штамм bifidobacterium bifidum, используемый для получения бифидосодержащей продукции

Формула изобретения

Штамм Bifidobacterium bifidum ВКПМ Ac-1875, используемый для получения бифидосодержащей продукции.

Описание изобретения к патенту

В связи с неблагоприятными экологическими условиями, стрессами, длительной антибактериальной, лучевой и химиотерапией, дисбиозами, возникающими вследствие перенесенных заболеваний, увеличивается количество людей, страдающих нарушениями нормальной микрофлоры организма. Для лечения и профилактики этих нарушений все большее внимание уделяется как препаратам, обладающим пробиотическим действием, так и пищевым продуктам, содержащим бифидобактерии.

В кишечнике человека в основном встречаются 5 видов бифидобактерий - B. bifidum, B. longum, B. adolescentis, B. breve и B. infantis. Из них с наибольшей частотой в биоценозе обнаруживаются виды B. bifidum и B. longum. Вид B. adolescentis чаще встречается у взрослых людей, а виды B. breve и B. infantis - преимущественно у детей грудного возраста.

Известны зарубежные моно- и комплексные препараты-эубиотики и кисломолочные продукты, включающие в свой состав бифидобактерии видов B. bifidum, B. lonqum, B. adolescentis, B. breve (патент 2336886, патент 2411008, Франция; патент 637297, Швейцария; патент 2134179, патент 2421066, ФРГ; патент 05227946, патент 0430642, Япония; патент 4645667, США, патент 6063935, Япония, патент 5922375, США, патент 5902743, США). У нас в стране для приготовления бактерийных препаратов, биологически активных добавок, продуктов лечебно-диетического питания применяют отечественные штаммы бифидобактерии видов B. bifidum 1,791,792; B. lonqum Я-2, Я-4; В. breve 79-119; B. infantis 79-43 и другие (авторское свидетельство № 343588, патент РФ № 1347221, патент РФ № 849779, патент РФ № 2108383, патент РФ № 2152993, патент № 863639, патент РФ № 2120991, патент РФ № 2078814, патент РФ № 2111248).

Качество лечебных продуктов и препаратов во многом обусловлено свойствами штамма-продуцента - его специфической активностью и технологичностью. Большой ассортимент биологически активных и технологичных штаммов бифидобактерий делает возможной разработку новых моно- и комплексных продуктов лечебного питания и бакпрепаратов, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность кишечника человека, восстановить его нормальную микрофлору и снизить заболеваемость различными кишечными инфекциями.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма микроорганизмов вида Bifidobacterium bifidum B-UH с высокой биологической активностью, устойчивостью к условиям внешней среды, обладающего стабилизирующим кислотообразованием во всем температурном диапазоне развития клеток, антагонистически активного по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре, хорошо сквашивающего молоко и быстро размножающегося на искусственных питательных средах.

Штамм Bifidobacterium bifidum B-UH выделен от здорового ребенка грудного возраста, депонирован в ВКПМ, ФГУП ГосНИИгенетика, коллекционный номер Ас-1875.

Заявляемый штамм может быть использован при производстве кисломолочной продукции, ферментированных пищевых продуктов, например квас, пиво и т.п., неферментированных пищевых продуктов, например соки, напитки и т.п., заквасок для приготовления кисломолочной продукции и биологически активных добавок к пище. Также штамм Bifidobacterium bifidum B-UH может применяться для производства гигиенических и косметических средств, например кремов, лосьонов, салфеток, мыла, присыпок, тампонов, питательных масок, гелей, женских прокладок, косметического молочка, различных пудр и т.д. Кроме того, штамм Bifidobacterium bifidum B-UH может быть использован при производстве бактериальных препаратов в виде свечей, пероральных и других средств.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение штамма Bifidobacterium bifidum B-UH, который может быть использован в качестве биологически активного компонента в составе различных пробиотических средств коррекции микробиоценозов организма человека, обладающего биологически и технологически значимыми свойствами, такими как высокая кислотообразующая активность, способность наращивать микробную биомассу в искусственных питательных средах за короткие сроки культивирования, сквашивать молоко, антагонистически активного по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.

Культурально-морфологические свойства штамма.

Клетки представляют собой гр+полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2-х концах, в жидких питательных средах растут по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза. Отдельно выросшие колонии на Бифидум - среде имеют кометообразную форму колоний. Логарифмическая фаза роста заканчивается к 12-18 ч культивирования.

Физико-биохимические свойства штамма.

Бесспоровый, неподвижный анаэроб. Оптимальная температура выращивания 37 -39 градусов по Цельсию. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L+молочной кислот, без образования газа, закисляя среду выращивания до рН 4,1-3,9. Ферментирует лактозу, фруктозу, галактозу, не ферментирует сорбит, арабинозу, салицин, инозит, инулин, целлобиозу, ксилозу, маннозу, маннит. Штамм сквашивает молоко к 16-24 ч.

Штамм Bifidobacterium bifidum B-UH обладает антагонистической активностью по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре (табл.1).

Таблица 1
Антагонистическая активность штамма В. bifidum B-UH
Штамм	Зона задержки роста тест-культур мм/ М±m
Sh. sonnci	Sh. flexneri	Е. соli	S. aureus	Pr. vulgaris
В. bifidum B-UH	22±2,0	25±1,8	18±1,6	20±1,2	25±1,4

Штамм активно наращивает микробную массу при росте на гидролизатно-молочной среде (ГМ), бифидум-среде (БФ), молоке (М), продуцируя кислоты (табл.2).

Таблица 2
Накопление микробной массы (КОЕ /мл lg 10) и активность кислотообразования (в градусах Тернера) штамма Bifidobacterium bifidum B-UH в динамике развития
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА	ВРЕМЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ
12 ч	24 ч	48 ч
КОЕ	°T	КОЕ	°T	КОЕ	°T
ГМ	8,2	94	9,0	114	7,8	162
БФ	8,4	86	9,2	108	7,6	142
М	8,2	82	8,6	112	8,0	138

Штамм максимально накапливает микробную массу к 12-18 ч, достигая в 1 мл lg 8-9 микробных клеток, активно продуцирует кислоты.

Таким образом, предлагаемый штамм Bifidobacterium bifidum B-UH технологичен, поскольку размножается в различных питательных средах с накоплением производственной биомассы с высокой концентрацией бифидобактерий; обладает кислотообразующей активностью, а также антагонистической активностью в отношении к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.

Кисломолочные, ферментированные, неферментированные пищевые продукты, гигиенические, косметические средства, биологически активные добавки и бактерийные препараты, содержащие штамм Bifidobacterium bifidum B-UH, могут найти широкое применение в пищевой, медицинской, биотехнологической и косметической промышленности.

Способность штамма Bifidobacterium bifidum B-UH наращивать биомассу в питательной среде в короткие сроки культивирования, кислотообразующая, антагонистическая активность по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре, а также другие полезные для организма человека свойства, характерные для вида Bifidobacterium bifidum, делают возможным использование штамма в составе различных корригирующих средств лечебно-профилактического назначения.

Пример 1. Использование штамма Bifidobacterium bifidum B-UH в составе биологически активных добавок.

1 пассаж: лиофилизированный штамм Bifidobacterium bifidum B-UH в количестве 0.1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной средой и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9 . Инкубируют при температуре 38±1°С до образования видимого роста в последних разведениях.

2 пассаж: выросшую культуру из 10^-7-9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную среду и культивируют при температуре 38±1°С в течение 12-18 ч до образования густого роста с видимой зоной аэробиоза.

3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-18 ч при 38±1°С до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10⁸/мл.

В результате получают биологически активную добавку, которая представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 10⁸/мл, содержанием бифидобактерий.

Пример 2. Использование штамма Bifidobacterium bifidum B-UH для приготовления ферментированных и неферментированных пищевых продуктов.

1 пассаж: лиофилизированный штамм Bifidobacterium bifidum B-UH в количестве 0.1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной средой и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при 38±1°С до образования видимого роста в последних разведениях.

2 пассаж: выросшую культуру из 10^-7-9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную среду и культивируют при температуре 38±1°С в течение 12-18 ч до образования густого роста с хорошо видимой зоной аэробиоза.

3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-18 ч при 38±1°С до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10⁸/мл.

Получение ферментированного или неферментированного пищевого продукта: выросшую биомассу вносят в пищевое сырье (молоко, соки, пиво, квас и пр.) в количестве до 10% от объема, перемешивают и разливают в емкости. В результате получают продукт с концентрацией живых бифидобактерий не менее 10⁶/мл.

Пример 3. Использование штамма Bifidobacterium bifidum B-UH для приготовления кисломолочного продукта.

1 пассаж: лиофилизированный штамм вносят в среду культивирования и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при 38±1°С до образования видимого роста в последних разведениях. Или сухую лиофилизированную биомассу бифидобактерий вносят в количестве 1-2 дозы в пробирку с 30 мл питательной среды. Культивируют при температуре 38±1°С до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10⁷/мл.

2 пассаж: выросшую культуру штамма Bifidobacterium bifidum B-UH из последних разведений или из пробирки с выросшей биомассой вносят в среду накопления объемом до 10% и культивируют при температуре 38±1°С до получения биомассы с содержанием бифидобактерий не менее 10⁸/мл.

3 пассаж; полученную биомассу штамма Bifidobacterium bifidum B-UH в объеме до 10% вносят в стерильное молоко, культивируют до образования сгустка (кисломолочный продукт). Количество пассажей № 2 может быть увеличено в зависимости от объема производства.

Пример 4. Использование штамма Bifidobacterium bifidum B-UH для получения бактерийных препаратов.

Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду, культивируют при температуре 38±1°С до получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 10 ⁸ в 1 мл. К полученной биомассе добавляют защитные среды высушивания (сахарозо-желатиновая среда, обезжиренное молоко). Полученную суспензию разливают в ампулы, флаконы и другие емкости, замораживают при температуре минус 35-45°С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат содержит не менее 10⁷ живых клеток бифидобактерий. Данное содержание бифидобактерий согласуется с научно-технической документацией на аналогичный бифидосодержащий препарат "Бифидумбактерин сухой" и является достаточным для использования полученного средства в качестве препарата - эубиотика.

Пример 5. Использование штамма Bifidobacterium bifidum B-UH для получения гигиенических и косметических средств.

Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду, культивируют при температуре 38±1°С до получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 10 ⁸ в 1 мл.

Полученную биомассу бифидобактерий штамма Bifidobacterium bifidum B-UH вводят в количестве не более 1% в состав мыла или крема.

Клиническая эффективность Bifidobacterium bifidum изучалась на базе Московской медицинской Академии имени И.М.Сеченова в составе жидкой биологически активной добавки - «Нормофлорин». Под наблюдением находились 20 взрослых человек с воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК) - язвенный колит, Болезнь крона, хронический колит. Больные, наряду с базисной терапией, получали «Нормофлорин» по 1 столовой ложке перед едой в течение 30 дней. В результате у больных на фоне применения биодобавки «Нормофлорин» отмечено снижение отрицательных проявлений диспепсического синдрома (тошнота, отрыжка, снижение аппетита), абдоминального синдрома (вздутие живота, метеоризм, частота и характер стула). При применении биодобавки «Нормофлорин» нежелательные явления не наблюдались.