наличие и характер судорог, координация движений, реакция на тактильные, звуковые, болевые и световые раздражители). Проводили макроскопическое исследование внутренних органов погибших животных (головной мозг, сердце, печень, почки, легкие, селезенка, надпочечники, желудок, кишечник, мочевой пузырь, поджелудочная железа, тимус). При отсроченной гибели проводилось микроскопическое исследование органов.

1.1.Токсикометрия

При внутрибрюшинном введении белым мышам использовали дозы 2000, 3500, 5000 мг/кг. Летальность белых мышей в течение 14 дней наблюдения (самки n=5, самцы n=5) отсутствовала. При внутривенном введении препарата крысам линии Wistar в дозах 1000, 2000, 3000 мг/кг (самки n=5, самцы n=5) летальность наблюдалась (14 дней наблюдения) только при дозе 3000 мг/кг. На протяжении всего периода наблюдения препарат вводился мышам и крысам ежедневно. У выживших животных отклонений от нормы по общему состоянию и поведению отмечено не было.

Расчет острой токсичности по методу пробит-анализа

probit-line zp=4.681*ln(d)+(-4.890)

Дозы (мг/кг)

Эффективная действующая доза (ED): ED16=2296, ED50=2842, ED84=3519. LD50=76.7 мл/кг или 88.2 г/кг

Таким образом, препарат обладает крайне низкой токсичностью.

Летальный исход в группах животных с внутривенным введением препарата происходил в течение первых 15 минут после введения препарата - на фоне заторможенности, выраженной одышки, выделения белой пены из носа происходила остановка дыхания. Клиническая картина свидетельствовала о развитии тромбоэмболии сосудов легких.

1.2. Влияние однократного введения препарата на интегральные и функциональные показатели

На протяжении всего периода наблюдения (14 дней) отклонений от нормы по общему состоянию и поведению у выживших животных опытных групп отмечено не было. При внутривенном введении препаратов в дозе 3000 мг/кг все параметры определялись на выживших животных (2 самки, 2 самца, общее количество животных - 4). В остальных группах (при внутрибрюшинном введении дозы составили 2000, 3500 и 5000 мг/кг, при внутривенном - 1000, 2000 и 3000 мг/кг) параметры определялись на 10 животных на дозу (5 самцов и 5 самок).

Наблюдалась равномерная прибавка массы животных во время всего срока наблюдения, что свидетельствует об отсутствии отсроченного токсического действия препарата. Для регистрации потребления животными воды и пищи в эти же временные сроки через 2 часа после введения препарата крыс на сутки высаживали в обменные клетки. При введении препарата во всех дозах отмечалось небольшое увеличение потребления корма к 14 суткам после введения препарата. В группах животных с внутривенным введением препарата в дозах 2000 и 3000 мг/кг наблюдалось увеличение потребления воды.

Оценка выделительной функции почек у крыс проводилось по количеству суточной мочи. Так же оценивалась частота мочеиспускания, цвет и прозрачность мочи. Моча у животных во всех группах на всех сроках наблюдения была прозрачная, цвет колебался от светло-желтого до темно-желтого. Значимого различия между исходными показателями и суточным количеством мочи после введения препарата выявлено не было.

Параметром оценки сердечно-сосудистой системы крыс была выбрана частота сердечных сокращений (ЧСС). У животных с внутривенным введением препарата в дозе 3000 мг/кг отмечена склонность к тахикардии.

Параметром оценки дыхательной системы крыс была выбрана частота дыхания (ЧД), значимых различий с исходными значениями по параметру ЧД выявлено не было.

Функцию пищеварительной системы оценивали по количеству и консистенции фекальных масс. При внутрибрюшинном и внутривенном введении препарата во всех дозах, изменений по количеству и консистенции фекальных масс зарегистрировано не было

1.3. Патологоанатомические исследования

Животные всех экспериментальных групп по истечении периода наблюдения (14 дней) были выведены из эксперимента. Дозы вещества при внутрибрюшинном введении составили 2000, 3500 и 5000 мг/кг, при внутривенном - 1 000, 2 000, 3000 (по 10 животных на каждую группу - 5 самок, 5 самцов). Внешних различий между животными опытных групп не выявлено.

Шерсть мышей и крыс имела опрятный вид, была блестящей, без очагов облысения. Питание животных удовлетворительное. Кожа и подкожная клетчатка в месте введения препарата изменений не представляли. Инфильтратов, раздражения или некроза тканей в месте введения не наблюдалось.

При макроскопическом исследовании отчетливого влияния препарата на состояние внутренних органов не установлено. При осмотре грудной и брюшной полостей нарушений в расположении внутренних органов не отмечалось. Щитовидная железа плотно прилежала к гортани, имела обычные размеры и плотность, розовато-красный цвет. Тимус имел треугольную форму, беловатый цвет и умеренно плотную консистенцию. Величина и форма сердца были не измененены. Мышца сердца была коричневой, плотной. Поверхность легких имела бледно-розовую окраску; легкие спадались при вскрытии грудной клетки. Ткань на разрезе также имела однородную бледно-розовую окраску. Слизистая оболочка вне легочных бронхов была гладкой, блестящей, бледно-розовой. Желудок имел обычную форму и размеры, просвет был заполнен плотным пищевым содержимым. Слизистая тела желудка была бледно-розовой, блестящей, складчатой. Слизистая тонкой и толстой кишки была блестящей, гладкой. Печень умеренно увеличена. Капсула печени была тонкой, прозрачной. Ткань печени имела коричневатый цвет и умеренно плотную консистенцию. Поджелудочная железа была бледно-розовой, дольчатой. Величина и форма почек не отличались от контроля, капсула легко снималась. Поверхность органа была гладкой, однородной коричнево-сероватой окраски. На разрезе почек четко различались корковое и мозговое вещество. Форма, размеры и плотность надпочечников, яичников или яичек не отличались от обычных. Селезенка имела темно-вишневый цвет, гладкую поверхность и плотную консистенцию. Оболочки головного мозга были тонкими, прозрачными. Вещество головного мозга имело умеренную плотность. Расширения желудочков мозга не наблюдалось.

У крыс с внутривенным введением препарата в дозе 3000 мг/кг (с летальным исходом) при вскрытии животных были обнаружены следующие изменения. В легких на поверхности разреза выступает пенистая жидкость бледно-розового цвета. Сосуды оболочек мозга полнокровны. Печень умеренно увеличена, ткань бледного цвета, зернистой консистенции.

1.4. Резюме по исследованию острой токсичности

Рандомизированное исследование острой токсичности на грызунах - белых нелинейных мышах и белых крысах линии Wistar - показало, что токсические дозы (мг/кг) испытуемого препарата сопоставимы с таковыми у разрешенных к применению рентгеноконтрастных масляных йодосодержащих средств и при однократном внутривенном введении препарата составляют ED16=2296; ED50=2842; ED84=3519. Проведенные испытания свидетельствуют об отсутствии противопоказаний по показателям острой токсичности для медицинского применения препарата.

2. Подострая токсичность

Эксперименты по изучению подострой токсичности препарата выполнялись на 40 половозрелых крысах обоего пола линии Wistar, объединенных в рандомизированные группы для проведения исследования. Исследуемый препарат вводили ежедневно в течение 28 дней внутрибрюшинно в дозах 900 мг/кг и 1800 мг/кг и внутривенно (в хвостовые вены) в следующих дозах: 140 мг/кг и 1400 мг/кг. Каждая группа животных состояла из 5 самцов и 5 самок.

Общая продолжительность наблюдения за животными составила 28 дней. Состояние животных (состояние волосяного и кожного покрова, места инъекции, поведение, интенсивность и характер двигательной активности, наличие и характер судорог, координация движений, симптомы интоксикации) фиксировалось ежедневно. Взвешивание животных, потребление пищи и воды за сутки выполнялось раз в неделю. Физиологические и биохимические исследования проводили до начала опыта (фоновые значения), на 7 и 14 день. После окончания введения препарата животные всех экспериментальных групп были подвергнуты эвтаназии и направлены на вскрытие и патоморфологическое исследование.

2.1. Токсикометрия

При введении препарата в дозах 900 мг/кг внутрибрюшинно и 140 мг/кг внутривенно смертности животных в течение 28-дневного введения препарата отмечено не было. Так как в течение первых 14 суток от момента введения летальности среди животных даже с дозами внутрибрюшинного и внутривенного введения 1800 и 1400 мг/кг не отмечалось, сроки введения препарата продлили до 28 суток. Животные умирали на фоне дыхательной недостаточности при внутривенном введении и на фоне общей интоксикации при внутрибрюшинном введении.

Расчет подострой токсичности при внутрибрюшинном введении осуществлялся Probit-Analys metod Litchfild-Wilcoxon, доза - 1800 мг/кг. Дозы (мг/кг) у самцов составляли ED16=28046 ED50=35622 ED84=45246, у самок - ED16=21570 ED50=32588 ED84=49236.

Результаты проведенных исследований показали, что изучаемое соединение обладает низкой токсичностью при внутрибрюшинном введении. Суммарная летальная доза вещества при внутрибрюшинном введении составила 32588 мг/кг, что соответствует VI классу токсичности (относительно безвредно). Анализ половой чувствительности показал отсутствие статистически значимых различий в сравниваемых группах.

Расчет подострой токсичности при внутривеном введении осуществлялся Probit-Analys metod Litchfild-Wilcoxon, доза - 1400 мг/кг. Дозы (мг/кг) у самцов составляли ED16=23966 ED50=28007 ED84-32729, у самок - ED16-21245 ED50-26928 ED84=32132.

Результаты проведенных исследований показали, что изучаемое соединение обладает низкой токсичностью при внутривенном введении. Полученные данные позволили рассчитать коэффициент кумулятивной активности LD_50(N)/LD₅₀₍₁₎. который составил около 10, что соответствует очень слабой кумулятивной активности (практически отсутствие). Анализ половой чувствительности показал отсутствие статистически значимых различий в сравниваемых группах.

Таким образом, препарат относится к 4 классу опасности по степени воздействия на организм.

2.2. Влияние на динамику массы тела крыс и потребление корма

Постоянная и положительная динамика массы тела крыс является интегральным показателем здоровья животных. Снижение массы тела у животных с внутрибрюшинном введении до 14 суток возможно объяснить стрессорным действием ежедневного введения препарата. Однако к 28 дню от момента введения отмечалось увеличение массы тела подопытных животных. При внутривенном введении отмечалось статистически достоверное увеличение массы тела крыс во всех группах.

При внутрибрюшинном и внутривенном введении препарата у животных отмечалась потеря аппетита на сроках до 14 суток от момента введения. К 28 суткам показатель нормализовался.

Для регистрации потребления животными воды и пищи в эти же временные сроки через 2 часа после введения препарата крыс на сутки высаживали в обменные клетки. Изменение потребления воды при внутрибрюшинном и внутривенном введении препарата не отмечено.

2.3. Влияние на функциональное состояние почек

Оценка выделительной функции почек проводилось по количеству суточной мочи. Так же оценивалась частота мочеиспускания, цвет и прозрачность мочи. Моча у животных во всех группах на всех сроках наблюдения была прозрачная, цвет колебался от светло-желтого до темно-желтого. Влияния внутрибрюшинного и внутривенного введения препарата на суточное количество мочи у крыс не выявлено.

2.4. Влияние на состояние сердечно-сосудистой системы

Параметром оценки была выбрана ЧСС. У животных с внутрибрюшинным и внутривенным введением препарата имела место склонность к тахикардии.

2.5. Влияние на состояние дыхательной системы

Параметром оценки была выбрана ЧД. У животных с внутрибрюшинным введением препарата отмечено снижение ЧД, в то время как в группах животных с внутривенным введением наблюдается значительное повышение частоты дыхательных движений.

2.6. Влияние препарата на функции пищеварительной системы

Функцию пищеварительной системы оценивали по количеству и консистенции фекальных масс. При внутрибрюшинном и внутривенном введении препарата во всех дозах, изменений по количеству и консистенции фекальных масс зарегистрировано не было.

2.7. Влияние на лабораторные показатели периферической крови

Биохимические и гематологические исследования проводили на 14 и 28 дни от начала введения препаратов. Кровь получали пункцией хвостовой вены или (в конце исследования) после одномоментного гильотинирования животных.

Следует отметить лейкоцитоз и повышение относительного содержания нейтрофилов в периферической крови крыс на 28 день после начала введения, более выраженное при внутрибрюшинном введении препарата, что следует расценивать как признак реактивной воспалительной реакции брюшины (перитонит) в результате длительного введения препарата.

Ежедневное внутривенное и внутрибрюшинное введение препарата не приводит к значимым отклонениям биохимических показателей периферической крови.

2.8. Результаты патоморфологического исследования

Патоморфологические исследования проводились при внутрибрюшинном введении препарата в дозах 900 мг/кг и 1800 мг/кг и внутривенном введении (в хвостовые вены) в следующих дозах: 140 мг/кг и 1400 мг/кг (по 10 животных на каждую группу - 5 самок, 5 самцов).

Крысы в группах внутрибрюшинного введения в дозе 900 мг/кг и внутривенного введения препарата в дозе 140 мг/кг, соответственно, правильного телосложения, удовлетворительного питания. Шерсть блестящая, опрятного вида, очагов облысения не определяется. При внутривенном введении препарата в дозе 1400 мг/кг и внутрибрюшинном введении в дозе 1800 мг/кг у животных шерсть тусклая, неопрятная.

Далее представлены обобщенные патоморфологические данные по крысам всех групп. Случаи расхождения данных по группам сравнения оговариваются дополнительно.

Зубы сохранены. Видимые слизистые оболочки бледной окраски, блестящие. Молочные железы самок без уплотнений на ощупь, выделения из сосков отсутствовали. Половые органы самцов развиты правильно. Деформации или отека конечностей нет. При внутрибрюшинном введении в брюшной полости содержится значительное количество исследуемого вещества, равномерно распределяющегося по всем интрабрюшинным органам. При внутривенном введении грудная и брюшная полости выпота не содержат. Положение внутренних органов грудной и брюшной полостей нарушений не представляет. Париетальный и висцеральный листки плевры и брюшины тонкие, блестящие, гладкие. Подчелюстные лимфатические узлы и слюнные железы овальной формы, бледно-желтого или розоватого цвета, с гладкой поверхностью, тонкой капсулой, не спаяны между собой и подлежащими тканями. Поверхность разреза однородной окраски. Щитовидная железа красноватого цвета, обычной величины и формы, умеренно плотной консистенции. Тимус треугольной формы, беловатого цвета, умеренно плотной консистенции, обычных размеров. Интима аорты гладкая, блестящая, беловатого цвета. Диаметр аорты не изменен. Листки перикарда тонкие, прозрачные, гладкие. Величина и форма сердца изменений не представляют. Левый желудочек сокращен, в правом содержится незначительное количество темной жидкой крови. Клапаны сердца тонкие, блестящие, гладкие. Мышца сердца на разрезе однородной коричневой окраски, умеренно плотная. Просвет трахеи и крупных бронхов не изменен, слизистая оболочка блестящая, гладкая, бледного цвета. Легкие воздушные, без уплотнений на ощупь, бледно-розовой окраски. В случае внутривенного введения препарата в дозе 1400 мг/кг легкие сниженной воздушности, при разрезе выделяется небольшое количество розоватой жидкости.

Слизистая пищевода блестящая, гладкая, бледного цвета. Желудок обычной величины и формы, заполнен пищевым содержимым. Слизистая оболочка железистой части желудка складчатая, розовая, блестящая. Слизистая оболочка тела желудка складчатая, розовая, блестящая. Слизистая оболочка тонкого кишечника бледно-розового цвета, блестящая, гладкая. Слизистая оболочка толстой кишки сероватого цвета, блестящая, гладкая. Печень умеренно увеличена в группах крыс с внутрибрюшинным и внутривенным введением препарата в дозах 1800 и 1400 мг/кг. Поверхность печени гладкая, однородной темно-красной окраски, капсула тонкая прозрачная. Ткань печени на разрезе полнокровная, умеренно плотная. Поджелудочная железа плоской формы, бледно-розового цвета, дольчатая, умеренно плотной консистенции. Селезенка обычной формы, темно-вишневого цвета, умеренно плотной консистенции. Поверхность органа гладкая, капсула тонкая. На разрезе на темно-красном фоне селезенки видны мелкие сероватого цвета фолликулы. В группе животных с внутрибрюшинным введением препарата в дозе 1800 мг/кг отмечалось увеличение селезенки. Величина и форма почек не изменены. Поверхность почек коричневого цвета, гладкая, капсула тонкая, прозрачная легко снимаемая. На разрезе органа хорошо различимы корковое и мозговое вещество. Надпочечники округлой формы, бледно-желтого цвета, с гладкой поверхностью, умеренно плотные. На разрезе четко выделяется темно-окрашенное мозговое вещество. Мочевой пузырь заполнен прозрачной мочой. Слизистая оболочка пузыря гладкая, блестящая, бледной окраски. Тело матки самок обычной плотности, величины и формы. Рога матки тонкие, слизистая - блестящая, бледная. Яичники темно-красного цвета, с неровной поверхностью, умеренно плотные. Яички самцов беловатого цвета, обычных размеров и плотности. Оболочки головного мозга тонкие, прозрачные. Вещество мозга обычной плотности, поверхность мозга гладкая. На фронтальных разрезах мозга отчетливо выделяются серое и белое вещество. Желудочки мозга обычной величины, расширения нет.

2.9. Результаты гистологического исследования

Объекты исследования фиксировали в 10% растворе формалина и заливали в парафин. Для гистологического исследования были представлены препараты головного мозга, печени, сердца, почек и легких в окрасках гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону и Суданом III. Окраска Суданом III является селективным методом определения жиров в гистологических средах. Таким образом, обнаружение суданположительных включений свидетельствует о накоплении масляного препарата тканях.

Исследование органов животных, включенных в эксперимент (14-е и 28-е сутки) проводилось по алгоритму, включающему оценку каждого из признаков по пятибальной системе: 0 - нет признака; 1 - минимальная степень выраженности; 2 - слабая выраженность; 3 - умеренная выраженность; 4 - признак выражен; 5 - признак резко выражен.

Изучение органов животных, погибших в ходе эксперимента, выявило резко выраженные нарушения кровообращения в изученных органах, что сопровождалось дистрофическими изменениями паренхиматозных элементов в головном мозгу и печени. При исследовании почек, сердца, головного мозга животных на 14-е и 28-е сутки от введения препарата не получено существенной разницы изученных параметров. Не выявлено зависимости структуры указанных органов от дозы и пути введения, а также от сроков эксперимента.

В печени состояние гепатоцитов характеризовалось большей выраженностью дистрофических изменений на 14-е сутки (варианты белковой дистрофии) по сравнению с 28-ми. Убедительных признаков жировой дистрофии или накопления препарата в печени не выявлено ни у одного животного.

В легких на поздних сроках эксперимента вне зависимости от пути введения препарата постоянно выявлялось накопление жиросодержащих веществ (препарата) в сосудах мелкого калибра и/или макрофагах (у 6 из 7 животных против 2 из 8 на ранних сроках). Это не сопровождалось существенными изменениями структуры бронхов или респираторных отделов. Не было отмечено и обогащения свободными клетками.

2.10. Резюме по подострой токсичности

Полученные данные по подострой токсичности позволяют рекомендовать данный препарат для одно- двукратного системного применения (для лимфографии, для внутрисосудистого введения - эмболизации сосудов при лечении опухолей). Противопоказано внутривенное введение препарата из-за опасности эмболизации сосудов легких и головного мозга, что подтверждается данными гистологических исследований. Многократное введение препарата может вызвать воспалительную реакцию.

3. Изучение аллергенных свойств

Исследование аллергенных свойств препарата проводили в соответствии с «Методическими указаниями по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ» МЗ РФ, 2000.

Эксперименты проводились на белых крысах линии Wistar с массой тела 200-225 г), белых беспородных мышах с массой тела 18-20 г, морских свинках-альбиносах (масса тела 250-300 г). Животные поступали из питомника РАМН «Рапполово», Санкт-Петербург.

Все экспериментальные животные проходили карантин (акклиматизационный период) длительностью 14 дней. В течение этого периода проводили ежедневный осмотр животных, оценивали поведение и общее состояние, больных или отличающихся по поведению животных отбраковывали. Перед началом эксперимента животные, отвечающие критериям включения в исследование, были распределены на группы с помощью метода рандомизации. Клетки с экспериментальными животными находились в специальных помещениях: световой режим: 12 часов свет, 12 часов - темнота; температура воздуха: 18-20°C; относительная влажность: 50-70%. Ежедневно проводили стерилизацию воздуха с помощью кварцевой лампы.

3.1. Реакция общей анафилаксии (анафилактический шок)

Морским свинкам вводили препарат в эффективной терапевтической дозе (140 мг/кг) и в дозе, в 10 раз ее превышающей (1400 мг/кг): первая инъекция подкожно, две последующие внутримышечно через день в область бедра. Контрольной группе животных вводили физиологический раствор в объеме, соответствующем объему исследуемого препарата.

На 21 день после сенсибилизирующей инъекции животным внутривенно вводили разрешающую дозу препарата, равную суммарной сенсибилизирующей. Аналогичную дозу вводили морским свинкам контрольных групп. Учет интенсивности анафилактического шока проводился в индексах по Wiegle:

++++ - шок со смертельным исходом;

+++ - шок тяжелой степени (общие судороги, асфиксия, животное теряет способность удерживаться на лапах, падает на бок, не погибает);

++ - шок умеренный (небольшие судороги, выраженные явления бронхоспазма);

+ - шок слабый (некоторое беспокойство, учащенное дыхание, почесывание мордочки, непроизвольное мочеиспускание, дефекация, шерсть взъерошенная);

0 - шок не развился, признаки его отсутствуют.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что препарат в терапевтической дозе обладает незначительными аллергизирующими свойствами. У половины животных был зафиксирован шок слабой степени (+ по шкале Wiegle). При введении препарата в дозе 1400 мг/кг в ряде случаев отмечался шок со смертельным исходом. Следует отметить, что и в группе контрольных животных, получивших ту же разрешающую дозу, также отмечался шок со смертельным исходом.

3.2. Реакция иммунных комплексов

Для постановки реакции использовали белых крыс линии Wistar, которым вводили препарата в дозе 140 и 1400 мг/кг. В контрольных группах использовали физиологический раствор в таком же объеме. Сенсибилизацию проводили подкожно, пятикратно с интервалом в 6 суток. Через 10 суток после последнего введения препарата осуществляли введение разрешающей дозы внутрикожно в объеме 0,2 мл.

Разрешающую дозу препарата определяли на интактных животных. За разрешающую дозу принимали наибольшее разведение антигена, не вызывающее видимых изменений в коже через час после введения. В контрольных группах в таком же объеме вводили растворитель.

Учет реакции проводили визуально (в баллах по С.В.Суворову), где:

0 - видимой реакции нет;

1 - бледно-розовая эритема по всему участку или его периферии;

2 - ярко-розовая эритема по всему участку или его периферии;

3 - красная эритема по всему участку;

4 - инфильтрация и отек кожи (утолщение кожной складки) при наличии или отсутствии эритемы;

5 - эритема, выраженная инфильтрация, очаговые изъязвления (некроз), возможны геморрагии, образование корочек.

При сенсибилизации животных терапевтической дозой признаков реакции обнаружено не было. В случае десятикратного ее превышения в месте введения отмечался незначительный отек без гиперемии.

По данным гистологического исследования при сенсибилизации дозой 140 мг/кг признаков отека, полнокровия, клеточной реакции нет. При окраске по Ван-Гизону соединительная ткань фуксинофильна. Судан-положительные включения располагаются на уровне придатков, местами достигают сосочкового слоя.

При сенсибилизации крыс дозой 1400 мг/мл в гистологических препаратах кожи отмечается отек и полнокровие дермы, очаговые кровоизлияния. При окраске по Ван-Гизону выраженная пикринофилия. Судан-положительные каплевидные включения располагаются преимущественно на уровне придатков кожи, местами - вплоть до сосочкового слоя дермы. Клеточной реакции нет.

3.3. Метод накожных аппликаций.

Исследование сенсибилизирующего действия препарата проводили путем 10 повторных накожных аппликаций на участок боковой поверхности туловища морских свинок-альбиносов. Нанесение препарата на кожу в дозах 140 мг/кг и 1400 мг/кг проводилось 5 раз в неделю на протяжении двух недель. Реакцию кожи учитывали ежедневно по шкале оценки кожных проб С.В.Суворова.

Возникновение красной эритемы по всему участку кожи отмечалось у животных с нанесением 1400 мг/кг через 7 аппликаций. У животных с нанесением 140 мг/кг отмечалось лишь возникновение транзиторной бледно-розовой эритемы по всему участку. У ряда животных этой группы визуально изменений на коже выявить не удалось. Таким образом, развитие контактного дерматита при накожном нанесении препарата возможно при десятикратном увеличении суточной дозировки.

3.4. Реакция гиперчувствительности «замедленного типа»

Эксперимент проводился на 10 мышах (5 самцов, 5 самок). Мышей сенсибилизировали однократно путем внутрикожного введения в основание хвоста 60 мкл эмульсии препарата в ПАФ. Группе контроля (мыши, 5 самцов, 5 самок) вводилась эмульсия ПАФ с раствором Хэнкса. Для выявления сенсибилизации через 5 суток мышам в подушечку задней лапы вводили 40 мкл ЮмМ препарата в растворе Хенкса. Регистрировали величину отека с помощью инженерного микрометра МК-0-25 через 6, 22 и 24 часа. Животных контрольной группы сенсибилизировали ПАФ с раствором Хенкса по той же схеме. По разнице в толщине обеих лапок характеризовали величину отека, по которой можно судить об интенсивности реакции гиперчувствительности «замедленного типа». Реакция гиперчувствительности «замедленного типа» в экспериментальной группе не развивалась.

3.5. Резюме по оценке аллергизирующих свойств

Препарат обладает умеренным аллергизирующим действием, однако при превышении дозировки возможно развитие анафилактического шока, контактного дерматита и гиперчувствительности, обусловленной образованием иммунных комплексов. Во избежание развития анафилатического шока следует исключить применение препарата при аллергиях на йодсодержащие препараты в анамнезе.

4. Иммунотоксическое действие

Исследование проводили на мышах линии Balb с весом 18-20 г. Общее количество животных - 60 штук.

Животные были разделены на три группы.

1. Группа контроля - животные (10 самцов и 10 самок), которым в течение двух дней подкожно вводили физиологический раствор.

2. Подопытные животные (10 самцов и 10 самок), которым подкожно вводили препарат в дозе 140 мг/кг веса.

3. Подопытные животные (10 самцов и 10 самок), которым подкожно вводили препарат в дозе 1400 мг/кг веса.

На 8-й день после первого введения препарата проводили оценку состояния иммунной системы подопытных и контрольной животных. У части мышей (15 самцов и 15 самок) определяли массу и клеточность лимфоидных органов, а также фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов. Другая часть животных (15 самцов и 15 самок) была использована для оценки иммунного ответа на эритроциты барана.

Животных умерщвляли с помощью дислокации шейных позвонков, вырезали у каждого животного 4 лимфоузла (2 паховых и 2 подмышечных), тимус и селезенку. Взвешивание органов проводили на торсионных весах типа ВТ. Из селезенки, тимуса и лимфоузлов готовили суспензии клеток. Подсчет количества клеток в суспензии проводили после лизиса эритроцитов на кондуктометрическом счетчике частиц ЦМК-2.

Для оценки фагоцитоза использовали частицы коллоидной туши. 0,05% суспензию туши в объеме 2 мл вводили внутрибрюшинно. Через 10 минут промывали полость 5 мл изотонического раствора хлорида натрия. Полученные таким образом клетки перитонеального экссудата (КПЭ) трижды отмывали, ресуспендировали в 1 мл физиологического раствора и подсчитывали в камере Горяева содержание ядросодержащих и процент фагоцитирующих клеток.

Мышам контрольной и двух подопытных групп вводили внутрибрюшинно суспензию эритроцитов барана (ЭБ) в физиологическом растворе в субоптимальной дозе, равной 5×10⁷ ЭБ/мышь. На 7-й день после введения эритроцитов от мышей брали кровь и определяли титр антител против ЭБ методом гемагглютинации.

Результаты. Масса лимфоидных органов животных подопытных групп не отличалась достоверно от соответствующего показателя животных контрольной группы. Клеточность лимфоидных органов после введения препарата оставалась в пределах контрольных значений. Исследование фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов показало, что введение препарата в дозе 140 мг/кг не влияло ни на количество клеток в брюшной полости, ни на их фагоцитарную активность. В то же время введение препарата в дозе 1400 мг/кг снижало количество клеток в полости. При этом процент фагоцитирующих клеток увеличивался в 2-3 раза. Определение титра антител против эритроцитов барана показало, что у животных, получивших препарат в дозе 140 мг/кг , титры антител в точности соответствуют контрольным значениям. В группе животных, получавших препарат в десятикратно увеличенной дозе, у части особей титр антител был в 2-4 раза выше, чем в контроле. Однако эти отклонения находятся в пределах ошибки метода титрования и потому их нельзя считать достоверными.

5. Мутагенные свойства

Исследование проводилось на мышах весом 18-20 г (общее количество - 28 шт.). Учет аберраций хромосом в первой серии опытов проводился только на самцах, препарат вводили однократно подкожно в дозах 140 и 1400 мг/кг (на дозу - 4 мыши), группе контроля (4 мыши) вводили физиологический раствор. Фиксацию клеточного материала (красный костный мозг и семенники) осуществляли через 24 ч после введения.

Во второй серии опытов препарат в дозе 140 мг/кг вводился подкожно ежедневно в течение 5 дней на самцах и самках (8 мышей, из них 4 самца и 4 самки, группа контроля - 8 мышей, из них 4 самца и 4 самки). Фиксация клеточного материала (красный костный мозг у самцов и самок, семенники у самцов) проводилась через 24 ч после последнего введения. Затем проводился микроскопический цитогенетический анализ приготовленных препаратов.

Было выявлено наличие мутагенного эффекта препарата в дозах, десятикратно превышающих эффективную терапевтическую дозу. При однократном и многократном применении препарата в дозировке 140 мг/кг мутагенный эффект не выявлен.

6. Влияние на репродуктивную функцию

В процессе исследования препарата проведено обоснование репродуктивной безопасности на основании сведений о влиянии на репродуктивные органы, фертильность и ранний эмбриогенез (самцы и самки), эмбриональное и постнатальное развитие. Исследование проводилось в экспериментальной лаборатории Санкт-Петербургского Института Фармации на аутбредных крысах (РАМН питомник лабораторных животных «Рапполово»).

Целью исследования явилось определение негативного влияния препарата на генеративную функцию при перинодулярном введении в двух экспериментальных дозах самцам и самкам лабораторных аутбредных крыс. Препарат вводился животным перинодулярно еженедельно: самкам на протяжении 15 дней, самцам - 49 дней в дозах 0,25 мл/кг и 0,50 мл/кг. Общее количество животных: 50 крыс самцов и 100 крыс самок. Животные были разделены на две группы: опытных и интактных.

Поскольку препарат предполагают использовать в основном как рентгеноконтрастное средство и как материал для эмболизации, то ежедневное введение препарата считали нецелесообразным. Расчет доз:

предполагаемая максимально вводимая внутриартериально через катетер доза для человека массой - 80 кг составляет 20 мл, т.е. 0,25 мл/кг, рассчитывали без учета метаболического коэффициента, с учетом того, что препарат надолго после введения задерживается в сосудах опухоли. Дозы, выбранные для исследования репродуктивной токсичности (0,25 и 0,50 мл/кг) являются адекватными максимальной терапевтической дозе и максимально безопасно переносимой дозе, т.е. минимальной токсической.

По окончании сроков введения препарата опытных животных спаривали с интактными, предварительно проверив эстральный цикл в соотношении самцы: самки=1:2, сроком на два эстральных цикла. На 16-19 сутки беременности осуществлялась некропсия самок. Самцы эвтаназии не подвергались. У самок, подвергшихся эвтаназии на 16-19 беременности, подсчитывали количество желтых тел в яичниках, мест имплантации в матке, живых плодов и погибших плодов. Оценивалась предимплантационная смертность (эмбриотоксическое действие препарата) - разность между количеством желтых тел в яичниках и количеством мест имплантации в матке и постимплантационная смертность (фетотоксическое действие препарата) - разность между количеством мест имплантации в матке и количеством живых плодов. В результате исследований репродуктивной токсичности у самок было показано, что препарат не оказывает токсического действия.

Самцы не подвергались эвтаназии, оценивали их способность к оплодотворению и зачатию. Рассчитывали индекс отношения числа беременных самок к числу ссаженных самок, в процентах. В результате исследования репродуктивной токсичности препарата при его ежедневном внутривенном введении в течение 49 дней самцам в дозах 0.25 и 0.5 мл/кг было показано, что исследуемый препарат не оказывает токсического действия на генеративную функцию экспериментальных крыс-самцов.

Следующей целью исследования являлось определение эмбрио- и фетотоксического действия препарата, наблюдаемого в антенатальном периоде при перинодулярном введении в двух дозах беременным самкам аутбредных крыс. Исследование проводилось на 90 беременных самках, которые были разделены на две группы: контрольная, получавшая внутривенно растворитель-плацебо, и две опытные, получавшие препарат в дозах 0,25 и 0,50 мл/кг. В исследованиях оценивали пред- и постнатальную эмбриональную смертность, фиксировали анатомические пороки развития, общее развития плодов. У потомства оценивали физическое развитие, скорость созревания сенсорно-двигательных рефлексов, двигательное и эмоциональное поведение и способность к координации движений. Результаты показали, что препарат при 3-кратном внутривенном введении в дозах 0,25 и 0,50 мл/кг беременным самкам не оказывает тератогенного действия, регистрируемого в антенатальном периоде. Обнаружено фетотоксическое действие препарата при применении его в дозе 0,50 мл/кг, проявившееся в увеличении постимплантационной смертности, что позволило дать рекомендацию о нежелательности применения препарата в период беременности.

Препарат вводили беременным самкам на 4-й (доимплантационный период), на 12-й (органогенез) и 17-й (фетогенез) дни беременности в дозах 0,25 и 0,50 мл/кг. Общее количество животных - 45 крыс самок. На 20-21 сутки беременности осуществляли некропсию самок. У самок, подвергшихся эвтаназии на 20-21 день беременности, подсчитывали количество: желтых тел в яичниках, мест имплантации в матке, живых и погибших плодов. Оценивали предимплантационную и постимплантационную смертность. Оценивали морфологические (анатомические) пороки развития, а также общую задержку развития плодов.

При оценке тератогенного действия препарата, подсчитывали количество плодов с аномалиями, заметными при внешнем осмотре, затем плоды делили на 2 группы и у одних плодов исследовали состояние внутренних органов, у других - состояние скелета. Плоды взвешивали и определяли их краниокаудальный размер. Клинический осмотр каждого животного проводился ежедневно, отмечали проявления и выраженность признаков интоксикации. Регистрировали массу тела перед началом введения препарата, на 10-11 день беременности и перед некропсией.

Далее определяли антенатальное повреждающее действие препарата, регистрируемое в постнатальном периоде развития при перинодулярном введении в двух дозах самкам аутбредных крыс на 12-й (органогенез) и 17-й (фетогенез) дни беременности и в период лактации еженедельно в течение 3-х недель в дозах 0,25 и 0,5 мл/кг (количество животных - 45 крыс-самок).

В каждом помете подсчитывали количество крысят, затем оставляли 6-8 новорожденных (ориентировочно одинаковое количество самок и самцов). На 25-30 день после рождения крысят их отсаживали от матерей. Оценивали: 1) физическое развитие потомства, 2) скорость созревания сенсорно-двигательных рефлексов в период вскармливания самкой, 3) двигательное и эмоциональное поведение и способность к координации движений у потомства после окончания вскармливания, 4) обучаемость и развитие памяти: выработку условных рефлексов как с положительным, так и с отрицательным подкреплением и сохранение полученных навыков (для этого исследования из каждого помета брали 2 крысенка).

Выводы: В результате исследований репродуктивной активности препарата показано, что исследуемый препарат не оказывает токсического действия на генеративную функцию экспериментальных крыс-самцов и репродуктивную функцию самок. Не было выявлено негативного влияния на пре- и постнатальное развитие потомства. Изучение антенатального повреждающего действия препарата, регистрируемого только в постнатальном периоде, показало, что препарат не влияет на физическое, сенсорно-двигательное, эмоциональное и зоосоциальное развитие потомства.

7. Местное и резорбтивное действие при внутрисосудистом введении

Была поставлена цель изучить местное и резорбтивное действие препарата при внутрисосудистом способе его введения. Были использованы следующие пути введения: в портальную вену печени, в брюшную аорту и внутривенно (в хвостовую вену крысам) в следующих дозах - 140 мг/кг и 1400 мг/кг. Каждая группа животных состояла из 5 самцов и 5 самок половозрелых крыс линии Wistar. Объектами наблюдений были аорта в месте введения препарата и портальная вена сразу после введения и спустя час после введения.

Методика морфологического исследования: для исследования взяты часть брюшной аорты в месте введения препарата, а также отрезок аорты дистальнее места инъекции препарата; портальная вена вместе с прилегающей частью печени.

Результаты: стенка брюшной аорты в месте инъекции препарата, портальной вены не изменены; признаков механического повреждения и воспаления не обнаружено; в просвете сосудов обнаружены неизмененные эритроциты; интима, мышечная оболочка и адвентиция исследованных сосудов у опытных животных не изменены.

8. Исследование рентгеноконтрастных свойств препарата

Исследование проводилось на половозрелых крысах линии Wistar (всего 20 особей). Осуществлялось внутрисосудистое введение препарата в дозе 140 мг/кг (в хвостовую вену) с последующими рентгеновскими снимками через 5 и 10 минут от момента введения (5 самцов опытная группа, 5 самцов - контрольная группа с введением липиодола - флюида). Второй группе животных производилось подкожное введение препарата с рентгеновскими снимками через 10 минут от момента введения (5 самцов опытная группа, 5 самцов - контрольная группа с введением липиодола - флюида), доза введения препарата - 900 мг/кг. Рентгеновское исследование осуществлялось с помощью рентгеновского аппарата «ДИАГНОМАКС М-25».

При подкожном введении на серии полученных рентгенограммах визуализируется рентгеноконтрастное образование в месте введения препарата (имбибиция препаратом мягких тканей), размером, соответствующим количеству введенного препарата.

При внутривенном введении наибольшая контрастность определялась в хвостовой вене по ходу введения на протяжении 30 мм. Меньшая степень контрастности определялась в сосудистой системе печени, легких, головного мозга. Такая картина сохранялась на всех временных периодах исследования.

При сравнении результатов рентгеновского исследования, полученного при аналогичном введении препарата липиодол-флюид, при визуальном исследовании, существенных отличий с препаратом не получено.

Резюме

По результатам проведенного доклинического исследования предлагаемого РКС в сравнении с липиодол-флюидом можно заключить, что препарат обладает низкой токсичностью (4 класс), высокой рентгеноконтрастностыо, сопоставимой с препаратом сравнения и прототипом. Другие преимущества заявляемого РКС представлены выше.

По результатам доклинических исследований стало возможным определить области применения заявляемого РКС: диагностика методом гепатографии, гистеросальпингографии, везикулографии, лимфографии, сиалографии, фистулографии и паллиативное лечение первичных и метастатических опухолей печени, почек методом масляной химиоэмболизации.

Рекомендуемые способы введения: в артерии печени, почки, поджелудочной железы, воротную вену, лимфатические сосуды, проток слюнной железы, свод ступни или кисть руки, лимфография в конечности, сиалография.

На заявляемое РКС поданы все необходимые документы, в том числе проект ФСП на субстанцию и лекарственную форму, в М3 - рег. номер 2720.