штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину человека (варианты)

Формула изобретения

1. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВКПМ Н-117 - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину человека, характеризующихся 8 изоформами IgG 1 с pI в диапазоне 6,5-7,4 с максимумами в изоточках 6,7 и 7,4.

2. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВКПМ Н-116 - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину человека, характеризующихся 7 изоформами IgG 1 с pI в диапазоне 6,6-7,7 с максимумом в изоточке 7,7.

3. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВКПМ Н-115 - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину человека, характеризующихся 6 изоформами IgG 1 с pI в диапазоне 6,5-7,6.

4. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВКПМ Н-113 - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину человека, характеризующихся 6 изоформами IgG 1 с pI в диапазоне 6,7-7,6.

5. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВКПМ Н-114 - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину человека, характеризующихся 5 изоформами IgG 1 с pI в диапазоне 6,0-7,2 с максимумами в изоточках 6,3; 6,7 и 7,0.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии и касается получения моноклональных антител (МкАт) к рекомбинантному эритропоэтину (ЭПО) человека с помощью гибридных культивируемых клеток (гибридом) животных.

ЭПО - гормон, регулирующий пролиферацию и дифференциацию предшественников эритроцитов (Eur.J.Biochem. 210: 649, 1992).

В клинической практике при анемии применяют рекомбинантный ЭПО, полученный в результате клонирования гена ЭПО человека в клетках эукариот (Nephr.Dial.Transpl., 17 (Suppl.5): 42-47, 2002).

Известно, что полипептидная цепь ЭПО сильно гликозилирована, то есть содержит углеводные цепи (J.Biol.Chem. 261: 3116, 1986; Eur.J.Biochem. 213: 39, 1993). Эндогенный и рекомбинантный ЭПО имеют практически идентичную структуру (J.Biol.Chem. 262:12059-12076, 1987; Analit.Biochem. 311: 119-126, 2002). В то же время и для эндогенного, и для рекомбинантного ЭПО характерен полиморфизм, связанный со степенью гликозилирования белковой молекулы. Большинство исследователей находят взаимосвязь между степенью гликозилирования ЭПО и его биологическими свойствами (Analit.Biochem. 311: 119-126, 2002). Известен ряд моноклональных антител, чувствительных к конформационным изменением белковой молекулы (J.Biol.Chem. 262:1161-1165, 1987; J.Immunol.Method. 293:191-205, 2004; US 4558005). Однако вопросы, связанные с иммуноспецифическим распознаванием форм ЭПО с различной степенью гликозилирования остаются нерешенными (J.Immunol.Method. 293:191-205, 2004). В то же время для развития биотехнологии актуальным остается создание иммунохимических методов для определения количества и качества получаемого рекомбинантного ЭПО, а также разделение его форм с различной биологической активностью (Blood 74: 1415, 1989; J.Immunol.Method. 293:191-205, 2004).

Создание панели моноклональных антител, специфически распознающих формы ЭПО с различной степенью гликозилирования, является перспективным для качественного и количественного анализа ЭПО-содержащих жидкостей, а также для иммуноаффинного выделения ЭПО из белковых смесей.

Известны штаммы-продуценты гибридом № ВСКК/П/634D, № ВСКК/П/635D и № ВСКК/П/636D, продуцирующие, соответственно, моноклональные антитела PCE/D7, PCE/D10, PCE/F6, специфичные к эндогенному ЭПО (RU 2151184). Эти МкАт чувствительны к конформационным изменениям ЭПО и специфичны к независимым антигенным детерминантам эндогенного ЭПО с высокой биологической активностью.

Сведений о МкАт, обладающих специфической активностью к дегликозилированным и гипогликозилированным формам ЭПО в источниках информации не обнаружено.

Задача заявляемого изобретения - расширить арсенал штаммов-продуцентов моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину человека.

Задача решена путем получения штаммов ЕРО 1-3, ЕРО 3-5, ЕРО 4-1, ЕРО 4-4, ЕРО 4-9 гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующих моноклональные антитела, обладающие различной специфичностью по отношению к гликозилированным, гипогликозилированным и дегликозилированным формам рекомбинантного эритропоэтина человека.

Штаммы депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) и имеют номера ВКПМ Н-117, ВКПМ Н-116, ВКПМ Н-115, ВКПМ Н-113 и ВКПМ Н-114 соответственно.

Штаммы получены путем гибридизации лимфоцитов иммунизированной мыши (Balb/c) с клетками миеломы (Sp2/0/Agl4) и применения подкожной схемы иммунизации с последующим выделением лимфоузельных В-лимфоцитов мыши. В качестве иммуногена применен рекомбинантный ЭПО человека (OOO «Фармапарк», ПУР № 56882590-02-06).

Полученные штаммы гибридных клеток оценивали по специфичности вырабатываемых ими моноклональных антител методом иммуноферментного анализа (ИФА) (ELISA) (В кн. «Антитела», т.2// изд. «Мир», под ред. Д.Кэтти, 223-230, 1991) с использованием нескольких маркеров специфичности, а именно:

- рекомбинантного белка ЭПО (ООО «Фармапарк», ПУР № 56882590-02-06);

- гипогликозилированного ЭПО (о-ЭПО), полученного в результате периодатного окисления природного антигена (J.Immunol. Methods: 78,143-153,1985);

- дегликозилированного ЭПО (de-ЭПО), полученного в результате ферментативной обработки рекомбинантного ЭПО (PNGasa) (J.Immunol.,293,191-205, 2004).

Очищенный рекомбинантный ЭПО имеет известную биологическую активность и использован как контроль при оценке взаимодействия моноклональных антител с менее гликозилированными антигенами. Дегликозилированный антиген (de-ЭПО) содержит не более 1% углеводных цепей, а о-ЭПО, полученный в результате более мягкого периодатного окисления, характеризуется слабым гликозилированием (гипогликозилированный антиген).

Способность МкАт связывать сорбированный или растворенный ЭПО характеризует их чувствительность к конформационным изменениям белковой молекулы. Для получения такой характеристики МкАт заявляемых штаммов использовали два формата ИФА (см. пример 4 (А) и (В)).

Культивирование заявляемых штаммов в питательной среде.

Для культивирования используют среду ДМЭМ (фирма Sigma), содержащую, мас.%:

фетальной сыворотки - 10, глутамина -1, пирувата - 1, раствора пенициллина и стрептомицина (5000 ед./мл) - 1. Клетки культивируют при 37°С в атмосфере, содержащей 5-7% CO₂. Для культивирования используют пластиковые или стеклянные планшеты или флаконы объемом 50 мл (фирма Lux). Характер роста - стационарная суспензия. Частота пассирования 2-3 суток. Кратность рассева 1:3-1:4. Титр антител в культуральной жидкости 1:128 для всех заявляемых штаммов.

Культивирование заявляемых штаммов в организме животного.

Для получения асцитов мышам вводят внутриперитонеально 0,5 мл пристана (В кн. «Моноклональные антитела» // изд. Медицина. Под. ред. Р.Кеннета, 396-397). Подготовленные животные отдыхают 3 недели. Гибридомные клетки отмывают от содержащейся в среде сыворотки и вводят 4·10⁶ клеток в растворе Хенкса (производитель - Московский завод бактериальных препаратов). Рост асцитной опухоли отмечают на 7-10 день. Титр антител в культуральной жидкости составляет 1:128, а в асцитической - 1: 10000 для всех заявляемых штаммов.

Продуктивность заявляемых штаммов.

Концентрация антител, продуцируемых штаммами ВКПМ Н-117, Н-116, Н-115, Н-113 и Н-114, составляет в культуральной жидкости 5-10 мкг/мл, в асцитной жидкости - 5-7 мг/мл. Стабильность продуцирования антител для всех заявляемых штаммов сохраняется на протяжении 20 пассажей в культуре и 7 пассажей на животных, если гибридома перевивается.

Контаминация заявляемых штаммов.

Бактерии и грибы в культурах заявляемых штаммов не обнаружены при посевах на стандартные питательные среды (МПА - для выявления бактерий и агар Сабуро - для грибов) (ГФ XI изд. // Вып.2, изм. № 3, с.187-192, 1990).

Заражение микоплазмой у заявляемых штаммов не выявлено (тест-система Mycoplasma Stain Kit, фирмы Flow Lab.).

Консервация клеток заявляемых штаммов.

Клетки штаммов ВКПМ Н-117, ВКПМ Н-116, ВКПМ Н-115, ВКПМ Н-113 и ВКПМ Н-114 замораживают после 2 и 3-го клонирования на 10 и 15 пассажах в культуре и после роста в виде асцитной опухоли в мышах. Клетки в криозащитной среде следующего состава, мас.%: ДМЭМ - 50, фетальной сыворотки - 40 и диметилсульфоксида - 10, помещают в холодильник при при -70°С, после чего переносят в жидкий азот.Выживаемость после размораживания для всех заявляемых штаммов составляет 70% -80%.

Пример 1. Получение штаммов ВКПМ Н-117 и Н-116

Мышей линии Balb/c иммунизируют рекомбинантным ЭПО в полном адъюванте Фрейнда в подушечки задних лапок. Доза иммунизации составляет 20 мкг на мышь. На 13-й день мышей иммунизируют в подушечки задних лапок тем же количеством ЭПО в неполном адъюванте Фрейнда (В кн. «Моноклональные антитела» // изд. Медицина. Под. ред. Р.Кеннета, 371-382, 1983). На 16-й день мышей забивают, выделяют подколенные лимфоузлы и клетки лимфоузлов сливают с клетками миеломы Sp2/0/Agl4 с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ). Соотношение клеток лимфоузлов и клеток миеломы составляет 5:1. После слияния клетки рассевают в лунки 96-луночного планшета (фирма Nunc) в количестве 200 тыс. клеток на лунку, в которые предварительно высевают перитонеальные макрофаги мыши по 10 тыс. клеток на лунку. Селекцию гибридом ведут в среде ДМЭМ, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ) (В кн. «Моноклональные антитела»// изд.Медицина, под. ред. Р.Кеннета, 371-382, 1983). Рост гибридов в среде культивирования, содержащей 15% фетальной сыворотки, наблюдают на 3-7 день.

Отбор растущих клонов клеток, секретирующих антитела, проводят на 10-12 день на основе ИФА с использованием указанных ранее маркеров специфичности.

В результате получены штаммы гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВКПМ Н-117 и ВКПМ Н-116 - продуценты моноклональных антител к рекомбинантному ЭПО человека.

Дважды проведенное клонирование штаммов Н-117 и Н-116 методом лимитирующих разведении путем рассева в лунки 96-луночного планшета из расчета 1 клетка на лунку в среде ДМЭМ и последующее тестирование на секрецию антител показало, что доля клонов, сохраняющих продукцию антител, составляет 100% для обоих штаммов.

Пример 2. Получение штаммов ВКПМ Н-115, Н-113 и Н-114

Получение штаммов осуществляют, как в примере 1, но доза иммунизации составляет 70 мкг на мышь. В результате получают штаммы гибридом ВКПМ Н-115, ВКПМ Н-113 и ВКПМ Н-114, доля клонов, сохраняющих продукцию антител, составляет для этих штаммов 100%.

Пример 3. Получение, выделение и очистка моноклональных антител, продуцируемых штаммами ВКПМ Н-117, Н-116, Н-115, Н-113 и Н-114

Для получения моноклональных антител клетки заявляемых штаммов выращивают в 24-луночных планшетах (фирма Nunc) на среде культивирования. При достижении концентрации клеток в лунке 10⁶ собирают культуральную жидкость, содержащую клетки, центрифугируют 10 мин при 2000g и удаляют надосадочную жидкость. Собранные клетки переводят в бессывороточную среду (ДМЭМ) и вводят мышам внутрибрюшинно из расчета 4·10⁶ клеток/мышь. Через 10 дней наблюдают визуальный рост асцитной опухоли, мышей забивают и шприцем собирают асциты из брюшной полости. Асцитную жидкость центрифугируют 10 мин при 2000 g, чтобы освободится от клеток, и надосадочную жидкость используют для выделения моноклональных антител каждого из заявляемых штаммов.

С этой целью к асцитной жидкости мыши, содержащей моноклональные антитела каждого из заявляемых штаммов, добавляют равный объем насыщенного (4 М) раствора сульфата аммония и центрифугируют при 5000 g 20 мин. Осадок растворяют, тщательно диализуют против 0,5 М фосфатного буфера рН 7,2 и очищают на колонке с DEAE целлюлозой (DE-5) (Иммунология: 4, 40-44, 1980) Из 1 мл асцитной жидкости получают:

- 7 мг моноклональных антител, продуцируемых штаммом ВКПМ Н-117;

- 8 мг моноклональных антител, продуцируемых штаммом ВКПМ Н-116;

- 9 мг моноклональных антител, продуцируемых штаммом ВКПМ Н-115;

- 10 мг моноклональных антител, продуцируемых штаммом ВКПМ Н-113;

- 8 мг моноклональных антител, продуцируемых штаммом ВКПМ Н-114.

При помощи электрофореза полученные моноклональные антитела каждого из заявляемых штаммов охарактеризованы по молекулярным весам (130 кД) и степени чистоты, которая составляет:

- 92% для моноклональных антител, продуцируемых штаммом ВКПМ Н-117;

- 95% для моноклональных антител, продуцируемых штаммом ВКПМ Н-116;

- 95% для моноклональных антител, продуцируемых штаммом ВКПМ Н-115;

- 95% для моноклональных антител, продуцируемых штаммом ВКПМ Н-113;

- 90% для моноклональных антител, продуцируемых штаммом ВКПМ Н-114.

При помощи иммуноферментной системы фирмы Sigma (Iso 2-1К-Т) установлена принадлежность моноклональных антител заявляемых штаммов к классу IgG 1 с изотипом легких цепей К.

Проведено изоэлектрофокусирование (ИЭФ) полученных моноклональных антител в диапазоне рI 5-8 (ReadyStrip IEF, BioRad) (J.Immunol.Methods: 345,60-69,2009). В качестве стандарта для ИЭФ использована смесь белков (Serva Liquid mix) с pI 5,2; 6,9; 7,8; 8,0. По результатам ИЭФ полученные моноклональные антитела имеют следующие характеристики:

- МкАт, продуцируемое штаммом ВКПМ Н-117, имеет 8 изоформ IgG 1 с рI в диапазоне 6,5-7,4 с максимумами в изоточках 6,7 и 7,4;

- МкАт, продуцируемое штаммом ВКПМ Н-116, имеет 7 изоформ IgG 1 с рI в диапазоне 6,6-7,7 с максимумом в изоточке 7,7;

-МкАт, продуцируемое штаммом ВКПМ Н-115, имеет 6 изоформ IgG 1 с рI в диапазоне 6,5-7,6;

- МкАт, продуцируемое штаммом ВКПМ Н-113, имеет 6 изоформ IgG 1 с рI в диапазоне 6,7-7,6;

- МкАт, продуцируемое штаммом ВКПМ Н-114, имеет 5 изоформ IgG 1 с рI в диапазоне 6,0-7,2 с максимумами в изоточках 6,3; 6,7 и 7,0.

Пример 4. Определение методом ИФА способности моноклональных антител, продуцируемых штаммами ВКПМ Н-117, Н-116, Н-115, Н-113 и Н-114, связывать рекомбинантный ЭПО.

А) с твердой фазы

В лунки 96-луночного планшета вносят по 100 мкл раствора ЭПО антигена с концентрацией 10 мкг/мл и инкубируют 2 ч при 37°С. После 4-кратной отмывки планшета от избытка антигена в лунки вносят рабочий буфер, фосфатный буфер с рН 7,2, содержащий 0,05% бычьего сывороточного альбумина и твина 20 (В кн. "Антитела", т.2 // Под ред. Д.Кэтти, 153-183, 1991). Инкубируют 30 мин. Готовят серию 10-кратных разведении культуральной или асцитной жидкостей заявляемых штаммов в рабочем буфере. Анализируемые пробы в объеме 50 мкл с 2-кратным повтором вносят в лунки планшета с антигеном и инкубируют 2 ч при комнатной температуре. После инкубации удаляют содержимое лунок, промывают планшет и вносят по 50 мкл на лунку раствора конъюгата кроличьих антител к иммуноглобулину мыши с пероксидазой в разведении 1:3000. Планшеты инкубируют еще 2 ч, отмывают и в лунки вносят по 100 мкл субстратного буфера (фосфатно-цитратный буфер с рН 4,5) (В кн. "Антитела", т.2 // Под ред. Д.Кэтти, 153-183, 1991), содержащего 4 мг/10 мл 0-фенилендиамина и 0,03% перикиси водорода. Планшеты инкубируют 10-15 мин и в останавливают реакцию добавлением 10% серной кислоты по 100 мкл на лунку. Планшеты сканируют на ридере для микропланшетов (фирма Labsystems) при длине волны 492 нм. Концентрацию антител определяют по калибровочной кривой, которую получают одновременно с проведением теста. Для построения калибровочной кривой вместо образцов в лунки планшета вносят разведения стандартных препаратов очищенных антител в известной концентрации.

Б) Из раствора

Одновременно в лунки 96-луночного планшеты вносят по 100 мкл раствора крысиных антител к иммуноглобулину мыши с концентрацией 10 мкг/мл и инкубируют 2 ч при 37°С. После 4-кратной отмывки планшета от избытка антител в лунки вносят рабочий буфер, фосфатный буфер с рН 7,2, содержащий 0,05% бычьего сывороточного альбумина и твина 20 (В кн. "Антитела", т.2 // Под ред. Д.Кэтти, 153-183, 1991). Инкубируют 30 мин. В лунки подготовленных таким образом планшет вносят те же 10-кратные разведения асцитных и культуральных жидкостей в объеме 50 мкл и инкубируют 2 ч при 37°С. После инкубации удаляют содержимое лунок, промывают планшет и вносят по 50 мкл на лунку раствора конъюгата ЭПО с пероксидазой в разведении 1:1500. Планшеты инкубируют еще 2 ч, отмывают и в лунки вносят по 100 мкл субстратного буфера (фосфатно-цитратный буфер с рН 4,5) (В кн. "Антитела", т.2 // Под ред. Д.Кэтти, 153-183, 1991), содержащего 4 мг/10 мл 0-фенилендиамина и 0,03% перикиси водорода. Планшеты инкубируют 10-15 мин и останавливают реакцию добавлением 10% серной кислоты по 100 мкл на лунку. Планшеты сканируют на ридере для микропланшетов (фирма Labsystems) при длине волны 492 нм. Интенсивность взаимодействия моноклональных антител с ЭПО оценивают по величине оптической плотности.

В табл. 1 представлены данные о специфичности полученных моноклональных антител к рекомбинантному ЭПО. Интенсивность взаимодействия моноклональных антител с ЭПО в таблице указана следующим образом:

- «-» - отсутствие взаимодействия антиген-антитело;

- «+» - слабое связывание;

- «++» - среднее связывание;

- «+++» - сильное связывание.

Все полученные моноклональные антитела слабо взаимодейтсвуют или не взаимодействуют с сорбированным рекомбинантным ЭПО, то есть чувствительны к конформационным изменениям молекулы ЭПО.

При этом моноклональные антитела, продуцируемые всеми заявляемыми штаммами, способны к связыванию растворенного ЭПО, то есть могут быть использованы для выделения ЭПО из смешанных белковых растворов.

Моноклональные антитела штамма ВКПМ Н-116 практически одинаково распознают ЭПО антиген как в сорбированном, так и растворенном виде, что позволяет использовать его для качественного анализа антигена с использованием твердых носителей, в частности при сорбции антигена ЭПО на нитроцеллюлозе.

Таблица 1
Способность полученных моноклональных антител связывать рекомбинантный ЭПО с твердой фазы и из раствора.
Название штаммов-продуцентов МкАт	Сорбированный ЭПО	ЭПО в растворе
ВКПМ Н-117	-	++
ВКПМ Н-116	++	+++
ВКПМ Н-115	+	+++
ВКПМ Н-113	+	+++
ВКПМ Н-114	-	+++

Пример 5. Определение методом ИФА специфичности моноклональных антител, продуцируемых штаммами ВКПМ Н-117, Н-116, Н-115, Н-113 и Н-114, к рекомбинантному ЭПО при гипо- и дегликозилировании.

В лунки 96-луночного планшета вносят по 100 мкл раствора крысиных антител к иммуноглобулину мыши с концентрацией 10 мкг/мл и инкубируют 2 ч при 37°С. После 4-кратной отмывки планшета от избытка антител в лунки вносят рабочий буфер, фосфатный буфер с рН 7,2, содержащий 0,05% бычьего сывороточного альбумина и твина 20 (В кн. "Антитела", т.2 // Под ред. Д.Кэтти, 153-183, 1991). Инкубируют 30 мин. Готовят серию 10-кратных разведений культуральной или асцитной жидкостей в рабочем буфере. Полученные разведения в объеме 50 мкл вносят в лунки планшета и инкубируют 2 ч при 37°С. После инкубации удаляют содержимое лунок, промывают планшет и вносят по 50 мкл на лунку раствора конъюгатов ЭПО, о-ЭПО или de-ЭПО с пероксидазой в разведении 1:1500. Планшеты инкубируют еще 2 ч, отмывают и в лунки вносят по 100 мкл субстратного буфера (фосфатно-цитратный буфер с рН 4,5) (В кн. "Антитела", т.2 // Под ред. Д.Кэтти, 153-183, 1991), содержащего 4 мг/10 мл о-фенилендиамина и 0,03% перекиси водорода. Планшеты инкубируют 10-15 мин и останавливают реакцию добавлением 10% серной кислоты по 100 мкл на лунку. Планшеты сканируют на ридере для микропланшетов (фирма Labsystems) при длине волны 492 нм. Способность моноклональных антител взаимодействовать с рекомбинантным ЭПО после частичного или полного дегликозилирования оценивают по величине оптической плотности.

В табл.2 представлены данные о специфичности полученных моноклональных антител к рекомбинатному ЭПО, а также его гипо- (о-ЭПО) и дегликозилированной форме (de-ЭПО). Условные обозначения в таблице 2 аналогичны условным обозначениям для таблицы 1.

Таблица 2
Иммуноспецифическая активность полученных моноклональных антител к гипо- и дегликозилированному ЭПО.
Название штаммов-продуцентов МкАт	ЭПО	О-ЭПО	De-ЭПО
ВКПМН-П7	++	+	-
ВКПМН-116	+++	+++	+++
ВКПМН-115	+++	++	+
ВКПМН-113	+++	++	+
ВКПМН-114	+++	+	-

Как следует из представленных в табл.2 данных, моноклональные антитела заявляемых штаммов ВКПМ Н-117 и ВКПМ Н-114 утрачивают способность взаимодействовать с полностью дегликозилированным рекомбинантным ЭПО. Моноклональные антитела штаммов ВКПМ Н-115 и ВКПМ Н-113 имеют низкую специфичность к de-ЭПО, но способны взаимодействовать в о-ЭПО. МкАт штамма ВКПМ Н-116 специфичны к рекомбинантному ЭПО независимо от степени гликозилирования. Эти данные свидетельствуют о высоком сродстве моноклональных антител заявляемых штаммов ВКПМ Н-117, ВКПМ Н-115, ВКПМ Н-113 и ВКПМ Н-114 к гликозилированным участкам молекулы ЭПО. При этом существуют различия между полученными моноклональными антителами в специфичности к гипо- и дегликозилированному ЭПО.

Таким образом, получены штаммы гибридных культивируемых клеток животных Mus museums ВКПМ Н-117, ВКПМ Н-116, ВКПМ Н-115, ВКПМ Н-113 и ВКПМ Н-114 - продуценты моноклональных антител, позволяющих отличать гликозилированную форму ЭПО от сопутствующих гипо- и дегликозилированных примесей, что необходимо для выделения гликозилированной формы ЭПО, а также количественного и качественного анализа смесей ЭПО.