производные камптотецина с противоопухолевой активностью

Формула изобретения

1. Соединение общей формулы I:



где R представляет собой F,

R1 представляет собой водород;

R2 представляет собой водород;

R3 представляет собой водород;

его фармацевтически приемлемые соли, диастереомеры и

соответствующие смеси.

2. Способ получения соединения формулы (I), по существу, включающий стадии, показанные на следующей схеме, где

a) защита гидроксигрупп предшественника;

b) дериватизация в положении 5 посредством образования карбаниона и реакции с электрофильным реагентом;

c) снятие защиты с гидроксигрупп;

Схема



где R, R1, R2 и R3 имеют значения, описанные выше, и PG представляет собой защитную группу для ОН.

3. Фармацевтическая композиция для лечения опухолей, содержащая соединение формулы (I) вместе с фармацевтически приемлемыми носителями и эксципиентами.

4. Фармацевтическая композиция по п.3 в форме, подходящей для перорального или парентерального введения.

5. Применение соединения по п.1 или композиции по пп.3-4 для получения лекарственного средства для лечения опухолей.

6. Применение по п.5, при котором указанное лекарственное средство применяют для лечения солидных опухолей и лейкозов, в частности опухолей легкого, яичника, груди, желудка, печени, простаты, сарком мягких тканей, пищевода, поджелудочной железы, головы и шеи, глиобластомы, хронических и острых миелоцитарных лейкозов.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к новым производным камптотецина, обладающим противоопухолевой активностью, способам их получения, их применению в качестве противоопухолевых лекарственных средств и фармацевтическим композициям, их содержащим.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Камптотецин является алкалоидом, экстрагированным из Camptotheca acuminata (Nyssaceae), впервые описанным Wall и Wani в 1966 г. (J. Am. Chem. Soc. 1966, 88, 3888-3890). Камптотецин, хотя и обладает широким спектром противоопухолевой активности, особенно против опухоли толстой кишки и других сòлидных опухолей и лейкозов, не применяют в терапии из-за его высокой токсичности, которая, в частности, проявляется в форме геморрагического цистита, желудочно-кишечной токсичности и миелосупрессии.

Ряд аналогов камптотецина был синтезирован с целью получения соединений, обладающих низкой токсичностью и высокой растворимостью. В настоящее время в клинической практике применяют два лекарственных средства, а именно СРТ-11 и топотекан. Другие производные, такие как белотекан, рубитекан, эксатекан, гиматекан, пегамотекан, луртотекан, каренитецин, афелетекан, гомокамптотецин, дифломотекан и многие другие, проходят клинические испытания. Соединение СРТ-11 является хорошо растворимым пролекарством для 10-гидрокси-7-этилкамптотецина (общеизвестного как SN-38), разрешенного для лечения многих солидных опухолей и асцитов (толстой и прямой кишки, кожи, желудка, легкого, шейки матки, яичников, неходжкинской лимфомы).

Топотекан является соединением, растворимым в физиологическом растворе, активным против опухолей легкого, желудка, печени, яичника, груди, простаты, пищевода, прямой кишки, сарком мягких тканей, головы и шеи, глиобластомы, хронических и острых миелоцитарных лейкозов. Однако топотекан показывает важные побочные эффекты, такие как нейтропения и тромбоцитопения.

Луртотекан является более растворимым производным, обладающим активностью в отношении опухолей шеи, яичника, груди, толстой и прямой кишки и легочной микроцитомы. Однако луртотекан также обладает гематотоксичностью.

Рубитекан является пролекарстом для перорального применения, эффективным против опухолей поджелудочной железы, яичника и груди.

Камптотецин и его аналоги, как это имеет место со всеми ингибиторами топоизомеразы I, эффективны против опухолей, невосприимчивых к традиционным лекарственным средствам, включая ингибиторы топоизомеразы II; поддерживают высокие уровни топоизомеразы в течение всего клеточного цикла, не вызывая множественной лекарственной резистентности (Pgo или MRP) или метаболизма детоксификации, опосредуемого ферментом.

В настоящее время исследования сфокусированы на новых ингибиторах топоизомеразы I, обладающих более низкой токсичностью, чем лекарственные средства, применяемые в настоящее время.

Производные камптотецина с открытым кольцом показывают высокое белковое связывание (в частности, с альбумином) и низкое распределение в опухолевых тканях. Вследствие этого продукт накапливается в организме и на опухоли оказывается лишь слабое воздействие.

Напротив, высокая липофильность лактоновой формы способствует адгезии производных камптотецина к клеточным мембранам, в частности эритроцитов, что влияет на отношение распределения между тканями и плазмой. По этой причине исследования фокусируют на двух альтернативных подходах: а) создание продуктов с низким белковым связыванием, но еще обладающих хорошей растворимостью; b) создание высокоэффективных продуктов, обладающих терапевтическим эффектом даже в крайне малых дозах.

Модификации в положениях 7, 9, 10 и 11 обычно оказываются хорошо переносимыми и не влияющими на стабильность тройного комплекса ДНК-топоизомераза-I-камптотецин, образование которого отвечает за противоопухолевую активность данных соединений.

Продукты с 20R-конфигурацией оказались либо неактивными, либо значительно менее активными, чем продукты с 20S-конфигурацией, которая совпадает с естественной конфигурацией.

Как правило, модификации в положении 5 считают неблагоприятными для образования тройного комплекса, тогда как модификации в пиридоновых кольцах D и E, согласно некоторым сообщениям, вредны для активности продукта.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте настоящее изобретение относится к производным камптотецина общей формулы I:

где

R представляет собой F, Cl, Br, I, -N₃, NH₂, -NR'R", -COOR', -CONR'R", -NHR'"-NR'R", в котором R', R" и R'" могут представлять собой H, алкил, арил, арилалкил, ацил, алкоксикарбонил, арилоксикарбонил;

R1 представляет собой алкил, аминоалкил, гидроксиалкил, нитрил, алкоксиминогруппу, арилоксиминогруппу, силилалкил;

R2 представляет собой водород, гидроксил, алкоксигруппу, аминоалкил;

R3 представляет собой водород, необязательно защищенный гидроксил, алкоксигруппу, аминоалкил;

где алкил, ацил, алкоксигруппа, аминоалкил или алкоксиминогруппа могут содержать от 1 до 8, предпочтительно от 1 до 4 атомов углерода в прямой или разветвленной цепи, и арил и арилоксигруппа могут содержать от 5 до 10 атомов углерода;

их фармацевтически приемлемым солям, изомерам, энантиомерам, диастереомерам и соответствующим смесям.

Соединения согласно настоящему изобретению показывают низкое белковое связывание и обладают хорошей растворимостью и высокой эффективностью даже в очень малых дозах.

Предпочтительный путь синтеза для получения соединений согласно настоящему изобретению иллюстрирован на схеме и включает в себя следующие стадии:

a) защиту гидроксигрупп предшественника;

b) дериватизацию в положении 5 посредством образования карбаниона и реакции с электрофильным реагентом;

c) снятие защиты с гидроксигрупп.

Схема

На схеме R, R1, R2 и R3 имеют значения, описанные выше, и PG представляет собой защитную группу гидроксила.

Предшественники могут быть доступными коммерчески или их можно получить, как описано в литературе.

Карбанионы в положении 5 можно получить обработкой предшественника сильным органическим основанием, предпочтительно LiHMDS.

Карбанион реагирует in situ с электрофильным реагентом, таким как источник галогена или азадикарбоксилат, изоцианат, хлоркарбонильное производное, тозилазид.

В качестве защитных групп гидроксилов предпочтительны силилы и карбаматы или их комбинации.

Соединения согласно настоящему изобретению испытывали в тестах на цитотоксичность в широкой группе опухолевых клеток. В качестве примера сообщают данные о цитотоксичности на линии клеток NCI-H460 (рак NSCL), относящиеся к двум соединениям формулы (I), с использованием камптотецина и препаратов топотекана и SN-38 в качестве сравнительных веществ:

Название	Формула	NCI-H460 IC 50 (мкг/мл) Количество клеток
Камптотецин	мол.м.=348,36 C20H 16N2O4	0,115±0,0174
Топотекан	мол.м.=421 C23H23 N3O5	0,63±0,44
SN38	мол.м.=392,42 C22H 20N2O5	0,0865±0,0049

5-F-камптотецин	мол.м.=366 C20H15 FN2O4	Изомер 1: 20,6±6,8 Изомер 2: 20±5,1
5-N3 -камптотецин	мол.м.=389 C20H15 N5O4	Изомер 1: 4,18±1,2 Изомер 2: 2,59±0,7
5-ди-трет-бутоксикарбонил-гидразинокамптотецин	мол.м.=578,63 C30H 34N4O8	Изомер 1: 50±16 Изомер 2: >100
5-NH2 -камптотецин	мол.м.=363,38 C20H 17N3O4	11±3,1
5-ди-трет-бутоксикарбонил-гидразинокамптотецин	мол.м.=646,66 C36H 30N4O8	Изомеры 1: 55±15 Изомеры 2: 39±9,7

Наиболее активные соединения оценивали в исследовании расщепления ДНК, измеряя активную концентрацию и устойчивость к повреждению (см. раздел Примеры ). Производные формулы (I) демонстрируют удивительно более высокую устойчивость в блокировании репликации ДНК, чем сравнительные стандарты (особенно топотекан и камптотецин), сохраняя при этом эффективную цитотоксическую активность.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединение формулы (I) вместе с фармацевтически приемлемыми носителями и эксципиентами. Фармацевтические формы, подходящие для перорального или парентерального введения соединений (I), могут быть твердыми, предпочтительно капсулами, таблетками и гранулами, или жидкими, предпочтительно растворами для инъекций или инфузий.

Подходящим образом разработанные рецептуры соединения согласно настоящему изобретению можно применять для лечения солидных опухолей и лейкозов, в частности опухолей легкого, яичника, груди, желудка, печени, простаты, сарком мягких тканей, головы и шеи, пищевода, поджелудочной железы, толстой кишки, прямой кишки, глиобластомы, хронических и острых миелоцитарных лейкозов.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР I - 20-OTES-камптотецин

Камптотецин (0,100 г, 0,287 ммоль) суспендировали в безводном диметилформамиде (3 мл) в инертной атмосфере и к полученной суспензии добавляли имидазол (0,980 г, 1,44 ммоль). Смесь перемешивали 10 минут, затем в нее по каплям добавляли триэтилсилилхлорид (TES-Cl) (0,193 мл, 1,15 ммоль), с последующим добавлением 4-диметиламинопиридина (DMAP) (0,040 г 0,287 ммоль). Спустя 46 ч реакционную смесь выпаривали в вакууме (контролируя с помощью ТСХ полное исчезновение реагента, элюент CH₂Cl₂/MeOH=30/1). Твердое вещество затем снова растворяли в CH₂Cl₂ и промывали H₂O и насыщенным NH₄Cl. Водную фазу экстрагировали CH₂Cl₂ (2×10 мл). Органические фазы объединяли, сушили над Na₂SО₄, фильтровали и концентрировали в вакууме, получая желаемый продукт (0,133 г, 0,287 ммоль) в виде бледно-желтого твердого вещества.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 8,37 (с, 1H, Ar, H-7), 8,25 (д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,92 (д, 1H, J=8,0 Гц, Ar), 7,82 (т, 1H, J=8,0 Гц, Ar), 7,65 (т, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,57 (с, 1H, H-14), 5,67 (д, 1H, J=16,4 Гц, H-17), 5,29 (с, 2H, H-5), 5,25 (д, 1H, J=16,4 Гц, H-17), 2,00-1,84 (м, 2H, H-19), 1,03-0,93 (м, 12H), 0,80-0,71 (м, 6H). ¹³ C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) 171,7, 157,6, 152,5, 151,5, 149,0, 145,9, 130,9, 130,4, 130,0, 128,4, 128,1, 128,0, 127,9, 118,9, 94,4, 75,3, 66,0, 50,0, 33,2, 7,9, 7,2, 6,4.

ПРИМЕР II - 20-OTES SN-38

SN-38 (0,100 г, 0,255 ммоль) суспендировали в безводном диметилформамиде (5 мл) в инертной атмосфере и к полученной суспензии добавляли имидазол (0,087 г, 1,28 ммоль). Смесь перемешивали 10 минут, затем в нее по каплям добавляли триэтилсилилхлорид (TES-Cl) (0,171 мл, 1,02 ммоль), с последующим добавлением 4-диметиламинопиридина (DMAP) (0,031 г 0,255 ммоль). Спустя 52 ч реакционную смесь выпаривали в вакууме, контролируя с помощью ТСХ (CH₂Cl₂ /MeOH=10/1) полное исчезновение реагента. Твердое вещество затем снова растворяли в CH₂Cl₂ и промывали H ₂O и насыщенным NH₄Cl. Водную фазу экстрагировали CH₂Cl₂ (2×10 мл). Органические фазы объединяли, сушили над Na₂SО₄, фильтровали и концентрировали в вакууме, получая желаемый продукт (0,121 г, 0,240 ммоль, 94%) в виде бледно-желтого твердого вещества.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 9,26 (ушир.с, 1H, OH), 8,14 (д, 1H, J=9,2 Гц, Ar, H-12), 7,58 (с, 1H, H-14), 7,49 (дд, 1H, J₁=9,2 Гц, J ₂=2,2 Гц, H-11), 7,46 (д, 1H, J=2,2 Гц, H-9), 5,70 (д, 1H, J=16,5 Гц, H-17), 5,28 (д, 1H, J=16,5 Гц, H-17), 5,23 (с, 2H, H-5), 3,05 (кв, 2H, J=7,5 Гц), 1,97-1,81 (м, 2H, H-19), 1,32 (т, 3H, J=7,5 Гц, Me), 0,98-0,88 (м, 12H), 0,77-0,68 (м, 6H). ¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) 172,1, 157,9, 156,6, 152,1, 149,0, 146,7, 144,6, 143,6, 131,9, 128,7, 126,9, 122,8, 117,9, 105,5, 98,5, 75,4, 65,9, 49,5, 32,9, 23,2, 13,5, 7,8, 7,2, 6,4.

ПРИМЕР III - 10-OTBDMS-20-OTES SN-38

20-OTES SN-38 (0,121 г, 0,240 ммоль) растворяли в безводной смеси CH₂Cl ₂/THF = 1:1 (8 мл) в инертной атмосфере. Туда же добавляли имидазол (0,081 г, 1,20 ммоль), с последующим добавлением через 10 минут трет-бутилдиметилсилилхлорида (TBDMS-Cl) (0,144 мг, 0,957 ммоль) и затем 4-диметиламинопиридина (DMAP) (0,029 г, 0,240 ммоль). Спустя 18 ч реакционную смесь выпаривали в вакууме, контролируя с помощью ТСХ (гексан/AcOEt = 1/1) исчезновение реагента. Затем твердое вещество снова растворяли в CH₂Cl ₂ и промывали H₂O и насыщенным NH₄ Cl. Водную фазу экстрагировали CH₂Cl₂ (2×10 мл) и органические фазы объединяли, сушили над Na₂ SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали флэш-хроматографией (SiО₂, гексан/AcOEt = 1/1), таким образом получая желаемый продукт (0,127 г, 0,205 ммоль, 85%) в виде бледно-желтого твердого вещества.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 8,14 (д, 1H, J=8,8 Гц, Ar, H-12), 7,49 (с, 1H, H-14), 7,40 (д, 1H, J=2,2 Гц, H-9), 7,38 (дд, 1H, J₁=8,8 Гц J₂=2,5 Гц, H-11), 5,67 (д, 1H, J=16,5 Гц, H-17), 5,25 (д, 1H, J=16,5 Гц, H-17), 5,23 (с, 2H, H-5), 3,11 (кв, 2H, J=7,6 Гц), 1,99-1,82 (м, 2H, H-19), 1,38 (т, 3H, J=7,6 Гц, Me), 1,04 (с, 9H), 1,00-0,92 (м, 12H), 0,78-0,69 (м, 6H), 0,30 (с, 6H). ¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) 171,9, 157,7, 155,1, 151,5, 150,1, 146,8, 145,6, 143,5, 132,2, 128,2, 126,9, 125,9, 118,0, 110,5, 97,7, 75,4, 66,0, 49,3, 33,2, 25,6, 23,1, 18,3, 13,7, 7,9, 7,2, 6,4, 4,3.

ПРИМЕР IV - 20-OTES топотекан

Топотекан (0,100 г, 0,238 ммоль) суспендировали в безводном диметилформамиде (5 мл) в инертной атмосфере и к полученной суспензии добавляли имидазол (0,081 г, 1,19 ммоль). Смесь перемешивали 10 минут, затем в нее по каплям добавляли триэтилсилилхлорид (TES-Cl) (0,160 мл, 0,952 ммоль), с последующим добавлением 4-диметиламинопиридина (DMAP) (0,029 г, 0,238 ммоль). Спустя 52 ч реакционную смесь выпаривали в вакууме, контролируя с помощью ТСХ (CH₂ Cl₂/MeOH = 10/1) полное исчезновение реагента. Твердое вещество затем снова растворяли в CHCl₃ и H₂ O и насыщенном NH₄Cl, водную фазу экстрагировали CHCl ₃ (2×15 мл). Органические фазы объединяли, сушили над Na₂SО₄, фильтровали и концентрировали в вакууме, таким образом получая желаемый продукт (0,120 г, 0,224 ммоль, 94%) в виде бледно-желтого твердого вещества.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 9,65 (ушир.с, 1H), 8,26 (с, 1H, Ar, H-7), 8,14 (д, 1H, J=8,8 Гц, Ar, H-12), 7,80 (д, 1H, J=8,8 Гц, Ar, H-11), 7,58 (с, 1H, H-14), 5,67 (д, 1H, J=16,5 Гц, H-17), 5,25 (д, 1H, J=16,5 Гц, H-17), 5,20 (с, 2H, H-5), 4,71 (с, 2H), 2,81 (с, 6H, 2 Me), 1,97-1,81 (м, 2H, H-19), 0,98-0,88 (м, 12H), 0,77-0,68 (м, 6H). ¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) 172,1, 157,9, 156,6, 152,1, 150,8, 146,8, 144,3, 134,3, 131,2, 129,9, 127,9, 123,0, 118,9, 110,1, 98,5, 75,4, 65,9, 51,1, 50,0, 43,1, 32,9, 7,8, 7,2, 6,4.

ПРИМЕР V - 10-OTBDMS 20-OTES топотекан

20-OTES топотекан (0,120 г, 0,224 ммоль) растворяли в безводной смеси CH₂ Cl₂/THF = 1:1 (8 мл) в инертной атмосфере. Добавляли имидазол (0,076 г, 1,12 ммоль), с последующим добавлением через 10 минут трет-бутилдиметилсилилхлорида (TBDMS-Cl), (0,135 мг, 0,896 ммоль), а затем 4-диметиламинопиридина (DMAP), (0,027 г, 0,224 ммоль). Спустя 21 ч реакционную смесь выпаривали в вакууме, контролируя с помощью ТСХ (гексан/AcOEt = 1/1) исчезновение реагента. Затем твердое вещество снова растворяли в CHCl₃ и H₂O и насыщенном NH₄Cl, водную фазу экстрагировали CHCl₃ (2×15 мл). Органические фазы объединяли и сушили над Na₂SО₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали флэш-хроматографией (SiО₂ , гексан/AcOEt = 1/1), таким образом получая желаемый продукт (0,116 г, 0,179 ммоль, 80%) в виде бледно-желтого твердого вещества.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 8,26 (с, 1H, Ar, H-7), 8,14 (д, 1H, J=8,8 Гц, Ar, H-12), 7,81 (д, 1H, J=8,8 Гц, Ar, H-11), 7,59 (с, 1H, H-14), 5,64 (д, 1H, J=16,5 Гц, H-17), 5,22 (д, 1H, J=16,5 Гц, H-17), 5,19 (с, 2H, H-5), 4,71 (с, 2H), 2,81 (с, 6H, 2 Me), 1,97-1,81 (м, 2H, H-19), 1,04 (с, 9H), 0,98-0,88 (м, 12H), 0,77-0,68 (м, 6H), 0,30 (с, 6H). ¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) 171,7, 157,7, 155,1, 151,5, 150,0, 146,8, 144,3, 134,3, 131,2, 129,9, 127,9, 123,0, 118,9, 110,1, 98,5, 75,4, 65,9, 51,1, 50,0, 43,9, 32,9, 25,6, 18,3, 7,8, 7,2, 6,4, -4,3.

ПРИМЕР VI - Получение 20-OTES 10-гидроксикамптотецина

10-Гидроксикамптотецин (0,100 г, 0,275 ммоль) суспендировали в безводном диметилформамиде (5 мл) в инертной атмосфере и к полученной суспензии добавляли имидазол (0,225 г, 3,31 ммоль). Смесь перемешивали 10 минут, затем в нее по каплям добавляли триэтилсилилхлорид (TES-Cl) (0,460 мл, 2,75 ммоль), с последующим добавлением 4-диметиламинопиридина (DMAP) (0,068 г, 0,550 ммоль). Спустя 24 ч реакционную смесь выпаривали в вакууме, контролируя с помощью ТСХ полное исчезновение реагента (CH₂Cl ₂/MeOH = 20/1). Твердое вещество затем снова растворяли в CH₂Cl₂ и промывали H₂O и насыщенным NH₄Cl. Водную фазу экстрагировали CH₂Cl ₂ (2×10 мл). Органические фазы объединяли, сушили над Na₂SО₄, фильтровали и концентрировали в вакууме, таким образом получая желаемый продукт (0,124 г, 0,259 ммоль, 94%) в виде бледно-желтого твердого вещества.

¹H ЯМР (CDCl₃ + 5% CD₃OD, 400 МГц) 8,10 (с, 1H, Ar, H-7), 8,05 (д, 1H, J=9,2 Гц, Ar), 7,50 (с, 1H, H-14), 7,39 (дд, 1H, J₁=9,2 Гц, J₂ =2,4 Гц, H-11), 7,11 (д, 1H, J=2,2 Гц, H-9), 5,60 (д, 1H, J=16,4 Гц, H-17), 5,21 (д, 1H, J=16,4 Гц, H-17), 5,15 (с, 2H, H-5), 1,97-1,81 (м, 2H, H-19), 0,98-0,88 (м, 12), 0,76-0,68 (м, 6H). ¹³C ЯМР (CDCl₃ + 5% CD₃OD, 100 МГц) 172,2, 157,8, 156,7, 151,8, 149,2, 146,1, 144,1, 130,9, 129,8, 129,0, 128,6, 123,2, 117,8, 108,8, 98,1, 75,4, 65,8, 50,0, 32,9, 7,7, 7,1, 6,3.

ПРИМЕР VII - 10-OTBDMS-20-OTES камптотецин

10-Гидрокси-20-OTES-камптотецин (0,105 г, 0,219 ммоль) растворяли в безводной смеси CH₂ Cl₂/THF = 1:1 (4 мл) и в инертной атмосфере. Добавляли имидазол (0,097 г, 1,42 ммоль), с последующим добавлением через 10 минут трет-бутилдиметилсилилхлорида (TBDMS-Cl), (0,164 мг, 1,10 ммоль), а затем 4-диметиламинопиридина (DMAP), (0,040 г, 0,329 ммоль). Спустя 18 ч реакционную смесь выпаривали в вакууме, контролируя с помощью ТСХ (циклогексан/AcOEt = 1/3) исчезновение реагента. Затем твердое вещество снова растворяли в CH₂ Cl₂ и промывали H₂O и насыщенным NH ₄Cl, водную фазу экстрагировали CH₂Cl₂ (2×10 мл). Органические фазы объединяли и сушили над Na ₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали флэш-хроматографией (SiО₂, циклогексан/AcOEt = 1/3), таким образом получая желаемый продукт (0,117 г, 0,197 ммоль, 90%) в виде бледно-желтого твердого вещества.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 8,22 (с, 1H, Ar, H-7), 8,13 (д, 1H, J=9,2 Гц, Ar, H-12), 7,51 (с, 1H, H-14), 7,39 (дд, 1H, J₁=9,2 Гц, J ₂=2,8 Гц, H-11), 7,22 (д, 1H, J=2,8 Гц, H-9), 5,66 (д, 1H, J=16,5 Гц, H-17), 5,25 (с, 2H, H-5), 5,24 (д, 1H, J=16,5 Гц, H-17), 1,99-1,82 (м, 2H, H-19), 1,03 (с, 9H), 1,00-0,92 (м, 12H), 0,78-0,69 (м, 6H), 0,29 (с, 6H). ¹³C ЯМР (CDCl ₃, 100 МГц) 172,0, 157,7, 155,1, 151,5, 150,6, 146,1, 145,1, 131,4, 129,4, 129,3, 128,7, 126,7, 118,3, 114,5, 97,7, 75,3, 66,0, 49,9, 33,1, 25,6, 18,3, 7,9, 7,2, 6,4, -4,3.

ПРИМЕР VIII - 5-F-20-OTES-камптотецин

Камптотецин 20-OTES (0,100 г, 0,216 ммоль) растворяли в безводном THF (6 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, затем охлаждали до температуры -78°C и по каплям добавляли 1,0M раствор LiHMDS в THF (0,260 мл, 0,260 ммоль). Через 20 минут добавляли NFSI (0,089 г, 0,281 ммоль) в безводном THF (2 мл). После инкубирования при -78°C в течение 2 ч температуре давали подняться до 25°C и исчезновение реагента контролировали с помощью ТСХ (гексан/AcOEt = 1/2). Наблюдали образование двух диастереомеров. После инкубирования при комнатной температуре в течение 3 ч реакцию гасили добавлением насыщенного NH₄Cl. Водную фазу экстрагировали CH₂Cl₂ (3×15 мл) и органические фазы объединяли, сушили над Na₂SО ₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали флэш-хроматографией (SiО₂, гексан/AcOEt = 3/1, затем 2/1 и окончательно 1/1), таким образом получая смесь двух изомеров (0,101 г, 0,210 ммоль, 97%) (отношение изомеров 1:1) в виде бледно-желтого твердого вещества. Два изомера разделяли дополнительной хроматографией. В порядке элюции:

Первый диастереомер: ¹ H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 8,52 (с, 1H, Ar, H-7), 8,25 (д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,96 (д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,87 (т, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,69 (т, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,47 (д, 1H, ¹J_HF=61,2 Гц, H-5), 7,45 (с, 1H, H-14), 5,62 (д, 1H, J=16,8 Гц, H-17), 5,22 (д, 1H, J=16,8 Гц, H-17), 2,02-1,84 (м, 2H, H-19), 1,03-0,93 (м, 12H), 0,80-0,71 (м, 6H). ¹³C ЯМР (CDCl₃ , 100 МГц) 171,4, 157,5, 152,3, 151,1, 150,2 (д, J=1,5 Гц), 150,3 (д, J=1,5 Гц), 143,6 (д, J=5,3 Гц), 133,7, 131,7, 130,2, 128,9, 128,4, 127,9 (д, J=15,0 Гц), 126,3 (д, J=15,0 Гц), 121,8, 98,9, 93,8 (д, ¹J_CF = 213,2 Гц, C-5), 75,1, 65,7, 33,1, 7,8, 7,2, 6,4.

Второй диастереомер: ¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 8,51 (с, 1H, Ar, H-7), 8,25 (д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,96 (д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,87 (т, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,68 (т, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,51 (д, 1H, ¹J_HF=60,8 Гц, H-5), 7,42 (с, 1H, H-14), 5,62 (д, 1H, J=17,2 Гц, H-17), 5,20 (д, 1H, J=17,2 Гц, H-17), 2,02-1,82 (м, 2H, H-19), 1,04-0,93 (м, 12H), 0,80-0,71 (м, 6H). ¹³C ЯМР (CDCl₃ , 100 МГц) 171,2, 157,8, 152,5, 151,2, 150,3, 143,7, 133,7 (д, J=2,4 Гц), 131,7, 130,2, 128,9, 128,3, 127,9 (д, J=2,3 Гц), 126,3 (д, J=16,7 Гц), 121,8 (д, J=1,5 Гц), 99,0, 93,8 (д, ¹J _CF=214,8 Гц, C-5), 75,0, 65,8, 33,3, 7,9, 7,1, 6,4.

ПРИМЕР IX - Получение первого диастереомера 5-F-камптотецина

Первый диастереомер 5-F-20-OTES-камптотецина (0,025 г, 0,052 ммоль) растворяли в безводном THF (5 мл) при перемешивании в инертной атмосфере. Затем по каплям добавляли Et₃N·3HF (0,060 мл, 0,368 ммоль). Реакционной смеси давали реагировать в течение 28 ч при комнатной температуре, контролируя с помощью ТСХ исчезновение реагента (гексан/AcOEt = 1/2). Растворитель выпаривали в вакууме и остаток хроматографировали (SiO₂, гексан/AcOEt=1/1), таким образом получая желаемый продукт (0,019 г, 0,051 ммоль, 98%) в виде бледно-желтого твердого вещества.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 8,52 (с, 1H, Ar, H-7), 8,25 (д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,96 (д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,87 (т, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,69 (т, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,59 (с, 1H, H-14), 7,46 (д, 1H, ¹J _HF=61,2 Гц, H-5), 5,69 (д, 1H, J=16,8 Гц, H-17), 5,26 (д, 1H, J=16,8 Гц, H-17), 3,87 (ушир.с, 1H, OH), 2,01-1,81 (м, 2H, H-19), 1,05 (т, 3H, J=7,6 Гц, Me). ¹³C ЯМР (CDCl ₃, 100 МГц) 173,5, 157,6, 151,1, 151,0, 150,2, 144,1, 133,9, 131,9, 130,0, 129,0, 128,5, 127,8, 126,4, 121,7, 98,8, 93,8 (д, ¹J_CF=214,0 Гц, C-5), 72,5, 66,0, 31,5, 7,8.

ПРИМЕР X - Получение второго диастереомера 5-F-камптотецина

Второй диастереомер 5-F-20-OTES-камптотецина (0,025 г, 0,052 ммоль) растворяли в безводном THF (5 мл) при перемешивании в инертной атмосфере. Затем по каплям добавляли Et₃N·3HF (0,060 мл, 0,368 ммоль). Реакционной смеси давали реагировать в течение 28 ч при комнатной температуре, контролируя с помощью ТСХ исчезновение реагента (гексан/AcOEt = 1/2). Растворитель выпаривали в вакууме и остаток хроматографировали (SiO₂, гексан/AcOEt = 1/1), таким образом получая желаемый продукт (0,018 г, 0,050 ммоль, 97%) в виде бледно-желтого твердого вещества.

¹H ЯМР (CDCl ₃, 400 МГц) 8,52 (с, 1H, Ar, H-7), 8,24 (д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,96 (д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,88 (т, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,69 (т, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,56 (с, 1H, H-14), 7,51 (д, 1H, ¹J _HF=60,4 Гц, H-5), 5,69 (д, 1H, J=16,4 Гц, H-17), 5,25 (д, 1H, J=16,4 Гц, H-17), 3,87 (ушир.с, 1H, OH), 1,98-1,78 (м, 2H, H-19), 1,04 (т, 3H, J=7,6 Гц, Me). ¹³C ЯМР (CDCl ₃, 100 МГц) 173,3, 157,7, 151,2, 151,2, 150,2, 144,2, 133,8, 131,9, 130,0, 129,0, 128,5, 127,8, 126,4, 121,6, 98,9, 93,7 (д, ¹J_CF=214,0 Гц, C-5), 72,5, 66,1, 31,6, 7,8.

ПРИМЕР XI - Получение 5-N₃-20-OTES-камптотецина

Камптотецин 20-OTES (0,100 г, 0,216 ммоль) растворяли в безводном THF (6 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, затем охлаждали до температуры -78°C и по каплям добавляли 1,0M раствор LiHMDS в THF (0,260 мл, 0,260 ммоль). Через 20 минут добавляли тозилазид (TsN₃) (0,055 г, 0,281 ммоль) в безводном THF (2 мл). После инкубирования при -78°C в течение 2 ч температуре давали подняться до 25°C и исчезновение реагента контролировали с помощью ТСХ (гексан/AcOEt = 2/1). Наблюдали образование двух диастереомеров. После инкубирования при комнатной температуре в течение 2 ч 30 мин реакцию гасили добавлением насыщенного NH₄Cl. Водную фазу экстрагировали CH₂Cl ₂ (3×15 мл) и органические фазы объединяли, сушили над Na₂SО₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток, состоящий из двух диастереомеров, очищали флэш-хроматографией (SiО₂, гексан/AcOEt = 3/1, затем 2/1 и окончательно 1/1), таким образом получая (0,106 г, 0,210 ммоль, 97%) смесь двух изомеров (отношение изомеров 1:1) в виде бледно-желтого твердого вещества. Два изомера разделяли дополнительной хроматографией. В порядке элюции:

Первый диастереомер: ¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 8,45 (с, 1H, Ar, H-7), 8,25 (д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,95 (д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,86 (т, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,68 (т, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,49 (с, 1H, H-14), 6,97 (с, 1H, H-5), 5,65 (д, 1H, J=16,8 Гц, H-17), 5,26 (д, 1H, J=16,8 Гц, H-17), 2,01-1,84 (м, 2H, H-19), 1,03-0,94 (м, 12H), 0,80-0,71 (м, 6H). ¹³ C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) 171,6, 158,3, 152,2, 150,8, 150,0, 144,0, 132,9, 131,4, 130,1, 128,6, 128,3, 128,2, 128,1, 120,8, 98,7, 75,4, 75,2, 65,7, 33,1, 7,9, 7,2, 6,4.

Второй диастереомер: ¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 8,45 (с, 1H, Ar, H-7), 8,24 (д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,95 (д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,86 (т, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,68 (т, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,46 (с, 1H, H-14), 6,99 (с, 1H, H-5), 5,66 (д, 1H, J=16,8 Гц, H-17), 5,22 (д, 1H, J=16,8 Гц, H-17), 2,02-1,84 (м, 2H, H-19), 1,03-0,94 (м, 12H), 0,80-0,71 (м, 6H). ¹³ C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) 171,4, 158,4, 152,3, 150,9, 150,0, 144,0, 132,9, 131,4, 130,1, 128,6, 128,3, 128,2, 128,1, 120,8, 98,7, 75,3, 75,1, 65,8, 33,3, 7,9, 7,2, 6,4.

ПРИМЕР XII - Получение первого диастереомера 5-N₃-камптотецина

Диастереомер 1 5-N₃-20-OTES-камптотецина (0,070 г, 0,139 ммоль) растворяли в безводном THF (6 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, затем по каплям добавляли Et₃N·3HF (0,170 мл, 1,016 ммоль). Реакционной смеси давали реагировать в течение 26 ч при комнатной температуре, контролируя с помощью ТСХ исчезновение реагента (гексан/AcOEt = 1/1). Растворитель выпаривали в вакууме и остаток очищали флэш-хроматографией (SiO₂, гексан/AcOEt = 1/1), таким образом получая желаемый продукт (0,053 г, 0,136 ммоль, 98%) в виде бледно-желтого твердого вещества.

¹H ЯМР (CDCl ₃, 400 МГц) 8,44 (с, 1H, Ar, H-7), 8,24 (д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,93 (д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,85 (т, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,67 (т, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,63 (с, 1H, H-14), 6,97 (с, 1H, H-5), 5,70 (д, 1H, J=16,8 Гц, H-17), 5,29 (д, 1H, J=16,8 Гц, H-17), 3,99 (ушир.с, 1H, OH), 2,00-1,84 (м, 2H, H-19), 1,04 (т, 3H, J=7,6 Гц, Me). ¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) 173,6, 158,3, 150,8, 150,7, 149,8, 144,4, 133,1, 131,5, 129,9, 128,6, 128,3, 128,3, 128,1, 120,6, 98,6, 75,4, 72,7, 66,0, 31,5, 7,8.

ПРИМЕР XIII - Получение второго диастереомера 5-N₃-камптотецина

Диастереомер 2 5-N₃-20-OTES-камптотецина (0,055 г, 0,109 ммоль) растворяли в безводном THF (6 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, затем по каплям добавляли Et₃ N·3HF (0,135 мл, 0,820 ммоль). Реакционной смеси давали реагировать в течение 26 ч при комнатной температуре, контролируя с помощью ТСХ исчезновение реагента (гексан/AcOEt = 1/1). Растворитель выпаривали в вакууме и остаток очищали флэш-хроматографией (SiO ₂, гексан/AcOEt = 1/1), таким образом получая желаемый продукт (0,042 г, 0,107 ммоль, 98%) в виде бледно-желтого твердого вещества.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 8,45 (с, 1H, Ar, H-7), 8,23 (д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,95 (д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,85 (т, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,68 (т, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,60 (с, 1H, H-14), 7,00 (с, 1H, H-5), 5,74 (д, 1H, J=16,8 Гц, H-17), 5,28 (д, 1H, J=16,8 Гц, H-17), 3,86 (ушир.с, 1H, OH), 1,98-1,82 (м, 2H, H-19), 1,04 (т, 3H, J=7,6 Гц, Me). ¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) 173,4, 158,4, 150,9, 150,7, 149,8, 144,5, 133,0, 131,5, 129,9, 128,6, 128,4, 128,3, 128,1, 120,6, 98,6, 75,3, 72,6, 66,1, 31,6, 7,8.

ПРИМЕР XIV - Получение 5-NH ₂-камптотецина

Диастереомер 2 5-N ₃-20-OH-камптотецина (0,050 г, 0,129 ммоль) растворяли в смеси безводного THF (1,5 мл) и безводного MeOH (6 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, после чего добавляли Pd/C (14 мг, ~10%) и проводили два цикла вакуум/H₂ (H ₂ при давлении баллона). Реакционной смеси давали реагировать в течение 3 ч при комнатной температуре, контролируя с помощью ТСХ (гексан/AcOEt = 1/3) исчезновение реагента, затем фильтровали через целит и промывали CH₂Cl₂ (2×15 мл). Растворитель выпаривали в вакууме. ¹H-ЯМР-спектроскопия неочищенной реакционной смеси выявляла присутствие желаемого продукта в виде 1:1-смеси двух эпимеров в положении С5. Флэш-хроматография (SiO₂, CH₂Cl₂/MeOH = 35/1, затем 25/1) позволяла получить смесь двух диастереомеров (0,046 г, 0,126 ммоль, 98%).

¹H ЯМР (CDCl ₃, 400 МГц) 8,48 (с, 1H, Ar, H-7), 8,22-8,17 (м, 1H, Ar), 7,95-7,90 (м, 1H, Ar), 7,85-7,78 (м, 1H, Ar), 7,68-7,60 (м, 1H, Ar), 7,58 (с, 0,5H, H-14), 7,54 (с, 0,5H, H-14), 6,50 (с, 0,5H, H-5), 6,47 (с, 0,5H, H-5), 5,74-5,64 (м, 1H, H-17), 5,28-5,22 (м, 1H, H-17), 4,00-2,40 (ушир.с, 3H, OH + NH₂), 1,98-1,82 (м, 2H, H-19), 1,07-1,01 (м, 3H, Me). ¹³C ЯМР (CDCl₃ , 100 МГц) 173,8 (2C), 158,5 (2C), 151,2 (2C), 150,4 (2C), 149,7 (2C), 144,5 (2C), 132,7 (2C), 131,0 (2C), 129,8 (2C), 128,5 (2C), 128,3 (2C), 128,0 (2C), 127,8 (2C), 120,2 (2C), 113,8 (2C), 97,7 (2C), 72,7 (2C), 66,3, 66,0, 31,5 (2C), 7,8, 7,8.

ПРИМЕР XV - 5-ди-трет-бутоксикарбонилгидразино-20-OTES-камптотецин

Камптотецин 20-OTES (0,100 г, 0,216 ммоль) растворяли в безводном THF (6 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, затем охлаждали до температуры -78°C и по каплям добавляли 1,0M раствор LiHMDS в THF (0,281 мл, 0,281 ммоль). Спустя 20 минут добавляли ди-трет-бутилазодикарбоксилат (DTBAC) (0,075 г, 0,324 ммоль) в безводном THF (2 мл). После инкубирования в течение 4 ч при -78°C контролировали исчезновение реагента с помощью ТСХ (гексан/AcOEt = 3/1). Наблюдали образование двух диастереомеров. Реакцию гасили добавлением насыщенного NH ₄Cl. Водную фазу экстрагировали CH₂Cl₂ (3×15 мл) и органические фазы объединяли, сушили над Na ₂SО₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали флэш-хроматографией (SiО₂, гексан/AcOEt = 3/1), таким образом получая смесь двух изомеров (0,145 г, 0,210 ммоль, 97%). Два изомера разделяли дополнительной хроматографией. В порядке элюции:

Первый диастереомер: ¹ H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 8,80 (ушир.с, 1H, Ar), 8,23 (д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 8,01 (ушир.д, 1H, Ar), 7,90-7,71 (м, 2H, Ar), 7,70-7,45 (м, 2H, Ar + H-14), 6,52 (ушир.с, 1H, H-5), 5,61 (д, 1H, J=16,8 Гц, H-17), 5,23 (д, 1H, J=16,8 Гц, H-17), 2,03-1,81 (м, 2H, H-19), 1,79-1,08 (ушир.с, 18H), 1,06-0,92 (м, 12H), 0,80-0,70 (м, 6H). ¹³ C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) 171,7, 157,8, 155,5, 155,5, 152,0, 152,0, 151,2, 149,4, 145,0, 132,1, 130,6, 130,0, 128,7, 128,4, 127,9, 119,9, 98,2, 82,7, 81,5, 79,7, 75,2, 65,7, 33,2, 28,3, 27,6, 7,7, 7,2, 6,4.

Второй диастереомер: ¹H ЯМР (CDCl ₃, 400 МГц) 8,79 (ушир.с, 1H, Ar), 8,23 (д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 8,01 (ушир.д, 1H, Ar), 7,85-7,76 (м, 2H, Ar), 7,65 (ушир.т, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,52 (с, 1H, H-14), 6,54 (ушир.с, 1H, H-5), 5,61 (д, 1H, J=16,8 Гц, H-17), 5,22 (д, 1H, J=16,8 Гц, H-17), 2,03-1,82 (м, 2H, H-19), 1,76-1,08 (ушир.с, 18H), 1,04-0,92 (м, 12H), 0,80-0,70 (м, 6H). ¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) 171,5, 157,9, 155,5, 155,5, 152,3, 152,0, 151,2, 149,4, 145,1, 132,1, 130,6, 130,0, 128,7, 128,4, 127,9, 119,9, 98,2, 82,9, 81,5, 79,6, 75,2, 65,8, 33,3, 28,3, 27,4, 7,8, 7,2, 6,4.

ПРИМЕР XVI - Получение первого диастереомера 5-ди-трет-бутоксикарбонилгидразинокамптотецина

Первый диастереомер 5-ди-трет-бутоксикарбонилгидразино-20-OTES-камптотецина (0,050 г, 0,072 ммоль) растворяли в безводном THF (4 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, после чего по каплям добавляли Et₃N·3HF (0,088 мл, 0,542 ммоль). Реакционной смеси давали реагировать в течение 35 ч при комнатной температуре, контролируя с помощью ТСХ исчезновение реагента (гексан/AcOEt = 3/2). Растворитель выпаривали в вакууме и остаток очищали флэш-хроматографией (SiО₂, гексан/AcOEt = 3/2), таким образом получая желаемое соединение (0,041 г, 0,071 ммоль, 98%) в виде бледно-желтого твердого вещества.

Продукт дополнительно очищали кристаллизацией из смеси CH₂Cl₂/пентан = 1/50.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 8,77 (ушир.с, 1H, Ar), 8,16 (ушир.д, 1H, J=8,0 Гц, Ar), 7,97 (ушир.с, 1H, Ar), 7,86-7,50 (м, 4H, Ar), 6,51 (ушир.с, 1H, H-5), 5,66 (д, 1H, J=16,4 Гц, H-17), 5,24 (д, 1H, J=16,4 Гц, H-17), 3,86 (ушир.с, 1H, OH), 2,00-1,80 (м, 2H, H-19), 1,79-1,13 (ушир.с, 18H), 1,03 (т, 3H, J=7,6 Гц, Me). ¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) 173,7, 157,9, 155,5, 155,5, 152,1, 151,3, 150,7, 149,6, 145,7, 132,3, 130,7, 129,9, 128,7, 127,9, 127,6, 120,0, 97,9, 82,8, 81,6, 79,7, 72,7, 66,1, 31,8, 28,3, 27,7, 7,7.

ПРИМЕР XVII - Получение второго диастереомера 5-ди-трет-бутоксикарбонилгидразинокамптотецина

Второй диастереомер 5-ди-трет-бутоксикарбонилгидразино-20-OTES-камптотецина (0,050 г, 0,072 ммоль) растворяли в безводном THF (4,5 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, после чего по каплям добавляли Et₃N·3HF (0,088 мл, 0,542 ммоль). Реакционной смеси давали реагировать в течение 35 ч при комнатной температуре, контролируя с помощью ТСХ исчезновение реагента (гексан/AcOEt = 3/2). Растворитель выпаривали в вакууме и остаток очищали флэш-хроматографией (SiО₂, гексан/AcOEt = 3/2), таким образом получая желаемое соединение (0,040 г, 0,069 ммоль, 96%) в виде бледно-желтого твердого вещества. Продукт дополнительно очищали кристаллизацией из смеси CH₂Cl₂/пентан = 1/50.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 8,79 (ушир.с, 1H, Ar), 8,22 (ушир.д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,99 (ушир.с, 1H, Ar), 7,88-7,50 (м, 4H, Ar), 6,53 (ушир.с, 1H, H-5), 5,65 (д, 1H, J=16,4 Гц, H-17), 5,26 (д, 1H, J=16,4 Гц, H-17), 3,80 (ушир.с, 1H, OH), 2,00-1,80 (м, 2H, H-19), 1,79-1,13 (ушир.с, 18H), 1,03 (т, 3H, J=7,2 Гц, Me). ¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) 173,6, 157,9, 155,4, 155,4, 152,1, 151,3, 150,8, 149,5, 145,6, 132,3, 130,8, 129,8, 128,7, 127,9, 127,8, 119,8, 98,0, 83,0, 81,5, 79,7, 72,7, 66,3, 31,8, 28,3, 27,7, 7,8.

ПРИМЕР XVIII - Получение 5-дибензилоксикарбонилгидразино-20-OTES-камптотецина

Камптотецин 20-OTES (0,100 г, 0,216 ммоль) растворяли в безводном THF (6 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, затем охлаждали до температуры -78°C и по каплям добавляли 1,0M раствор LiHMDS в THF (0,281 мл, 0,281 ммоль). Спустя 20 минут добавляли дибензилазодикарбоксилат (0,097 г, 0,324 ммоль) в безводном THF (2 мл). После инкубирования при -78°C в течение 3 ч температуре давали подняться до 25°С и исчезновение реагента контролировали с помощью ТСХ (гексан/AcOEt = 3/1). Наблюдали образование двух диастереомеров. После инкубирования при комнатной температуре в течение 90 мин реакцию гасили добавлением насыщенного NH₄Cl. Водную фазу экстрагировали CH₂Cl ₂ (3×15 мл) и органические фазы объединяли, сушили над Na₂SО₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали флэш-хроматографией (SiО₂ , гексан/AcOEt = 4/1, затем 7/2), таким образом получая бледно-желтое твердое вещество (0,161 г, 0,212 ммоль, 98%). Два изомера разделяли дополнительной хроматографией. В порядке элюции:

Первый диастереомер: ¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 8,70 (ушир.с, 1H, Ar), 8,39 (ушир.с, 1H, Ar), 8,22 (ушир.д, 1H, J=7,6 Гц, Ar), 7,95 (ушир.д, 1H, J=7,6 Гц, Ar), 7,83 (ушир.т, 1H, J=7,6 Гц, Ar), 7,65 (ушир.т, 1H, J=7,6 Гц, Ar), 7,64-7,00 (м, 11H, Ar + H-14), 6,49 (ушир.с, 1H, H-5), 5,57 (д, 1H, J=16,4 Гц, H-17), 5,47-4,44 (м, 5H), 1,98-1,82 (м, 2H, H-19), 1,02-0,89 (м, 12H), 0,80-0,70 (м, 6H). ¹³C ЯМР (CDCl₃ , 100 МГц) 171,6, 158,0, 156,3, 156,3, 153,0, 152,2, 151,0, 149,6, 144,8, 135,3, 132,1, 130,6, 130,0, 128,6-127,8 (11C), 119,9, 98,4, 79,5, 75,2, 68,4, 67,9, 65,6, 33,0, 7,9, 7,2, 6,4.

Второй диастереомер: ¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 8,85 (ушир.с, 1H, Ar), 8,58 (ушир.с, 1H, Ar), 8,20 (ушир.с, 1H, Ar), 7,93 (ушир.с, Ar), 7,81 (ушир.т, 1H, J=7,6 Гц, Ar), 7,63 (ушир.т, 1H, J=7,6 Гц, Ar), 7,56-6,90 (м, 11H, Ar + H-14), 6,52 (ушир.с, 1H, H-5), 5,55 (д, 1H, J=16,8 Гц, H-17), 5,44-4,71 (м, 5H), 1,98-1,80 (м, 2H, H-19), 1,05-0,90 (м, 12H), 0,81-0,70 (м, 6H). ¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) 171,5, 157,9, 156,4, 156,4, 152,9, 152,4, 150,9, 149,4, 144,8, 135,3, 132,1, 130,6, 129,9, 128,6-127,8 (11C), 119,9, 98,5, 79,3, 75,2, 68,4, 67,8, 65,6, 32,9, 7,8, 7,2, 6,4.

ПРИМЕР XIX - Получение первого диастереомера 5-дибензилоксикарбонилгидразинокамптотецина

Первый диастереомер 5-дибензилоксикарбонилгидразино-20-OTES-камптотецина (0,140 г, 0,184 ммоль) растворяли в безводном THF (6 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, после чего по каплям добавляли Et₃N·3HF (0,225 мл, 1,380 ммоль). Реакционной смеси давали реагировать в течение 52 ч при комнатной температуре, контролируя с помощью ТСХ исчезновение реагента (гексан/AcOEt = 1/3). Растворитель выпаривали в вакууме и остаток очищали флэш-хроматографией (SiО₂, гексан/AcOEt = 1/1, затем 2/3), таким образом получая желаемое соединение (0,113 г, 0,175 ммоль, 95%) в виде бледно-желтого твердого вещества. Продукт дополнительно очищали кристаллизацией из смеси CH₂Cl₂/пентан = 1/50.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 8,67 (ушир.с, 1H, Ar), 8,39 (ушир.с, 1H, Ar), 8,12 (ушир.д, 1H, J=7,6 Гц, Ar), 7,95 (ушир.с, 1H, Ar), 7,74 (ушир.т, 1H, J=7,6 Гц, Ar), 7,65-6,66 (м, 12H, Ar + H-14), 6,48 (ушир.с, 1H, H-5), 5,55 (д, 1H, J=16,0 Гц, H-17), 5,42-4,44 (м, 5H), 3,86 (ушир.с, 1H, OH), 1,92-1,72 (м, 2H, H-19), 0,95 (т, 3H, J=7,6 Гц, Me). ¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) 173,5, 158,0, 156,2, 156,0, 153,0, 150,9, 150,9, 149,5, 145,3, 135,4, 132,2, 130,7, 129,8, 128,7-127,8 (11C), 119,9, 98,2, 79,6, 72,7, 68,5, 68,0, 65,9, 31,6, 7,8.

ПРИМЕР XX - Получение второго диастереомера 5-дибензилоксикарбонилгидразинокамптотецина

Второй диастереомер 5-дибензилоксикарбонилгидразино-20-OTES-камптотецина (0,140 г, 0,184 ммоль) растворяли в безводном THF (6 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, после чего по каплям добавляли Et₃N·3HF (0,150 мл, 0,921 ммоль). Реакционной смеси давали реагировать в течение 55 ч при комнатной температуре, контролируя с помощью ТСХ исчезновение реагента (гексан/AcOEt = 3/2). Растворитель выпаривали в вакууме и остаток очищали флэш-хроматографией (SiО₂, гексан/AcOEt = 1/1), таким образом получая желаемое соединение (0,113 г, 0,175 ммоль, 95%) в виде бледно-желтого твердого вещества. Продукт дополнительно очищали кристаллизацией из смеси CH₂Cl₂/пентан = 1/50.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 8,71 (ушир.с, 1H, Ar), 8,34 (ушир.с, 1H, Ar), 8,18 (ушир.с, 1H, Ar), 7,94 (ушир.с, 1H, Ar), 7,79 (ушир.т, 1H, J=7,6 Гц, Ar), 7,70-6,70 (м, 12H, Ar + H-14), 6,52 (ушир.с, 1H, H-5), 5,53 (д, 1H, J=16,4 Гц, H-17), 5,44-4,48 (м, 5H), 3,87 (ушир.с, 1H, OH), 1,90-1,70 (м, 2H, H-19), 0,99 (т, 3H, J=7,6 Гц, Me). ¹³ C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) 173,4, 158,0, 156,3, 156,1, 153,0, 151,0, 150,9, 149,6, 145,3, 135,5, 132,3, 130,8, 129,8, 128,7-127,8 (11C), 119,8, 98,4, 79,5, 72,7, 68,5, 67,8, 66,0, 31,6, 7,7.

ПРИМЕР XXI - Исследование ингибирования роста клеток

Клетки H460 из крупноклеточной опухоли легкого человека культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Чувствительность клеток определяли, анализируя ингибирование роста клеток после 1 или 72 часов воздействия лекарственного средства. Клетки в логарифмической фазе роста собирали и высевали в дупликатах в 6-луночные планшеты. Через двадцать четыре часа после посева клетки подвергали воздействию лекарственных средств и подсчитывали с помощью счетчика Coulter conter через 72 часа после воздействия лекарственного средства для определения значений IC₅₀. IC₅₀ определяли как концентрацию, ингибирующую рост клеток на 50% по сравнению с ростом в необработанном контроле.

ПРИМЕР XXII - Исследование разрывов ДНК, зависимых от топоизомеразы I

Разрывы ДНК определяли с использованием очищенного геля BamHI-EcoRI-фрагмента (длиной 751 п.о.) ДНК SV40 (Beretta GL, Binaschi M, Zagni AND, Capuani L, Capranico G. Tethering a type IB topoisomerase to a DNA site by enzyme fusion to a heterologous site-selective DNA-binding protein domain. Cancer Res 1999; 59:3689-97). Фрагменты ДНК были мечеными только на 3'-конце. Реакцию разрыва (20000 импульсов в минуту в образце) проводили в 20 мл 10 мМ Трис-HCl (pH 7,6), 150 мМ KCl, 5 мМ MgCl₂, 15 мкг/мл BSA, 0,1 мМ тиотреитола и с человеческим рекомбинантным ферментом (для топов полной длины) в течение 30 мин при 37°C. Реакцию блокировали, применяя 0,5% SDS и 0,3 мг/мл K-протеиназы в течение 45 мин при 42°C. Устойчивость ДНК к повреждениям испытывали в течение различных периодов времени, добавляя 0,6M NaCl после 30 мин инкубирования с 10 мкМ лекарственного средства. После осаждения ДНК снова суспендировали в буфере денатурации (80% формамида, 10 мМ NaOH, 0,01 M EDTA и 1 мг/мл красителя) перед посевом в денатурирующий гель (7% полиакриламида в буфере TBE). Все уровни разрыва ДНК измеряли с помощью Phospholmager model 425 (Molecular Dynamics) (Dallavalle S, Ferrari A, Biasotti B, et al. Novel 7-oxyiminomethyl camptothecin derivatives with potent in vitro и in vivo antitumor activity. J Med Chem 2001; 44:3264-74).

Устойчивость к повреждению ДНК (%)
Соединения	Время (мин)
	0	1	5	10
Топотекан	100	65	20	10
Камптотецин	100	58	23	20
SN38	100	60	33	28
Изомеры 1 5-F CPT	100	18	18	10
Изомеры 2 5-F CPT	100	10	10	13
5-N 3 CPT	100	50	30	15