новая детерминанта вирулентности в пределах структурного гликопротеина е2 вируса классической лихорадки свиней

Формула изобретения

1. Рекомбинантный вирус классической лихорадки свиней для создания иммуногенных композиций, содержащий ДНК, кодирующую модифицированный гликопротеин Е2 вируса классической лихорадки свиней (CSFV), который модифицирован путем прогрессивного мутирования участка гена Е2 высокопатогенного штамма Брешиа, где указанный участок кодирует аминокислоты 829-837 гликопротеина Е2 CSFV, и где прогрессивные мутации в указанной ДНК приводят к замене от двух до шести аминокислот, характерных для гликопротеина Е2 CSFV, аминокислотами в количестве от двух до шести, характерными для гомологичного участка гликопротеина Е2 вируса вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), где эта модификация приводит в результате к уменьшению тяжести или аттенуированию CSFV.

2. Рекомбинантный вирус классической лихорадки свиней по п.1, где аминокислоты 829-837 гликопротеина Е2 замещены последовательностью TSFNMDTLR (SEQ ID NO:6), где эта модификация приводит в результате к аттенуированию CSFV.

3. Рекомбинантный вирус классической лихорадки свиней по п.1, где аминокислоты 829-837 гликопротеина Е2 замещены последовательностью TSFNMDTLA (SEQ ID NO:7), где эта модификация приводит в результате к аттенуированию CSFV.

4. Вакцина против классической лихорадки свиней, содержащая рекомбинантный живой аттенуированный вирус классической лихорадки свиней по п.1.

5. Способ различения животных, инфицированных CSFV, и животных, вакцинированных живой аттенуированной вакциной CSFV по п.4, при котором:

анализируют сыворотку анализируемого животного в конкурентном анализе ИФА для обнаружения того, ингибирует ли указанная сыворотка связывание mAb303.

6. Способ получения аттенуированного рекомбинантного вируса классической лихорадки свиней, при котором:

(а) идентифицируют детерминанту вирулентности внутри гликопротеина Е2 в высокопатогенном штамме Брешиа;

(б) идентифицируют гомологичную детерминанту вирулентности в вирусе вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), где указанный вирус не патогенен у свиней;

(в) подвергают прогрессивному и последовательному мутированию ДНК, кодирующую указанную детерминанту вирулентности, где прогрессивные мутации в указанной ДНК приводят в результате к замене аминокислот, характерных для детерминанты вирулентности CSFV на аминокислоты, характерные для гомологичной детерминанты вирулентности; и

(г) достигают аттенуирования CSFV.

7. Способ получения аттенуированного рекомбинантного вируса классической лихорадки свиней (CSFV), содержащего ДНК, кодирующую модифицированный гликопротеин Е2 CSFV, при котором:

(а) подвергают прогрессивному мутированию участок гена Е2 высокопатогенного штамма Брешиа, где указанный участок кодирует аминокислоты 829-837 гликопротеина Е2 CSFV, где прогрессивные мутации в указанной ДНК приводят в результате к замене от двух до шести аминокислот, характерных для гликопротеина Е2 CSFV, аминокислотами в количестве от двух до шести, характерным для гомологичного участка гликопротеина Е2 вируса вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV); и

(б) достигают уменьшенной тяжести или аттенуирования CSFV в результате такой модификации.

Описание изобретения к патенту

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область изобретения

Данное изобретение относится к выделению и характеристике новых детерминант вирулентности вируса классической лихорадки свиней (CSFV) в пределах структурного гликопротеина Е2 и к применению этих новых детерминант вирулентности для конструирования живых аттенуированных вакцин CSF.

Описание предшествующего уровня техники

Классическая лихорадка свиней (CSF) является высоко контагиозным заболеванием свиней, которое по природе может быть либо острым, либо хроническим (van Oirschot, J. Т. 1986. In: Diseases of Swine, 6th edition, Leman et al., eds., Iowa State University Press, Ames, Iowa, page 289). Возбудитель, вирус CSF (CSFV), представляет собой мелкий вирус с оболочкой с положительным однонитевым РНК-геномом, и, параллельно с вирусом вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV) и вирусом пограничной болезни овец (BDV), его классифицируют как член рода Pestivirus в пределах семейства Flaviridae (Hulst et al. 2001. J. Virol. 75: 9585-9595). Геном CSFV 12,5 кб содержит единственную открытую рамку считывания, которая кодирует 4000-аминокислотный полипротеин и, в конечном счете, образует от 11 до 12 конечных продуктов расщепления (NH2-Npro-C-Ems-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH) посредством котрансляционного и посттрансляционного процессинга этого полипротеина клеточными и вирусными протеазами (Rice, С.М. 1996. In: Fundamental Virology, 3rd edition, Fields and Howley, eds., Lippincott Raven, Philadelphia, pp.931-959).

Вирулентность и спектр фенотипов хозяина варьируют среди изолятов CSFV и среди пестивирусов. Инфекция высоко вирулентными штаммами CSFV приводит к гибели инфицированных животных, тогда как изоляты с вирулентностью от умеренной до слабой вызывают длительное хроническое заболевание (van Oirschot, см. выше). Кроме того, BVDV и BDV, хотя они являются возбудителями заболеваний у видов крупного рогатого скота и овец, соответственно, могут также инфицировать свиней, не вызывая клинического заболевания (van Oirschot, см. выше). Несмотря на доступность геномных последовательностей из CSFV фенотипов, различающихся по вирулентности, BVDV и BDV, генетическая основа вирулентности CSFV у природного хозяина остается слабо понятой (van Oirschot, см. выше). Использование "обратной генетики" дало возможность идентификации вирусных детерминант вирулентности, что способствовало разработке живых аттенуированных вакцин-кандидатов CSF (Mayer et al. 2004, Vaccine 22: 317-328; Meyers et al. 1999, J. Virol. 73:10224-10235; Moorman et al. 1996, J. Virol. 70: 763-770; Moser et al. 2001, Vims Genes 23: 63-68; Risatti et al. 2005°, J. Virol. 79: 3787-3796; Risatti et al. 2005b, Virology 343: 116-117; Ruggli et al. 1996, J. Virol. 70: 3478-3487; Tratschin et al. 1998. J. Virol. 72: 7681-7684; van Gennip etal. 2000, Vaccine 19: 447-459).

Капсидный белок и гликопротеины Ems, Е1 и Е2 являются структурными компонентами вириона CSFV, где Е1 и Е2 заякорены в оболочке своими карбокси-концами, а Ems слабо связан с оболочкой вируса (Thiel et al. 1991, J. Virol. 65: 4705-4712; Weiland et al. 1990, J. Virol. 64: 3563-3569; Weiland et al. 1999. J. Gen. Virol. 80: 1157-1165). Все три гликопротеина связаны с вирулентностью CSFV (Meyers, см. выше; Risatti et at. 2005 a, b, см. выше).

Гликопротеин Е2 считают существенным для репликации CSFV, поскольку мутанты вируса, содержащие частичные или полные делеции гена Е2, оказались нежизнеспособными (van Gennip et al. 2002, Vaccine 20: 1544-1556). Е2 вовлечен параллельно с Ems (Mayer et al., см. выше) и Е1 (Wang et al. 2004, Virology 330: 332-341) в адсорбцию вируса к клеткам-хозяевам; действительно, химерные пестивирусы проявляют инфективность и фенотипы клеточного тропизма соответственно таковым для донора гена Е2 (van Gennip et al. 2000, 2002, см. выше). Е2 является наиболее иммуногенным среди гликопротеинов CSFV (Konig et al. 1995, J. Virol. 69: 6479-6486; Weiland et al. 1990, см. выше), индуцируя нейтрализующие антитела и защиту против летального заражения. CSFV Е2 также содержит между остатками 829 и 837 эпитоп, распознаваемый моноклональным антителом (mAb) WH303 (Lin et al. 2000, J. Virol. 74: 11619-11625), реагент, который неспособен реагировать с Е2 BVDV или BDV, и его применяют в обычной практике для диагностики CSF.

Здесь авторы изобретения описали эффекты мутаций в пределах эпитопа WH303 Е2 CSFV, где эти мутации изменяют аминокислотную последовательность вирулентного Брешиа CSFV прогрессивно в сторону гомологичной аминокислотной последовательности штамма NADL BVDV, демонстрируя аддитивный эффект вирулентности вируса у свиней и полное аттенуирование после шести аминокислотных замен. Такие аттенуированные вирусы дают возможность рационального конструирования живых аттенуированных вакцин CSF. Животные, инфицированные мутантами вируса, были защищены при контрольном заражении вирулентным вирусом Брешиа на 3 и 21 сутки после вакцинации. Модификация в этом сайте в пределах эпитопа WH303 дает возможность разработки диагностического теста для дифференциации вакцинированных и инфицированных животных.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения идентифицировали новую детерминанту вирулентности CSFV в пределах гликопротеина Е2.

В соответствии с этим открытием целью изобретения является разработка рекомбинантного вируса классической лихорадки свиней (CSFV), содержащего ДНК, кодирующую модифицированный гликопротеин Е2 CSFV.

Целью изобретения также является разработка рекомбинантного вируса классической лихорадки свиней, содержащего ДНК, кодирующую гликопротеин Е2 CSFV, который модифицирован путем прогрессивного мутирования участка гена Е2 высоко патогенного штамма Брешиа, приводящего в результате к мутированному Е2 вирусу, более близко напоминающему последовательность эпитопа WH303 гомологичного гена Е2 из BVDV, где эта модификация приводит к аттенуированию CSFV.

Дополнительной целью изобретения является разработка иммуногенных композиций, содержащих жизнеспособный рекомбинантный вирус классической лихорадки свиней, содержащий модифицированный гликопротеин Е2 CSFV.

Дополнительной целью изобретения является разработка рационально сконструированной живой аттенуированной вакцины CSFV, которая уменьшает тяжесть CSF.

Дополнительной целью изобретения является разработка рационально сконструированной живой аттенуированной вакцины CSFV, эффективной для защиты животного от клинического заболевания CSF при заражении вирулентным CSFV Брешиа.

Дополнительной целью изобретения является разработка маркерной вакцины, которая дает возможность серологического отличия между вакцинированными животными и животными, инфицированными CSFV.

Еще одной дополнительной целью изобретения является разработка способа защиты животного против CSF путем введения эффективного количества рационально сконструированной живой аттенуированной вакцины CSFV.

Другие цели и преимущества данного изобретения должны стать легко очевидными на основании последующего описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг.1 изображено сравнение CSFV Брешиа, BVDV штамма NADL и мутантных вирусов CSFV Т1-5 в эпитопной области mAb WH303 гликопротеина Е2. Указаны положения аминокислотных остатков в полипротеине CSFV. Курсивом указаны остатки, отличающиеся от остатков в Е2 Брешиа, как в BVDV штамм NADL, так и в T1v - T5v CSFV.

На фиг.2А и 2Б приведено сравнение характеристик мутантов T1v-T5v и BICv. На фиг.2А показаны характеристики роста in vitro мутантов T1v-T5v и BICv. Монослои SK6 были инфицированы (МИ [множественность инфекции] = 0,01) T1v, T2v, T3v, T4v, T5v или BICv и выход вируса, титрованный по промежутку времени после инфекции. В данных представлены средние значения и стандартные отклонения из двух независимых экспериментов. На фиг.2Б показано образование бляшек и реактивность mAb мутантов T1v-T5v и BICv. Монослои SK6 инфицировали 50-100 TCID₅₀ (инфекционной дозы тканевой культуры), покрывали 0,5% агарозой и инкубировали при 37°С в течение 3 суток. Чашки фиксировали 50% (об/об) этанолом-ацетоном и дифференциально окрашивали на иммуногистохимию с mAb WH303 и mAb WH308.

На фиг.3 показаны клинические баллы, зарегистрированные у свиней, инфицированных рекомбинантными вирусами T1v-T5v и BICv. Клинические баллы вычисляли, как описано ранее, с модификациями, и основывали на наблюдении двух (T1v, T2v, T3v и T4v) или шести (T5v и BICv) животных.

На фиг.4А-Б показаны периферические формулы лейкоцитов (фиг.4А) и тромбоцитов (фиг.4Б) у свиней, инфицированных рекомбинантными вирусами T1v-T5v и BICv. Формулы выражены в виде числа/мл, и каждая точка выражает среднее значение и стандартную ошибку для двух (T1v, T2v, T3v и T4v) или шести (T5v и BICv) животных.

На фиг.5А-В изображены титры вирусов в крови (фиг.5А), мазках из носа (фиг.5Б) и соскобах миндалин (фиг.5В) от свиней, инфицированных мутантами T1v-T5v или BICv. Каждая точка представляет среднее значение TCID₅₀/мл и стандартное отклонение для двух (T1v, T2v, T3v и T4v) или шести (T5v и BICv) животных.

На фиг.6А-Б показаны периферические формулы лейкоцитов (фиг.6А) и тромбоцитов (фиг.6Б) у свиней, ложно вакцинированных или вакцинированных T5v и подвергнутых контрольному заражению на 3 или 21 сутки после инфекции BICv. Значения для контрольных, ложно вакцинированных и подвергнутых контрольному заражению животных представлены сплошными квадратами. Формулы выражены в виде числа/мл и представляют среднее для четырех индивидуумов с планками погрешностей, показывающими стандартную ошибку.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Разработка стратегий борьбы с заболеванием в случае вспышки CSFV требует раннего начала защиты, которое становится более важным параметром качества вакцины, чем, например, длительность защиты. При разработке таких вакцин следует использовать рационально сконструированные живые аттенуированные вакцины штаммов CSFV.

Генетическая основа и молекулярные механизмы, лежащие в основе вирулентности пестивирусов, все еще неясны. В случае CSFV в различных сообщениях описаны связи между вирусными белками или специфичной областью генома и вирулентностью. Мутации одного или двух кодонов, аннулирующих РНКазную активность гликопротеина Ems штамма Alfort CSFV, аттенуировали вирус у свиней (Meyers et al., см. выше). Подобные результаты также наблюдали путем мутирования домена РНКазы гликопротеина Ems BVDV (Меуеr et al. 2002, J. Virol. 76: 8494-8503). Более недавно показано, что делеция Npro из вирулентных штаммов Alfort/187 и Eystrup CSFV привела в результате к аттенуированным вирусам у свиней (Mayer et al., см. выше). Аминокислотная замена в гликопротеине Е2 CSFV в сочетании с тремя аминокислотными заменами в Ems привела в результате к сниженной вирулентности у свиней (van Gennip et al. 2004, J. Virol. 78: 8812-8823). Кроме того, инсерция в рамке считывания 19 аминокислот в гене Е1 штамма Брешиа CSFV привела к аттенуированию in vivo (Risatti et al. 2005b, см. выше). Е2 CSFV также вовлечен в вирулентность. Замещение гена Е2 в штамме Брешиа CSFV геном Е2 из вакцинного штамма CS привело в результате к химерному вирусу, который обладал значительным аттенуированием in vivo (Risatti et al. 2005a, см. выше). Одна из 22 аминокислотных замен в белке Е2 вакцинного вируса CS по сравнению с последовательностью белка Е2 Брешиа влияет на эпитоп mAb WH303. Все три типа вируса, Брешиа, CS и химерный, сильно реагировали с mAb 303, что позволяет предположить существование другой генетической детерминанты, связанной с аттенуированием CSFV.

Здесь авторы изобретения показали, что мутации, введенные в эпитоп mAb WH303 в гликопротеине Е2 высоко патогенного штамма Брешиа CSFV, приводят в результате к аттенуированию вируса. В эпитоп WH303 Брешиа CSFV были введены прогрессивные изменения (TAVSPTTLR; SEQ ID NO:1), напоминающие остатки, находящиеся в том же положении (TSFNMDTLA; SEQ ID NO:2) в гликопротеине Е2 штамма NADL BVDV. Интересно, что у TSFNMDTLR (T4v) или TSFNMDTLA (T5v) отсутствует реактивность к mAb WH303, они проявляют мелкую морфологию бляшек и в значительной степени аттенуированы in vivo. В отличие от острого смертельного заболевания, вызванного BICv, инфекция T4v и T5v была субклинической, характеризующейся сниженной репликацией вируса в органах-мишенях и уменьшенным вирусовыделительством.

Релевантность WH303 в качестве основного иммунодоминантного эпитопа недавно наблюдали в процессе характеристики нейтрализующих моноклональных антител к Е2 и Ems CSFV, используя статистическую пептидную библиотеку фагового дисплея (Zhang et al. 2006, Archives of Virology 151 (1): 37-54). Было обнаружено, что эти моноклональные антитела связывают общий мотив SPTxL, который также картирован в эпитопе WH303 (SPTTL). Кроме того, мультипептидные вакцины, содержащие эпитоп WH303, состоящие из шести перекрывающихся пептидов в интервале длины между 20-25 аминокислотами, индуцировали иммунитет против CSFV (Dong et al. 2005, Vaccine 23:3630-3633).

В аттенуирование T5v у свиней, следовательно, может быть вовлечен некоторый аспект прикрепления вируса и/или проникновения в важные клетки-мишени in vivo. Ems, E1 и Е2 являются структурными гликопротеинами в оболочке вириона CSFV (Thiel et al., см. выше). Заякоренный в эпитопе, Е2 встречается в виде как гомо-, так и гетеродимеров, связанных дисульфидными мостиками (Thiel et al., см. выше; Weiland et al. 1990, 1999, см. выше), и показано, что параллельно с Ems (Hulst et al. 1997, J. Gen. Virol. 78: 2779-2787) и E1 (Wang et al., см. выше) он важен для рецепции вируса. Пестивирусы, сконструированные генно-инженерным путем, содержащие химерные белки Е2, имели измененный спектр хозяев. Химерный BVDV, несущий полноразмерный ген Е2 от вируса пограничной болезни овец (BDV), пестивируса овец, терял свою способность к образованию бляшек в клетках почек коровы (MDBK), но сохранял свою способность к образованию бляшек в клетках овцы (Lian et al. 2003. J. Gen. Viol. 84: 1269-1274). Однако клетки MDBK были все же пермиссивными к химерному вирусу, хотя различие в выходе вирусного потомства через 24 часа после инфекции составляло в 100 раз меньше, чем у вируса дикого типа BVDV. Подобным образом частичное замещение амино-конца Е2 штамма С CSFV гомологичной последовательностью BVDV привело в результате к 10-кратному снижению выхода вирусного потомства в клетках почек свиньи (SK6). Клетки SK6 обладали сходной пермиссивностью к химере и к BVDV донору Е2; однако химера не приобретала способность BVDV к инфицированию фетальных эпителиальных клеток теленка (van Gennip et al. 2000, см. выше). Подобным образом у T4v и T5v было представлено 10-кратное снижение выхода вирусного потомства в клетках SK6 по сравнению с BICv, T1v, T2v и T3v (фиг.2А) и отсутствие способности к эффективной репликации в клетках почек коровы (MDBK) (данные не представлены).

T4v и T5v проявляли примерно 70% уменьшение размера бляшек по сравнению с исходным BICv в клетках SK6 (фиг.2Б). Подобный фенотип мелких бляшек наблюдали со штаммом NADL BVDV на клетках SK6 (данные не представлены), что позволяет предположить, что эти вирусы обладают измененной способностью к прикреплению и/или распространению in vitro. Хотя связь между уменьшением размера бляшек in vitro и аттенуированием CSFV in vivo еще следует устанавливать, существуют некоторые наблюдения, которые позволяют предположить эту связь. Hulst et al. (J. Virol 74: 9553-9561; Hulst et al. 2001, см. выше) наблюдали, что варианты Брешиа CSFV, зависимые от связывания гепарина сульфата, полученные после серийных пассажей в культивируемых клетках почек свиньи, имели уменьшенный размер бляшек. Эти варианты, содержащие мутацию одной аминокислоты в белке Ems, были вирулентными у свиней (Hulst et al. 2000, 2001, см. выше). Однако два различных рекомбинантных вируса, производных от штамма Брешиа CSFV, содержащие мутации в Е1 (Risatti et al. 2005b, см. выше) и Е2 (Risatti et al. 2005a, см. выше), проявляли фенотип уменьшенного размера бляшек в культивируемых клетках почек свиньи и были аттенуированы у свиней.

В заключение, идентифицирована новая генетическая детерминанта вирулентности CSFV, связанная с гликопротеином Е2. Хотя механизм, лежащий в основе аттенуирования, остается неизвестным, интересно, что постепенная потеря реактивности с mAb WH303 коррелировала с потерей вирулентности in vivo, приводя к окончательному аттенуированию CSFV, что позволяет предположить связь между утратой последовательности эпитопа и неспособностью вызывать заболевание другими пестивирусами (BVDV и BDV) у свиней. Улучшенное понимание генетической основы вирулентности CSFV даст возможность рационального конструирования живых аттенуированных вакцин CSF повышенной безопасности, эффективности и пользы. Кроме того, в конкретном случае вирусов T4v и T5v потеря реактивности с mAb WH303, которое распознает высокоспецифичный и консервативный эпитоп CSFV, открывает потенциальную возможность применения этих вирусных мутантов в качестве аттенуированной маркерной вакцины.

ПРИМЕРЫ

Теперь, имея в целом описанное данное изобретение, это описание должно быть более понятно со ссылкой на некоторые конкретные примеры, которые включены здесь только для дополнительной иллюстрации изобретения и не предназначены для ограничения объема изобретения, как определено формулой изобретения.

ПРИМЕР 1

Вирусы и клеточные культуры

Клетки почек свиньи (SK6) (29), свободные от BVDV, культивировали в минимальной поддерживающей среде Дульбекко (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY) с 10% фетальной сывороткой теленка (FCS) (Atlas Biologicals, Fort Collins, CO). Штамм Брешиа CSFV размножали в клетках SK6 и использовали для конструирования инфекционного клона кДНК (17). Титрование CSFV из клинических проб проводили, используя клетки SK6 в 96-луночных планшетах (Costar, Cambridge, MA). Инфективность вируса определяли после 4 суток в культуре с помощью иммунопероксидазного анализа, используя моноклональные антитела к CSFV WH303 или WH308 (1) и набор Vectastain ABC (Vector Laboratories, Buringames, CA) (25). Титры вычисляли, используя метод Reed and Muench (14), и выражали в виде TCID₅₀ /мл. Проведенная таким образом контрольная чувствительность составляла > 1,8 TCID₅₀/мл.

ПРИМЕР 2

Конструирование инфекционных клонов Т1-Т5 CSFV

Полноразмерный инфекционный клон (1C) вирулентного изолята Брешиа (рВIC) (17) использовали в качестве матрицы, в которой шесть остатков эпитопа WH303 (TAVSPTTLR; SEQ ID NO:1) между остатками 829-837 Е2 мутировали таким образом, чтобы они отражали гомологичные остатки, присутствующие в изоляте NADL BVDV (TSFNMDTLA; SEQ ID NO:2) (Lin et al, см. выше). Мутации добавляли прогрессивно с получением пяти 1C для спасения следующих пяти вирусных мутантов: T1v (TSFSPTTLR; SEQ ID NO:3), T2v (TSFNPTTLR; SEQ ID NO:4), T3v (TSFNMTTLR; SEQ ID NO:5), T4v (TSFNMDTLR; SEQ ID NO:6) и T5v (TSFNMDTLA; SEQ ID NO:7) (фиг.1). Мутации вводили путем сайт-направленного мутагенеза, используя набор для сайт-направленного мутагенеза QuickChange XL (Stratagene, Cedar Creek, TX), проведенного в соответствии с инструкциями изготовителя и с использованием праймеров и плазмидных мишеней, описанных в таблице 1.

Таблица 1 Праймеры, используемые для конструирования вирусов Т1-Т5
Праймеры *	Последовательность	SEQ ID NO:
T1F	5'-GGGTGTTATAGAGTGCACGTCATTTAGCCCGACAAC TCTGAGAAC-3'	8
T2F	5'-GGGTGTTATAGAGTGCACGTCATTTAATCCGACAAC TCTGAGAAC-3'	9
T3F	5'-GGGTGTTATAGAGTGCACGTCATTTAATATGACAAC TCTGAGAAC-3'	10
T4F	5'-GAGTGCACGTCATTTAATATGGACACTCTGAGAACA GAAGTGGTA-3'	11
T5F	5'-TCATTTAATATGGACACTCTGGCAACAGAAGTGGTA AAGACCTTC-3'	12
* Приведены последовательности только прямого праймера. Обратные Праймеры соответствуют комплементарной последовательности.

Инфекционные РНК транскрибировали in vitro с полноразмерных 1C штамма Брешиа CSFV или мутантов Т1-Т5 и использовали для трансфекции клеток SK6 (фиг.1А). Вирус выделяли из трансфецированных клеток на 4-е сутки после трансфекции. Нуклеотидные последовательности выделенных вирусных геномов были идентичны исходным ДНК плазмидам, что подтверждает, что только мутации в локусе, кодирующем эпитоп WH303, были отражены в T1v-T5v.

ПРИМЕР 3

Спасение in vitro Брешиа и мутантных вирусов Т1-T5v CSFV

Полноразмерные геномные инфекционные клоны линеаризовали Srfl и транскрибировали in vitro, используя систему Т7 Megascript (Ambion, Austin, TX). Продукты РНК осаждали LiCl и трансфецировали в клетки SK6 путем электропорации при 500 В, 720 Ом, 100 Вт электропоратором ВТХ 630 (ВТХ, San Diego, CA). Клетки высевали в 12-луночные планшеты и флаконы на 25 см² и инкубировали в течение 4 суток при 37°С и атмосфере 5% CO₂. Вирус определяли с помощью иммунопероксидазного окрашивания, используя CSFV Е2-специфичное монокпональное антитело (WH308). Концентрированные растворы спасенных вирусов хранили при -70°С. Точность введенных мутаций проверяли путем секвенирования гена Е2 мутированных вирусов.

ПРИМЕР 4

Анализ T1v-T5v in vitro и in vivo

Характеристики роста in vitro T1v-T5v относительно исходного pBICv оценивали на многоступенчатой кривой роста (фиг.2А). Культуры клеток SK6 инфицировали при множественности инфекции (МИ) 0,01 TCIDao на клетку. Вирус абсорбировали в течение 1 ч (нулевое время), и образцы собирали через промежутки времени после инфекции через 72 ч. Хотя мутанты T1v, T2v и T3v проявляли характеристики роста, практически неотличимые от pBICv, T4v и T5v проявляли 10-кратное снижение в конечном выходе вируса. T4v и T5v также проявляли 80-90% снижение в размере бляшек относительно BICv, T1v, T2v и T3v (фиг.2Б). Наконец, хотя иммуноцитохимическая реактивность с MAb WH303 была эквивалентна для T1v, T2v и pBICv, реактивность была частично утрачена в клетках, инфицированных T3v, и полностью прекращена в клетках, инфицированных T4v и T5v (фиг.2Б). Эти результаты указывают на то, что мутации эпитопа WH303, влияющие на способность CSFV к репликации in vitro, обладают подобным действием на реактивность к WH303.

Для исследования эффекта прогрессивной мутации эпитопа WH303 на вирулентность CSFV у свиней сравнивали фенотипы вирулентности мутантных вирусов T1v-T5v и вируса дикого типа BICv в 6 группах Йоркширских свиней, инокулированных интраназально 105 TCID₅₀ вируса, и проводили мониторинг на клиническое заболевание. Результаты этого эксперимента представлены в таблице 2 и на фиг.3-5. Идентичность и стабильность мутаций эпитопа WH303 подтверждали анализом нуклеотидной последовательности вируса из миндалин животных, инфицированных T1v-T5v, на сутки 6 после инфекции (данные не представлены).

Таблица 2.
Выживаемость и температурная реакция у свиней после инфекции Т1-T5v или BICv
Вирус	Выжившие/Всего	Среднее время до гибели, сутки (СО)	Среднее время до появления температурной реакции, сутки (СО)	Средняя продолжительность температурной реакции, сутки (СО)	Средняя макс.суточная температура (СО)
T1v	0/2	8,5 (2,1)	3,0(1,4)	4,5 (2,1)	107,2 (0,0)
T2v	0/2	14,5	4,5 (0,7)	9,5 (0,7)	106,6 (1,7)
		(2,1)
T3v	0/2	19,0	5,0 (0,0)	6,0 (1,4)	105,7 (1,6)
		(0,0)
T4v	4/4		5,0 (0,0)	2,5 (2,1)*	106,2 (0,6)
T5v	6/6#	-	-	-	104,8 (0,6)
BICv	0/2*	12,5 (2,1)	4,5 (0,7)	4,5 (0,7)	105,8 (0,3)
* У двух из 4 животных была выражена	температурная реакция.
# Включены животные, использованные в исследовании защиты.

Хотя BICv, как ожидали, был высоко патогенным, эффективно вызывая температурную реакцию, клинические признаки и гибель у свиней, оказалось, что мутанты T1v-T5v обладали фенотипами вирулентности, которые имели возрастающее аттенуирование (таблица 2, фиг.3). T1v и T2v также были высоко патогенными, вызывая температурную реакцию и гибель у свиней подобно BICv (таблица 2); однако для T2v продемонстрирована некоторая задержка в клинических баллах относительно BICv (таблица 3). T3v вызывал летальное заболевание, но с замедленной кинетикой относительно BICv, поскольку смерть наступала на 4-8 суток позже (таблица 2). Примечательно, что T4v и T5v были неспособны вызывать летальное заболевание, причем T4v вызывал только легкую и преходящую температурную реакцию, и T5v почти не вызывал клинического заболевания (таблица 2, фиг.3). Подобным образом, инфекция BICv, T1v, T2v и T3v к 6 суткам после инфекции приводила в результате к резкому снижению числа лейкоцитов (WBC) и тромбоцитов, которое оставалось низким вплоть до гибели, тогда как инфекция T4v и T5v вызывала преходящий и значительно менее резкий эффект (фиг.4).

Таблица 3.
Титры вируса1 в клинических пробах и тканях после инфекции T5v или BICv
Вирус	T5v	BICv
СПИ 2	2	4	6	8	14	2	4	6	8	14
Мазок из носа	Отр 3	1,97	Отр	Отр	Отр	Отр	Отр	1,97	4,63	3,97
Соскобы миндалин	Отр	Отр	2,63	Отр	Отр	Отр	Отр	1,97	4,97	2,97
Кровь	Отр	НО4	2,97	3,97	Отр	Отр	3,13	6,47	6,30	6,80
Миндалины	2,13	2,97	3,30	1,97	2,80	1,97	4,63	5,13	5,47	6,13
Нижнечелюстной лимфоузел	2.80	3,30	3,63	2,47	3,30	1,80	2,80	4,80	5,80	5,97
Селезенка	Отр	2,97	2,63	3,47	2,80	Отр	2,13	2,80	5,63	6,30
Почки	Отр	2,47	2,97	3,13	2,13	Отр	Отр	2,80	4,80	5,97
1 Титры, выраженные в TCID50/мл
2 СПИ, сутки после инфекции
3 Отр (отрицательный): <1,80 TCID50/мл
4 НО: не определяли

Аттенуирование T1v-T5v было также отражено в виремии и вирусовыделительстве. Хотя T1v и T2v вызывали титры виремии, сравнимые с титрами, вызванными BICv, титры T3v были снижены на 10¹-10² log₁₀, а T4v и T5v вызывали титры на 10³-10⁵ log ₁₀ ниже, чем титры BICv через сходные промежутки времени после инфекции (фиг.5А). Подобный паттерн наблюдали для титров вируса из мазков из носа и соскобов миндалин (фиг.5Б и В, соответственно), причем титры T3v, T4v и T5v падали ниже обнаружимых уровней на поздние СПИ.

Для более детального исследования патогенеза T5v животных, инфицированных T5v и BICv, подвергали эвтаназии на сутки 2, 4, 6, 8 и 14 после инфекции (одно животное/момент времени/группа) и определяли титры вируса для тканевых образцов миндалин, нижнечелюстного лимфоузла, селезенки, крови и почек, а также для проб мазков из носа и соскобов миндалин (таблица 3). T5v проявлял значительно более низкие уровни репликации вируса в миндалинах (примерно 10²-10⁴ log ₁₀) относительно BICv. Подобные различия между T5v и BICv наблюдали в титрах вируса из местного дренажа нижнечелюстного лимфоузла, селезенки и почек (таблица 3).

Эти результаты указывают на то, что повышение числа мутаций в пределах эпитопа WH303 Е2 CSFV обладает аддитивным эффектом на аттенуирование вируса для свиней, причем мутации, присутствующие в T4v и T5v, приводят в результате к значительному снижению вирулентности вируса. Кроме того, инфекция T5v характеризуется очень легким и преходящим клиническим заболеванием, сниженной репликацией вируса в миндалинах и тканях-мишенях, а также резко сниженным вирусовыделительством.

ПРИМЕР 5

Секвенирование и анализ ДНК

Полноразмерные инфекционные клоны, спасенные in vitro вирусы, и вирусы, выделенные из инфицированных животных, были полностью секвенированы с CSFV-специфичными праймерами дидезоксинуклеотидным методом терминации цепи (Sanger et al. 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467). Реакции секвенирования готовили с набором Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer, Boston, MA). Продукты реакции секвенировали на автоматическом секвенаторе ДНК PRISM 3730х1 (РЕ Biosystems, Foster City, CA). Данные по последовательности собирали с помощью программного обеспечения Phrap (www.phrap.org), причем подтверждающие сборки проводили, используя САР3. Конечная согласованная последовательность ДНК представляла в среднем пятикратную избыточность по каждому положению основания. Сравнения последовательностей проводили, используя программу BioEdit.

ПРИМЕР 6

Инфекции животных

Каждый из мутантов T1v-T5v первоначально подвергали скринингу на его фенотип вирулентности у свиней относительно вирулентного вируса Брешиа. Свиньи, использованные здесь во всех исследованиях животных, представляли собой свиней в возрасте 10-12 недель, массой 40 фунтов (18,144 кг), инокулированных интраназально 10⁵ TCID₅₀, либо мутантного вируса, либо вируса дикого типа. Для скрининга 12 свиней случайно распределяли на 6 групп по 2 животных в каждой, и свиней в каждой группе инокулировали одним из мутантов T1v-T5v или pBICv. Клинические признаки (анорексия, угнетение, температурную реакцию, покраснение кожи, шатающаяся походка, диарея и кашель) наблюдали ежедневно на протяжении всего эксперимента и оценивали, как описано ранее, с модификациями.

Для оценки эффекта мутаций T5v на вирусовыделительство и распространение на различные органы во время инфекции 10 свиней случайно распределяли на 2 группы по 5 животных в каждой и инокулировали T5v или pBICv. По одной свинье на группу умерщвляли на 2, 4, 6, 8 и 14 СПИ. Пробы крови, мазков из носа и соскобов миндалин получали от свиней при аутопсии. Образцы тканей (миндалины, нижнечелюстной лимфоузел, селезенка и почки) подвергали быстрому замораживанию в жидком азоте для титрования вируса.

Для исследований защиты 12 свиней случайно распределяли на 3 группы по 4 животных в каждой. Свиней в группах 1 и 2 инокулировали T5v, животные в группе 3 были ложно инфицированы. На 3 СПИ (группа 1) или 21 СПИ (группа 2) животных подвергали контрольному заражению BICv параллельно с животными в группе 3. Клинические признаки и температуру тела записывали ежедневно на протяжении всего эксперимента, как описано выше. Кровь, сыворотку, мазки из носа и соскобы миндалин собирали через промежутки времени после контрольного заражения, причем кровь брали из передней полой вены в пробирки, содержащие ЭДТА (Vacutainer), для суммарной и дифференциальной лейкоцитарной формулы. Суммарную и дифференциальную лейкоцитарную и тромбоцитарную формулы получали, используя счетчик Beckman Coulter ACT (Beckman, Coulter, CA).

ПРИМЕР 7

Инфекция T5v защищает свиней против контрольного заражения патогенным BICv.

Оценивали способность T5v вызывать защиту против контрольного заражения BICv. Свиней, вакцинированных T5v, подвергали контрольному заражению на 3 или 21 СПИ 10⁵ TCID₅₀ патогенного BICv. У ложно вакцинированных контрольных свиней, не получающих T5v, развивалась анорексия, угнетение и температурная реакция к 4 суткам после контрольного заражения (СПКЗ) BICv, развивалось заметное снижение лейкоцитов и тромбоцитов в кровообращении к 7 суткам СПК3, и они погибали или находились в агонии, и их подвергали эвтаназии к суткам 12 СПК3 (таблица 4 и фиг.6).

Примечательно, что T5v вызывал к суткам 3 СПИ полную защиту против вызванного BICv клинического заболевания. Все свиньи пережили инфекцию и остались клинически нормальными, причем только у двух животных была выражена преходящая температурная реакция на сутки 4 СПКЗ (таблица 4), и без значительных изменений в их гематологических показателях (фиг.6). Подобным образом, свиньи, подвергнутые контрольному заражению на сутки 21 после инфекции T5v, оставались клинически нормальными (таблица 4).

Виремию и вирусовыделительство после контрольного заражения вирусом BICv, который специфично обнаруживали mAb WH303, также исследовали на 4, 6, 8, 14 и 21 СПК3 (данные не представлены). Как ожидали, у ложно вакцинированных контрольных животных виремию BICv наблюдали к 5 СПК3, причем титры вируса оставались высокими (10⁶ TCID₅₀/мл к 8 СПК3) вплоть до гибели, и BICv титровался из мазков из носа и соскобов миндалин к 4 СПК3, достигая титров 10⁴-10⁵ TCID₅₀ /мл к 8 СПК3. Напротив, BICv отсутствовал во всех клинических пробах (кровь, мазки из носа или соскобы миндалин) от T5v-вакцинированных свиней после контрольного заражения. Эти результаты указывают на то, что T5v способен быстро вызывать полную защиту против контрольного заражения летальным CSFV, что T5v-иммунные свиньи не проявляют обнаружимой виремии или вирусовыделительства после контрольного заражения вирусом.

Таким образом, T5v способен вызывать у подопытных вакцинированных животных полную защиту как против присутствия клинического заболевания, так и против репликации вируса после контрольного заражения при контрольном заражении вирулентным исходным вирусом Брешиа как на 3, так и на 28 сутки после вакцинации T5v.

Все публикации и патенты, упомянутые в данном описании, включены здесь путем ссылки в такой степени, как если бы индивидуальная публикация или патент были конкретно и индивидуально указаны как включенные путем ссылки.

Приведенное выше описание и некоторые репрезентативные воплощения и подробности изобретения представлены в целях иллюстрации и описания изобретения. Их не следует истолковывать как исчерпывающие или ограничивающие изобретение до конкретных раскрытых форм. Специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что в них могут быть сделаны модификации и вариации без отклонения от объема изобретения.