способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума

Формула изобретения

Способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума, включающий использование штаммов Е. coli, способных продуцировать термолабильный, термостабильный и шигаподобный токсины, их культивирование с получением культуральной жидкости, инактивацию культур формалином, объединение равных объемов культур с получением комплексного препарата, содержащего 3 вида антигенов, стерилизующую фильтрацию с отделением микробной массы от среды культивирования, разведение антигена фосфатно-буферным раствором pH 7,2 и сенсибилизацию посредством его соединения в равных объемах с 2,5% формалинизированными эритроцитами барана в течение 2 ч при 37°C.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и иммунологии и может быть использовано в качестве серологического метода выявления в сыворотке крови животных антител к экзотоксинам Escherichia coli - возбудителя эшерихиоза (колибактериоза) сельскохозяйственных животных.

Важным звеном в системе мероприятий по профилактике эшерихиоза является иммунизация животных специфическими вакцинами. При этом установлено, что наиболее эффективными являются те вакцины, которые содержат в своем составе инактивированные экзотоксины возбудителя (Биологические препараты для специфической профилактики и терапии эшерихиоза животных / М.К.Пирожков // Дисс. док. вет. наук. - Москва, 2002, - 298 с.). Однако данные вещества в меньшей степени, чем соматические O-антигены обладают иммунногенной активностью. Поэтому при разработке вакцинных препаратов, дозы и схемы их применения необходимо устанавливать величину выработки специфических антител. В настоящее время общедоступным и простым методом выявления антител к растворимым антигенам является реакция преципитации в агаровом геле (Лабораторные тесты. Микробиологическая и вирусологическая диагностика. Ч.1. под общей ред. проф. М.Х.Турьянова. М.: КАППА, 1995. - С.90). Однако данная реакция хотя и является специфичной, но не обладает высокой чувствительностью, а самое главное проявляется только через 48 ч.

Известен более чувствительный метод - реакция непрямой гемагглютинации, в которой используются сенсибилизированные эритроциты барана (Каральник Б.В. Эритроцитарные диагностикумы. - М.: Медицина. 1976). Данным методом можно выявлять антитела или антигены уже через 2 ч.

Известен способ получения пастереллезного эритроцитарного диагностикума (патент РФ на изобретение № 2110801. - 1995). Данный диагностикум в качестве носителя содержит стабилизированные бараньи эритроциты, а в качестве сенситина - пастереллезную сыворотку к капсульному антигену, выделенному из клеток эпизоотического штамма Pasteurella multocida. Данным диагностикумом выявляется капсульный антиген пастереллы.

Известен способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума (патент РФ на изобретение № 2120300. - 1998), заключающийся в сенсибилизаци формалинизированных эритроцитов барана смесью антигенов, экстрагируемых мочевиной из возбудителя иерсиниоза серовариантов 03; 09; 05, 27; 06, 30. Данный диагностикум позволяет выявлять в крови животных и человека антитела сразу к нескольким соматическим O-антигенам иерсиний.

Однако эти диагностикумы разработаны для выявления в сыворотке крови антител только к пастереллам и иерсиниям определенных серотипов.

Известен способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума с использованием в качестве антигена капсульного полисахарида из Escherichia coli при сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана посредством инкубации антигена с формалинизированными эритроцитами в течение 2 часов при 37°C (SU 1072863 A, 15.02.1984, (D2)) - прототип.

Данный диагностикум предназначен для выявления антител к капсульному антигену кишечной палочки, но он не может быть использован для выявления в сыворотке крови животных антител к экзотоксинам Escherichia coli. В доступной научно-технической литературе не обнаружено информации о способе приготовления эритроцитарного диагностикума для выявления антител к экзотоксинам Escherichia coli.

Техническим решением задачи является обеспечение возможности выявления в сыворотке крови животных антител в экзотоксинам Escherichia coli и расширения диагностических возможностей.

Поставленная задача достигается тем, что способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума включает использование штаммов E.coli, способных продуцировать термолабильный, термостабильный и шигаподобный токсины, их культивирование с получением культуральной жидкости, инактивацию культур формалином, объединение равных объемов культур с получением комплексного препарата, содержащего 3 вида антигенов, стерилизующую фильтрацию с отделением микробной массы от среды культивирования, разведение антигена фосфатно-буферным раствором pH 7,2 и сенсибилизацию посредством его соединения в равных объемах с 2,5% формалинизированными эритроцитами барана в течение 2 часов при 37°C.

Данный диагностикум позволяет определить антитела в сыворотке крови животных сразу к трем токсинам кишечной палочки - термолабильному (TL), термостабильному (TS) и шигаподобному (STX), путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана одновременно смесью растворимых антигенов - инактивированных формалином термолабильного, термостабильного и шигаподобного токсинов, находящихся в среде культивирования токсигенных Escherichia coli.

Способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума включает в себя следующие этапы: 1) получение антигенов; 2) сенсибилизация эритроцитов смесью антигенов.

Пример конкретного осуществления получения эритроцитарного антигенного диагностикума.

1. Для получения антигенов (экзотоксинов) используют токсигенные штаммы Escherichia coli, обладающие способностью продуцировать термолабильный, термостабильный и шигаподобный токсины. Отобранные штаммы по отдельности засевают в пробирки с 10 мл бульона Хоттингера, после чего их помещают в термостат, где культивируют при 37°C в течение 6-8 ч до появления легкой мути, свидетельствующей о росте микроорганизмов. Затем полученные культуры переносят в колбы с 200-300 мл бульона Хоттингера и инкубируют при 37°C в течение 7 суток. Ежедневно 2 раза в сутки колбы встряхивают. Перед окончанием инкубирования из каждой колбы отбирают по 10 мл культуральной жидкости и используют ее после центрифугирования при 10 тыс. об/мин в течение 30 мин для определения наличия токсинов.

Наличие токсинов в культуральной среде определяют с помощью биотеста на инфузориях стилонихиях по Пат. РФ № 2262529, а именно по проценту выживания инфузорий. Для этого на предметное стекло наносят 3 капли среды со стилонихиями (суточная культура), проводят с помощью бинокулярной лупы или микроскопа (увеличение 2×8) их предварительный подсчет (для удобства подсчета желательно, чтобы количество живых активных стилонихий составляло 10-20 особей), затем добавляют 1 каплю исследуемой бульонной культуры E.coli. После чего, спустя 5 минут производят предварительный просмотр и подсчет количества живых инфузорий, для того чтобы исключить погрешность, связанную с влиянием различных факторов окружающей среды - запах, перепад температуры, избыточное осмотическое давление и прочее, так как инфузории являются весьма чувствительными к ним. Стекла с исследуемым материалом помещают в чашки Петри, которые ставят в термостат с температурой, оптимальной для инфузорий - 18-23°C. Чтобы капли с инфузориями не высыхали, на дно чашки помещают фильтровальную бумагу, смоченную водопроводной водой. По истечении 2-х часов производят окончательный подсчет числа живых инфузорий, который сравнивают с первоначальным значением. Подсчитывают всех стилонихий (как подвижные, так и не подвижные), погибшими считаются только лизированные. Для получения достоверных данных, каждую пробу культуральной среды токсигенной кишечной палочки исследуют трижды (ставим биотест одновременно на 3 стеклах), затем подсчитывается средний показатель. При наличии в культуральной среде экзотоксина количество погибших инфузорий должно быть не менее 70-80%, в то время как количество погибших инфузорий в контрольной пробе (стерильный питательный бульон), не содержащей токсин, не должно превышать 5%.

При наличии токсинов в оставшиеся культуры добавляют формалин до концентрации 0,3-0,4%. Инактивацию культур проводят в течение 14 суток при температуре 37°C с ежедневным двукратным перемешиванием. После завершения инактивации равные объемы культур объединяют, получив, таким образом, комплексный препарат, содержащий 3 вида антигенов. С помощью стерилизующей фильтрации отделяют микробную массу от среды культивирования.

2. Сенсибилизацию эритроцитов осуществляют следующим образом. Антиген разводят фосфатно-буферным раствором (pH 7,2) в соотношении 1:2 и соединяют (сенсибилизируют) в равных объемах с формалинизированными эритроцитами барана, предварительно разведенными тем же буферным раствором до 2,5% концентрации. Сенсибилизацию проводят в течение 2 ч при температуре 37°C. После этого сенсибилизированные эритроциты трижды отмывают центрифугированием при 1500 об/мин 10 мин 5-кратным объемом фосфатно-буферным раствором с pH 7,2. Осадок отмытых сенсибилизированных эритроцитов суспензируют в фосфатно-буферном растворе до 10% концентрации и хранят в условиях холодильника.

Контроль сенсибилизации проводят в реакции непрямой гемагглютинации с сыворотками крови кроликов, иммунизированных токсинами кишечной палочки.

Оптимальные условия сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана подобраны опытным путем. Для сенсибилизации эритроцитов лучше использовать антиген в разведении 1:2, т.к. при более сильном разведении (1:4 и выше) чувствительность реакции снижалась в 4-8 раз, а при более меньшем разведении (1:1) чувствительность не изменялась, но требовалось увеличить количество отмываний эритроцитов от остатков антигена. При сокращении времени сенсибилизации эритроцитов наблюдали снижение чувствительности диагностикума, а при увеличении - чувствительность не повышалась.

Полученный таким образом эритроцитарный диагностикум применяют для выявления в реакции непрямой гемагглютинации антител в сыворотке крови животных, иммунизированных инактивированными экзотоксинами (термолабильным, термостабильным и шигаподобным) кишечной палочки.

Результаты определения различными серологическими методами специфических антител в сыворотке крови кроликов, иммунизированных отдельными инактивированными токсинами, представлены в таблице 1. Из материалов данной таблицы видно, что чувствительность реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с использованием приготовленного эритроцитарного антигенного диагностикума в 16 раз превосходит чувствительность реакции диффузной преципитации (РДП) в агаром геле. Методом РНГА с использованием разработанного диагностикума выявляются антитела к термолабильному и шигаподобному токсинам при разведении сыворотки крови 1:128, а к термостабильному токсину - 1:64. Антитела к этим же токсинам в реакции иммуннодиффузии выявлялись только в разведении сыворотки 1:4-1:8.

Таблица 1
Уровень антитоксических антител у иммунизированных TL-, TS- и STX-анатоксинами кроликов, выявленных методом РНГА (с использованием разработанного диагностикума) и РДП
Титры антител к токсинам E.coli	Титры антител, установленные с помощью
РНГА	РДП
TL	1:128	1:8
TS	1:64	1:4
STX	1:128	1:8

Аналогичный результат был получен при выявлении поствакцинальных антител при использовании для иммунизации кроликов комплексного препарата (анатоксина), содержащего антигены сразу трех токсинов кишечной палочки. Результаты данного опыта отражены в таблице 2, из данных которой видно, что

Таблица 2
Выявление антител к токсинам E.coli у иммунизированных комплексным антигеном (содержащим антигены термолабильного, термостабильного и шигаподобного токсинов) кроликов
Метод	Разведение сыворотки
1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256	1:512
РНГА	++++	++++	++++	++++	++++	+++	+++	+	-
РДП	++++	++++	+++	-	-	-	-	-	-

выраженная реакция (4 и 3 креста) гемагглютинации наблюдается до разведения сыворотки крови 1:128, в то время как выраженная зона преципитации образовывалась только при разведении сыворотки крови 1:8, следовательно, с помощью РНГА антитела выявляются в гораздо меньших количествах, чем с помощью РДП, а это значит, что реакция непрямой гемагглютинации более чувствительная.

Таким образом, авторами разработан простой, дешевый и чувствительный диагностикум, позволяющий в течение 2 ч проводить обнаружение специфических (антитоксических) антител после иммунизации животных эшерихиозным анатоксином.