антибактериальные пептиды из actinomadura namibiensis

Формула изобретения

1. Соединение формулы (I)



где R1 представляет собой Н, С(O)-(С₁ -С₆)алкил или С(O)-O-(С₁-С₆)алкил;

R2 представляет собой ОН, NH₂, NH-(C₁ -C₆)алкил, NН-(С₁-С₄)алкилен-фенил или NН-(С₁-С₄)алкилен-пиридил;

R3 и R4 независимо друг от друга представляют собой Н или ОН, или R3 и R4 вместе представляют собой =O; и

m и n независимо друг от друга равны 0, 1 или 2;

в любой стереохимической форме, или в смеси любых стереохимических форм при любом отношении, или его физиологически переносимая соль.

2. Соединение формулы (I) по п.1, представленное формулой (II)

3. Соединение формулы (I) по любому из пп.1 или 2, в котором R1 представляет собой Н.

4. Соединение формулы (I) по п.1, в котором R2 представляет собой ОН.

5. Соединение формулы (I) по п.1, в котором R3 и R4 представляют собой Н или ОН, где, если R3 представляет собой ОН, тогда R4 представляет собой Н, или если R3 представляет собой Н, тогда R4 представляет собой ОН, или R3 и R4 вместе представляют собой =O.

6. Соединение формулы (I) по п.1, в котором R3 представляет собой ОН и R4 представляет собой Н, или если R3 представляет собой Н, то и R4 представляет собой ОН.

7. Соединение формулы (I) по п.1, в котором m и n равны 0, или m и n равны 2, или m равно 0 и n равно 2, или m равно 2 и n равно 0.

8. Соединение формулы (I) по п.1, в котором m и n равны 0.

9. Соединение формулы (I) по п.1, в котором R1 представляет собой Н; R2 представляет собой ОН; R3 и R4 независимо друг от друга представляют собой Н или ОН, где, если R3 представляет собой ОН, тогда R4 представляет собой Н, и если R3 представляет собой Н, тогда R4 представляет собой ОН; и m и n независимо друг от друга равны 0, 1 или 2.

10. Соединение формулы (I) по п.1, в котором R1 представляет собой Н; R2 представляет собой ОН; R3 и R4 независимо друг от друга представляют собой Н или ОН, где, если R3 представляет собой ОН, тогда R4 представляет собой Н, и если R3 представляет собой Н, тогда R4 представляет собой ОН; и m и n равны 0, или m и n равны 2, или m равно 0 и n равно 2, или m равно 2 и n равно 0.

11. Соединение формулы (I) по п.1, в котором R1 представляет собой Н; R2 представляет собой ОН; R3 и R4 независимо друг от друга представляют собой Н или ОН, где, если R3 представляет собой ОН, тогда R4 представляет собой Н, и если R3 представляет собой Н, тогда R4 представляет собой ОН; и m и n равны 0.

12. Соединение формулы (I) по п.1, представляющее собой соединение формулы (III)

13. Соединение по п.1, выделенное из Actinomadura namibiensis (DSM 6313), имеющее моноизотопную нейтральную молекулярную массу 1922,6872 Да и молекулярную формулу C₈₅H ₁₁₀N₂₀O₂₄S₄.

14. Применение соединения по любому из пп.1-13 для получения лекарственного средства для лечения бактериальных инфекций, вызванных грамположительными бактериями и/или для лечения невропатической боли или боли, инициируемой воспалениями.

15. Фармацевтическая композиция, содержащая, по меньшей мере, одно соединение формулы (I) по любому из пп.1-13 и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый ингредиент, для применения в лечении бактериальных инфекций, вызванных грамположительными бактериями, и/или для лечения невропатической боли или боли, инициируемой воспалениями.

16. Способ получения соединения формулы (I) по любому из пп.1-13, который включает

a) ферментацию штамма Actinomadura namibiensis (DSM 6313) или одного из его вариантов и/или мутантов при соответствующих условиях в культуральной среде до тех пор, пока одно или несколько соединений формулы (I) не накопятся в культуральной среде,

b) выделение соединения формулы (I) из культуральной среды и

c) модификацию соединения формулы (I), если это необходимо, и/или, если необходимо, преобразование в физиологически переносимую соль.

17. Способ по п.16, в котором соединение (I) является соединением формулы (II).

18. Способ по любому из пп.16 или 17, в котором соединение (I) является соединением формулы (III).

19. Способ по п.16, в котором m и n равны 0, или m и n равны 2, или m равно 0 и n равно 2, или m равно 2 и n равно 0.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым пептидам, выделенным из Actinomadura namibiensis (DSM 6313), к способу их получения и к их применению при получении лекарственного средства для лечения бактериальных инфекций, для лечения вирусных инфекций и/или для лечения боли.

Уровень техники

Несколько пептидов с большим количеством мостиковых связей известны в литературе, например конопептиды, выделенные из моллюсков конусов (относительно обзора смотри, например, Terlau & Olivera, Physiol. Rev. 2004, 84, 41-68), или так называемые лантибиотики (Chatterjee et al., Chem. Rev. 2005, 105, 633-683) из грамположительных бактерий. Указанные пептиды имеют различные применения. Лантибиотик низин используется, среди других применений, как пищевой консервант в течение многих лет.

Конопептиды являются, например, пригодными для лечения боли, диабета, рассеянного склероза и сердечно-сосудистых заболеваний и в настоящее время подвергаются предклинической или клинической разработке. Примеры конопептидов представляют собой -GI (последовательность: ECCNPACGRHYSC*, *амидированный, мостиковые связи: 1-3,2-4) и -GID (последовательность: IR CCSNPACRVNNOHVC, мостиковые связи: 1-3,2-4), где O/Hyp представляет собой гидроксипролин и мостиковые связи показывают положение цистеина, участвующего в каждой конкретной дисульфидной связи, например, от первого до третьего и от второго до четвертого, как в -GID:

Сущность изобретения

В настоящее время неожиданно обнаружено, что пептиды с большим количеством мостиковых связей могут быть выделены из штамма микроорганизмов Actinomadura namibiensis (DSM 6313) и являются пригодными для лечения бактериальных инфекций, вирусных инфекций и/или боли.

Подробное описание изобретение

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения представляет собой соединение формулы (I)

где

R1 представляет собой H, C(O)-(C₁-C₆)алкил или C(O)-O-(C ₁-C₆)алкил;

R2 представляет собой OH, NH₂, NH-(C₁-C₆)алкил, NH-(C ₁-C₄)алкилен-фенил или NH-(C₁-C ₄)алкилен-пиридил;

R3 и R4 независимо друг от друга представляют собой H или OH, или R3 и R4 вместе представляют собой =O; и

m и n независимо друг от друга равны 0, 1 или 2;

в любой стереохимической форме или смеси любых стереохимических форм при любом отношении или их физиологически переносимую соль.

В дополнительном варианте осуществления соединение формулы (I) является соединением формулы (II)

где R1, R2, R3, R4, m и n являются такими, как определено выше.

R1 предпочтительно представляет собой H. R2 предпочтительно представляет собой OH. R3 и R4 предпочтительно представляют собой H или OH, где если R3 представляет собой OH, тогда R4 представляет собой H, и если R3 представляет собой H, тогда R4 представляет собой OH, или R3 и R4 вместе представляют собой =O. Более предпочтительно, R3 и R4 представляют собой H или OH, где если R3 представляет собой OH, тогда R4 представляет собой H, и если R3 представляет собой H, тогда R4 представляет собой OH.

Предпочтительно, m и n равны 0, или m и n равны 2, или m равно 0 и n равно 2, или m равно 2 и n равно 0. Наиболее предпочтительно, m и n равны 0.

Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой соединение формулы (I) или формулы (II), где

R1 представляет собой H;

R2 представляет собой OH;

R3 и R4 представляют собой H или OH, где если R3 представляет собой OH, тогда R4 представляет собой H, и если R3 представляет собой H, тогда R4 представляет собой OH; и

m и n независимо друг от друга равны 0, 1 или 2, предпочтительно, m и n равны 0, или m и n равны 2, или m равно 0 и n равно 2, или m равно 2 и n равно 0, особенно предпочтительно, m и n равны 0;

или их физиологически переносимую соль.

Наиболее предпочтительно, соединение (I) является соединением формулы (III)

Для дополнительной характеризации соединений по настоящему изобретению пептидные остатки были преобразованы обратно в их вероятные предшественники по рибосомальному пептидному синтезу. Альфа, альфа-дизамещенные аминокислоты в остатках 1 и 10 не описаны в литературе. Указанная аминокислота может описываться как остаток Ala, соединенный мостиковой метиленовой группой и замещенный в бета-положении, как показано ниже:

Настоящее изобретение, кроме того, относится ко всем очевидным химическим эквивалентам соединений формул (I), (II) и (III) в соответствии с настоящим изобретением. Эти эквиваленты представляют собой соединения, которые демонстрируют только небольшое химическое различие и имеют одинаковое фармакологическое воздействие или которые преобразуются в соединения в соответствии с настоящим изобретением при мягких условиях. Указанные эквиваленты также включают, например, соли, продукты восстановления, продукты окисления, полученные в результате процессов частичного гидролиза сложные эфиры, простые эфиры, ацетали или амиды соединений формул (I), (II) и (III), а также эквиваленты, которые специалист в данной области может получить, используя стандартные способы, и в дополнение к этому все оптические антиподы и диастереомеры и все стереоизомерные формы.

Если не указано иного, хиральные центры соединений формулы (I) могут присутствовать в R конфигурации или в S конфигурации. Настоящее изобретение относится как к оптически чистым соединениям, так и к стереоизомерным смесям, таким как энантиомерные смеси и диастереомерные смеси.

Физиологически переносимые соли соединений формул (I), (II) и (III) понимаются как представляющие собой как их органические соли, так и их неорганические соли, как описано в Remington's Pharmaceutical Sciences (17th edition, page 1418 (1985)). Из-за их физической и химической стабильности и их растворимости предпочтительными являются соли натрия, калия, кальция и аммония, среди прочего, относительно кислотных групп; соли хлористоводородной кислоты, серной кислоты, или фосфорной кислоты, или карбоновых кислот, или сульфоновых кислот, такой как уксусная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, винная кислота и п-толуолсульфоновая кислота, являются предпочтительными, среди прочего, относительно основных групп.

Представленные соединения будут именоваться по тексту лабиринтопептины.

Настоящее изобретение также относится к способу получения соединения формулы (I), где m и n независимо друг от друга равны 0, 1 или 2, который включает

a) ферментацию штамма Actinomadura namibiensis (DSM 6313) или одного из его вариантов и/или мутантов при соответствующих условиях в культуральной среде до тех пор, пока одно или несколько соединений формулы (I) не накопятся в культуральной среде,

b) выделение соединения формулы (I) из культуральной среды и

c) модификацию соединения формулы (I), где это необходимо, и/или, где необходимо, преобразование в физиологически переносимую соль.

Настоящее изобретение предпочтительно относится к способу получения соединения формулы (I), где соединение (I) является соединением формулы (II), более предпочтительно, настоящее изобретение относится к способу получения соединения формулы (I) или предпочтительно (II), где m и n равны 0, или m и n равны 2, или m равно 0 и n равно 2, или m равно 2 и n равно 0.

Особенно предпочтительно, настоящее изобретение относится к способу получения соединения формулы (I), где соединение (I) является соединением формулы (III).

Культуральная среда представляет собой питательный раствор или твердую среду, содержащую, по меньшей мере, один стандартный источник углерода и, по меньшей мере, один источник азота, а также одну или несколько стандартных неорганических солей.

Способ в соответствии с настоящим изобретением может использоваться для ферментации в лабораторном масштабе (масштабе от миллилитров до литров) и для ферментации в промышленном масштабе (масштабе кубических метров).

Пригодные для использования источники углерода для ферментации представляют собой усваиваемые углеводы и сахарные спирты, такие как глюкоза, лактоза, сахароза или D-маннитол, а также содержащие углеводы природные продукты, такие как экстракт солода или экстракт дрожжей. Примеры азотсодержащих питательных сред представляют собой аминокислоты; пептиды и белки, а также продукты их распада, например казеин, пептоны или триптоны; мясные экстракты; экстракты дрожжей; глютен; молотые семена, например, кукурузы, пшеницы, бобов, сои или растений хлопка; остатки перегонки от получения спирта; мясную муку; экстракты дрожжей; соли аммония; нитраты. Предпочтение отдается источнику азота, представляющему собой один или несколько пептидов, которые получают синтетически или биосинтетически. Примеры неорганических солей представляют собой хлориды, карбонаты, сульфаты или фосфаты щелочных металлов, щелочноземельных металлов, железа, цинка, кобальта и марганца. Примеры микроскопических элементов представляют собой кобальт и марганец.

Условия, которые являются особенно пригодными для получения лабиринтопептинов в соответствии с настоящим изобретением, являются следующими: от 0,05 до 5%, предпочтительно от 0,1 до 2,5%, экстракта дрожжей; от 0,2 до 5,0%, предпочтительно от 0,1 до 2%, казитона; от 0,02 до 1,0%, предпочтительно от 0,05 до 0,5%, CaCl₂ × 2H ₂O; от 0,02 до 1,5%, предпочтительно от 0,05 до 0,7%, MgSO ₄ × 7H₂O и от 0,00001% до 0,001% цианокобаламина. Процентные значения, которые приводятся, в каждом случае относятся к массе питательного раствора в целом.

Микроорганизм культивируется аэробно, то есть, например, при погружении, в то время как его встряхивают или перемешивают во встряхиваемых колбах или ферментерах, или на твердой среде, где необходимо, чтобы в это время пропускался воздух или кислород. Микроорганизм может культивироваться в диапазоне температур примерно от 18 до 35°C, предпочтительно, примерно от 20 до 32°C, в частности от 27 до 30°C. Диапазон pH должен находиться в пределах между 4 и 10, предпочтительно между 6,5 и 7,5. Микроорганизм, как правило, культивируется при этих условиях в течение периода от 2 до 10 дней, предпочтительно от 72 до 168 часов. Микроорганизм преимущественно культивируется на нескольких стадиях, то есть одна или несколько предварительных культур сначала приготавливается в жидкой питательной среде, при этом эти предварительные культуры затем инокулируются в реальной среде продуцирования, то есть в главной культуре, например, при объемном отношении от 1:10 до 1:100. Предварительную культуру получают, например, посредством инокулирования штамма в форме вегетативных клеток или спор в питательный раствор и предоставления им возможности для роста в течение примерно от 20 до 120 часов, предпочтительно в течение от 48 до 96 часов. Вегетативные клетки и/или споры могут быть получены, например, посредством предоставления возможности штамму для роста в течение примерно от 1 до 15 дней, предпочтительно в течение от 4 до 10 дней, на твердом или жидком питательном субстрате, например на агаре с дрожжевым экстрактом.

Производные лабиринтопептина могут выделяться и очищаться из культуральной среды с использованием известных способов и принимая во внимание химические, физические и биологические свойства природных веществ. ВЭЖХ используют для исследования концентраций соответствующих производных лабиринтопептина в культуральной среде или на индивидуальных стадиях выделения, при этом качество полученного вещества непосредственно сравнивают с калибровочным раствором.

Для выделения культуральную среду или культуру вместе с твердой средой необязательно лиофилизируют, и производные лабиринтопептина эктрагируют из лиофилизата с использованием органического растворителя или смеси воды и органического растворителя, предпочтительно содержащей 50-90% органического растворителя. Примеры органических растворителей представляют собой метанол и 2-пропанол. Органическая фаза растворителя содержит природные вещества в соответствии с настоящим изобретением; ее концентрируют, где это необходимо, в вакууме и подвергают дополнительной очистке.

Дополнительную очистку одного или нескольких соединений в соответствии с настоящим изобретением осуществляют с помощью хроматографии на соответствующих материалах, предпочтительно, например, на молекулярных ситах, на силикагеле, на оксиде алюминия, на ионообменниках или на адсорбирующих смолах, или на обращенных фазах (RP). Эту хроматографию используют для разделения производных лабиринтопептинов. Производные лабиринтопептинов подвергаются хроматографии с использованием дополненных буферами основных или подкисленных водных растворов или смесей водных и органических растворов.

Смеси водных или органических растворов понимаются как представляющие собой все смешиваемые с водой органические растворители, предпочтительно метанол, 2-пропанол или ацетонитрил, при концентрации от 5 до 99% органического растворителя, предпочтительно от 5 до 50% органического растворителя, или, кроме того, все дополненные буфером водные растворы, которые являются смешиваемыми с органическими растворителями. Буферы, которые должны быть использованы, являются такими же, как описано выше.

Производные лабиринтопептинов разделяются на основе их различной полярности с помощью хроматографии с обращенной фазой, например, на MCI (адсорбирующая смола, Mitsubishi, Japan) или Amberlite XAD (TOSOHAAS), или на других гидрофобных материалах, например на фазах RP-8 или RP-18. В дополнение к этому разделение может осуществляться посредством хроматографии с нормальной фазой, например, на силикагеле, оксиде алюминия и тому подобном.

Дополненные буферами основные или подкисленные водные растворы понимаются как представляющие собой, например, воду, фосфатный буфер, аммоний-ацетатный и цитратный буфер при концентрации до 0,5 M, а также муравьиную кислоту, уксусную кислоту, трифторуксусную кислоту, аммоний и триэтиламин, или все коммерчески доступные кислоты и основания, известные специалисту в данной области, предпочтительно при концентрации до 1%. В случае дополненных буферами водных растворов особенное предпочтение отдается 0,1% ацетату аммония.

Хроматография может осуществляться с использованием градиента, который начинается с 100% воды и заканчивается 100% органического растворителя; хроматографию предпочтительно осуществляют при линейном градиенте от 5 до 95% ацетонитрила.

Альтернативно возможно также осуществление гель-хроматографии или хроматографии на гидрофобных фазах. Гель-хроматография может, например, осуществляться на полиакриламидных гелях или сополимерных гелях. Последовательность рассмотренных выше хроматографических шагов может быть обращена.

Постольку поскольку лабиринтопептины присутствуют как стереоизомеры, они могут разделяться с использованием известных способов, например, посредством разделения с использованием хиральной колонки.

Модификация группы OH с образованием производного в форме сложного эфира или простого эфира осуществляется с использованием известных способов (J. March, Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, 4th edition, 1992), например, посредством реакции с ангидридом кислоты или посредством реакции с ди-алкилкарбонатом или ди-алкилсульфатом. Модификация группы COOH с образованием сложноэфирного или амидного производного осуществляется с использованием известных способов (J. March, Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, 4th edition, 1992), например, посредством реакции с аммиаком до соответствующей группы CONH₂, или с необязательно активированным алкильным соединением до соответствующего сложного алкилового эфира. Окисление группы -CH₂-S-CH₂ - до группы -CH₂-S(O)-CH₂- или -CH ₂-S(O)₂-CH₂- может быть осуществлено путем воздействия на соответствующее производное лабиринтопептина кислородом или воздухом.

Изолят штамма микроорганизма Actinomadura namibiensis находится под идентификационным обозначением FH-A 1198 в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen [German Collection of Microorganisms and Cell Cyltures] GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1B, 38124 Braunschweig, Germany, в соответствии с правилами Будапештского договора от 23.01.1991, под следующим номером: DSM 6313. Штамм микроорганизм Actinomadura namibiensis, кроме того, описан Wink et al., в International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2003, 53, 721-724.

Вместо штамма Actinomadura namibiensis (DSM 6313) можно также использовать его мутанты и/или варианты, которые синтезируют одно или несколько соединений в соответствии с настоящим изобретением.

Мутант представляет собой микроорганизм, у которого один или несколько генов в геноме модифицированы, при этом ген или гены, которые ответственны за способность организма к продуцированию соединения по настоящему изобретению, остаются функциональными и наследуемыми.

Такие мутанты могут быть получены известным способом с использованием физических средств, например, облучения, например ультрафиолетовым излучением или рентгеновским излучением, или химических мутагенов, таких как этилметансульфонат (EMS); 2-гидрокси-4-метоксибензофенон (MOB) или N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (MNNG), или как описано Brock et al. в Biology of Microorganisms , Prentice Hall, стр. 238-247 (1984).

Вариант представляет собой фенотип микроорганизма. Микроорганизмы обладают способностью адаптироваться к их окружающей среде и по этой причине демонстрируют ярко выраженную физиологическую изменчивость. Все клетки микроорганизма вовлечены в фенотипическую адаптацию, при этом природа изменения не является генетически обусловленной и является гибкой при изменяющихся условиях (H. Stolp, Microbial ecology: organism, habitats, activities. Cambridge University Press, Cambridge, GB, стр. 180, 1988).

Скрининг относительно мутантов и/или вариантов, которые синтезируют одно или несколько соединений в соответствии с настоящим изобретением, достигается посредством необязательной лиофилизации ферментационной среды и экстрагирования лиофилизата или ферментационного бульона органическим растворителем или смесью воды и органического растворителя, как определено выше, и анализа посредством ВЭЖХ или ТСХ или посредством исследования биологической активности.

Условия ферментации могут применяться к Actinomadura namibiensis (DSM 6313) и к его мутантам и/или вариантам.

Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой применение соединения формулы (I), предпочтительно соединения формулы (II) или (III), как определено выше, для лечения бактериальных инфекций, в частности бактериальных инфекций, вызываемых грамположительными бактериями, для лечения вирусных инфекций и/или для лечения боли, в частности невропатической боли или боли, инициируемой воспалением.

Описанное выше лекарственное средство (упоминаемое также, как фармацевтический препарат или фармацевтическая композиция) содержит эффективное количество, по меньшей мере, одного соединения формулы (I), в любой стереохимической форме, или смесь любых стереохимических форм при любом отношении, или физиологически переносимую соль или ее химический эквивалент, как описано выше, и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель, предпочтительно, одно или несколько веществ фармацевтически приемлемого носителя (или связывающих веществ) и/или добавки (или наполнители).

Лекарственное средство может вводиться перорально, например в форме пилюль, таблеток, глазированных таблеток, таблеток с покрытиями, гранул, твердых и мягких желатиновых капсул, растворов, сиропов, эмульсий, суспензий или аэрозольных смесей. Введение, однако, может также осуществляться ректально, например в форме суппозиториев, или парентерально, например внутривенно, внутримышечно или подкожно, в форме растворов для инъекций или растворов для вливаний, микрокапсул, имплантов или стержней, или чрескожно, или местным образом, например в форме мазей, растворов или тинктур, или другими путями, например, в форме аэрозолей или назальных спреев.

Лекарственные средства в соответствии с настоящим изобретением получают способом, известным специалистам в данной области, фармацевтически приемлемые вещества инертных неорганических и/или органических носителей и/или добавок используются в дополнение к соединению (соединениям) формулы (I) в любой стереохимической форме или в смеси любых стереохимических форм при любом отношении, или физиологически переносимой соли или ее химическому эквиваленту, как описано выше. Для получения пилюль, таблеток, таблеток с покрытием и твердых желатиновых капсул можно использовать, например, лактозу, кукурузный крахмал или его производные, тальк, стеариновую кислоту или ее соли и тому подобное. Вещества носителей для мягких желатиновых капсул и суппозиториев представляют собой, например, жиры, воски, полутвердые и жидкие полиолы, природные или отвержденные масла и тому подобное. Соответствующие вещества носителей для получения растворов, например растворов для инъекций или эмульсий, или сиропов представляют собой, например, воду, солевой раствор, спирты, глицерин, полиолы, сахарозу, обращенный сахар, глюкозу, растительные масла и тому подобное. Соответствующие вещества носителей для микрокапсул, имплантов или стержней представляют собой, например, сополимеры гликолевой кислоты и молочной кислоты. Фармацевтические препараты обычно содержат примерно от 0,5 примерно до 90% мас. соединения формулы (I) и/или их физиологически приемлемых солей и/или их пролекарств. Количество активного ингредиента формулы (I) в любой стереохимической форме или в смеси любых стереохимических форм при любом отношении, или его физиологически переносимой соли или химического эквивалента, как описано выше, в лекарственных средствах обычно составляет примерно от 0,5 примерно до 1000 мг, предпочтительно примерно от 1 примерно до 500 мг.

В дополнение к активным ингредиентам формулы (I) в любой стереохимической форме или в смеси любых стереохимических форм при любом отношении или их физиологически переносимой соли или химическому эквиваленту, как описано выше, и к веществам носителям, фармацевтические препараты могут содержать одну или несколько добавок, таких как, например, наполнители, разрыхлители, связывающие вещества, смазывающие вещества, смачивающие агенты, стабилизаторы, эмульсификаторы, консерванты, подсластители, красители, отдушки, ароматизаторы, загустители, разбавители, буферные вещества, растворители, солюбилизаторы, агенты для достижения эффекта депо, соли для изменения осмотического давления, агенты для нанесения покрытий или антиоксиданты. Они также могут содержать два или более соединений формул (I) в любой стереохимической форме или смесь любых стереохимических форм при любом отношении или его физиологически переносимую соль или химический эквивалент. В случае когда фармацевтический препарат содержит два или более соединений формулы (I), выбор индивидуальных соединений может иметь целью конкретный общий фармакологический профиль фармацевтического препарата. Например, сильнодействующее соединение с более короткой продолжительностью действия может объединяться с соединением длительного действия с более низким сильнодействием. Гибкость, допустимая по отношению к выбору заместителей, в соединениях формулы (I) делает возможным высокий уровень контроля над биологическими и физико-химическими свойствами соединений и, таким образом, делает возможным выбор таких желаемых соединений. Кроме того, в дополнение, по меньшей мере, к одному соединению формулы (I), фармацевтические препараты могут также содержать один или несколько других терапевтически или профилактически активных ингредиентов.

При использовании соединений формулы (I) доза может изменяться в широких пределах, и, как обычно и как известно врачу, они должны приспосабливаться к индивидуальному состоянию в каждом индивидуальном случае. Это зависит, например, от конкретного используемого соединения, от природы и тяжести заболевания, которое должно лечиться, от способа и временного графика введения, или от того, лечится ли острое или хроническое состояние или осуществляется профилактика. Соответствующая дозировка может устанавливаться с использованием клинических подходов, хорошо известных в области медицины. Как правило, ежедневная доза для достижения желаемых результатов у взрослого с массой примерно 75 кг составляет примерно от 0,01 примерно до 100 мг/кг, предпочтительно примерно от 0,1 примерно до 50 мг/кг, в частности примерно от 0,1 примерно до 10 мг/кг (в каждом случае в мг на кг массы тела). Ежедневная доза может разделяться в особенности в случае введения относительно больших количеств, на несколько, например на 2, 3 или 4, частичных введения. Как обычно, в зависимости от индивидуального поведения, может оказаться необходимым отклонение вверх или вниз от показанной ежедневной дозы.

Пример 1: Получение криокультуры Actinomadura namibiensis (DSM 6313)

100 мл культуральной среды (10 г крахмала, 2 г экстракта дрожжей, 10 г глюкозы, 10 г глицерина, 2,5 г порошка кукурузного экстракта, 2 г пептона, 1 г NaCl, 3 г CaCO₃ в 1 л водопроводной воды, pH 7,2 перед стерилизацией) засевают штаммом Actinomadura namibiensis (DSM 6313) в стерильной 500-мл колбе Эрленмайера и инкубируют в течение 72 часов при 27°C и при 120 об/мин на шейкере. Впоследствии 1 мл культуры и 1 мл стерильного консервирующего раствора (20 г глицерина, 10 г сахарозы, 70 мл деионизованной воды) смешивают и хранят при -80°C. Альтернативно маленькие кусочки хорошо проросшей культуры на агаре переносят в Cryotubes® (Vangard International) вместе с 1,5 мл 50% стерильного раствора глицерина и хранят при -196°C в жидком азоте.

Пример 2: Получение лабиринтопептинов

Стерильную 500-мл колбу Эрленмайера, содержащую 100 мл культуральной среды, описанной в Примере 1, засевают культурой Actinomadura namibiensis (DSM 6313), которую выращивают на агаровой пластинке и инкубируют при 27°C и 120 об/мин на шейкере. Через 72 часа дополнительные колбы Эрленмайера, содержащие эту же культуральную среду в том же количестве, засевают 2 мл этой предварительной культуры каждую и инкубируют при идентичных условиях в течение 168 часов. Альтернативно 300-мл колбу Эрленмайера, содержащую 100 мл культуральной среды, описанной в Примере 1, засевают культурой Actinomadura namibiensis (DSM 6313) и инкубируют при 25°C и 180 об/мин. Через 72 часа дополнительные колбы Эрленмайера, содержащие такую же культуральную среду в таком же количестве, засевают 5 мл этой предварительной культуры каждую и инкубируют при идентичных условиях в течение 168 часов.

Пример 3: Выделение лабиринтопептинов

2% диатомовой земли Hyflo Super-cel (Hyflo Supercell; VWR, Darmstadt, Germany) добавляют к 10 л культурального бульона, с содержанием в соответствии с Примером 2, и культуру фильтруют через фильтр-пресс для отделения раствора культуры от мицелл. Фильтрат вводят в колонку, содержащую 1 л смолы Amberlite XAD-16 (диаметр колонки: 5,5 см, высота колонки: 42 см), и промывают 5 л деионизованной воды и 5 л 20% метанола в воде. Лабиринтопептин элюируют 5 л 60% метанола в воде и 5 л 80% метанола в воде. Фракции, содержащие лабиринтопептин, идентифицируют с помощью ВЭЖХ-DAD и ЖХ-ESI-МС, коллективно концентрируют на роторном испарителе до получения водного остатка, а затем сушат вымораживанием. Получают 300 мг сырого продукта.

Пример 4: Высокоэффективная жидкостная хроматография с детектированием на диодной матрице (ВЭЖХ-DAD) лабиринтопептинов

Колонка:	Nucleosil 100 - C18; 20 + 125 мм × 4,6 мм, 5 мкм (Machery-Nagel)
Подвижная фаза:	0,1% H3PO4 в воде (элюент A) и ацетонитрил (элюент B)
	линейный градиент от 0% до 100% элюента B в элюенте A в течение периода 15 минут
Поток:	2 мл в минуту

Детектирование с помощью УФ/видимого поглощения дает пики при 210, 230, 260, 280, 310, 360, 435 и 500 нм.

Время удерживания лабиринтопептина формулы (II): 7,75 минут.

Пример 5: Высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектроскопией с электрораспылительной ионизаций (ВЭЖХ-ESI-МС) лабиринтопептинов

Колонка:	Purospher RP-18e; 125 мм × 4 мм, 5 мкм (Agilent)
Подвижная фаза:	0,1% трифторуксусная кислота в воде (элюент A) и
	0,1% трифторуксусная кислота в ацетонитриле (элюент B)
	линейный градиент от 5% до 100% элюента B в элюенте A
	в течение периода 10 минут

Поток:

1,5 мл в минуту. Поток в интерфейс ESI масс-спектрометра уменьшают до 0,4 мл в минуту с помощью T-образного разветвителя.

Детектирование с помощью УФ поглощения на 210 нм и ESI-МС (положительный режим), где ионная ловушка используется как масс-анализатор.

Время удерживания лабиринтопептина формулы (III) равно 5,9 минут. Молекулярная масса равна 1922 Да.

Пример 6: Очистка лабиринтопептинов

Сырой продукт лабиринтопептина, полученный в соответствии с примером 3 (300 мг), растворяют в смеси диметилсульфоксида, метанола и воды (1:3:6), и компоненты разделяют с помощью хроматографии на колонке Nucleosil 100 - C₁₈ (размер частиц: 10 мкм, размер колонки: 250 × 16 мм) с использованием изократического элюирования (вода + 0,1% муравьиная кислота/метанол, 35:65) при скорости потока 20 мл в минуту. Фракции анализируют с помощью ВЭЖХ (смотри пример 4). 62 мг лабиринтопептина формулы (III) получают с 99% чистотой.

Пример 7: Общие характеристики лабиринтопептина (III)

Соединение формулы (III) окисляется при экспонировании для воздуха до соответствующих сульфоксидов. Соединение формулы (III) содержит 2 цис-амиды между ²Asp-³Trp и ¹¹Thr-¹² Gly.

Пример 8: ESI-FTICR-масс-спектрометрия высокого разрешения

Раствор лабиринтопептина формулы (III) в метаноле (c=0,2 мг/мл) вводят через плунжерный насос при скорости потока 2 мкл/мин в Bruker Apex III FTICR МС (магнит 7T), снабженный источником электрораспыления. Спектры регистрируют в положительном режиме с использованием внешней калибровки.

m/z, наблюдаемое, в Да (z=2, M+2Na+ ион)	984,3333
Точная моноизотопная масса нейтрального соединения [M]	1922,6872
Теоретическая масса [M] для C85H110N 20O24S4	1922,6885
Молекулярная формула	C85H110N20O24S 4

Пример 9: Анализ аминокислот

Гидролиз: лабиринтопептин (III) (0,05 мг) гидролизируют в атмосфере азота с помощью 6 н. HCl, 5% фенола при 110°C в течение 24 час. Гидролизат сушат в потоке азота.

Ахиральная ЖХ-МС: гидролизат нагревают вместе с бис(триметилсилил)трифторацетамидом (BSTFA)/ацетонитрилом (1:1) при 150°C в течение 4 час. Для экспериментов ЖХ-МС используют DB5 - тянутый кварцевый капилляр (l=15 м × 0,25 мкм тянутый кварц, покрытый диметил-(5%-фенилметил)полисилоксаном, d_f=0,10 мкм; температурная программа: T=65°/3 мин/6/280°C).

Хиральная ЖХ-МС: гидролизат этерифицируют с помощью 200 мкл 2 н. HCl в этаноле при 110°C в течение 30 мин и сушат. Впоследствии смесь ацилируют с помощью 25 мкл TFAA в 100 мкл дихлорметана при 110°C в течение 10 мин и сушат. Для ЖХ-МС используют тянутый кварцевый капилляр - (l=22 м × 0,25 мкм, тянутый кварц, покрытый Chirasil- S-Val (Machery-Nagel), d_f=0,13 мкм; температурная программа: T=55°/3 мин/3,2/180°C).

		Конфигурация
Аминокислоты	1 Ala, 1 Thr, 2 Leu, 1 Asp, 2 Cys, 1 Phe, 1 Glu, 2 Trp, 1 Gly	Все S-аминокислоты

Пример 10: ЯМР спектроскопия

2-мерные спектры ЯМР (COSY, TOCSY, NOESY, HSQC, HMBC) измеряют на ЯМР спектрометре AMX 600 MHz (Bruker, Karlsruhe, Germany), снабженном 5-мм головкой с датчиком тройного резонанса с Z-градиентом, и на спектрометре ЯМР DRX500 (Bruker, Karlsruhe, Germany), снабженном 5-мм головкой с широкополосным датчиком для инверсии с Z-градиентом. Следующая далее таблица показывает сигналы, полученные при измерениях.

Данные ЯМР для лабиринтопептина формулы (III) в ДМСО-d₆:

1H

0,68; 0,71; 0,75; 0,78; 1,05; 1,07; 1,10; 1,35; 1,40; 1,42; 1,49; 1,90; 1,96; 2,00; 2,10; 2,17; 2,26; 2,77; 2,86; 2,90; 2,97; 3,03; 3,14; 3,16; 3,18; 3,18; 3,20; 3,24; 3,29; 3,30; 3,39; 3,59; 3,67; 3,67; 3,72; 3,99; 4,02; 4,03; 4,10; 4,13; 4,14; 4,16; 4,19; 4,34; 4,36; 4,45; 4,49; 4,59; 6,96; 7,26; 7,00; 7,04; 7,08; 7,08; 7,10; 7,18; 7,22; 7,23; 7,24; 7,24; 7,31; 7,35; 7,36; 7,42; 7,51; 7,53; 7,65; 7,65; 7,69; 7,77; 7,84; 7,98; 8,00; 8,01; 8,56; 10,80; 10,81.

13C

19,7; 21,3; 21,4; 22,6; 23,04; 23,2; 23,7; 26,4; 26,4; 27,1; 33,4; 35,2; 35,4; 36,7; 38,3; 40,0; 40,5; 40,7; 40,8; 40,8; 41,2; 41,2; 43,4; 48,4; 48,7; 49,0; 51,2; 51,4; 52,5; 52,6; 52,7; 53,2; 53,5; 54,0; 56,9; 60,0; 60,3; 66,4; 109,8; 110,6; 111,2; 111,2; 117,4; 118,1; 118,1; 118,2; 120,7; 120,7; 122,1; 123,4; 126,5; 127,2; 127,3; 127,8; 129,4; 136,0; 136,1; 136,6; 140,8; 169,4; 173,0; 174,3; 176,9.

Пример 11: Рентгеновская кристаллография лабиринтопетина (III)

Условия кристаллизации: белок растворяют в 0,02 M Трис, pH 8,2 (концентрация 7 мг/мл). Кристаллы растут при комнатной температуре посредством капельно-диффузионной кристаллизации из паровой фазы из 1:1 смеси раствора белка с раствором из 60% этанола, 0,75% PEG 6000, 0,025 M ацетата натрия и 0,05 M хлорида натрия. Кристаллы растут в пределах примерно одной недели.

Измерение: рентгеновские данные собирают на круговом дифрактометре Bruker 3 с вращающимся анодом и монохроматизированном на зеркальном монохроматоре излучением CuK-альфа. Интенсивности собирают на площадном CCD детекторе SMART 6000.

Данные кристаллов:

Формула	NaN 20C85S4O48	NaC85N20O24S4
Формульная масса	2220,29	1834,82
Кристаллическая система	орторомбическая
Пространственная группа	P 21 21 2 ( № 18)
Размеры элементарной ячейки	a=41,1360 Å
b=12,8850 Å
c=25,5900 Å
Объем ячейки	13563,66 Å3
Z	4
Плотность, вычисленная	1,087 г/см3
Код Пирсона	oP732
Тип формулы	NO4P20Q48R85
Последовательность Вайкоффа	c181b3a

Атомные координаты:

№	Атом	№ атома	x	y	z	e--плотность
0	Na	NA	0,26282	1,11533	-0,20024	1,0
1	N	18NH	0,16643	0,62593	0,30751
2	C	18Ca	0,15933	0,69120	0,26221
3	C	18Cb	0,12264	0,69329	0,24928
4	S	18Sg	0,11248	0,78619	0,19945
5	C	18CO	0,16446	0,80225	0,28144
6	O	18OC1	0,15211	0,83361	0,32212
7	O	18OC3	0,17868	0,86558	0,25381	0,290
8	O	18OC2	0,18240	0,86116	0,25780	0,710
9	N	17NH2	0,17255	0,50082	0,39461	0,570
10	C	17Ca2	0,19839	0,49670	0,35604	0,570
11	N	17NH1	0,17994	0,49779	0,40196	0,430
12	C	17Ca1	0,20056	0,49833	0,35678	0,430
13	C	17Cb	0,20165	0,38479	0,33630	1,0
14	S	13S1	0,16523	0,32006	0,32001
15	C	17CO	0,19312	0,57036	0,31036
16	O	17OC	0,21276	0,57136	0,27366
17	N	16NH1	0,11776	0,48825	0,45694	0,570
18	C	16Ca1	0,14725	0,54296	0,47554	0,570
19	C	16Cb2	0,14824	0,52387	0,53451	0,570
20	C	16CO2	0,17744	0,51223	0,44580	0,570
21	O	16OC2	0,20586	0,50283	0,46026	0,570
22	N	16NH2	0,12522	0,46605	0,47460	0,430
23	C	16Ca2	0,15695	0,50741	0,49039	0,430
24	C	16Cb1	0,17666	0,42678	0,52110	0,430
25	C	16CO1	0,17829	0,54862	0,44623	0,430
26	O	16OC1	0,19399	0,62818	0,45350	0,430
27	N	15NH	0,08606	0,28654	0,38875	1,0
28	C	15Ca	0,08545	0,33846	0,43783
29	C	15Cb	0,07342	0,26519	0,48191
30	C	15Cg	0,07342	0,31743	0,53443
31	C	15Cd1	0,09641	0,30051	0,57015
32	C	15Ce1	0,09892	0,34692	0,61802
33	C	15Cz	0,07361	0,41607	0,62963
34	C	15Ce2	0,04891	0,43679	0,59512
35	C	15Cd2	0,04787	0,38914	0,54580
36	C	15CO2	0,11795	0,38518	0,45303	0,570
37	O	15OC2	0,14083	0,32503	0,46100	0,570
38	C	15CO1	0,11985	0,37400	0,45272	0,430
39	O	15OC1	0,14260	0,31215	0,44467	0,430
40	N	14NH	0,09663	0,22957	0,28367	1,0
41	C	14Ca	0,06493	0,21832	0,30973
42	C	14Cb	0,05881	0,10260	0,32228
43	C	14Cg	0,06148	0,01917	0,28163
44	C	14Cd1	0,05246	-0,08320	0,30793
45	C	14Cd2	0,04038	0,05153	0,23556
46	C	14CO	0,06073	0,27513	0,35936
47	O	14OC	0,03420	0,31036	0,37413
48	N	13NH	0,14348	0,21739	0,21016
49	C	13Ca	0,13259	0,32131	0,22415
50	C	13Cb	0,15887	0,37393	0,25639
51	C	13CO	0,10174	0,31603	0,25729
52	O	13OC	0,08431	0,39162	0,25920
53	N	12NH	0,13789	0,04315	0,10383
54	C	12Ca	0,14494	0,06092	0,15913
55	C	12CO	0,12665	0,15374	0,17941
56	O	12OC	0,09846	0,17540	0,16440
57	N	11NH	0,18026	0,23392	0,10274
58	C	11Ca	0,18245	0,14769	0,06491
59	C	11Cb	0,21437	0,08040	0,07601
60	O	11Og	0,24067	0,15367	0,06932
61	C	11Cg	0,21483	-0,00652	0,03877
62	C	11CO	0,15298	0,08188	0,06213
63	O	11OC	0,14289	0,05192	0,01723
64	N	10NH	0,15427	0,48630	0,10547
65	C	10Ca	0,15553	0,39216	0,13693
66	C	10Cb	0,12680	0,38774	0,17495
67	C	10CO	0,15563	0,30214	0,09785
68	O	10OC	0,13341	0,29174	0,06737
69	N	9NH	0,15921	0,62732	0,02599
70	C	9Ca	0,17078	0,65813	0,07761
71	C	9Cb1	0,15364	0,74568	0,10696	0,650
72	S	9Sg2	0,11348	0,70773	0,12986	0,650
73	C	9Cb2	0,14430	0,73147	0,09699	0,350
74	S	9Sg1	0,15631	0,80140	0,15424	0,350
75	C	9CO	0,17309	0,56593	0,11423	1,0
76	O	9OC	0,19300	0,56593	0,15084
77	N	8NH	0,18541	0,52953	-0,09746
78	C	8Ca	0,16349	0,52728	-0,05346
79	C	8Cb	0,15665	0,41428	-0,03791
80	S	4S1	0,14207	0,33194	-0,08922
81	C	8CO	0,17870	0,57819	-0,00528
82	O	8OC	0,20763	0,56423	0,00430
83	N	7NH	0,20632	0,49826	-0,20125
84	C	7Ca	0,21045	0,59830	-0,17558	1,0
85	C	7Cb	0,20977	0,68941	-0,21403
86	C	7Cg	0,23965	0,69290	-0,24846
87	C	7Cd	0,27179	0,70780	-0,21942
88	O	7O2	0,27356	0,77789	-0,18617
89	O	7O2	0,29422	0,64688	-0,23185
90	C	7CO	0,18551	0,60947	-0,13036
91	O	7OC	0,16934	0,68669	-0,12474
92	N	6NH	0,14508	0,31502	-0,23408
93	C	6Ca	0,17581	0,36438	-0,24779
94	C	6Cb	0,17865	0,38440	-0,30618
95	C	6Cg	0,21065	0,42228	-0,32263
96	C	6Cd1	0,24023	0,37835	-0,31634
97	N	6Ne	0,26396	0,43927	-0,33810
98	C	6Ce2	0,24957	0,52674	-0,35877
99	C	6Cd2	0,21551	0,51704	-0,34959
100	C	6Ce1	0,19382	0,59341	-0,36554
101	C	6Cz1	0,20739	0,67707	-0,39101
102	C	6Ch	0,24169	0,68111	-0,39910
103	C	6Cz2	0,26459	0,61009	-0,38421
104	C	6CO	0,17783	0,46644	-0,21817
105	O	6OC	0,15276	0,51859	-0,21294
106	N	5NH	0,09092	0,22755	-0,18031
107	C	5Ca	0,10636	0,17447	-0,22462
108	C	5Cb	0,08579	0,17788	-0,27331
109	C	5Cg1	0,06556	0,08855	-0,29223	0,400
110	C	5Cd2	0,05562	0,00295	-0,25553	0,400
111	C	5CD3	0,03406	0,13232	-0,31950	0,400
112	C	5Cg2	0,05122	0,12511	-0,26843	0,600
113	C	5Cd1	0,05227	0,02119	-0,24021	0,600
114	C	5Cd2	0,03647	0,22422	-0,25795	0,600
115	C	5CO	0,14049	0,21405	-0,23552	1,0
116	O	5OC	0,16220	0,15250	-0,24447
117	N	4NH	0,04424	0,29531	-0,10297
118	C	4Ca	0,07828	0,26318	-0,08968
119	C	4Cb	0,09901	0,36213	-0,08847
120	C	4CO	0,09150	0,19084	-0,13193
121	O	4OC	0,10378	0,10656	-0,12020
122	N	3NH	-0,02049	0,37136	-0,10602
123	C	3Ca	-0,01386	0,26387	-0,12087
124	C	3Cb	-0,02263	0,24478	-0,17726
125	C	3Cg	-0,05642	0,26752	-0,19336
126	C	3Cd1	-0,08244	0,28646	-0,16303
127	N	3Ne	-0,10966	0,30431	-0,19328
128	C	3Ce2	-0,10052	0,29888	-0,24451
129	C	3Cd2	-0,06697	0,27528	-0,24627
130	C	3Ce1	-0,05275	0,26512	-0,29539
131	C	3Cz1	-0,07001	0,27753	-0,33970
132	C	3Ch	-0,10351	0,30097	-0,33634
133	C	3Cz2	-0,11905	0,31339	-0,29019
134	C	3CO	0,02125	0,22763	-0,11313
135	O	3OC	0,02703	0,13349	-0,11547
136	N	2NH	0,00873	0,33093	-0,00078
137	C	2Ca	-0,02584	0,34024	-0,01079
138	C	2Cb	-0,04293	0,38712	0,03587
139	C	2Cg	-0,07852	0,41234	0,02763
140	O	2Od1	-0,09430	0,35452	-0,00285
141	O	2Od2	-0,09060	0,48825	0,05303
142	C	2CO	-0,02912	0,40784	-0,06006
143	O	2OC	-0,03851	0,49903	-0,05444
144	N	1NH	0,07381	0,20163	0,05701
145	C	1Ca	0,06250	0,25417	0,00903
146	C	1Cb	0,07969	0,20450	-0,03763
147	C	1CO	0,02526	0,24331	0,00649
148	O	1OC	0,01235	0,15545	0,00653

Пример 12: Окисление лабиринтопептина (III)

50 мг Лабиринтопептина (III) (0,026 ммоль) растворяют в 1 мл ДМСО и смешивают с 11 мг 1-гидрокси-1-оксид-1,2-бензойодоксол-3(1H)-он (IBX, 0,039 ммоль) при комнатной температуре. Смесь перемешивают в течение 6 час при 40°C и дополнительно 12 час при комнатной температуре, а затем очищают с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой на колонке Phenomenex Luna® Axia 5 мкм C18 (2) (размер: 100 мм × 30 мм) с предварительной колонкой XTerra® Prep МС C18 10 мкм (Waters, размер: 19 × 10 мм). Градиент от 5% до 95% ацетонитрила в воде в течение 30 мин (содержащей 0,1% ацетата аммония, pH 7,0) используют в качестве элюента. Поток в колонке (60 мл/мин) фракционируют и исследуют с помощью УФ детектирования. Фракции 7-11 содержат желаемое соединение. Указанные фракции дают 25 мг (50%) после лиофилизации. Продукт характеризуют с помощью масс-спектрометрии (Bruker Daltonics MicroTof).

УФ: 222 sh (субгармоники), 278 нм

ESI-МС: MW=1920,66518 (моно MW)

Молекулярная формула: C₈₅H₁₀₈N₂₀ O₂₄S₄

Молекулярная масс (MW)=1922,2

Пример 13: Пептидный синтез на C-конце лабиринтопептинов (III)

40 мг Лабиринтопептина (III) (0,021 ммоль) растворяют в 2 мл абсолютного диметилформамида и обрабатывают 10 мг (0,045 ммоль) ди-трет-бутил-дикарбоната (Boc₂ O) и 7 мг (0,054 ммоль) диизопропилэтиламина в течение 1 час при комнатной температуре. Впоследствии добавляют 6,8 мг (0,063 ммоль) бензиламина и 50 мкл (0,072 ммоль) 50% раствора ангидрида пропилфосфоновой кислоты в ДМФ. Реакционную смесь очищают с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой на колонке Waters XBridge Shield® C18, 5 мкм (размер: 100 мм × 30 мм), содержащей предварительную колонку XBridge Shield® C18, 10 мкм (Waters, размеры: 19 × 10 мм). Градиент от 5% до 95% ацетонитрила в воде в течение 30 мин (содержащей 0,1% ацетата аммония, pH 7,0) используют в качестве элюента. Поток в колонке (60 мл/мин) фракционируют и изучают с помощью УФ детектирования. Фракции 30 и 31 объединяют и получают 9,6 мг (22%) желаемого соединения. Продукт характеризуют с помощью масс-спектроскопии (Bruker Daltonics MicroTof).

УФ: 222 sh (субгармоники), 276 нм

ESI-МС: MW=2111,79018 (моно MW)

Молекулярная формула: C₉₇H₁₂₅N₂₁O₂₅ S₄

Молекулярная масса (MW)=2113,5

Пример 14: Пептидный синтез на N-конце лабиринтопептинов (III)

5 мг (0,028 ммоль) 2-хлор-4,6-диметокси-1,3,5-триазина (CDMT) растворяют в 2 мл абсолютного диметилформамида и смешивают с 8,6 мг (0,085 ммоль) N-метилморфолина (NMM). Смесь перемешивают в течение 1 час при комнатной температуре. Добавляют 3,3 мг (0,028 ммоль) н-капроновой кислоты и смесь перемешивают в течение дополнительных 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 40 мг (0,021 ммоль) лабиринтопептина (III) и полученную смесь перемешивают в течение дополнительных 2 час при комнатной температуре. Реакционную смесь очищают с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой на колонке Waters XBridge Shield® C18, 5 мкм (размер: 100 мм × 30 мм) с предварительной колонкой XBridge Shield® C18 10 мкм (Waters, размер: 19 × 10 мм). Градиент от 5% до 95% ацетонитрила в воде в течение 30 мин (содержащей 0,1% муравьиной кислоты, pH 2,0) используют в качестве элюента. Поток в колонке (60 мл/мин) фракционируют и изучают с помощью УФ детектирования. Фракции 38-40 объединяют и получают 11,0 мг (26%) желаемого соединения. Продукт характеризуют с помощью масс-спектроскопии (Bruker Daltonics MicroTof).

УФ: 220 sh (субгармоники), 278 нм

ESI-МС: MW=2020,75738 (моно MW)

Молекулярная формула: C₉₁H₁₂₀N₂₀ O₂₅S₄

Молекулярная масса (MW)=2022,3

Пример 15: Противобактериальная активность

После культивирования организмов в экстракте говяжьего бульона суспензии бактерий устанавливаются до определенной плотности посредством разбавления свежей культуральной средой (5·10⁵ организмов/мл).

Лабиринтопептин (III) растворяют и разбавляют водой в последовательных геометрических разбавлениях (коэффициент 2). 1,5 мл раствора на индивидуальных стадиях разбавления смешивают с 13,5 мл жидкого агара (агар Мюллера-Хинтона) приблизительно при 45°C.

Максимальная концентрация соединения в чашке Петри обычно составляет 100 мг/л. Пластинка с агаром без соединения служит в качестве контроля.

После охлаждения и отверждения культуральной среды агаровые пластинки инокулируют одновременно 20 различными бактериальными штаммами с использованием Multipoint Inoculator, доставляющего 5·10⁴ колониеобразующих единиц (кое) на пятно инокуляции, а затем инкубируют при 37°C в течение 17 часов при аэробных условиях.

После инкубирования пластинки исследуют макроскопически на самую низкую концентрацию соединения, при которой бактериальный рост больше не наблюдается. Отдельная колония или рост мутности в пятне инокуляции во внимание не принимается.

Противобактериальное воздействие оценивается как минимальная ингибиторная концентрация исследуемого соединения (MIC: самая низкая концентрация соединения, при которой бактериальный рост больше не наблюдается макроскопически):

Исследуемый организм	MIC
Staphylococcus aureus SG 511	12,5 мг/л
Staphylococcus aureus 285	12,5 мг/л
Staphylococcus aureus 503	3,13 мг/л
Streptococcus pyogenes 308 A	3,13 мг/л
Streptococcus pyogenes 77 A	3,13 мг/л
Streptococcus faecium D	6,25 мг/л

Пример 16: Противовирусная активность

Вирусы могут размножаться только в живых клетках. По этой причине вирусные исследования осуществляют на клеточных культурах. Вирусы выбирают в связи с их важностью, либо как инфекционные агенты, либо как типичные биохимические или морфологические структуры.

Последовательные разбавления лабиринтопептина (III) приготавливают в 96-луночных планшетах для микротитрования. Клетки Hela или Vero, в соответствии с инфицирующим вирусом, добавляют до получения конфлюентного монослоя в пределах 24 час инкубирования. После инкубирования в течение 3 часов, соответствующий вирус добавляют к клеткам при концентрации, которая, как ожидается, полностью разрушит монослой клеток в пределах 2 дней. Культуры инкубируют при 37°C в газифицированном инкубаторе (5% CO ₂ в воздухе). Через 24 часа максимальная переносимая доза исследуемого соединения (MTD) в культуре клеток оценивается с помощью микроскопического исследования. Результаты сравнивают с контролем неинфицированной ткани и с соответствующим инфицированным контролем:

№	Организм хозяина	Исследуемый организм	Ингибирование [мг/л]
1	клетки Vero	Mycovirus (RNA/Influenza A/Aichi)	44,44
2	клетки Hela	Herpes (DNA), Simplex 1	133,33
3	клетки Vero	Herpes (DNA), Simplex 2 VR 734	44,44
4	клетки Hela	Adenovirus (DNA), 5	133,33

Пример 17: Активность относительно невропатической боли

Лабиринтопептин (III) исследуют на модели невропатической боли мыши с вызванным заранее повреждением нерва (SNI) для проверки активности относительно тактильной аллодинии. При общей анестезии две главных ветви седалищного нерва у взрослых самцов мышей C57B6 (22,7 г ± 0,26SEM) лигируют и иссекают, при этом суральный нерв остается интактным. Тактильная аллодиния определяется с помощью автоматического исследования фон Фрея: с использованием тупого конца иглы, кожа на тыльной стороне задних лап экспонируется для стимула давления с повышающейся интенсивностью до 5 г. Силу в граммах, при которой животное реагирует с отдергиванием задней лапы, используют в качестве регистрации тактильной аллодинии. Исследование осуществляют через 7 дней после повреждения нерва в течение 6 часов, с дополнительным измерением через 24 часа. В пределах двух дней после иссечения нерва тактильная аллодиния развивается полностью и остается стабильной в течение, по меньшей мере, двух недель. Соединение вводят внутривенно как единственное введение (3 мг/кг). В качестве связывающего вещества для внутривенного введения используют 1:1:18 (этанол:солютол:фосфатный буферный раствор) выбранного связывающего вещества.

Измерения порога отдергивания лапы (PWT) используют для вычисления значимых воздействий лечения и для вычисления AUC в течение эталонного периода времени (6 часов) и последующих вычислений % улучшения. Для статистического анализа значения PWT для ипсилатеральных задних лап используют два пути: сначала с помощью 2-стороннего ANOVA на основе значений PWT для конкретных времен (в пределах периода в 24 часа), а затем с помощью 1-стороннего ANOVA непреобразованных значений AUC |AUC1-6 час|.

Двухсторонний анализ разброса с многократными измерениями (повторяющийся фактор: TIME, переменная анализа: PWT) с последующим комплементарным анализом (воздействие фактора GROUP для каждого уровня фактора TIME (анализ Винера), переменная анализа: PWT) и с последующим тестом Дюннета относительно фактора TREATMENT для каждого уровня фактора TIME (двухстороннее сравнение в зависимости от уровня VEHICLE) показывает в высшей степени значимые различия от группы со связывающим веществом от 1 до 6 часов после внутривенного введения для каждого соединения. Воздействие пропадает через 24 часа после введения. 1-сторонний ANOVA с использованием значений дельта |AUC1-6 час| показывает значение p, p<0,0001, для теста Дюннета и дает значимые воздействия лечения для обоих соединений. Процент улучшения после лечения оценивают с использованием значений |AUC1-6 час| ипсилатеральной группы со связывающим веществом (улучшение 0%) и всех значений |AUC1-6 час| контралатеральных сторон всех трех групп (100% улучшение = максимальное возможное воздействие). По сравнению с этими пределами , лабиринтопептин (III) достигает 97% улучшения.

Как вывод, соединение значимо уменьшает тактильную аллодинию в модели мышей SNI невропатической боли.

Пример 18: Активность против боли, инициируемой воспалением

Лабиринтопептин (III) исследуют в карагенановой модели (CAR), индуцированного воспаления задней лапы у мышей в порядке исследования активности по отношению термальной гиперальгезии, типичных данных для боли, инициируемой воспалением.

Индукция воспаления задней лапы: при небольшой общей изофлурановой анестезии, CAR 2% (Sigma, Deisenhofen, Germany) в 20 мкл солевого раствора вводят в плантарный аспект обеих задних лап самцов мышей C57B6. Латентность отдергивания лапы (PWL) определяют при экспонировании лап для определенного теплового стимула с использованием коммерчески доступного устройства (Plantar Test Ugo Basile Biological Research Apparatus, Comerio, Italy), соединенного с миникамерой, для обеспечения правильного размещения инфракрасного нагрева под задней лапой, представляющей интерес. Мышей содержат в клетках для исследований в течение всего периода исследований (6 часов).

Измерение тепловой гиперальгезии: таймер, который измеряет продолжительность инфракрасного света, отраженного задней лапой, запускается исследователем и останавливается, если животное трясет подвергающейся воздействию задней лапой. Выключение устанавливается при 16 секундах для предотвращения повреждения ткани. Исследование осуществляют до инъекции CAR и в течение 6 часов после него. Латентность отдергивания лап в секундах используется как данные для дальнейшего анализа.

В качестве связывающего вещества для внутривенного введения используют выбранное связывающее вещество, 1:1:18 (этанол:солютол:фосфатный буферный раствор).

Измерение латентности отдергивания лап (PWL) используют для вычисления значимых воздействий лечения и для вычислений AUC в течение эталонного периода времени (6 часов) и последующих вычислений % улучшения. Для статистического анализа значения PWL для обеих задних лап используют двумя путями: сначала с помощью 2-стороннего анализа разброса (ANOVA) на основе значений PWL для конкретных времен (в пределах периода 6 часов), а затем с помощью 1-стороннего ANOVA для непреобразованных значений дельта AUC |AUC1-6 час|.

Двухсторонний анализ разброса с многократными измерениями (повторяющийся фактор: TIME, переменная анализа: PWL) с последующим комплементарным анализом (воздействие фактора GROUP для каждого уровня фактора TIME (анализ Винера), переменная анализа: PWL) и с последующим тестом Дюннета относительно фактора DOSAGE для каждого уровня фактора TIME (двухстороннее сравнение в зависимости от уровня 0=VEHICLE) показывает в высшей степени значимые отличия от группы со связывающим веществом от 1 до 2 часов после внутривенного введения для обеих дозировок. Воздействие пропадает через 4 часа после введения. 1-сторонний ANOVA с использованием значений дельта |AUC1-6 час| показывает значение p, p<0,0001, для теста Дюннета и дает значимые воздействия лечения для обеих дозировок. Процент улучшения после лечения оценивают с использованием значений |AUC1-6 час| группы со связывающим веществом (улучшение 0%) и всех значений |AUC1-6 час| перед инъекцией CAR (теоретический фон в течение 6 часов = максимальное возможное воздействие = 100% воздействие). Сравнивая с этими базовыми данными, группа с дозировкой 1 мг/кг достигает 37, а группа с 10 мг/кг, 34% улучшения.

В качестве вывода, соединение значительно уменьшает тепловую гиперальгезию в модели мышей CAR для боли, инициируемой воспалением.