способ определения конъюгированных ксенобиотиков при допинговом контроле спортсменов

Формула изобретения

Способ определения конъюгированных ксенобиотиков при допинговом контроле спортсменов, включающий приготовление анализируемой пробы мочи путем гидролиза ферментом в присутствии буферного раствора и внутреннего стандарта, отделение гидролизата, дериватизацию его с последующим хромато/масс-спектральным анализом пробы и регистрацией полученных результатов и определения наличия стероидов, отличающийся тем, что при приготовлении анализируемой пробы гидролиз образца мочи осуществляют смесью двух ферментов: -глюкуронидазы E.coli и арилсульфатазы H.pomatia при соотношении объемов от 1:1 до 1:3, а в качестве буфера используют цитратный буферный раствор.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а точнее к клинической химии, в частности к способам определения уровня содержания ксенобиотиков в организме, и может быть использовано, например, при допинговом контроле спортсменов.

Известен способ определения ксенобиотиков, например стероидов, методами колориметрического анализа [1].

Способ этот относится к методам качественного анализа и соответственно позволяет определить только наличие стероидов, без определения их структурных характеристик и, собственно, природы. К тому же по указанному способу возможно анализировать объекты только с очень высоким содержанием стероидов.

Известны также способы определения ксенобиотиков методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией [2-4].

Общим недостатком таких методов является трудоемкая и продолжительная во времени стадия получения летучих производных, что существенно усложняет ход анализа, увеличивает его продолжительность и удорожает проведение процесса.

Наиболее близким по своей технической сущности и достигаемому результату к заявляемому способу является ГХ-МС способ определения конъюгированных ксенобиотиков, в т.ч. стероидов, в моче человека методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС) [5].

По указанному способу в образец мочи добавляют фосфатный буферный раствор, внутренний стандарт, а также фермент ( -глюкуронидаза E.coli). Смесь перемешивают и инкубируют и после гидролиза добавляют карбонатный буферный раствор и диэтиловый эфир, далее органический слой отделяют после центрифугирования, упаривают досуха, дериватизируют и анализируют методом ГХ/МС. Основным недостатком указанного способа является низкая степень достоверности определения ксенобиотиков и высокий порог чувствительности (например, для эпитестостерона до 25-50 нг/мл), поскольку указанный стероид выводится в мочу в виде как глюкуронидов, так и сульфатов, а анализу подвергаются только глюкурониды.

Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является повышение степени достоверности определения ксенобиотиков за счет снижения порога чувствительности определения и расширения номенклатуры определяемых ксенобиотиков (КБ).

Поставленный технический результат достигается тем, что в процессе пробоподготовки гидролиз анализируемого образца мочи ведут смесью двух ферментов: -глюкуронидазы E.coli и арилсульфатазы H.pomatia в объемном соотношении от 1:1 до 1:3, и в качестве буферного раствора используют цитратный буферный раствор.

Известно, что при ГХ/МС анализе КБ необходимо провести несколько стадий пробоподготовки, поскольку выведение КБ в мочу происходит после фазы II метаболизма, а именно конъюгирования, во время которого образуются сложные эфиры соединений, причем КБ выводятся в мочу в виде глюкуронидов и сульфатов. Некоторые КБ образуют наиболее долгоживущие метаболиты именно в сульфатной фракции, поэтому их можно обнаружить в биологической жидкости в течение, например, не 8 часов, а в течение 18 или 24 часов, что должно повысить достоверность подтверждения приема допинга спортсменом. Тем не менее в настоящее время концентрации КБ, в том числе и стероидов, по нормативам WADA рассчитывают исходя из глюкуронидов соответствующих соединений [6].

При реализации заявляемого изобретения в качестве аппаратурного оформления процесса может быть использован, например, хроматограф Agilent 6890, соединенный с масс-селективным детектором Agilent 5973N с электронной ионизацией (70 eV), колонка Restek Rxi - 1ms (длина 12 м, внутренний диаметр 0.20 мм, толщина неподвижной фазы 0.33 мкм).

Температурная программа может быть установлена со следующими параметрами: подъем от 188 до 232°C со скоростью 2°C/мин, далее от 232 до 300°C по 12°C/мин, изотерма 5.33 мин при объеме вводимой пробы 2 мкл в режиме деления потока (1:20), температура инжектора - 280°С. Газ-носитель - гелий (0.6 мл/мин). Температура источника ионов - 230°С, температура переходной линии - 290°С, квадруполя - 150°С, скорость сканирования - 1.69 циклов/сек, диапазон масс в режиме полного сканирования - 50-600 а.е.м.

В качестве реагентов и материалов могут быть использованы, например N-метил-N-(триметилсилил)-трифторацетамид (МСТФА), -глюкуронидаза из H.pomatia, арилсульфатаза из H.pomatia и ацетат натрия (Sigma-Aldrich, США); стандартные образцы тербуталина, форместана, карведиолола, морфина, тимолола, андростендиона, эпиандростерона и станозолола (Steraloids, Newport, США); метанол, соляная кислота и уксусная кислота (Merck, ФРГ); дигидрофосфат калия, гидрофосфат натрия и йодид аммония (Riedel-de-Haën, ФРГ); карбонат калия, гидрокарбонат калия и сульфат натрия (ХимМед, РФ); диэтиловый эфир (МедХимПром, РФ); 1,4-дитио-DL-триэтол (ДТТ), имидазол (Fluka, Швейцария); цитрат калия (Alfa Aesar, США); внутренний стандарт - метилтестостерон (МТ), D4-андростерон-глюкуронид и D5-этиохоланолон (LGC Standards, Великобритания); деионизированная вода (MilliQ, ФРГ).

Разумеется, могут быть использованы оборудование, материалы и реактивы других производителей, однако с тем условием, что по качественным характеристикам они будут обеспечивать воспроизводимость результатов исследования в объеме заявляемых патентных притязаний.

В качестве вспомогательного оборудования могут быть использованы: автоматический шейкер фирмы Glas-Col^®, США для ЖЖЭ; центрифуга марки Rotina 46R фирмы Hettich (ФРГ) для получения контрастной поверхности раздела между органической и водной фазами; упариватель фирмы Barnstead Inc. (США), совмещенный с генератором азота марки Mistral-4 фирмы Schmidlin-DBS AG (Чехия) для упаривания органического экстракта. В качестве экстрагента для ЖЖЭ может быть использован метилтретбутиловый эфир (МТБЭ). В качестве регуляторов рН могут быть использованы гидрокарбонат натрия и карбонат калия.

Изобретение может быть осуществлено следующим образом.

Готовят образцы мочи, добавляют в них буферный раствор, внутренний стандарт (метилтестостерон, для конечной концентрации 500 нг/мл мочи), точные количества фермента или смеси ферментов. Смесь далее перемешивают и инкубируют при повышенной температуре в течение 1,0 -1,5 ч. По окончании гидролиза в смесь добавляют карбонатный буферный раствор (рН 10,4) и диэтиловый эфир, встряхивают в течение 3-10 мин, центрифугируют, отделяют органический слой и упаривают его досуха и дериватизируют раствором МСТФА/NH₄I/ДТТ при нагревании в течение 20-40 минут, дериватизат переносят в виалу и анализируют методом ГХ/МС. Снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики веществ-эталонов, а также всех растворов и проб (детектируют не менее трех характеристических ионов каждого эталонного вещества, определяют время удержания, молекулярную массу, прекурсор-ионы, характеристичные ионы, нижний предел обнаружения) и полученные результаты вводят в программное обеспечение, например ChemStation фирмы Agillent, США.

Для лучшего понимания изобретение может быть проиллюстрировано, но не исчерпано следующими примерами его конкретного осуществления.

Пример 1

Готовят стандартные растворы аналитов (1 мг/мл), в частности тербуталина, форместана, карведиолола, морфина, тимолола, андростендиона, эпиандростерона и станозолола. Рабочие растворы готовят растворением точной навески ксенобиотиков - эталонов в метаноле. Далее получают рабочие растворы разбавлением стандартных растворов до содержания 10 мкг/мл. Стандартные растворы каждого из КБ (1 мг/мл) готовят растворением точной навески в точном объеме метанола. К 3 мл мочи (из приготовленных ранее образцов) добавляют 1 мл буферного раствора, 30 мкл внутреннего стандарта (МТ, для конечной концентрации 500 нг/мл мочи), точные количества смеси ферментов. Смесь перемешивают и инкубируют при 55°С 1 час 10 минут. После гидролиза добавляют 1 мл карбонатного буферного раствора (рН 10.4) и 5 мл диэтилового эфира. Встряхивают в течение пяти минут, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин; органический слой отделяют, упаривают досуха при 70°C в течение 40 минут и проводят дериватизацию - 50 мкл раствора МСТФА/NH₄I/ДТТ (1000:3:2) при нагревании до 70°С в течение 30 минут, раствор переносят в виалу и анализируют далее методом ГХ/МС (параметры аналитической процедуры приведены выше).

С разрешения этической комиссии и согласия добровольцев (5 человек) ими были приняты допинг (андростендион и тербуталин - 1-й; форместан и карведиолол - 2-й; морфин - 3-й; тестостерон - 4-й и станозолол - 5-й). Пробоподготовку образцов мочи допированных добровольцев проводят в описанном выше порядке (добавляют буферный раствор, внутренний стандарт, точные количества фермента или смеси ферментов, далее смеси перемешивают и инкубируют при повышенной температуре в течение 1,0 -1,5 ч) и далее проводят ГХ/МС анализ. КБ в пробах мочи определяют в том же порядке и при тех же параметрах, что и в стандартных растворах. Результаты анализов представлены в Таблице 1.

Таблица 1
Образец мочи	фермент	Буфер	Найденные КБ, концентрация, нг/мл
1	E.coli + helix pomatia	цитратный	Андростендион, 120 Тербуталин, 430
2	E.coli + helix pomatia	цитратный	Форместан, 260 Карведиолол, 120
3	E.coli + helix pomatia	цитратный	Морфин, 1450
4	E.coli + helix pomatia	цитратный	Тестостерон, 279
5	E.coli + helix pomatia	цитратный	Станозолол, 153

Одновременно эти же образцы мочи исследуют по методике, предписанной в прототипе (фермент E. Coli, фосфатный буфер). Результаты анализов представлены в Таблице 2.

Таблица 2
Образец мочи	фермент	Буфер	Найденные КБ, концентрация, нг/мл
1	E.coli	фосфатный	Андростендион не обнаружен Тербуталин, 180
2	E.coli	фосфатный	Форместан, 100 Карведиолол, 120
3	E.coli	фосфатный	Морфин, 500
4	E.coli	фосфатный	Тестостерон, 240
5	E.coli	фосфатный	Станозолол, 140

Из представленных в Таблице 1 результатов становится очевидным, что использование для гидролиза смеси ферментов E.coli + helix pomatia в цитратном буфере позволяет расширить номенклатуру определяемых КБ, а также существенно понизить порог определения указанных соединений.

В частности, это видно из сопоставления полученных результатов в Таблице 2 (количество определенных в пробе КБ - нг/мл).

Для сравнения проводят анализы образцов мочи, подвергнутых гидролизу при различных сочетаниях ферментов и буферов (см. Таблицу 3).

Таблица 3
1	Фермент E.coli	Буфер фосфатный	По WADA
2	Смесь ферментов Е.coli + helix pomatia	Буфер цитратный	По изобретению
3	Фермент E.coli	Буфер цитратный	Для сравнения
4	Фермент helix pomatia	Буфер фосфатный	Для сравнения
5	Фермент helix pomatia	Буфер цитратный	Для сравнения

На рис.1-5 представлены результаты анализов для исследованной серии КБ в зависимости от природы фермента(ов) и буфера.

Из представленных иллюстративных материалов вытекает, что при использовании в качестве гидролизующей среды смеси ферментов (Е.coli + helix pomatia) в цитратном буфере нижний предел обнаружения исследованных КБ по сравнению с известным (единица, или 100%) понижается по меньшей мере до 0,8-0,35 (т.е. в 1,2-1,65 раза)

Пример 2

Готовят образец мочи, добавляют в него буферный раствор, внутренний стандарт (МТ, для конечной концентрации 500 нг/мл мочи), точные количества фермента или смеси ферментов. Смесь далее перемешивают и инкубируют при повышенной температуре в течение 1,0-1,5 ч и далее процедуру проводят, как в Примере 1, включая технику и условия проведения ГХ/МС анализа, за исключением того, что образец мочи разделяют на пять аликвот и каждую аликвоту подвергают гидролизу при следующих условиях (Таблица 4):

Таблица 4
Аликвота	Фермент Е.coli (мл)	Helix pomatia (мл)	Примечание
1	1,0	0,7
2	1,0	1,0
3	1,0	2,0
4	1,0	3,0
5	1,0	3,5

На рис.6 приведены результаты определения карведиолола в зависимости от соотношения объемов смеси используемых ферментов.

Из рис.6 следует, что оптимальное соотношение объемов используемых ферментов составляет 1:2 - 1:3. Выход соотношения за заявленные пределы снижает ожидаемый результат определения ЭС.

Как видно из описания и приведенных примеров осуществления способа и сравнительных примеров, изобретение обеспечивает снижение порога чувствительности определения ЭС, а также расширение номенклатуры определяемых соединений.

Источники информации

1. RU 2190853 С2, G01N 33/74, 2002 г.

2. Хим. фарм. Журнал, 1988, т.22, с.622.

3. RU 2313086 C2, G01N 30/72, 2007.

4. J.Anal. Toxicol., 2005, v.29, № 4, p.217.

5. WADA Technical Document - TD2004EAAS - прототип.

6. Wada Prohibited List, Version 5.0, 2010.