способ получения матрикса трахеи для аллогенной трансплантации

Формула изобретения

Способ получения матрикса трахеи для аллогенной трансплантации, включающий использование донорской трахеи, отличающийся тем, что образец трахеи механически очищают от жировой и соединительной ткани, промывают дистиллированной водой, инкубируют в течение 14-21 сут в 5%-ном растворе NaClO₄, обновляя раствор каждые 72 ч, промывают физиологическим раствором.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, в частности трансплантологии.

При развитии стеноза трахеи, вызванного злокачественными новообразованиями, инфекционными заболеваниями, послеоперационными осложнениями или травмой, возникает необходимость в резекции значительных участков органа. В ряде случаев невозможно формирование первичного анастомоза и требуется замена дефекта трансплантатом.

Для восстановления целостности трахеи использовались различные протезы и ткани: замещение трахеальных дефектов аутологичными тканями, такими как надкостница, тонкая кишка, мышцы, пищевод, ткани бронха и аорты. Эти способы оказались малоэффективными и не позволяли формировать полноценный каркас трахеи. Кроме того, эти трансплантаты в дальнейшем замещались соединительной тканью, блокирующей воздухопроводящие пути [Grillo НС. Tracheal replacement: a critical review. Ann. Thorac. Surg.. - 2002. - Vol.73. - P.1995-2004].

Известны аллотрансплантаты для замещения дефектов трахеи, содержащие эпителий и хрящевые кольца, которые являлись мишенями для отторжения. Для предотвращения отторжения аллотрансплантата требуется проведение длительной неспецифической иммуносупрессивной терапии, вызывающей ряд побочных эффектов. В большинстве случаев после прекращения иммуносупрессивной терапии наблюдалось отторжение трансплантированных тканей [М. Sykes Immune evasion by chimeric trachea. N. Engl. J. Med. -. 2010 - Vol.362. - P.172-174].

В качестве прототипа заявляемого способа получения матрикса трахеи для аллогенной трансплантации предлагается способ с использованием трупной трахеи, детергентов и энзимов [Р. Macchiarini at al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet 2008; 372:2023-2030]. Для снижения иммуногенности и удаления молекул главного комплекса гистосовместимости МНС I и II классов образец трахеи выдерживали в дистиллированной воде в течение 72 часов, затем проводили децеллюляризацию путем инкубирования трахеи в смеси 4% раствора натрия деоксихолата и 2000 ед. дезоксирибонуклеазы в 1 mM/л натрия хлорида, 25 циклов в течение 6 недель.

Недостатки прототипа: 1) не обеспечивает стерильность трансплантата, что может привести к гнойно-септическим осложнениям и к последующему отторжению трансплантата; 2) длительность обработки трансплантата трахеи (6 недель) не позволяет использовать его у больных с острой дыхательной недостаточностью, обусловленной дефектом или обтурацией трахеи; 3) нарушает структуру хрящевой ткани.

Задачей заявляемого изобретения является разработка способа получения стерильного матрикса трахеи для аллогенной трансплантации в более короткие сроки (2-3 недели).

Заявляемый способ предусматривает следующие стадии:

а) механическое очищение донорской трупной трахеи от соединительной и жировой тканей;

б) децеллюляризация донорской трахеи.

Способ осуществляется следующим образом: образцы трахеи механически очищают от жировой и соединительной тканей, промывают дистиллированной водой. С целью децеллюляризации трахею инкубируют в 5% растворе перхлората натрия (NaClO ₄) в течение 14-21 суток, при этом растворы обновляют каждые 72 часа. Затем образцы трахеи отмывают физиологическим раствором.

Пример 1. Оценка макро- и микроструктуры иммуногистохимических особенностей трасплантата

Исследования проведены на мышах линии C57BL/6 весом 22-25 г. У мышей линии C57BL/6 под эфирным наркозом удаляли трахею и механически освобождали от слизи, мышечных элементов, жировой и соединительной тканей; затем промывали дистиллированной водой. С целью децеллюляризации образцы трахеи инкубировали в 5% растворе NaClO₄ в течение 14 суток. Раствор обновляли каждые 72 часа. Затем образцы отмывали физиологическим раствором и проводили морфологическое и иммуногистохимическое исследования. Экспрессию антигенов МНС I и II классов, а также дифференцировочных антигенов натуральных киллеров определяли на отпечатках и криостатных срезах образцов трахеи. Для этих целей использовали антитела NK 1.1 - РЕ, МНС I-FITC и МНС II-FITC фирмы Coltag. Световую и флюоресцентную микроскопию проводили с использованием фотовидеосистемы фирмы Zeiss и программы Axiovision 2.

Как показано на фиг.1, обработка 5% раствором NaClO₄ не приводит к выраженным нарушениям структуры хрящевой и соединительной тканей трахеи.

В заявляемом способе получения матрикса трахеи для аллогенной трансплантации образцы сохраняли свою макроструктуру и эластичность. При использовании заявляемого способа наблюдали полное разрушение структуры слизистой оболочки, в то время как хрящевая ткань сохраняла свою структуру, а в хондроцитах определяли невакуолизированную цитоплазму и ядро (Фиг.2, 3). Показано, что после обработки слизистой оболочки 5% раствором NaClO₄ были обнаружены лишь отдельные полуразрушенные клетки с вакуолизированной цитоплазмой и безъядерные клеточные фрагменты (Фиг.4, 5). При иммунофлюоресцентном исследовании выявлено, что после воздействия 5% раствора NaClO₄ в отпечатках трахеи не обнаружено специфической реакции на антигены гистосовместимости МНС I класса, определяли лишь единичные МНС II-положительные клетки (Фиг.6, 7).

Пример 2. Оценка гетеротопной аллогенной трасплантации матрикса трахеи у мышей

Подготовку трансплантатов осуществляли, как описано в примере 1. Далее у мышей реципиентов линии Balb/c в дорзолатеральной области грудной клетки формировали подкожный карман, в который помещали трансплантат. Через 28 суток трансплантат извлекали и проводили гистологическое исследование. Световую микроскопию проводили с использованием фото-видеосистемы фирмы Zeiss (Германия) и программы Axiovision 2. Гистологическое исследование извлеченного трансплантата позволило установить, что в нем сохранялись хрящевые полукольца и соединительная ткань (Фиг.8, 9).

Пример 3. Оценка гетеротопной аллогенной трасплантации матрикса трахеи у собак

Подготовку образцов донорской трахеи человека осуществляли, как описано в примере 1, но обработка трахеи длилась 21 сутки. Далее у собаки-реципиента в области паховой складки делали дугообразный разрез кожи и формировали межмышечный карман, в который помещали матрикс донорской трахеи, полученный заявляемым способом.

У животного после имплантации трахеи, обработанной по заявляемому способу, не наблюдалось симптомов общей или местной воспалительных реакций. Через 28 суток трансплантат извлекали и проводили гистологическое исследование. Трансплантат сохранил свою форму, хрящевую основу и эластичность (Фиг.10). При гистологическом исследовании было установлено, что микроструктура образца трахеи, обработанной по заявляемому способу, полностью сохранена: целостность хрящевой и мембранозной частей трахеи не претерпела существенных изменений, признаки отторжения тканей отсутствуют (Фиг.11, 12).

Технический результат

Заявляемый способ получения матрикса трахеи для аллогенной трансплантации обеспечивает в короткие сроки (2-3 недели) снижение иммуногенности, стерильность, сохранение макроструктуры и эластичности трахеи.

Изобретение иллюстрировано следующими фигурами:

Фиг.1 - трахея мыши после обработки 5% раствором NaClO₄, микрофотография, ув. 100.

Фиг.2 - срез трахеи после обработки 5% раствором NaClO₄, окр. гематоксилин-эозин, микрофотография, ув. 100.

Фиг.3 - срез трахеи после обработки 5% раствором NaClO₄, окр. гематоксилин-эозин, микрофотография, ув. 900.

Фиг.4 - отпечаток трахеи мыши после обработки 5% раствором NaClO₄, живые клетки, окр. по Романовскому-Гимза, микрофотография, ув. 900.

Фиг.5 - отпечаток трахеи мыши после обработки 5% раствором NaClO₄, живые клетки, окр. по Романовскому-Гимза, микрофотография. Ув. 400.

Фиг.6 - отпечаток трахеи мыши после обработки 5% раствором NaClO ₄, окр. антителами МНС I-FITC, иммунофлюоресценция, микрофотография, ув. 400.

Фиг.7 - отпечаток трахеи мыши после обработки 5% раствором NaClO₄, окр. антителами МНС II-FITC, иммунофлюоресценция, микрофотография, ув. 900.

Фиг.8 - аллотрансплантат трахеи после инкубации в 5% растворе NaClO₄, окраска гематоксилин-эозин, микрофотография, ув. 200.

Фиг.9 - аллотрансплантат трахеи после инкубации в 5% растворе NaClO₄, окраска гематоксилин-эозин, микрофотография, ув. 400.

Фиг.10 - Матрикс трахеи человека после инкубации в 5% растворе NaClO₄, удаленный через 30 суток после трансплантации собаке, макрофотография.

Фиг.11 - матрикс трахеи человека после инкубации в 5% растворе NaClO₄, удаленный через 30 суток после трансплантации собаке, окраска гематоксилин-эозин, микрофотография, ув. 100.

Фиг.12 - матрикс трахеи человека после инкубации в 5% растворе NaClO₄, удаленный через 30 суток после трансплантации собаке, окраска гематоксилин-эозин, микрофотография, ув. 400.