противоопухолевый препарат

Формула изобретения

Противоопухолевый препарат, представляющий собой стабильные наночастицы и включающий цитостатик, биодеградирующий полимер, поверхностно-активное вещество, криопротектор и векторную молекулу для адресной доставки частиц в пораженные органы и ткани, отличающийся тем, что в качестве цитотостатика содержит паклитаксел - 0,4÷1,0 мас.%, в качестве биодеградирующего полимера - сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA 50:50) - 14,0÷15,0 мас.%, в качестве поверхностно-активного вещества - сукцинилированный поливиниловый спирт - 3,5÷4,0 мас.%, в качестве векторной молекулы для адресной доставки частиц в пораженные органы и ткани - С-концевой домен альфа-фетопротеина (р3дАФП) - 0,1÷0,3 мас.%, а в качестве криопротектора - D-маннит - 75,0÷80,0 мас.%.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области фармакологии и медицины и может быть использовано для создания препаратов для лечения злокачественных новообразований с использованием фармацевтической композиции противоопухолевого препарата паклитаксела на основе сополимера молочной и гликолевой кислот, содержащего пептидный фрагмент альфа-фетопротеина.

Известен противоопухолевый препарат с использованием пептида формулы QMTOVNOG, являющегося аналогом фрагмента -фетопротеина с 472-й по 479-ю аминокислоту, способного избирательно захватываться опухолевыми клетками и выполнять функцию векторной молекулы для направленной доставки противопухолевых препаратов в опухолевые клетки, конъюгата указанного пептида с доксорубицином, в котором доксорубицин ковалентно присоединен к пептиду через тиоэфирную связь, а также фармацевтической композиции для лечения онкологических заболеваний, содержащей конъюгат доксорубицина с пептидом QMTOVNOG в качестве векторной молекулы в эффективном количестве и подходящий для внутривенного введения фармацевтический носитель [RU 2317102, С1, А61К 38/08, 20.02.2008].

Недостатком известного противоопухолевого препарата является относительно низкая эффективность применения.

Наиболее близким по своей сущности к предложенному является противоопухолевый пептидный препарат на основе рекомбинантного фрагмента альфа-фетопротеина (АФП) человека, представляющий собой пептид, имеющий в первичной структуре 237 аминокислотных остатка и молекулярную массу около 27 кДа, способный связываться с рецептором альфа-фетопротеина и ингибировать эстрадиол-индуцированный рост клеток гормонзависимых опухолей, а также выполнять функцию векторной молекулы для направленной доставки цитотоксического препарата в опухолевые клетки [RU 2385537, С1, А61К 38/12, 20.10.2006].

Недостатком наиболее близкого противоопухолевого препарата является относительно низкая эффективность, проявляющаяся при его применении.

Требуемый результат заключается в повышении эффективности путем обеспечения повышенной специфической активности к опухолевым клеткам, экспрессирующим рецепторы альфа-фетопротеина.

Требуемый результат достигается в противоопухолевом препарате, который представляет собой стабильные наночастицы и включает цитостатик, биодеградирующий полимер, поверхностно-активное вещество, криопротектор и векторную молекулу для адресной доставки частиц в пораженные органы и ткани.

Кроме того, требуемый результат достигается тем, что противоопухолевый препарат в качестве цитотостатика содержит паклитаксел в масс.%: 0.4÷1.0.

Кроме того, требуемый результат достигается тем, что противоопухолевый препарат в качестве биодеградирующего полимера содержит сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA 50:50) в масс.%: 14.0÷15.0.

Кроме того, требуемый результат достигается тем, что противоопухолевый препарат в качестве поверхностно-активного вещества содержит сукцинилированный поливиниловый спирт в масс.%: 3.5÷4.0.

Кроме того, требуемый результат достигается тем, что противоопухолевый препарат в качестве векторной молекулы для адресной доставки частиц в пораженные органы и ткани содержит C-концевой домен альфа-фетопротеина (р3дАФП) в масс.%: 0.1÷0.3.

Кроме того, требуемый результат достигается тем, что противоопухолевый препарат в качестве криопротектора содержит D-маннит в масс.%: 75.0-80.0.

Кроме того, требуемый результат достигается тем, что в противоопухолевом препарате стабильные наночастицы выполнены в виде частиц размером от 250 до 300 нм.

Состав противоопухолевого препарата и его повышенная эффективность применения относительно известных препаратов аналогичного назначения обосновывается следующим.

Серьезным недостатком используемых в настоящее время противоопухолевых препаратов является их высокая общая токсичность. Химиотерапия онкологических заболеваний существующими сильнодействующими препаратами сопровождается выраженной интоксикацией организма больного и побочными эффектами, что существенно ограничивает возможности применения и использования в полной мере цитостатического и цитотоксического потенциала современных противоопухолевых средств. Возникновение токсических и побочных эффектов при проведении химиотерапии онкологических больных связано с низкой избирательностью существующих лекарств, необходимостью длительно поддерживать достаточно высокую терапевтическую дозу, что приводит к сильному отрицательному воздействию на здоровые органы и ткани.

Серьезной проблемой, снижающей эффективность химиотерапии злокачественных новообразований, является также множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) опухолевых клеток. Одной из основных причин МЛУ является гиперэкспрессия трансмембранных белков, относящихся к семейству АВС-транспортеров (MDR1, MRP1, BCRP и др.), выбрасывающих химиопрепараты, в том числе молекулы противоопухолевых препаратов, из клетки [1].

Один из способов решения данных проблем связан с созданием систем адресной доставки лекарственных веществ путем их включения в полимерные частицы или липосомы, имеющие размеры не более 500 нм. Высокая терапевтическая активность наносомальных препаратов при лечении онкологических заболеваний определяется способностью наночастиц обеспечивать пассивный направленный транспорт связанных с ними лекарственных веществ в опухоль. Пассивный направленный транспорт обусловлен большей уязвимостью поврежденных тканей для данных лекарств. В литературе это явление получило название «эффекта повышенной проницаемости и удерживания». Важным преимуществом данной технологии является ее гибкость, позволяющая варьировать свойства носителей лекарств в зависимости от локализации очага патологии.

Возможно также создание механизма активного направленного транспорта «нанопрепаратов» с помощью присоединения к ним «молекулярного адреса» или вектора, обеспечивающего связывание данных частиц со специфическими рецепторами на поверхности опухолевых клеток-мишеней. В качестве векторных молекул могут быть использованы антитела, РНК-, или пептидные аптамеры к поверхностным белкам, а также лиганды рецепторов, специфических для опухолевых клеток, или их фрагменты [2-4]. Наиболее интересные данные получены при использовании олигонуклеотидного вектора А10 PSMA для «адресной» доставки полимерных частиц с паклитакселом в клетки рака предстательной железы мышей LNCaP [4].

При использовании таких векторов препарат будет проникать внутрь клетки, после связывания с соответствующим рецептором, посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза в составе окаймленного клатрином мембранного пузырька. Внутри такого пузырька препарат не обладает сродством к MDR-насосам. Таким образом, данный подход является одним из способов преодоления множественной лекарственной устойчивости.

В качестве векторной молекулы для доставки цитостатиков, а также для диагностики злокачественных новообразований может быть использован онкофетальный белок альфа-фетопротеин (АФП) или его С-концевой домен (рЗдАФП) [5, 6]. Рецепторы альфа-фетопротеина во взрослом организме не обнаруживаются в норме, но возникают на поверхности клеток при развитии некоторых видов опухолей, таких как рак печени, легкого, молочной железы и др. [7]. Альфа-фетопротеин представляет собой крупный гликопротеин (70 кДа), состоящий из одной полипептидной цепи, и является одним из основных циркулирующих белков, обнаруживаемых у млекопитающих в процессе развития эмбриона и плода. Он считается также онкофетальным маркером, поскольку секретируется различными опухолями. Главная из функций АФП - транспортная. Считается, что АФП состоит из полипептидной цепи размером 590 аминокислотных остатков, разделенной на три домена примерно по 195 аминокислот каждый.

Патентные исследования показали, что на основе АФП разработаны ряд препаратов и способов их получения из природных источников, а также способы лечения этими препаратами [8-11].

Для использования АФП в терапевтических целях необходимы значительные количества белка, которые трудно обеспечить выделением из природных источников. Получение рекомбинантного белка сильно осложнено его сложной структурой.

Избежать этих затруднений удается при использовании генно-инженерных конструкций, обеспечивающих получение не цельного АФП, а его активных фрагментов, что значительно упрощает и удешевляет процедуру получения препарата. В данной работе применялся С-концевой домен альфа-фетопротеина (р3дАФП), описанный ранее [6] и использованный для получения конъюгата с цисплатином. Исходя из электрофореграммы молекулярная масса белка составляет приблизительно 23 кДа. По данным масс-спектрометрического анализа она оказалась равной 22480 Да. Также на масс-спектре виден пик, соответствующий 22620 Да. Он может соответствовать целевому белку с добавлением N-концевого метионина. Селективность связывания и эндоцитоза C-концевого домена АФП опухолевыми клетками была продемонстрирована как in vitro, так и in vivo [12, 13]. Данное свойство указывает на перспективность использования полученного рекомбинантного белка в качестве векторной молекулы для адресной доставки противоопухолевых веществ как в виде конъюгатов, так и в составе полимерных наночастиц

Сущность предложенного решения заключается в том, что создана наносомальная форма цитотоксического препарата - паклитаксела на основе сополимера молочной и гликолевой кислот, содержащая пептидный вектор р3дАФП, для адресной доставки лекарства в опухолевые клетки.

Получение частиц проводили с использованием биодеградирующего сополимера молочной и гликолевой кислот (PLGA 50/50, молекулярная масса 17 кДа) и модифицированного поливинилового спирта (ПВС) в качестве стабилизатора. В состав частиц предварительно вводили свободные карбоксильные группы, для чего проводили сукцинилирование ПВС. Наночастицы получали методом одинарного эмульгирования под воздействием ультразвука (200 Вт, 2 мин) [2].

Свободную карбоксильную группу частиц связывали с аминогруппой векторного белка с использованием водорастворимого карбодиимида. Размеры полученных НЧ составляли 250-290 нм. Эффективность включения паклитаксела в полимерную матрицу составила около 60%. Количество связанного белка составило 1,3 мг на 1 г наночастиц.

Для исследования уровня связывания и эндоцитоза наночастиц в опухолевые клетки использовали флуоресцентно-меченые доксорубицином (ДОКСО) частицы (НЧ-ДОКСО-р3дАФП), в которых свободная карбоксильная группа полимера была предварительно связана с ДОКСО с использованием сшивающего агента дициклогексилкарбодиимида. Исследование уровня связывания и эндоцитоза наночастиц проводили в отношении опухолевых клеток аденокарциномы молочной железы человека линии MCF-7, характеризующихся высоким уровнем экспрессии рецепторов АФП (около 310 тыс. РАФП на клетку) [14]. НЧ инкубировали с клетками линии MCF-7 при 4°С, после чего определяли интенсивность флуоресценции клеток методом проточной цитофлуорометрии. Было показано, что при инкубации НЧ-ДОКСО-р3дАФП с клетками при 4°С частицы связываются с клетками, причем связывание носит специфический характер, так как частично блокируется избытком р3дАФП (рис.1, столбцы 1 и 2).

Исследование цитотоксической активности НЧ проводили в отношении клеток линии MCF-7 и резистентной к антрациклиновым антибиотикам сублинии MCF-7Adr. Было показано, что паклитаксел в составе НЧ, связанных с вектором, проявлял более высокую противоопухолевую активность по сравнению со свободным паклитакселом и паклитакселом в составе частиц без вектора (рис.2 и 3). Так, в отношении клеток линии MCF-7 активность НЧ-паклитаксел-р3дАФП, оцениваемая по показателю IC₅₀, была в 2.8 и 25 раз выше активности паклитаксела в составе НЧ без вектора и свободного паклитаксела, соответственно. Полученные данные свидетельствуют о высокой эффективности рецептор-опосредованного эндоцитоза как механизма активного транспорта паклитаксела в случае применения наночастиц с вектором, по сравнению с механизмом неспецифического фагоцитоза наночастиц, не содержащих вектор, а также по сравнению с пассивным транспортом свободного паклитаксела.

Превышение цитотоксической активности НЧ-паклитаксел-р3дАФП по сравнению со свободным паклитакселом в 7.4 раза в отношении резистентных MDR1 + клеток сублинии MCF-7 Adr, свидетельствует, что паклитаксел в составе НЧ, связанных с вектором, проникает внутрь клетки, минуя действие трансмембранных MDR-насосов.

Исследование селективности действия полученных частиц, связанных с вектором, показало, что уровень накопления их в опухолевых клетках был в 500 раз выше по сравнению с лифоцитами, что свидетельствует об избирательности накопления и токсического эффекта препарата в отношении опухолевых клеток, экспрессирующих РАФП, по сравнению с нормальными лимфоцитами.

На основе данного препарата разработана фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевым действием, содержащая также фармацевтический носитель. В качестве носителя для внутривенного введения использован физиологический раствор для инъекций.

Данная лекарственная форма может быть создана и с другими противоопухолевыми препаратами: доцетакселом, доксорубицином, дауномицином и др. Следует отметить, что пептидный вектор р3дАФП ранее не использовался для адресной доставки наночастиц с противоопухолевыми препаратами.

На фиг.1 представлен уровень связывания флуоресцентно-меченых наночастиц и р3дАФП с клетками аденокарциномы молочной железы человека линии MCF-7 с предварительной блокировкой рецептора АФП и без нее.

На фиг.2 представлена цитотоксическая активность паклитаксела в свободной форме и в составе НЧ в отношении опухолевых клеток линии MCF-7 и лимфоцитов. Кривые выживаемости клеток линии MCF-7 обозначены сплошной линией, лимфоцитов - прерывистой линией.

На фиг.3 представлена цитотоксическая активность паклитаксела в свободной форме и в составе НЧ в отношении опухолевых клеток линии MCF-7 Adr.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение сукцинилированного поливинилового спирта.

2.0 г поливинилового спирта растворяют в 40.0 мл диметилсульфоксида при нагревании до 70°С. Далее к раствору добавляют 50.0 мг диметиламинопиридина, 50.0 мкл триэтиламина и 50.0 мг ангидрида янтарной кислоты. Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение 4 часов. Добавление ангидрида янтарной кислоты повторяют еще трижды, с интервалами в 1 час. Затем реакционную смесь перемешивают в течение 48 часов при комнатной температуре. Для очистки продукта реакции раствор по каплям добавляют к 160.0 мл изопропилового спирта; выпавший осадок отделяют центрифугированием при 18 тыс. g в течение 40 мин. Преципитацию повторяют еще дважды. Полученный осадок растворяют в воде и подвергают лиофилизации в течение 48 часов при 0,03-0,05 мбар. Продукт реакции охарактеризован с помощью ¹Н ЯМР-анализа на приборе Bruker AM300 (300 MHz, DMSO-d6).

Пример 2. Получение полимерных частиц с паклитакселом

Для включения паклитаксела в состав наночастиц был использован известный метод одинарного эмульгирования [2]. 100.0 мг сополимера молочной и гликолевой кислот (PLGA 50/50) и 10.0 мг паклитаксела растворяют в хлористом метилене. Раствор по каплям добавляют к 50.0 мл 1% водного раствора сукцинилированного поливинилового спирта. Полученную суспензию обрабатывают ультразвуком (200 Ватт, скважность 0,5 с, 3*45 с) с помощью ультразвукового дезинтегратора на ледяной бане. Раствор интенсивно перемешивают с помощью магнитной мешалки в вытяжном шкафу до полного удаления органического растворителя. Далее раствор центрифугируют при 15000 g в течение 45 мин, осадок суспендируют в дистиллированной воде и лиофилизуют при 0,03-0,05 мбар в течение суток с добавлением 1% по массе D-маннита. Для регенерации несвязавшегося с частицами сукцинилированного поливинилового спирта, супернатант подвергают трехкратной экстракции хлороформом, после чего фильтруют и подвергают лиофилизации.

Количество паклитаксела, включенного в состав наночастиц, определяют с помощью ВЭЖХ, после растворения их в диметилсульфоксиде. Для определения концентрации паклитаксела в полученном растворе используют хроматографическую систему высокого давления фирмы Shimadzu SPD-20A и колонку Luna С-18, 15*4,5 см. В качестве подвижной фазы используют 60-% раствор ацетонитрила в воде (по объему) с добавлением трифторуксусной кислоты до 0,1%, детекцию паклитаксела производят при длине волны 227 нм.

Эффективность включения паклитаксела оценивают по разности взятого в синтез наночастиц паклитаксела и паклитаксела, включенного в состав наночастиц, приведенной к количеству паклитаксела, взятого в синтез, и умноженной на 100%.

Определение размеров и поверхностного заряда частиц прозводилось методом фазового анализа рассеяного света на приборе Zeta PALS (Brookhanen Instruments Corporation).

Пример 3. Получение наночастиц, ковалентно связанных с рекомбинантным C-концевым доменом АФП (р3дАФП).

Наночастицы, полученные по примеру 2, растворяют в фосфатно-солевом буферном растворе (20.0 мг/мл); рН раствора доводят до 7,2. Добавляют раствор белка (р3дАФП) до конечной концентрации 2.0 мг/мл и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид до конечной концентрации 0,3 М. Раствор интенсивно перемешивают в течение 2 часов, поддерживая рН=7.2 с помощью соляной кислоты. Добавляют этаноламин до концентрации 30.0 мМ и продолжают перемешивание еще 15 минут. Реакционную смесь центрифугируют при 11 тыс. об/мин в течение 30 мин; супернатант декантируют, а осадок суспендируют в 0.1 М водном растворе гидрокарбоната аммония. Суспензию наночастиц разбавляют в 50 раз тем же раствором и концентрируют в 15 раз с помощью ячейки для ультрафильтрации. Полученный концентрат лиофилизуют с добавлением D-маннита (10% по массе).

Количество связавшегося с наночастицами белка определяют по разности концентраций белка в реакционной смеси, до и после проведения реакции. Концентрацию белка определяют фотоколориметрически с использованием набора реактивов BCA-kit.

Для получения наночастиц, используемых в качестве контроля в экспериментах на клетках in vitro, проводят все описанные выше операции, кроме добавления в реакционную смесь белка.

Пример 4. Получение наночастиц с доксорубицином.

Наночастицы с доксорубицином получают для исследования процесса эндоцитоза. Доксорубицин, в этих опытах, выступает в роли флуоресцирующей метки.

А. Получение конъюгата сополимера молочной и гликолевой кислот с доксорубицином.

150.0 мг сополимера молочной и гликолевой кислот (PLGA-COOH 50/50), содержащего свободную концевую карбоксильную группу, растворяют в 1,5 мл хлороформа. К раствору добавляют 18.0 мг дициклогексилкарбодиимида и 10.0 мг N-гидроксисукцинимида (10-кратные молярные избытки по отношению к полимеру). Реакционную смесь перемешивают в течение 2 часов при комнатной температуре и отделяют от выпавшего осадка дициклогексилмочевины с помощью фильтрации. К смеси прибавляют 5.0 мкл триэтиламина и 7,5 мг доксорубицина гидрохлорида. Реакционную смесь перемешивают в течение 15 часов. Очистку реакционной смеси от избытка доксорубицина производят с помощью трехкратной экстракции 0.1 М водным раствором соляной кислоты. Продукт реакции очищают преципитацией в ледяном метаноле, осадок собирают центрифугированием при 18 тыс.g в течение 30 мин, предварительно выпарив из раствора хлороформ под вакуумом. Полученный конъюгат применяют для приготовления наночастиц.

Б. Получение наночастиц.

Для получения флуоресцирующих наночастиц используют методику, описанную выше для получения наночастиц с включенным паклитакселом. Однако на первой стадии в хлористом метилене растворяют сополимер молочной и гликолевой кислот, ковалентно связанный с доксорубицином (см. опыт А). Полученные наночастицы затем конъюгируют с рАФП3д по методике, описанной выше (см. пример 3). Полученные таким образом частицы используют для исследования процесса эндоцитоза.

Пример 5. Исследование процесса эндоцитоза флуоресцентно-меченых наночастиц и р3дАФП.

Уровень связывания и накопления флуоресцентно-меченых наночастиц в клетках оценивают по интенсивности их флуоресценции с помощью метода проточной цитофлуориметрии. Количество смешанных с культурами клеткок наночастиц, определяемое по содержанию доксорубицина, соответствовало 1.5 мкМ. Для оценки специфичности связывания наночастиц с рецептором АФП проводят предварительную блокировку рецептора инкубацией опухолевых клеток с р3дАФП (концентрация 15 мкМ) в течение 1 часа при 4°С, после чего вносят наносомальные препараты и продолжают инкубацию еще 1 час. Для сравнения аналогичным образом исследуют связывание флуоресцеин-меченого р3дАФП. Для оценки уровня накопления НЧ в клетках линии MCF-7 и лимфоцитах проводят инкубацию клеток с наносомальными препаратами в течение 1 часа при 37°С. Интенсивность флуоресценции клеток оценивают методом проточной цитофлуорометри [5].

Пример 6. Исследование цитотоксической активности наносомальных препаратов.

Для оценки цитотоксической активности препаратов in vitro проводят определение жизнеспособности клеток после инкубации с наночастицами с помощью МТТ-теста по методу Mosmann [15]. Опухолевые клетки аденокарциномы молочной железы человека линий MCF-7 и MCF-7 Adr, a также лимфоцитов периферической крови человека культивируют в среде DMEM, содержащей 10% FBS и 50 мкг/мл гентамицина, высевают в 96-луночные платы по 4-5 тыс. клеток на лунку за сутки до внесения препаратов. К клеткам однократно добавляют препараты в дипазоне концентраций 3.0·10^-4÷1.25 мкг/мл, для MCF-7 и лимфоцитов и 0.6÷140 мкг/мл, для MCF-7 Adr (по паклитакселу), после чего инкубируют в течение 1 часа при 37°С, после чего клетки отмывают от препаратов, вносят свежую среду и проводят культивирование в течение 72 часов. За 4 часа до окончания инкубации добавляют раствор МТТ (бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия). Выживаемость клеток оценивали в процентах от необработанного контроля и по кривым выживаемости рассчитывали значение IC ₅₀ - концентрацию препарата, при которой наблюдается гибель 50% клеток.

Противоопухолевый препарат применяется путем введения пациентам с гормонзависимой опухолью в форме стерильной суспензии в водно-солевом растворе (физраствор) внутривенно, под контролем уровня лейкоцитов периферической крови, курсами до элиминации злокачественных образований.

Таким образом, предложенный противоопухолевый препарат обладает повышенной эффективностью относительно известных препаратов аналогичного назначения.

Предложенный противоопухолевый препарат проявляет более высокую противоопухолевую активность по сравнению со свободным паклитакселом и паклитакселом в составе частиц без вектора р3дАФП в отношении клеток линии MCF-7 и резистентной к антрациклиновым антибиотикам сублинии MCF-7Adr, поскольку лекарственное средство проникает внутрь резистентных MDR1+ клеток сублинии MCF-7 Adr, минуя действие трансмембранных MDR-насосов. Изобретение обеспечивает селективность действия конъюгата, что позволяет расширить область применения препарата, а исследование цитотоксической активности полимерной композиции в отношении клеток рака молочной железы человека линии MCF-7 и резистентной к антрациклиновым антибиотикам сублинии MCF-7 Adr показало, что паклитаксел, в составе частиц, связанных с вектором, проявляет более высокую специфическую активность по сравнению с комерческим препаратом паклитаксела, а также препаратом вещества, включенным в состав полимерных частиц, не содержащих р3дАФП.

Источники информации, принятые во внимание

1. Северин Е.С., Родина А.В. Проблемы и перспективы современной противоопухолевой терапии // Успехи биологической химии. - 2006. - Т.46 - С.43-64.

2. Saneeb К. Sahoo et al. Efficacy of Transferrin - Conjugated Paclitaxel - Loaded Nanoparticles in a Murine Model of Prostate Cancer // Int. J. Cancer - 2004. Vol 112, P.335-340.

3. Danhier F., Vroman B. et al. Targeting of tumor endothelium by RGD-grafted PLGA-nanoparticles loaded with Paclitaxel // Journal of Controlled Release 2009 Vol.140, P 166-173.

4. Farokhzad О.С, Cheng J. et al. Targeted nanoparticle-aptamer bioconjugates for cancer chemotherapy in vivo // PNAS 2006 Vol.103, N.16, P.6315-6320.

5. Гороховец Н.В., Дигтярь А.В. и др. Противоопухолевый пептидный препарат на основе фрагмента альфа-фетопротеина, его конъюгат, фармацевтическая композиция и способ лечения гормонзависимых опухолей // Пат. RU 2285537 С; заявлено, 05.04.2005; опубл. 20.10.2006.

6. Годованный А.В., М.В. Соватеева M.B., Сотниченко А.И. и др. Изучение противоопухолевой активности in vitro конъюгата рекомбинантного C-концевого домена АФП с цисплатином // Молекулярная медицина, 2011, № . 1, с.44-48.

7. Posypanova, G.A. et al. J.Drug. Target., 2008, Vol.16, N4, PP.321-328.

8. Стариков В.В., Родионов С.Ю. Способ получения препарата альфа-фетопротеина // Пат. RU 2121350 С1; заявлено 03.06.1996; опубл. 10.11.1998.

9. Мягкоходов В.А., Решетников С.С. Способ получения препарата альфа-фетопротеина // Пат. RU 2123009 С1; заявлено 02.04.1998; опубл. 10.12.1998.

10. Родионов С.Ю. Способ получения таблеток альфа-фетопротеина // Пат. RU 2154468 С1; заявлено 09.11. 1999; опубл. 09.11.1999.

11. Родионов С.Ю. Способ лечения злокачественных опухолей // Пат. RU 2105567 С1 заявлено 01.12. 1995; опубл. 27.02.1998.

12. Line В.R. et al. Scintigraphic Detection of Breast Cancer Xenografts with Tc-99m Natural and Recombinant Human Alpha-Fetoprotein // Cancer biother. radiopharm. - 1999 - Vol.14, N6 - P.485-494.

13. Posypanova G.A., Gorokhovets N.V., Makarov et al. Recombinant alpha-fetoprotein C-terminal fragment: The new recombinant vector for targeted delivery // Journal of Drug Targeting - 2008. - Vol.16, N4. - P.321-328.

14. Leong S.J., Middelberg A.P.J. The refolding of different -fetoprotein variants // Protein Sci. - 2006. - Vol.15, N9 - P.2040-2050.

15. Mossman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays // J.Immunol. Meth. 1983. V.65 (1-2). P.55-63.