фармацевтическая композиция, обладающая противовоспалительной, бронхолитической, противотуберкулезной активностями

Формула изобретения

1. Фармацевтическая композиция, обладающая противовоспалительной, бронхолитической и противотуберкулезной активностью, представляющая собой N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамид.

2. Твердая дозированная фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что она выполнена в виде таблеток, или капсул, или в виде порошка для приготовления суспензии для питья.

3. Твердая дозированная фармацевтическая композиция по пп.1 и 2, отличающаяся тем, что она содержит активное вещество и целевые добавки при следующем соотношении компонентов, мас.%:

активное вещество	0,05-98,0
целевые добавки	2,0-99,95

4. Твердая дозированная фармацевтическая композиция по пп.1-3, отличающаяся тем, что в качестве целевых добавок она содержит необязательно одновременно крахмал, натрия кроскармеллозу, поливинил-пирролидоны, сахара, производные целлюлозы, органические и неорганические соли цинка и кальция, кремния диоксид, соли бензойной кислоты, соли стеариновой кислоты, 2-(диметиламино)этанол, N-ацетил-L-глутаминовую кислоту, коррегирующие вещества при следующем соотношении компонентов, мас.%:

крахмал	0,0-15,0
натрия кроскармеллоза	0,0-10,0
поливинилпирролидоны	0,0-10,0
сахара	0,0-10,0
производные целлюлозы	0,0-20,0
органические и неорганические соли цинка
и кальция	0,0-10,0
кремния диоксид	0,0-5,0
соли бензойной кислоты	0,0-50,0
соли стеариновой кислоты	0,0-1,0
2-(диметиламино)этанол	0,0-12,0
N-ацетил-L-глутаминовая кислота	0,0-10,0
тальк	0,0-2,0
коррегирующие вещества (ароматизаторы)	0,0-1,0

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, конкретно к фармацевтической композиции, обладающей противовоспалительной, бронхолитической и противотуберкулезной активностью, представляющей собой N-(5-Этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамид.

Указанные свойства позволяют предполагать возможность применения предлагаемой фармацевтической композиции на основе нового соединения для профилактики и лечения воспалительных, бронхолегочных (бронхиты, пневмонии, бронхиальная астма) заболеваний, туберкулеза.

Известным противовоспалительным средством, широко применяемым в медицинской практике для лечения бронхолегочных заболеваний, является кортикостероид будесонид. Однако этот популярный препарат, как и все кортикостероидные лекарственные средства, обладает существенными нежелательными побочными реакциями (М.Д.Машковский, Лекарственные средства, М., ООО "Новая волна", 2004, т.II, стр.26, 33; РЛС, Энциклопедия лекарств, 2007, стр.162-163).

Популярными средствами лечения туберкулеза являются такие препараты, как изониазид, пиразинамид, этамбутол и др., которые обладают комплексом нежелательных побочных реакций (РЛС, Энциклопедия лекарств, 2007 г., стр.349, 697, 1051).

Целью изобретения является фармацевтическая композиция, обладающая противовоспалительной, бронхолитической и противотуберкулезной активностью, представляющей собой N-(5-Этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамид (1), а также возможность применения предлагаемой фармацевтической композиции на основе данного соединения для профилактики и лечения воспалительных, бронхолегочных (бронхиты, пневмонии, бронхиальная астма) заболеваний, туберкулеза.

Данное соединение зарегистрировано в CAS Registry под № 313662-95-2, однако никаких сведений о его биологической активности и способах получения не выявлено. Заявитель считает, что выявленная им фармакологическая активность делает соединение 1 перспективным для создания лекарственного средства, обладающего противовоспалительной, бронхолитической и противотуберкулезной активностью, поэтому были разработаны способы получения соединения 1 и фармацевтической композиции на его основе.

Соединение 1 получают реакцией ацилирования 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазола 4-нитробензоилхлоридом в различных условиях: в апротонных растворителях при нагревании без акцепторов гидрохлорида, а также в присутствии акцепторов гидрохлорида.

Твердая дозированная фармацевтическая композиция в виде таблеток, капсул, порошков для приготовления суспензий, содержащая активное вещество - N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамид - и целевые добавки, получают как путем смешения и гомогенизации сухих порошков, так и путем предварительного гранулирования с последующим таблетированием, заполнением капсул и других контейнеров.

При этом соотношение активного вещества и целевых добавок составляет, мас.%:

активное вещество	0,05-98,0
целевые добавки	2,0-99,95

В качестве целевых добавок фармацевтическая композиция содержит не обязательно одновременно крахмал, натрия кроскармеллозу, поливинилпирролидоны, сахара, производные целлюлозы, органические и неорганические соли цинка и кальция, кремния диоксид, соли бензойной кислоты, соли стеариновой кислоты, 2-(диметиламино)этанол, N-ацетил-L-глутаминовую кислоту, коррегирующие вещества, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

крахмал	0,0-15,0
натрия кроскармеллоза	0,0-10,0
поливинилпирролидоны	0,0-10,0
сахара	0,0-10,0
производные целлюлозы	0,0-20,0
органические и неорганические соли цинка и кальция	0,0-10,0
кремния диоксид	0,0-5,0
соли бензойной кислоты	0,0-50,0
соли стеариновой кислоты	0,0-1,0
2-(диметиламино)этанол	0,0-12,0
N-ацетил-L-глутаминовая кислота	0,0-10,0
тальк	0,0-2,0
коррегирующие вещества (ароматизаторы)	0,0-1,0

Заявляемые соотношения компонентов найдены экспериментальным путем, являются оптимальными и позволяют получить технический результат, соответствующий поставленной задаче: новое вещество и твердую фармацевтическую композицию на его основе, выполненную в виде таблеток, капсул, порошков, суспензий и растворов, соответствующих требованиям Государственной Фармакопеи XI и XII изд., имеющих срок годности не менее 2-х лет и обеспечивающих высокий фармакотерапевтический эффект активного вещества.

Синтез нового вещества, состав и способы получения заявляемых фармацевтических композиций приведены в следующих примерах.

Пример 1. Получение N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамида.

В трехгорлую колбу, снабженную мешалкой, термометром и холодильником, заливают 600 мл ацетонитрила, загружают 38,4 г 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазола. Реакционную массу перемешивают, затем при температуре 20-25°С загружают 55,8 г 4-нитробензоилхлорида. Реакционную массу нагревают на водяной бане до температуры кипения и выдерживают в течение 1-2 часов, далее реакционную массу охлаждают до 20-25°С. Выпавший осадок отфильтровывают, на фильтре его промывают сначала ацетонитрилом, затем дистиллированной водой до рН в промывной воде 3,5-4,0. Получают 103,2 г влажного осадка, который загружают в колбу с мешалкой, заливают 750 мл дистиллированной воды, массу нагревают при перемешивании до 90-95°С и выдерживают в течение 1 часа. Осадок отфильтровывают и промывают дистиллированной водой до отсутствия Сl^- ионов, сушат при 50-70°С до постоянного веса

Получают 78,46 г N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамида с выходом 94,29%, считая на исходный 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазол, т.пл. 283-285°С.

Найдено %: С 47,48; Н 3,57; N 20,31; S 11,49

С₁₁Н₁₀N ₄O₃S, М.м 278,31

Вычислено %: С 47,43; Н 3,59; N 20,22; S 11,51

ИК-спектр, см-¹: 3400 (NH), 1790 (-N=C), 1605 (-C=С ар.),

1520 (СО NН амид)

УФ-спектр: 0,001% раствор в 0,1 М растворе натрия гидроксида имеет максимум поглощения при 262±2 нм.

Пример 2. Аналогично примеру 1 вместо ацетонитрила загружают 600 мл ацетона, перемешивают при 55-60°С 3-4 ч. Получают 72,93 г N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамида с т.пл. 284-286°С.

ИК-спектр, см-¹: 3400 (NH), 1790 (-N=C), 1605 (-С=С ар.), 1520 (CO NH амид)

УФ-спектр: 0,001% раствор в 0,1М растворе натрия гидроксида имеет максимум поглощения при 262±2 нм.

Пример 3. В трехгорлую колбу, снабженную мешалкой, термометром и обратным холодильником, загружают 25,6 г 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазола, приливают 150 мл ацетона, смесь нагревают до 40°С. В стакане растворяют 18,6 г 4-нитробензоилхлорида в 40 мл ацетона, раствор постепенно добавляют к полученной массе в колбе. Реакционную массу выдерживают при перемешивании и температуре 56-57°С в течение 2 часов. Окончание реакции определяют методом ТСХ (на хроматограмме не должно быть пятна 4-нитробензоилхлорида).

Полученный осадок отделяют на фильтре, промывают горячим ацетоном и сушат при 50°С до постоянной массы. Получают 23,52 г N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамида с выходом 84,6%, считая на исходный 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазол, т.пл. 283-285°С.

ИК-спектр, см-¹: 3400 (NH), 1790 (-N=C), 1605 (-С=С ар.), 1520 (СО NH амид)

УФ-спектр: 0,001% раствор в 0,1 М растворе натрия гидроксида имеет максимум поглощения при 262±2 нм.

Пример 4. Аналогично примеру 3 смешивают 100 мл ацетона, 25 мл пиридина и 6,4 г 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазола. Реакционную массу охлаждают до 5-10°С, загружают 9,3 г 4-нитробензоилхлорида, массу нагревают до 56-57°С и выдерживают в течение 1 часа. Конец реакции оценивают хроматографически по отсутствию на хроматограмме пятна 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазола. Массу охлаждают до 18-20°С, приливают 50 мл воды, перемешивают 5-10 мин, осадок отделяют, на фильтре промывают водой до отсутствия Cl-ионов, сушат до постоянной массы при 50-70°С.

Получают 9,2 г N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамида с выходом 85,4%, считая на исходный 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазол, т.пл. 283-285°С.

ИК-спектр, см-¹: 3400 (NH), 1790 (-N=C), 1605 (-С=С ар.), 1520 (СО NН амид)

УФ-спектр: 0,001% раствор в 0,1 М растворе натрия гидроксида имеет максимум поглощения при 262±2 нм.

Пример 5. Аналогично примеру 4 получают из 6,4 г 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазола, 9,3 г 4-нитробензоилхлорида в присутствии 30 мл триэтиламина и 100 мл ацетона 9,1 г N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамида с выходом 85,13%, считая на исходный 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазол, т.пл. 283-285°С.

ИК-спектр, см^-1: 3400 (NH), 1790 (-N=C), 1605 (-C=С ар.),

1520 (СО NН амид)

УФ-спектр: 0,001% раствор в 0,1 М растворе натрия гидроксида имеет максимум поглощения при 262±2 нм.

Пример 6. В аппарат с мешалкой загружают 170,0 г 1,5% водного раствора гидроксипропилцеллюлозы, к раствору при перемешивании постепенно добавляют 266,0 г N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамида, 16,0 г кальция дигидрофосфата. Смесь тщательно перемешивают до образования равномерно увлажненной массы, которую гранулируют до размера гранул 1,5-2,0 мм. Гранулы сушат при 50-60°С (гранулят № 1). Высушенные гранулы измельчают на грануляторе до размера гранул 0,6-0,07 мм. Гранулы в смесителе смешивают с 3,0 г талька (гранулят № 2). Полученный гранулят № 2 заполняют в капсулы.

В одной капсуле содержится 250,0 мг N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамида.

Капсулы соответствуют требованиям Госфармакопеи XI и XII изд.

Пример 7. Аналогично примеру 6 гранулят № 1 получают исходя из 170,0 г 2,0% водного раствора гидроксипропилметилцеллюлозы, 266,0 г N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамида, 15,0 г цинка сернокислого, 5,0 г маннита, 5,0 г натрия бензоата. Гранулят № 2 получают, добавляя к грануляту № 1 3,0 г магния стеарата и 3,0 г ароматизатора.

Массу таблетируют, получая в одной таблетке 250,0 мг N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамида.

Таблетки соответствуют требованиям Госфармакопеи XI и XII изд.

Пример 8. Аналогично примеру 7 гранулят № 1 получают, исходя из 150,0 г 10,0% водного раствора поливинилпирролидона, 266,0 г N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамида, 5,0 г сорбита, 5,0 г N-ацетил-L-глутаминовой кислоты, 4,0 г 2-(диметиламино)этанола, 3,0 г целлюлозы микрокристаллической. Гранулят № 2 получают, добавляя к грануляту № 1 5,0 г натрия кроскармеллозы, 3,0 г кремния диоксида и 3,0 г ароматизатора.

Массу таблетируют, получая в одной таблетке 250,0 мг N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамида.

Таблетки соответствуют требованиям Госфармакопеи XI и XII изд.

Пример 9. Аналогично примеру 8 гранулят № 1 получают исходя из 160,0 г 5,0% водного раствора крахмала, 266,0 г N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамида, 5,0 г цинка сернокислого, 15,0 г натрия бензоата, 5,0 г N-ацетил-L-глутаминовой кислоты, 4,0 г 2-(диметиламино)этанола, 5,0 г целлюлозы микрокристаллической. Гранулят № 2 получают, добавляя к грануляту № 1 3,0 г кремния диоксида, 1,0 г магния стеарата.

Массу таблетируют и покрывают пленочной оболочкой, используя раствор гидроксипропилметилцеллюлозы.

Получают таблетки, содержащие по 250,0 мг N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамида.

Таблетки соответствуют требованиям Госфармакопеи XI и XII изд.

Пример 10. Аналогично примеру 7 гранулят № 1 получают исходя из 160,0 г 5,0% водного раствора крахмала, 266,0 г N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамида, 15,0 г цинка сернокислого, 10,0 г маннита, 10,0 г натрия бензоата. Гранулят № 2 получают, добавляя к грануляту № 1 5,0 г натрия кроскармеллозы, 3,0 г кремния диоксида и 3,0 г ароматизатора.

Полученный гранулированный порошок рассыпают в ламинированные пакеты.

В одной дозе порошка, используемого в виде суспензии, содержится 250,0 мг N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамида.

Порошок соответствует требованиям Госфармакопеи XI и XII изд.

Пример 11. В смеситель-гомогенизатор загружают 100,0 г N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамида, 10,0 г маннита, 100,0 г натрия бензоата, массу тщательно гомогенизируют. Полученный порошок рассыпают в многодозовые дозированные ингаляторы, однодозовые контейнеры или готовят суспензии и растворы для ингаляции через небулайзер.

Полученные порошки для ингаляции соответствуют требованиям Госфармакопеи XI и XII изд.

Показатели качества фармацевтических композиций приведены в таблице 1.

Таблица 1
Показатели качества фармацевтических композиций N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамида
Показатели качества	Нормы требований качества	Фактические показатели, примеры
		6	7	8	9	10	11
Описание	Белый или белый с кремоватым оттенком	Белый	Белый	Белый с кремоватым оттенком	Белый	Белый с кремоватым оттенком	Белый
Распадаемость, мин	Не более 15	8	10	13	8	10	6
Количественное содержание	Не менее 98,5%	99,0	99,2	98,8	99,0	99,1	99,3
Посторонние примеси	Не более 1% (ТСХ)	Менее 0,5	Менее 0,5	Менее 0,5	Менее 0,5	Менее 0,5	Менее 0,5
Стабильность	2 года при 20°С	2 года	2 года	2 года	2 года	2 года	2 года

Биологические и фармакологические исследования

1. Изучение противовоспалительной и бронхолитической активностей N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамида (далее ЛХТ-15-06)

В экспериментах были использованы морские свинки обоего пола массой 400-600 г, крысы-самцы Wistar массой 200-250 г, нелинейные белые мыши-самцы массой 20-25 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария ОАО «ВНЦ БАВ» при 12-часовом режиме освещения, доступе к воде и корму - ad libitum.

Экспериментальные исследования проведены в соответствии с «Руководством по экспериментальному доклиническому изучению новых фармакологических веществ» (М., 2005).

В качестве референтных препаратов использовали кромогликат натрия и будесонид.

1.1. Бронхорасширяющее действие ЛХТ 15-06 на модели гистамин-индуцированного бронхоспазма in vivo у ненаркотизированной морской свинки с аэрозольным воздействием бронхоконстриктора.

У морских свинок индуцировали бронхоспазм аэрозольным введением гистамина (1000 мкг/кг) с помощью небулайзера ("Amron"). Через сутки превентивно (за 1 час до повторного введения гистамина) аэрозольным способом животным однократно вводили тестируемое вещество в виде 1%-ного водного раствора и ингаляционный кортикостероид будесонид в виде референтного препарата в терапевтической дозе 30 мкг/кг. Полученные данные представлены в таблице 2.

Таблица 2
Протективный эффект ЛХТ 15-06 (1%-ный р-р) на модели бронхоспазма in vivo у ненаркотизированной морской свинки с аэрозольным воздействием бронхоконстриктора (гистамин) (М±m)
Вещество N=6	До лечения	После лечения
Экспозиция (сек)	Острая фаза (сек)	Подострая фаза (сек)	Экспозиция (сек)	Острая фаза (сек)	Подострая фаза (сек)
Контроль	240±10	185±30	320±25	240±30**	190±10	30±15
ЛХТ 15-06	179±50	310±25	260±30	180±15	0	80±25
Будесонид	220±40	96±25	256±35	200±50*	80±15	120±25
Примечание:
* - гибель 25% животных;
** - гибель 40% животных.

Контрольные морские свинки реагировали на аэрозольное воздействие гистамина выраженной бронхоспастической реакцией, проявляющейся в тихипноэ и падении животного на бок. Длительность острой фазы бронхоспазма составляла в среднем 190±10 секунд, а затем после возвращения животного в нормальное положение учащение дыхания сохранялось еще на протяжении 300±15 секунд. В группе морских свинок, получавших ингаляционно через небулайзер ЛХТ 15-06, острая фаза бронхоспастической реакции на гистамин либо практически не развивалась (у 90% животных), либо значительно сокращалась продолжительность острой и подострой фаз бронхоспастической реакции (на 43±4,0% и 58±8,8%, соответственно). При применении препарата сравнения будесонида регистрировалась гибель 40,0±10,0% животных от острого удушья, в 40,0±5,5% случаев препарат полностью предотвращал бронхоспазм, а в 20,0±2,0% сокращал продолжительность острой и подострой фаз (на 27,5±3,0% и 40,0±4,5%, соответственно). Таким образом, протективный эффект ЛХТ 15-06 соответствовал уровню активности референтного препарата будесонида. Кроме того, в данной группе, в отличие от всех остальных групп, не отмечалось гибели животных от острого удушья.

Аналогичный результат выявлен при ингаляционном введении ЛХТ 15-06 в концентрации в 10 раз меньшей (0,1%-ный р-р): ингаляция вещества в данной концентрации вызывала полную профилактику развития бронхоспазма в 33% случаев. У остальных 67% животных острая фаза не развивалась и отмечалось значительное сокращение продолжительности подострой фазы бронхоспастической реакции - на 60,9%, соответственно. Важно отметить, что в отличие от контрольной группы, в которой от бронхоспазма погибло 65% животных, в группе, получавшей ингаляции ЛХТ 15-06, гибель животных от острого бронхоспазма не была зарегистрирована (таблица 3).

Таким образом, ингаляционное применение ЛХТ 15-06 в обеих концентрациях (1%-ный и 0,1%-ный раствор) вызывало сопоставимые бронхопротективные эффекты и не уступало по эффективности референтному препарату будесонид, что свидетельствует о высокой специфической фармакологической активности ЛХТ 15-06.

Таблица 3
Протективный эффект ЛХТ 15-06 (0,1%-ный р-р) на модели бронхоспазма in vivo у ненаркотизированной морской свинки с аэрозольным воздействием бронхоконстриктора (гистамин) (М±m)
Вещество N=6	До лечения	После лечения
Экспозиция (сек)	Острая фаза (сек)	Подострая фаза (сек)	Экспозиция (сек)	Острая фаза (сек)	Подострая фаза (сек)
Контроль	255±41	190±23	310±25	140±30**	290±45	285±62
ЛХТ 15-06	160±50	260±61	230±30	300±47	0	90±15
Будесонид	190±34	106±25	250±38	280±52*	0	105±25
Примечание:
* - гибель 30% животных;
**- гибель 65% животных.

1.2. Изучение бронхопротективного действия ЛХТ 15-06 на модели гистамин-индуцированного бронхоспазма по методу Konzett et Rossler (1940)

У наркотизированной морской свинки (этаминал натрий 70 мг/кг, интраперитонеально) выделяли трахею, вставляли ее в канюлю, которую подсоединяли с помощью системы полихлорвиниловых трубочек к датчику бронхоспазма и аппарату искусственного дыхания (Ugo Basile). В течение эксперимента поддерживали определенный режим дыхания. В качестве индуктора бронхоспазма вводили гистамин (10 мкг/кг). ЛХТ 15-06 и препарат сравнения вводили однократно интраперитонеально в дозе 10 мг/кг. С помощью самописца, присоединенного к датчику, регистрировали изменения сопротивления дыхательных путей воздушному потоку (величину бронхоконстрикторной реакции). Эффект изучаемого вещества оценивали по степени торможения бронхоконстрикторной реакции, выраженной в процентах по отношению к максимальной. Максимальный бронхоспазм вызывали полным пережатием трубочки, соединенной с трахеальной канюлей (принимали за 100%). Полученные результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4
Влияние ЛХТ 15-06 в сравнении с кромогликата натрием на амплитуду дыхания в условиях гистамин-индуцированного бронхоспазма у морских свинок (интраперитонеальное введение ЛХТ 15-06) (M±m)
Вещество N=6	Амплитуда дыхания, исходный уровень, мм*	Максимальная амплитуда (вызванная компрессией дыхательной трубки), мм	Амплитуда дыхания через 20 мин после введения гистамина, мм
Контроль	20,75±1,9	94,6±8,4	89,14±4,6
ЛХТ 15-06	21±1,5	94,0±5,2	32,3±2,8
Кромогликат натрий	19,8±1,07	95,2±10,1	53,7±2,5
Примечание: * - единицы измерения - мм графика, очерченного самописцем.

Таблица 5
Торможение гистамин-индуцированного бронхоспазма у морских свинок при интраперитонеальном введении ЛХТ 15-06 (M±m)
Вещество N=6	Бронхоспазм (% от максимального)	Торможение бронхоспазма, %
Контроль	91,9±7,4
ЛХТ 15-06	35,14±2,2**	64,9%
Кромогликат натрий	45,17±3,1**	54,8%
**р<0,01 - различия с контролем достоверны

Как видно из данных таблиц 4 и 5, гистамин вызывал развитие мощной бронхоконстрикторной реакции: амплитуда дыхания составляла 91,9% от максимальной. ЛХТ 15-06 значительно тормозил развитие гистамин-индуцированной бронхоспастической реакции (торможение составило 64,9%) у наркотизированных морских свинок. Препарат сравнения - кромогликат натрий - оказывал менее выраженный эффект, составивший 54,8%. Следовательно, не только при ингаляционном, но и интраперитонеальном введении ЛХТ 15-06 существенно редуцировал бронхоспазм у морских свинок, вызванный гистамином.

1.3. Изучение бронхопротективного действия ЛХТ 15-06 на модели антиген-индуцированного бронхоспазма у активно сенсибилизированных ненаркотизированных морских свинок

Бронхоспастическую реакцию у активно сенсибилизированных морских свинок вызывали разрешающей дозой овальбумина (ОА), который вводили в виде аэрозоля (0,5%-ного в 0,9%-ном растворе NaCl) с помощью небулайзера до появления признаков анафилактического бронхоспазма с регистрацией экспозиции, длительности острой и подострой фаз удушья. ЛХТ 15-06 вводили однократно путем небулизации в виде 0,1%-ного раствора в течение 3 минут. Была использована именно эта концентрация вещества, поскольку ранее было показано, что в данной концентрации на модели гистамин-вызванного бронхоспазма у неиммунных морских свинок препарат высоко активен именно в этой концентрации. Через 60 минут после запыления исследуемого вещества животным таким же способом вводили раствор овальбумина.

Таблица 6
Влияние ЛХТ 15-06 на антиген-индуцированный бронхоспазм у активно иммунизированных ненаркотизированных морских свинок (М±m)
Группа	n	Латентный период, сек	Острая фаза, сек	Подострая фаза, сек
Контроль, овальбумин	6	210±20	310±30*	270±50
ЛХТ 15-06 1%-ный раствор	6	310±30	230±40**	220±30
Будесонид	6	360±28	55±4**	210±13
Примечание:
* - гибель 50% животных;
** - р<0,01 - различия с контролем достоверны

В контрольной группе после ингаляции разрешающей дозы антигена (овальбумина) у морских свинок развивалась сильная бронхоспастическая реакция, от которой погибло 50% животных.

При ингаляционном введении 1%-ного ЛХТ 15-06 достоверно сокращалась продолжительность острой и подострой фаз бронхоспазма, кроме того, в 50% случаев острая фаза отсутствовала, что говорит о высокой активности тестируемого вещества, способного в ряде случаев полностью предотвращать ОА-ндуцированный бронхоспазм. В условиях данной модели ЛХТ 15-06 несколько уступал по своей эффективности референтному препарату - будесониду (30 мкг/кг).

Таким образом, результаты изучения ЛХТ 15-06 на моделях бронхоспазма in vivo при ингаляционном и интраперитонеальном введении показали его высокую бронхопротективную активность, по степени выраженности которой он либо сопоставим с препаратом сравнения, либо превосходит его.

1.4. Изучение противовоспалительной активности ЛХТ 15-06 на модели сефадекс-индуцированного бронхоальвеолита у крыс

Для постановки эксперимента были сформированы следующие группы: 1) интактный контроль; 2) контроль, крысы, получавшие только сефадекс (модель); 3) крысы, получавшие ЛХТ 15-06 на фоне индукции бронхоальвеолита; 4) животные, получавшие будесонид в качестве референтного препарата. ЛХТ 15-06 в разовой дозе 10 мг/кг вводили интраперитонеально за 30 минут до введения сефадекса. Инсуффляцию сефадекса повторяли на следующие (вторые) сутки эксперимента. Тестируемые препараты вводили на протяжении 7 суток.

Курсовое внутрибрюшинное введение ЛХТ 15-06 в дозе 10 мг/кг вызывает выраженное противовоспалительное действие в отношении развития сефадекс-индуцированного бронхоальвеолита.

Данные цитологического исследования БАЛ представлены таблице 7.

Таблица 7
Характеристика бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) в исследуемых группах (М±m)
Группы животных	Альвеолярный эпителий (клетки в поле зрения микроскопа), М±m	Полиморфноядерные лейкоциты (клетки в поле зрения микроскопа), М±m	Прочие клетки
1. Контроль, интактные животные	2,0±0,5	Отсутствуют	Отсутствуют
2. Контроль, сефадекс (модель)	3,0±1,0	5,0±2,0	Единичные скопления мерцательного эпителия
3. (ЛХТ 15-06) 10 мг/кг в/бр.	2,0±1,0	Отсутствуют	Отсутствуют
5. Будесонид 1 мг/кг в/бр.	1,0±0,5	Отсутствуют	Единичные

Показатель цитологического исследования БАЛ представляется крайне важным, поскольку воспаление, индуцированное сефадексом, имеет прежде всего, нейтрофильный характер. А противовоспалительное действие нового препарата может играть важную роль в терапии ассоциированных с воспалением, в том числе и нейтрофильной его составляющей, бронхолегочных заболеваний (бронхиальной астмы, ХОБЛ).

1.5. Противовоспалительное действие ЛХТ 15-06 при ингаляционном введении на модели бронхоальвеолита у крыс

Животные были разделены на 5 групп: 1) контроль, интактные; 2) сефадекс (модель); 3) крысы, получавшие ЛХТ 15-06 на фоне индукции бронхоальвеолита; 4) животные, получавшие будесонид на фоне введения сефадекса. За один час до введения сефадекса животным ингаляционно через небулайзер ("Amron") вводили ЛХТ 15-06 в виде суспензии 5 мг/кг, будесонид в виде суспензии - 1 мг/кг. Сефадекс (5 мг/кг) вводили с помощью инсуффлятора под легким эфирным наркозом. Запыление сефадекса повторяли на следующие (вторые) сутки эксперимента. Изучаемые вещества ингалировали животным ежедневно на протяжении всего эксперимента (7 суток).

Данные по влиянию ЛХТ 15-06 на цитологические характеристики БАЛ приведены в таблице 8.

Таблица 8
Влияние ЛХТ 15-06 на относительное содержание клеток в 1 мкл бронхоальвеолярного лаважа у крыс Вистар
Группа Субпопуляция	Интактный-контроль	Модель (сефадекс)	ЛХТ 15-06 5 мг/кг	Будесонид 1,0 мг/кг
N=8	n=10	n=10	n=10
Макрофаги	77,9±1,2	59,75±4,0	75,7±2,1*	89,6±1,1*
Лимфоциты	18,0±2,5	9,6±1,5	17,6±2,5*	4,8±2,1*
Нейтрофилы	1,6±0,5	27,75±4,0	5,2±0,5*	4,0±0,5*
Эозинофилы	0	0,1±0,1	0	0
Примечание: * - различия с контролем достоверны (р<0,001).

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что ЛХТ 15-06 показал хорошую активность в условиях моделирования бронхоальвеолита у крыс, индуцированного инсуффляцией сефадекса. При его ингаляционном введении цитологические и гистологические характеристики практически отвечали параметрам нормы и эквивалентны таковым в группе интактного контроля. Лечение ЛХТ 15-06 способствовало более быстрому разрешению островоспалительного процесса в бронхах и паренхиме легкого, что подтвердилось данными цитологического исследования БАЛ.

Результаты экспериментального изучения фармакологической активности оригинального вещества N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамида (ЛХТ 15-06) показали, что изучаемое оригинальное вещество проявляет существенное прямое бронхорелаксирующее действие в отношении всех видов контрактур гладкомышечного препарата изолированной трахеи, индуцированных гистамином, овальбумином. Бронхолитический эффект, выявленный in vitro, нашел свое подтверждение в условиях моделирования бронхоспазма in vivo, что подтверждает его антиастматическую эффективность. В проявлении бронхопротективных эффектов ЛХТ 15-06 не уступал референтным препаратам - кромогликату натрия и будесониду.

2. Изучение противотуберкулезной активности

При проведении внеэкспериментального компьютерного прогноза структура-активность по базе данных фармакологически активных веществ установлено, что N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамида (ЛХТ 15-06) по своей структуре в высокой степени вероятности обладает противотуберкулезной активностью.

Экспериментальное изучение ЛХТ 15-06 проведено на моделях in vitro и in vivo на культурах микобактерий туберкулеза человеческого и бычьего типов, свеже выделенных от больных туберкулезом легких.

Микробиологические исследования свидетельствуют, что ЛХТ 15-06 в концентрации 40 мкг/мл обладает бактерицидным, а в концентрации 10 мкг/мл и 20 мкг/мл проявляет бактериостатическое действие в отношении чувствительных к противотуберкулезному препарату изониазид лабораторных штаммов клинических изолятов микобактерий туберкулеза (МБТ).

Изучение ингибирующей концентрации ЛХТ 15-06 определяли на лабораторных штаммах МБТ, используя плотную яичную среду Попеску. Препаратом сравнения выбран противотуберкулезный препарат изониазид. Результаты представлены в таблице 9.

Таблица 9
Ингибирующая активность ЛХТ 15-06 в отношении лабораторных штаммов МБТ
минимальная концентрация	ЛХТ 15-06	изониазид
мкг/мл	0,15	0,18

По минимальной ингибирующей концентрации ЛХТ 15-06 не уступает препарату сравнения изониазиду.

Изучение бактериостатической эффективности ЛХТ 15-06 в сравнении с изониазидом проводили на мышах-самцах линии CBA/L. Животных подвергали действию клинических изолятов микобактерий туберкулеза человеческого типа. Затем внутрибрюшинно в течение 30 дней ежедневно по 2 раза вводили в виде суспензии ЛХТ 15-06 5 мг/кг и изониазид 25 мг/кг. Данные представлены в таблице 10.

Таблица 10
Бактереостатические эффекты ЛХТ 15-06 в отношении клинических изолятов микобактерий туберкулеза человеческого типа
индекс эффективности	ЛХТ 15-06	изониазид
%	90,23	82,01

Таким образом, ЛХТ 15-06 по экспериментальным данным, по минимальной ингибирующей концентрации, индексу эффективности не уступает широко применяемому в медицине противотуберкулезному препарату изониазид.

Полученные фармакологические данные позволяют предполагать возможность применения предлагаемой фармацевтической композиции на основе нового соединения для профилактики и лечения воспалительных, бронхолегочных (бронхиты, пневмонии, бронхиальная астма) заболеваний, туберкулеза.