способ получения симбиотического препарата на основе escherichia coli vl-613
Классы МПК: | C12N1/20 бактерии; питательные среды для них C12R1/19 Escherichia coli |
Автор(ы): | Самуйленко Анатолий Яковлевич (RU), Эрнст Лев Константинович (RU), Школьников Ефим Эмануилович (RU), Раевский Александр Андреевич (RU), Эрнст Константин Львович (RU), Анисимова Любовь Викторовна (RU), Коротеева Людмила Александровна (RU), Павленко Игорь Викторович (RU), Чеботарев Иван Изотович (RU), Гринь Светлана Анатольевна (RU), Бондарева Наталья Анатольевна (RU) |
Патентообладатель(и): | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности РАСХН (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2010-08-18 публикация патента:
10.05.2012 |
Способ получения симбиотического препарата на основе Escherichia coli VL-613 предусматривает засев, культивирование бактерий в жидкой питательной среде на основе перевара Хоттингера, концентрирование бактериальной суспензии с последующим смешиванием со стабилизатором, расфасовку и лиофилизацию препарата. При этом в процессе культивирования Escherichia coli VL-613 сразу после засева окислительно-восстановительный потенциал бактериальной культуры снижают до минус (80-100) мВ. До окончания процесса культивирования рО2 поддерживают на уровне 20±5% от насыщения кислородом воздуха, рН регулируют на уровне 7,0-7,4. Дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,1-0,2% при лимитировании роста Escherichia coli VL-613 глюкозой. Длительность процесса культивирования при этом составляет 4-6 ч. Изобретение обеспечивает повышение качества и стабильности симбиотического препарата на основе Escherichia coli VL-613. Препарат содержит 80-85% жизнеспособных клеток и позволяет полностью заменить синтетический лизин в полноценных рационах при выращивании бройлеров. 3 табл., 5 пр.
Формула изобретения
Способ получения симбиотического препарата из Escherichia coli VL-613, включающий засев, культивирование в жидкой питательной среде на основе перевара Хоттингера, концентрирование бактериальной суспензии с последующим смешиванием со стабилизатором, расфасовку и лиофилизацию препарата; при этом в процессе культивирования Escherichia coli VL-613 сразу после засева окислительно-восстановительный потенциал бактериальной культуры снижают до минус (80-100) мВ, после чего до окончания процесса культивирования рО2 поддерживают на уровне (20±5) % от насыщения кислородом воздуха, рН регулируют на уровне (7,0-7,4), а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации (0,1-0,2) % при лимитировании роста Escherichia coli VL-613 глюкозой, длительность процесса культивирования составляет 4-6 ч.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биотехнологии и зоотехнии и может быть использовано при промышленном производстве симбиотического препарата из штамма Escherichia coli VL-613.
Симбиоз птицы и микроорганизмов играет важную роль в нормальном функционировании организма птицы и реализации их генетического потенциала продуктивности.
Особенно четко проявляется роль микрофлоры желудочно-кишечного тракта в питании птицы (синтез аминокислот, витаминов, ферментов и других биологически активных веществ). Одним из наиболее плодотворных путей использования полезных форм микроорганизмов в птицеводстве являются пробиотики. По эффективности применения пробиотики не уступают антибиотикам (кормового и ветеринарного назначения), но одновременно не оказывают побочного действия на организм птицы и микрофлору кишечника, т.е. являются экологически чистыми. Их использование позволяет получить продукцию птицеводства, не содержащую остатков химиотерапевтического действия и антибиотических препаратов.
При интенсивном ведении птицеводства в условиях промышленной технологии содержания птицы биологически полноценное кормление является решающим фактором получения высокой продуктивности.
При этом предусматривается обеспечение птицы не только качественными белковыми и энергетическими компонентами, но и лимитирующими аминокислотами и другими жизненно необходимыми веществами.
Известно, что недостаток лимитирующих аминокислот нельзя восполнить за счет кормов животного происхождения, доля которых в комбикормах для птицы к тому же снижается, а цена на них растет. Для повышения полноценности растительных комбикормов широко используют добавки синтетических аминокислот.
Среди незаменимых аминокислот лизин занимает особое место. Он входит в состав структурных тканевых белков и белковых ферментов, способствует улучшению пищеварения, играет важную роль в формировании костяка, повышении продуктивности, оказывает благотворное влияние на воспроизводительные функции птицы.
В настоящее время во многих странах при кормлении продуктивных животных и птицы используют кормовые добавки бактерий, продуцирующих аминокислоты, в т.ч. лизин. Препараты - продуценты этой аминокислоты в зависимости от технологии производства существенно отличаются между собой, прежде всего, по концентрации действующего вещества. Это обстоятельство становится главной причиной разработки технологии производства таких препаратов, которые, будучи введенными в желудочно-кишечный тракт животных и птицы, продуцируют одну из незаменимых аминокислот - лизин.
Симбиотики - продукты биотехнологического производства, содержащие живые микроорганизмы, продуцирующие в желудочно-кишечном тракте животных и птиц аминокислоты (в том числе незаменимые), ферменты, витамины и таким образом способствующие повышению продуктивности.
Лиофильно высушенная баккультура Е.coil представляет собой симбиотический препарат, а та же баккультура, нанесенная на носители (цеолит, глауконит и другие) и высушенная конвекционным способом, представляет кормовую добавку. Симбиотический препарат применяется методом выпаивания, а не добавлением к корму.
Известны способы культивирования бактерий рода Escherichia, которые проводятся на плотных (1) и жидких (2) питательных средах. Однако способ культивирования эшерихий на плотных питательных средах является не технологичным и малопродуктивным - культуру эшерихий выращивают в течение 24 часов в чашках Петри на твердой питательной среде. Культивирование в жидких питательных средах проводится без регулирования основных технологических параметров - окислительно-восстановительного потенциала, количества растворенного в культуральной жидкости кислорода и длительностью в течение 24-48 часов, в силу чего эти способы не пригодны для промышленного получения препарата.
Известен также способ получения кормовой добавки, содержащей культуру штамма Escherichia coli - продуцент лизина (3). Однако и в данном случае выращивание эшерихий проводится в неуправляемом режиме - без регулирования окислительно-восстановительного потенциала, количества растворенного в культуральной жидкости кислорода, рН, в течение 6-12 ч, что не позволяет получить стабильную по биологическим свойствам культуру.
Целью заявляемого изобретения является сокращение времени выращивания культуры, снижение себестоимости препарата, а также повышение качества и стабильности получения симбиотического препарата на основе Escherichia coli VL-613.
Эта цель достигается за счет того, что периодическое глубинное культивирование Escherichia coli VL-613 проводят в питательной среде в течение 4-7 часов в соответствии с разработанным алгоритмом управления процессом, концентрируют полученную культуру, бактериальную массу ресуспендируют в защитной среде и лиофильно высушивают для длительного сохранения биологических свойств симбиотического препарата.
Способ осуществляют следующим образом.
В стерильный ферментер, который снабжен системой автоматического контроля и регулирования основных технологических параметров (температура, обороты мешалки, рН, pО2, eH), загружают жидкую питательную среду - бульон Хоттингера (приготовленный на основе перевара Хоттингера с содержанием 600-800 мг% аминного азота), приготовленную по следующей прописи, масс.%:
Перевар Хоттингера | 18,0-22,0 |
Пептон | 0,8-1,2 |
Натрий фосфорнокислый двузамещенный | 0,7-0,9 |
Хлористый натрий | 0,7-0,9 |
Глюкоза | 0,15-0,25 |
Дрожжевой экстрат | 0,4-0,6 |
Вода дистиллированная | До 100,0 |
Готовая стерильная питательная среда должна содержать 160-180 мг% аминного азота и иметь рН 7,4-7,6 ед. рН.
В ферментер с питательной средой инокулируют 18-24-часовую матриксную культуру эшерихий (Escherichia coli шт. VL-613), выращенную в жидкой питательной среде по составу аналогичному со средой культивирования, в соотношении 5-10% от объема питательной среды в ферментере, и культивируют при (37±1)°С в течение 4-7 часов.
После засева ферментера окислительно-восстановительный потенциал (eH) культуральной жидкости снижают до (-100)-(-80) мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке, после чего до окончания процесса культивирования с помощью изменения расхода воздуха на аэрацию и скоростью вращения мешалки поддерживают парциональное давление растворенного кислорода (рО2 ) в культуральной жидкости на уровне (20±5)% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости регулируют на уровне (7,2-7,4) ед.рН подачей 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации (0,1-0,2) % при лимитировании роста эшерихий глюкозой, характеризующемся резким повышением рО2 при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения рН культуральной жидкости.
Общая концентрация эшерихий по окончанию культивирования составляет (16-30) млрд. м.к./см3.
Полученную бактериальную культуру концентрируют, осадок смешивают с защитной средой высушивания. После тщательного перемешивания смешанную с защитной средой высушивания бактериальную суспензию расфасовывают с соблюдением условий асептики в стерильные флаконы и проводят ее лиофилизацию.
С одного культивирования в ферментере объемом 10 л получается симбиотического препарата для выпаивания 45000 голов бройлеров.
Пример 1.
Способ получения препарата с минимальными значениями параметров
еН Культуральной жидкости снижают до - 100 мВ; рО 2 поддерживают на уровне 15%; рН в культуральной жидкости регулируют на уровне 7,2 ед. рН; дробная подача глюкозы осуществляется дозами до концентрации 0,1%.
Культивирование - в течение 4-х часов.
Накопление - 16,0 млрд. м.к./см 3.
Пример 2.
Способ получения препарата с оптимальными значениями параметров
еН Культуральной жидкости снижают до - 90 мВ; рО2 поддерживают на уровне 20%; рН в культуральной жидкости регулируют на уровне 7,3 ед. рН; дробная подача глюкозы осуществляется дозами до концентрации 0,15%.
Культивирование - в течение 5-х часов.
Накопление - 23,0 млрд. м.к./см 3.
Пример 3.
Способ получения препарата с максимальными значениями параметров
еН Культуральной жидкости снижают до - 80 мВ; рО2 поддерживают на уровне 25%; рН в культуральной жидкости регулируют на уровне 7,4 ед. рН; дробная подача глюкозы осуществляется дозами до концентрации 0,2%.
Культивирование - в течение 6-ти часов.
Накопление - 30,0 млрд. м.к./см 3.
Пример 4.
Способ получения препарата со значениями параметров ниже минимальных
еН Культуральной жидкости снижают до - 110 мВ; рО2 поддерживают на уровне 10%; рН в культуральной жидкости регулируют на уровне 7,1 ед. рН; дробная подача глюкозы осуществляется дозами до концентрации 0,05%.
Культивирование - в течение 3-х часов.
Накопление - 9,0 млрд. м.к./см 3.
Пример 5.
Способ получения препарата со значениями параметров выше максимальных
еН Культуральной жидкости снижают до - 70 мВ; рО2 поддерживают на уровне 30%; рН в культуральной жидкости регулируют на уровне 7,5 ед. рН; дробная подача глюкозы осуществляется дозами до концентрации 0,25%.
Культивирование - в течение 7-ми часов.
Накопление - 37,0 млрд. м.к./см 3.
Технологические параметры изготовления симбиотического препарата из штамма Escherichia coli VL-613, указанные в примерах, приведены в таблице 1.
Таблица 1 | |||||
Значения технологических параметров периодического культивирования эшерихий | |||||
Время культивирования, час | еН, мВ | рН, ед. | рO2, % | Количество глюкозы, % | Накопление, млрд/см 3 |
Минимальные значения параметров | |||||
3 | -100 | 7,2 | 15 | 0,1 | 16,0 |
Оптимальные значения параметров | |||||
4 | -90 | 7,3 | 20 | 0,15 | 23,0 |
Максимальные значения параметров | |||||
5 | -80 | 7,4 | 25 | 0,2 | 30,0 |
Значения параметров ниже минимальных | |||||
6 | -110 | 7,1 | 10 | 0,05 | 9,0 |
Значения параметров выше максимальных | |||||
7 | -70 | 7,5 | 30 | 0,25 | 37,0 |
Препарат, приготовленный по примерам 1-3, после сублимационного высушивания содержит 80-85% жизнеспособных клеток и соответствует требованиям технических условий, тогда как препарат, приготовленный по примерам 4 и 5, содержит 25-30% жизнеспособных клеток и является малопригодным для применения.
При выращивании бройлеров на полноценных рационах, в которых синтетический лизин (моногидрохлорид лизина) заменяли симбиотическим препаратом из штамма Escherichia coli VL 613, отмечено повышение продуктивности цыплят за счет улучшения перевариваемости и использования питательных веществ корма.
Для определения эффективности замены кристаллического лизина (моногидрохлорид лизина) продуцентом лизина на основе штамма Escherichia coli VL613 в экспериментальном хозяйстве ВНИТИП проведен опыт на цыплятах-бройлерах кросса «Кобб-500» с 7-суточного до 5-недельного возраста по схеме, представленной в таблице 2.
Первые семь дней цыплята всех групп получали одинаковый гранулированный комбикорм с питательностью согласно нормам по кроссу «Кобб-500», в дальнейшем использовали рассыпной комбикорм согласно схеме опыта.
Таблица 2 | ||
Схема опыта | ||
Группы | Количество голов | Характеристика кормления |
Контроль | 35 | Основной рацион с добавлением синтетического лизина (моногидрохлорид лизина) |
Опытная | 35 | Основной рацион - без добавления синтетического лизина, но с добавлением симбиотического препарата |
Результаты исследований представлены в таблице 3.
Таблица 3 | ||
Показатели | Группы | |
Контроль | Опытная | |
1 | 2 | 3 |
Живая масса, г суточного цыпленка | 50 | 50 |
Живая масса по группе, г | 194,1+43,54 | 204,06±4,02 |
в 7 дней | 380,5±7,99 | 403,86±7,03 |
в 14 дней | 754,00±17,63 | 813,86±17,78 |
в 21 день | 1312,29±28,80 | 1454,00±29,10 |
в 28 дней | 2092,70±45,84 | 2212,66±43,80 |
в 38 дней | 2107,00±46,17 | 2483,6±44,79 |
Живая масса в 38 дней, в том числе | ||
петушков | 2024,30±66,19 | 2299,75±53,19 |
курочек | 1786,28±52,90 | 2067,50±56,65 |
Сохранность поголовья, % | 100 | 100 |
Расход корма на 1 гол., кг | 3,59 | 3,48 |
Затраты корма на 1 кг прироста, кг | 1,74 | 1,61 |
Среднесуточный прирост живой массы, г | 54,1 | 59,1 |
Как видно из таблицы 3, живая масса опытных бройлеров превышала контроль. При этом она была достоверно выше контроля за весь цикл выращивания бройлеров. Исследуемый препарат позволяет обеспечить синтез лизина в организме цыплят в наиболее ответственный период жизни, когда пищеварительная система отличается наибольшей уязвимостью и незрелостью. Использование препарата не повлияло отрицательно на сохранность бройлеров и конверсию корма.
Таким образом, использование симбиотического препарата на основе Escherichia coli VL-613 при выпаивании бройлерам высокопродуктивных кроссов позволяет полностью заменить синтетический лизин (моногидрохлорид лизина).
Источники информации
1. Патент РФ № 2175351, С12Р 13/04, C12N 1/20, C12N 15/31, C12N 1/20, C12R 1/185, 27.01.2001.
2. Патент РФ № 2189253, А61К 39/108, 09.04.2001.
3. Патент РФ № 2347807, C12N 1/20, А33К 1/14, C12R 1/185, 27.02.2009.
Класс C12N1/20 бактерии; питательные среды для них
Класс C12R1/19 Escherichia coli