вакцина против salmonella

Формула изобретения

1. Способ вакцинации птиц против Salmonella, включающий: по меньшей мере, одно первичное введение аттенуированной иммуногенной композиции или вакцины, включающей фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду и, по меньшей мере, одну аттенуированную Salmonella, которые вводят животному-птице перед, по меньшей мере, одним бустерным введением инактивированной иммуногенной композиции или вакцины, включающей фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду, и, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella, где, по меньшей мере, одну аттенуированную Salmonella или, по, меньшей мере, одну инактивированную Salmonella выбирают из Salmonella В-группы и, по меньшей мере, одну аттенуированную Salmonella или, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella выбирают из Salmonella D-группы, согласно которому первичное введение и бустерное введение осуществляют с интервалом в 2-18 недель.

2. Способ по п.1, где Salmonella В-группы включает Salmonella typhimurium, Salmonella braenderup, Salmonella agona, Salmonella bredeney, Salmonella heidelberg, Salmonella indiana, Salmonella saint-Paul, Salmonella brandenburg.

3. Способ по п.2, где, по меньшей мере, одна аттенуированная Salmonella или, по меньшей мере, одна инактивированная Salmonella из Salmonella В-группы представляет собой Salmonella typhimurium.

4. Способ по п.3, где Salmonella D-группы включает Salmonella enteritidis, Salmonella panama, Salmonella dublin, Salmonella gallinarum, Salmonella pullorum.

5. Способ по п.4, где, по меньшей мере, одна аттенуированная Salmonella или, по меньшей мере, одна инактивированная Salmonella из Salmonella D-группы представляет собой Salmonella enteritidis.

6. Способ по п.1, где, по меньшей мере, одна аттенуированная Salmonella представляет собой Salmonella D-группы, по меньшей мере, одна инактивированная Salmonella представляет собой Salmonella В-группы, дополнительно включающий, по меньшей мере, одно введение Salmonella D-группы в промежутке примерно от 2 до примерно 18 недель после введения, по меньшей мере, одной инактивированной Salmonella В-группы.

7. Способ вакцинации птиц против Salmonella, включающий: по меньшей мере, одно первичное введение инактивированной иммуногенной композиции или вакцины, включающей фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду и, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella, которые вводят животному-птице перед, по меньшей мере, одним бустерным введением аттенуированной иммуногенной композиции или вакцины, включающей фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду, и, по меньшей мере, одну аттенуированную Salmonella, где по меньшей мере, одну аттенуированную Salmonella или, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella выбирают из Salmonella В-группы и, по меньшей мере, одну аттенуированную Salmonella или, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella выбирают из Salmonella D-группы, согласно которому первичное введение и бустерное введение осуществляют с интервалом в 2-18 недель.

8. Способ по п.7, где Salmonella В-группы включает Salmonella typhimurium. Salmonella braenderup, Salmonella agona, Salmonella bredeney, Salmonella heidelberg, Salmonella indiana, Salmonella saint-Paul, Salmonella brandenburg.

9. Способ по п.8, где, по меньшей мере, одна аттенуированная Salmonella или, по меньшей мере, одна инактивированная Salmonella из Salmonella В-группы представляет собой Salmonella typhimurium.

10. Способ по п.7, где Salmonella D-группы включает Salmonella enteritidis, Salmonella panama, Salmonella dublin, Salmonella galhnarum, Salmonella pullorum.

11. Способ по п.10, где, по меньшей мере, одна аттенуированная Salmonella или, по меньшей мере, одна инактивированная Salmonella из Salmonella D-группы представляет собой Salmonella enteritidis.

12. Способ по п.14, где аттенуированные бактерии Salmonella D-группы представляют собой Salmonella Enteritidis, инактивированные бактерии Salmonella В-группы представляют собой Salmonella typhimurium и инактивированные бактерии Salmonella D-группы представляют собой Salmonella enteritidis.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к вакцинации животных против Salmonella, в частности к вакцинации животных/птиц. Настоящее изобретение также включает наборы и применения иммуногенных композиций или вакцин против Salmonella.

Уровень техники

Salmonella spp. представляют собой факультативные внутриклеточные патогены, вызывающие локализованные или системные инфекции, в дополнение к хроническому бессимптомному состоянию носительства. Они имеют глобальное значение для экономики и здравоохранения. Тиф птиц и пуллороз у домашней птицы продолжают вызывать экономические потери в тех странах, где промышленное птицеводство продолжает интенсифицироваться и где обычным является содержание птиц на открытом воздухе. Также увеличивается количество серотипов, которые вызывают гастроэнтерит у людей. Затраты или нецелесообразность модернизации гигиенических мер или терапии вместе с усиливающимися проблемами устойчивости к антибиотикам указывают на то, что более привлекательной в качестве вспомогательного средства к существующим мерам контроля становится вакцинация домашней птицы (Zhang-Barber L. et al., Vaccine, 1999, 17(20-21): 2538-45).

Salmonella является одной из главных причин пищевых инфекций у людей. По заключению Комиссии по зоонозам (European Commission: Trends and sources of zoonotic infections in animals, feed, food and man in the European Union and Norway in 2003) в 15 странах-участницах Евросоюза и Норвегии в 2003 г. сообщалось о 135546 случаев сальмонеллеза у людей.

Птицеводство, в особенности в Европе и в Соединенных Штатах Америки, находится под усиленным контролем органов здравоохранения и потребителей для снижения рисков заражения людей бактериями Salmonella, источником которых являются домашние птицы, и в частности сальмонеллезом (ослабление патогенов и НАССР в США, Директива Совета ЕС 92/117/ЕЕС в Евросоюзе).

Так как Salmonella инфицирует многие популяции животных (например, млекопитающих, птиц), всегда существует риск заболевания сальмонеллезом, вне зависимости от страны, времени года или технологии обработки пищи.

Зоонозные факторы Salmonella spp. желудочно-кишечной инфекции у людей лечили доступными антибактериальными средствами. С начала 1990-х годов появились штаммы Salmonella, устойчивые к широкому спектру антибактериальных средств, что сделало лечение инфекции менее эффективным и повысило у людей риск заражения желудочно-кишечной инфекцией, вызываемой Salmonella spp.

Как и в предыдущие годы, доминировала Salmonella enterica, подвид enterica, серовар Enteritidis (Salmonella Enteritidis), вызывающая 61,8% (2002: 67,1%) всех зарегистрированных случаев в Евросоюзе и Норвегии. Заболеваемость в отдельных странах колебалась от 87,9% в Австрии до 33,3% во Франции. Salmonella enterica, подвид enterica, серовар Typhimurium (Salmonella Typhimurium), занимала второе место, вызывая 16,5% всех случаев заболевания. Заболеваемость в отдельных странах колебалась от 5,8% в Австрии до 28,7% в Ирландии. Как и в предыдущие годы, вслед за Salmonella Enteritidis и Salmonella Typhimurium большинство случаев было вызвано Salmonella enterica, подвид enterica, серовар Virchow (Salmonella Virchow); Salmonella enterica, подвид enterica, серовар Infantis (Salmonella Infantis) и Salmonella enterica, подвид enterica, серовар Hadar (Salmonella Hadar). Каждый из этих сероваров вовлечен менее чем в 1% всех зарегистрированных случаев.

Основным источником заражения является заражение при употреблении в пищу яиц и мяса домашней птицы. Снижения таких рисков достигают с помощью комбинации методов, применяемых на всем протяжении этапов производства яиц и мяса, таких как оптимальное ведение сельского хозяйства, гигиенические технологии и вакцинация.

Законодательство сообщества в отношении гигиены питания и надзора за зоонозами включает целый ряд положений, которые стремятся контролировать и предупреждать загрязнение продуктов питания бактериями Salmonella. Полагают, что меры для уменьшения распространенности Salmonella в живых организмах являются одним из наиболее эффективных способов снижения загрязнения пищевых продуктов и количества случаев сальмонеллеза у людей.

В 2003 г. было опубликовано новое Европейское законодательство в отношении зоонозов; Регламент 2160/2003 обеспечивает систему нормативов для подавления патогенов в пищевой цепи, в основном для популяций животных, и осуществление национальных планов контроля для выполнения этих нормативов. Первичной мишенью является Salmonella spp., в частности серовары, которые, как полагают, имеют важное значение для здравоохранения. Нормативы в различных популяциях животных повышаются в следующем порядке: племенные стада Gallus gallus, курицы-несушки, бройлеры, индюки и свиньи, забиваемые на мясокомбинатах. Вплоть до настоящего времени нормативы были установлены только для племенных стад Gallus gallus (Регламент 1003/2005); норматив был установлен как 1%, что означает, что в конце 2009 г. максимальный процент стад, позитивных на Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Infantis, Salmonella Hadar и Salmonella Virchow на уровне Евросоюза составит 1%.

Что касается специалистов по разведению животных, то Регламент 1091/2005 запрещает использование антибактериальных средств в качестве мер контроля в отношении Salmonella, в то время как применение вакцин одобрено и рекомендовано. Заключения и рекомендации Научно-исследовательской экспертной группы по биологической опасности по запросу Комиссии в отношении использования вакцин для контроля за Salmonella у домашней птицы (The EFSA Journal (2004) 114, 1-74) в значительной степени благоприятствуют применению вакцин для контроля за Salmonella на уровне ферм. В частности, заключения экспертной комиссии в числе прочих состоят в следующем.

- Основа успешного контроля за инфекциями Salmonella на фермах домашних птиц состоит в хорошем ведении сельского хозяйства и методах гигиены (включая все аспекты защиты кормов, птиц, ведения хозяйства, чистки и дезинфекции, контроля за грызунами и т.д.), а также в тестировании и удалении позитивных животных из производства. Вакцинацию цыплят рассматривают как меру повышения устойчивости птиц против воздействия Salmonella и снижения выделения микроорганизмов.

- Существуют экспериментальные данные и некоторые результаты эксплуатационных наблюдений, согласно которым сниженный уровень экскреции с фекалиями и системной инвазии микроорганизмами Salmonella у вакцинированных птиц приведет к уменьшению заражения столовых яиц и окружающей среды.

- Если программа контроля нацелена на производителей кур-несушек/бройлеров или кур-несушек, а частота заболеваний в стаде высока, то для снижения выделения микроорганизмов и заражения яиц может быть полезной вакцинация. Если частота заболеваний в стаде низкая, то вакцинация может быть не такой полезной, но все еще может быть использована в качестве одной из профилактических мер для поддержания низкой заболеваемости.

Существуют более чем 2000 сероваров бактерий Salmonella.

В соответствии с классификацией Кауфмана и Уайта (http://en.wikipedia.org/wiki/Kauffman-White_classification) допускают серологические разновидности рода Salmonella, чтобы отличать их друг от друга. Эта схема дифференцирует изоляты путем определения поверхностных антигенов, которые производятся бактериями. В первую очередь определяют «О» тип антигенов. «О» антигены являются полисахаридами, ассоциированными с липополисахаридом внешней мембраны бактерий. После определения группы «О» антигенов определяют «Н» антиген. «Н» антигены представляют собой белки, ассоциированные с бактериальным жгутиком. Сальмонеллы существуют в двух фазах: подвижной фазе и неподвижной фазе. Их также относят к специфической и неспецифической фазам. В зависимости от фазы, в которой обнаруживают сальмонеллу, продуцируются различные «Н» антигены. Патогенные штаммы Salmonella typhi несут дополнительный антиген «Vi», называемый так из-за повышенной вирулентности штаммов, которые производят этот антиген, который ассоциирован с бактериальной капсулой.

В соответствии с классификацией Кауфмана и Уайта устанавливают "O" - группы сероваров сальмонеллы.

Против заселения цыплят бактериями Salmonella группы С была разработана аттенуированная вакцина на основе Salmonella Hadar с делениями генов cya/crp и на основе Salmonella Hadar с делецией гена phoP (Roland К. et al., Avian Dis., 2004, 48(3): 445-52). Хотя вариант с делениями генов суа/crp вызывал повышенный уровень антитела в сыворотке крови, он не обеспечивал иммунный ответ, направленный против заселения бактериями Salmonella Hadar.

Chacana et al. (Chacana P.A. et al., Avian Dis., 2006, 50(2): 280-3) показали, что аттенуированная вакцина против Salmonella может вызвать перекрестный иммунитет против представителей одной и той же серогруппы схемы Кауфмана-Уайта. Против тифа птиц применяли иммунитет, обеспеченный с помощью TAD Salmonella vac E, аттенуированной вакцины на основе Salmonella Enteritidis. Три группы кур-несушек вакцинировали с помощью различных протоколов вакцинации, начиная с первого дня жизни, и затем инфицировали их с помощью 2×10⁵ КОЕ вирулентного штамма Salmonella Gallinarum или на 28-й неделе, или на 52-й неделе жизни. Оценивали смертность, выделение микроорганизмов с фекалиями или инвазию органов бактериями Salmonella Gallinarum. Вакцина на основе Salmonella Enteritidis была способна вызывать перекрестный иммунитет в отношении Salmonella Gallinarum, обоих штаммов D-группы сальмонеллы в соответствии с классификацией Кауфмана-Уайта. На 28-й неделе куры, вакцинировованные тремя пероральными дозами или двумя пероральными дозами совместно с подкожно-введенной дозой, были защищены вакциной. Однако на 52-й неделе, если куры были инфицированы через 36 недель после завершающей иммунизации, вакцина не обеспечивала защиту.

Из-за огромного количества сероваров Salmonella существует необходимость в вакцинах, направленных на бактерии Salmonella, которые способны вызывать защитный иммунный ответ против более чем одного серовара Salmonella и/или против более чем одной группы в соответствии с классификацией Кауфмана-Уайта.

Раскрытие изобретения

Соответственно, настоящее изобретение относится к стратегии вакцинации, которая основана, по меньшей мере, на одном первичном введении аттенуированной иммуногенной композиции или вакцины на основе Salmonella и, по меньшей мере, одном бустерном введении аттенуированной иммуногенной композиции или вакцины на основе Salmonella. Эта стратегия вакцинации полезна для профилактики переноса гомологичных или гетерологичных Salmonella у вакцинированных субъектов.

Целью этого изобретения также является предоставление способов применения иммуногенных композиций или вакцин для предупреждения заражения птиц гомологичными и/или гетерологичными Salmonella, в которых проводят, по меньшей мере, одно первичное введение аттенуированной иммуногенной композиции или вакцины на основе Salmonella птицам перед, по меньшей мере, одним бустерным введением инактивированной иммуногенной композиции или вакцины на основе Salmonella, которое осуществляют спустя несколько недель, в частности от 2 недель до 18 недель после единственного или первичного введения.

Целью этого изобретения также является предоставление способов применения иммуногенных композиций или вакцин для предупреждения переноса гомологичных или гетерологичных Salmonella у птиц, в которых проводят, по меньшей мере, одно первичное введение аттенуированной иммуногенной композиции или вакцины на основе Salmonella группы D птицам перед, по меньшей мере, одним бустерным введением инактивированной иммуногенной композиции или вакцины на основе Salmonella группы В и Salmonella группы D, которое осуществляют спустя несколько недель, в частности от 2 недель до 18 недель, после единственного или первого первичного введения. Примеры Salmonella групп В и D предоставлены в этом документе.

Целью этого изобретения также является предоставление наборов для вакцинации птиц, включающих, по меньшей мере, два флакона и листок-вкладыш с инструкциями по введению, первый флакон, содержащий иммуногенную композицию или вакцину на основе аттенуированной Salmonella, и второй флакон, содержащий иммуногенную композицию или вакцину на основе инактивированной Salmonella. Необязательно могут быть включены дополнительные флаконы, которые включают иммуногенную композицию или вакцину на основе аттенуированной Salmonella для многократного введения при первичной иммунизации, и/или флаконы, включающие иммуногенную композицию или вакцину на основе инактивированной Salmonella для многократного бустерного введения.

Следует отметить, что в этом описании и, в частности, в формуле изобретения такие термины, как "включает", "включали", "включающие" и т.п., могут иметь значение, которое относится к закону о патентах США; например, они могут означать "охватывает", "охватывали", "охватывающие" и т.п.; а такие термины, как "состоящий в основном из" и "состоит в основном из", имеют значение, которое приписывает им закон о патентах США, например в них допускается присутствие элементов, которые не были точно перечислены, но в них исключены элементы, которые обнаружены в предшествующем уровне техники или которые затрагивают основные или новые характеристики изобретения.

Эти и другие воплощения раскрыты или очевидны, или охвачены подробным описанием изобретения, приведенным ниже.

Краткое описание фигур

Приведенное ниже описание, которое дано в виде примеров и которое не предназначено ограничить изобретение описанными специфическими воплощениями, следует понимать в связи с прилагаемыми фигурами, которые включены сюда путем отсылки:

фигура 1 иллюстрирует процент повторной локализации штаммов Salmonella для экспериментального заражения в селезенках цыплят через 4-7 дней после заражения;

фигура 2 иллюстрирует средние цифры штаммов Salmonella для экспериментального заражения в слепой кишке цыплят через 4-7 дней после заражения и стандартные отклонения.

Для фигуры 1 и фигуры 2 "Control" («контроль») представляет собой невакцинированную контрольную группу, соответствующую G.00; "L+K" является группой, вакцинированной дважды, первый раз вакциной на основе аттенуированной Salmonella и второй раз вакциной на основе инактивированной Salmonella, соответствующей G.01; "Killed» («убитая») - группа, вакцинированная только вакциной на основе инактивированной Salmonella, соответствующая G.02.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение относится к способам применения иммуногенных композиций или вакцин на животных/птицах для повышения иммунного ответа, по меньшей мере, против одной гетерологичной Salmonella, в которых животному/птице проводят, по меньшей мере, одно первичное введение аттенуированной иммуногенной композиции или вакцины, включающей фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду, и, по меньшей мере, один аттенуированный серовар Salmonella одной из Salmonella, перед, по меньшей мере, одним бустерным введением инактивированной иммуногенной композиции или вакцины, включающей фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду, и, по меньшей мере, один аттенуированный серовар Salmonella одной из Salmonella, с интервалом в несколько недель, в частности с интервалом от 2 недель до 18 недель. Аттенуированная Salmonella и инактивированная Salmonella могут происходить из одного и того же серовара или из различных сероваров. Гетерологичная Salmonella представляет собой бактерию, отличающуюся от тех, которые применяют в иммуногенных композициях или вакцинах, которые вводят при первичной иммунизации или во время бустерного введения, например бактерию Salmonella другого серовара или другой группы Salmonella в соответствии с классификацией Кауфмана-Уайта.

Способы предмета изобретения можно применять на животных/птицах для того, чтобы создать перекрестный иммунитет у животных/птиц против заболевания, вызываемого, по меньшей мере, одной гетерологичной бактерией Salmonella, и/или для того, чтобы предупредить носительство, по меньшей мере, одной гетерологичной бактерии Salmonella у животных/птиц.

Способы настоящего изобретения также можно применять на животных/птицах для того, чтобы уменьшить количество бактерий Salmonella С-группы в селезенке и/или в слепой кишке инфицированных животных/птиц, в частности чтобы уменьшить количество бактерий Salmonella С1-группы и бактерий Salmonella С2-группы в селезенке и/или в слепой кишке инфицированных животных/птиц или чтобы уменьшить количество бактерий Salmonella В-группы и бактерий Salmonella С-группы в селезенке и/или в слепой кишке инфицированных животных/птиц. Примеры бактерий Salmonella С-групп представлены в этом документе.

Термин «иммуногенная композиция» относится к любой композиции, способной после инъецирования животному/птице вызывать или стимулировать иммунный ответ против Salmonella.

Термин «вакцинная композиция» или «вакцина» относится к любой композиции, способной после инъецирования животному, в частности животному/птице, вызывать или стимулировать защитный иммунный ответ против заболеваний, вызываемых бактериями Salmonella и/или вызывать или стимулировать защитный иммунный ответ для того, чтобы предупредить или уменьшить носительство бактерий Salmonella у животных, в частности у животных/птиц.

Режим первичной бустерной иммунизации включает, по меньшей мере, одно первичное введение и, по меньшей мере, одно бустерное введение с применением, по меньшей мере, одного общего полипептида, антигена, эпитопа или иммуногена. Вакцина, применяемая при первичном введении, может отличаться по своей природе от той вакцины, которую применяют позже для бустерного введения. Первичное введение может включать одно или несколько введений. Сходным образом, бустерное введение может включать одно или несколько введений.

Способы изобретения включают, по меньшей мере, одно первичное введение и, по меньшей мере, одно бустерное введение животному, предпочтительно птице, эффективного количества иммуногенной композиции или вакцины в соответствии с изобретением. Животное может быть самцом или самкой. Это введение может быть, в частности, сделано с помощью внутримышечной (IM), внутрикожной (ID) или подкожной (SC) инъекции или с помощью интраназального или перорального введения, где пероральное введение включает, но не ограничивается только этим, введение пищи или питьевой воды, гелей или распыляемых растворов.

Фармацевтически или ветеринарно-приемлемые эксципиенты, разбавители или среды могут быть водой, водой для инъекции, солевым раствором или буфером. К аттенуированной иммуногенной композиции или вакцине можно добавлять стабилизатор, такой как глицерин, раствор глюцидов, например раствор сахарозы.

Аттенуированная иммуногенная композиция или вакцина, применяемая при первичном введении, в соответствии со способами настоящего изобретения включает фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду и, по меньшей мере, одну аттенуированную бактерию Salmonella. Аттенуированную бактерию Salmonella можно выбирать из группы, состоящей из бактерий Salmonella D-группы и Salmonella В-группы, предпочтительно среди D-группы, состоящей из Salmonella Enteritidis, Salmonella Panama, Salmonella Dublin, Salmonella Gallinarum, Salmonella Pullorum, и среди В-группы, состоящей из Salmonella Typhimurium, Salmonella Braenderup, Salmonella Agona, Salmonella Bredeney, Salmonella Heidelberg, Salmonella Indiana, Salmonella Saint-Paul, Salmonella Brandenburg. В предпочтительном воплощении аттенуированная иммуногенная композиция или вакцина, применяемая при первичном введении, в соответствии со способами настоящего изобретения включает фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду и, по меньшей мере, одну аттенуированную бактерию Salmonella D-группы. В другом предпочтительном воплощении аттенуированная иммуногенная композиция или вакцина, применяемая при первичном введении, в соответствии со способами настоящего изобретения включает фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду и, по меньшей мере, одну аттенуированную бактерию Salmonella В-группы. В другом предпочтительном воплощении аттенуированная иммуногенная композиция или вакцина, применяемая при первичном введении, в соответствии со способами настоящего изобретения включает фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду и, по меньшей мере, одну аттенуированную бактерию Salmonella D-группы и, по меньшей мере, одну аттенуированную бактерию Salmonella В-группы. В наиболее предпочтительном воплощении аттенуированная иммуногенная композиция или вакцина, применяемая при первичном введении, в соответствии со способами настоящего изобретения включает фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду и аттенуированную Salmonella Enteritidis. В другом наиболее предпочтительном воплощении аттенуированная иммуногенная композиция или вакцина, применяемая при первичном введении, в соответствии со способами настоящего изобретения включает фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду и аттенуированную Salmonella Enteritidis и аттенуированную Salmonella Typhimurium.

Примеры различных групп в соответствии с классификацией Кауфмана-Уайта включают группы А, В, С 1-3, D, E 1-4, F, G, Н и I, примеры которых представлены ниже.

Например, А-группа включает Salmonella enterica, подвид enterica, серовар Paratyphi A (Salmonella Paratyphi A), Salmonella Paratyphi А вариант durazzo.

Некоторые аттенуированные вакцины на основе Salmonella и некоторые инактивированные вакцины на основе Salmonella имеются в продаже.

Патенты США U.S. Patent Nos. 7,045.122; 6,923,957; 6,905,691; 6,605,285; 5,843,426; 5,733,760; 5,424,065; 5,389,368 и 6,592,869 имеют отношение к вакцинам на основе Salmonella, включающим аттенуированные и инактивированные вакцины.

Вид Salmonella может быть рационально аттенуирован путем введения в геном определенных нереверсивных мутаций для того, чтобы получить штаммы живой вакцины. Идентифицированы некоторые гены, которые при мутировании аттенуируют Salmonellae. В частности, штаммы сальмонеллы, несущие нереверсивные мутации в генах, вовлеченных в метаболический путь биосинтеза предшественников хоризматов, создают прекрасные пероральные вакцины, вызывающие сильные гуморальные, местные и клеточные иммунные реакции в организме-хозяине (Chatfield S.N. et al., Vaccine, 1989, 7(6): 495-8; Chatfield S.N. et al., FEMS immunol. Med. Microbiol., 1993, 7(1): 1-7), это касается и генов aro метаболического пути биосинтеза ароматических соединений (ЕР-В1-0322237) и мутантов регулятора транскрипции RfaH бактерий Salmonella Typhimurium, которые выгодны в качестве аттенуированных пероральных вакцин против сальмонеллеза у мышей (Nagy G. et al., Infect. Immun., 2006, 74(10): 5914-25).

Бактерии Salmonella можно аттенуировать с помощью модификации структуры генома бактерий, например путем делеции части гена Salmonella, путем вставки гетерологичной нуклеотидной последовательности в ген Salmonella и/или путем замены части гена Salmonella на гетерологичную нуклеотидную последовательность. Возможно аттенуировать Salmonella путем введения мутаций, которые (i) обеспечивают ауксотрофность, (ii) затрагивают метаболизм сахаров и биосинтез липополисахаридов или (iii) воздействуют на некоторые общие способы устройства регуляторных генов, необходимых для полного проявления вирулентности.

Например, аттенуированные бактерии Salmonella могут быть бактериями, включающими для аттенуации, по меньшей мере, одну дрейф-мутацию метаболизма устойчивости к стрептомицину или рифампицину (ЕР-В1-0642796), такими как аттенуированный штамм Salmonella Enteritidis Sm 24/Rif 12/Ssq (ЕР-В1-0642796), штамм Salmonella Enteritidis, аттенуированный с помощью первой мутации в регуляторном участке гена phoP, вызывающего конститутивную экспрессию гена под контролем указанного участка, и второй мутации в гене pag или prg (ЕР-В1-0563311); штамм Salmonella Enteritidis, аттенуированный с помощью нереверсивной мутации в гене htrA (US-A-5.804.194); аттенуированный штамм Salmonella, который демонстрирует ауксотрофность в отношении одного или нескольких факторов роста, выбираемых из группы, состоящей из фенилаланина, тирозина, триптофана и парааминобензойной кислоты, так что он не способен расти на минимальной среде в отсутствие указанного одного или нескольких факторов роста (US-A-6,231,871), как, например, штамм Salmonella Typhimurium STM-1, депонированный в Австралийские правительственные аналитические лаборатории под кодом доступа N93/43266 (US-A-6,231,871); ауксотрофные мутанты Salmonella Enteritidis, полученные путем N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидинового мутагенеза, такие как штамм Е 3/49, штамм 1/37, штамм С7/1, штамм С7/2, штамм С7/18, штамм С7/19, штамм Е1/23, штамм Е1/25, штамм Е2/7, штамм Е3/44 и штамм Е3/51 (Martin G. et al., Berl. Münch. Tierärztl. Wschr., 1996, 109(10): 325-9); аттенуированный штамм Salmonella Typhimurium, несущий нереверсивную мутацию в каждом из двух дискретных генов aro метаболического пути биосинтеза ароматических соединений, таких как aroA и aroC, aroA и aroD, aroA и aroE (EP-B1-0322237); аттенуированный штамм Salmonella Enteritidis, генетически определенное производное гена aroC (штамм LVR02, смотри Betancor L. et al., Vet. Microbiol., 2005, 107(1-2): 81-9); и аттенуированный штамм Salmonella Typhimurium, имеющий мутацию, которая инактивирует ген, выбираемый из: hupA, dksA, rfaY, sipC или clpB (WO-A1-98/02523).

Аттенуирующие мутации также можно получать путем вставки транспозона. Например, транспозон в мутанте EZ870 вводят в нуклеотидную последовательность Salmonella Enteritidis, которая гомологична (98,4% идентичных пар оснований в перекрывающейся области 188 п.о.) гену spiC Salmonella Typhimurium (код доступа U51927, Ochman Н., Soncini F.C. Solomon F. and Groisman E.A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 7800-7804, 1996). Генетически модифицированный штамм Salmonella enteritidis EZ870 имеет номер депонирования LMGP-18484 в Коллекции культур BCCM/LMG Laboratorium voor Microbiologie, Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Belgium (WO-A-99/37759).

Инактивированная иммуногенная композиция или вакцина, применяемая при бустерном введении, в соответствии со способами настоящего изобретения включает фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду и, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella. Инактивированную Salmonella можно выбирать из группы, состоящей из Salmonella Е-группы, Salmonella D-группы, Salmonella С-группы и Salmonella В-группы, предпочтительно из группы, состоящей из Salmonella E1-группы, Salmonella Е4-группы, Salmonella D-группы, Salmonella С1-группы, Salmonella С2-группы, Salmonella С3-группы и Salmonella В-группы, и более предпочтительно из El-группы, состоящей из Salmonella Anatum, из Е4-группы, состоящей из Salmonella Senftenberg, из D-группы, состоящей из Salmonella Enteritidis, Salmonella Panama, Salmonella Dublin, Salmonella Gallinarum, Salmonella Pullorum, из С1-группы, состоящей из Salmonella Infantis, Salmonella Mbandaka, Salmonella Livingstone, Salmonella Virchow, salmonella Ohio, salmonella Montevideo, Salmonella Tennessee, Salmonella Rissen, из С2-группы, состоящей из Salmonella Hadar, Salmonella Newport, Salmonella Kottbus, из C3-группы состоящей из Salmonella Kentucky, Salmonella Albany и из В-группы, состоящей из Salmonella Typhimurium, Salmonella Braenderup, Salmonella Agona, Salmonella Bredeney, Salmonella Heidelberg, Salmonella Indiana, Salmonella Saint-Paul, Salmonella Brandenburg.

В предпочтительном воплощении инактивированная иммуногенная композиция или вакцина, применяемая при бустерном введении, в соответствии со способами настоящего изобретения включает фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду и, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella В-группы и, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella D-группы. В другом предпочтительном воплощении инактивированная иммуногенная композиция или вакцина, применяемая при бустерном введении, в соответствии со способами настоящего изобретения включает фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду и, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella В-группы, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella С-группы и, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella D-группы. В наиболее предпочтительном воплощении инактивированная иммуногенная композиция или вакцина, применяемая при бустерном введении, в соответствии со способами настоящего изобретения включает фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду и инактивированную Salmonella Typhimurium и инактивированную Salmonella Enteritidis. В другом наиболее предпочтительном воплощении инактивированная иммуногенная композиция или вакцина, применяемая при бустерном введении, в соответствии со способами настоящего изобретения включает фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду и инактивированную Salmonella Typhimurium и инактивированную Salmonella Enteritidis и, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella С2-группы. В другом наиболее предпочтительном воплощении инактивированная иммуногенная композиция или вакцина, применяемая при бустерном введении, в соответствии со способами настоящего изобретения включает фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду и инактивированную Salmonella Typhimurium и инактивированную Salmonella Enteritidis и, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella C2-группы и, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella C1-группы.

Salmonella можно химически инактивировать путем обработки инактивирующими агентами, такими как формальдегид, этиленимин, производные этилениминамида (например, этиленимина), пропиленимин, Р-пропиолактон, тимеросал, ацетон или термоинактивация. В предпочтительном воплощении инактивирующий агент является формальдегидом.

В определенных аспектах предпочтительные способы применения иммуногенных композиций или вакцин на животных/птицах в соответствии с изобретением включают, по меньшей мере, одно первичное введение аттенуированной иммуногенной композиции или вакцины, включающей фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду и, по меньшей мере, одну аттенуированную Salmonella D-группы, которые вводят животному/птице перед, по меньшей мере, одним бустерным введением инактивированной иммуногенной композиции или вакцины, включающей фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella В-группы и, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella D-группы, с интервалом в несколько недель, например с интервалом от 2 недель до 18 недель. В специфическом воплощении такого предпочтительного способа аттенуированные бактерии Salmonella D-группы представляют собой Salmonella Enteritidis, инактивированные бактерии Salmonella В-группы представляют собой Salmonella Typhimurium и инактивированные бактерии Salmonella D-группы представляют собой Salmonella Enteritidis.

Другие предпочтительные способы применения иммуногенных композиций или вакцин на животных/птицах в соответствии с изобретением включают, по меньшей мере, одно первичное введение аттенуированной иммуногенной композиции или вакцины, включающей фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду и, по меньшей мере, одну аттенуированную Salmonella D-группы, которые вводят животному/птице перед, по меньшей мере, одним бустерным введением инактивированной иммуногенной композиции или вакцины, включающей фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella В-группы, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella С2-группы и, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella D-группы, с интервалом в несколько недель, в частности с интервалом от 2 недель до 18 недель. В специфическом воплощении этого предпочтительного способа аттенуированные бактерии Salmonella D-группы представляют собой Salmonella Enteritidis, инактивированные бактерии Salmonella В-группы представляют собой Salmonella Typhimurium, инактивированные бактерии Salmonella D-группы представляют собой Salmonella Enteritidis и инактивированные бактерии Salmonella С2-группы представляют собой Salmonella Hadar.

Другие предпочтительные способы применения иммуногенных композиций или вакцин на животных/птицах в соответствии с изобретением включают, по меньшей мере, одно первичное введение аттенуированной иммуногенной композиции или вакцины, включающей фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду и, по меньшей мере, одну аттенуированную Salmonella D-группы, которые вводят животному/птице перед, по меньшей мере, одним бустерным введением инактивированной иммуногенной композиции или вакцины, включающей фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella В-группы, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella С1-группы, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella С2-группы и, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella D-группы, с интервалом в несколько недель, например с интервалом от 2 недель до 18 недель. В специфическом воплощении этого предпочтительного способа аттенуированные бактерии Salmonella D-группы представляют собой Salmonella Enteritidis, инактивированные бактерии Salmonella В-группы представляют собой Salmonella Typhimurium, инактивированные бактерии Salmonella D-группы представляют собой Salmonella Enteritidis, инактивированные бактерии Salmonella С2-группы представляют собой Salmonella Hadar и инактивированные бактерии Salmonella С1-группы представляют собой Salmonella Virchow и/или Salmonella Infantis.

Другие предпочтительные способы применения иммуногенных композиций или вакцин на животных/птицах в соответствии с изобретением включают, по меньшей мере, одно первичное введение аттенуированной иммуногенной композиции или вакцины, включающей фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду и, по меньшей мере, одну аттенуированную Salmonella D-группы и, по меньшей мере, одну аттенуированную Salmonella В-группы, которые вводят животному/птице перед, по меньшей мере, одним бустерным введением инактивированной иммуногенной композиции или вакцины, включающей фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella В-группы и, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella D-группы, с интервалом в несколько недель, например с интервалом от 2 недель до 18 недель. В специфическом воплощении этого предпочтительного способа аттенуированные бактерии Salmonella D-группы представляют собой Salmonella Enteritidis, аттенуированные бактерии Salmonella В-группы представляют собой Salmonella Typhimurium, инактивированные бактерии Salmonella В-группы представляют собой Salmonella Typhimurium и инактивированные бактерии Salmonella D-группы представляют собой Salmonella Enteritidis.

Другие предпочтительные способы применения иммуногенных композиций или вакцин на животных/птицах в соответствии с изобретением включают, по меньшей мере, одно первичное введение аттенуированной иммуногенной композиции или вакцины, включающей фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду и, по меньшей мере, одну аттенуированную Salmonella D-группы и, по меньшей мере, одну аттенуированную Salmonella В-группы, которые вводят животному/птице перед, по меньшей мере, одним бустерным введением инактивированной иммуногенной композиции или вакцины, включающей фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella В-группы, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella С2-группы и, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella D-группы, с интервалом в несколько недель, в частности с интервалом от 2 недель до 18 недель. В специфическом воплощении этого предпочтительного способа аттенуированные бактерии Salmonella D-группы представляют собой Salmonella Enteritidis, аттенуированные бактерии Salmonella В-группы представляют собой Salmonella Typhimurium, инактивированные бактерии Salmonella В-группы представляют собой Salmonella Typhimurium, инактивированные бактерии Salmonella D-группы представляют собой Salmonella Enteritidis и инактивированные бактерии Salmonella С2-группы представляют собой Salmonella Hadar.

Другие предпочтительные способы применения иммуногенных композиций или вакцин на животных/птицах в соответствии с изобретением включают, по меньшей мере, одно первичное введение аттенуированной иммуногенной композиции или вакцины, включающей фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду и, по меньшей мере, одну аттенуированную Salmonella D-группы и, по меньшей мере, одну аттенуированную Salmonella В-группы, которые вводят животному/птице перед, по меньшей мере, одним бустерным введением инактивированной иммуногенной композиции или вакцины, включающей фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент, разбавитель или среду, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella В-группы, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella С1-группы, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella С2-группы и, по меньшей мере, одну инактивированную Salmonella D-группы, с интервалом в несколько недель, например с интервалом от 2 недель до 18 недель. В специфическом воплощении этого предпочтительного способа аттенуированные бактерии Salmonella D-группы представляют собой Salmonella Enteritidis, аттенуированные бактерии Salmonella В-группы представляют собой Salmonella Typhimurium, инактивированные бактерии Salmonella В-группы представляют собой Salmonella Typhimurium, инактивированные бактерии Salmonella D-группы представляют собой Salmonella Enteritidis, инактивированные бактерии Salmonella С2-группы представляют собой Salmonella Hadar и инактивированные бактерии Salmonella С1-группы представляют собой Salmonella Virchow и/или Salmonella Infantis.

К бактериальной суспензии можно добавлять вспомогательное средство (средства), в частности к бактериальной суспензии, полученной после культивирования и инактивации. Вспомогательное средство можно выбирать из гидроокиси алюминия, сапонина, любой эмульсии вода-в-масле или эмульсии масло-в-воде, которые совместимы с тканями птиц (смотри, например, Herbert W.J., The Lancet, 1965, October 16: 771; Brugh M. et al., Am. J. Vet. Res., 1983, 44(1): 72-5; Boersma W.J.A. et al., 44^th Forum in Immunology, «Characteristics and use of new-generation adjuvants», 503-511; Gast et al., Avian Diseases, 1993, 37 (4): 1085-91; Stone, Avian Diseases, 1993, 37: 399-405; Stone et al., Avian Diseases, 1990, 34: 979-983; Stone et al., Avian Diseases, 1983, 27(3): 688-697; US-A-3.919.411; WO-A-05/009462, все работы включены сюда путем отсылки).

Примеры вспомогательных средств включают, но не ограничены только ими, эмульсии масло-в-воде, вода-в-масле-в-воде на основе минерального масла и/или растительного масла и неионных поверхностно-активных соединений, таких как блок-сополимеры, Tween®, Span®. Такие эмульсии, в частности, представляют собой эмульсии, описанные на странице 147 в книге «Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach», Pharmaceutical Biotechnology, 1995, volume 6, edited by Michael F. Powell and Mark J. Newman, Plenum Press, New York and London, или TS-эмульсии, в частности TS6-эмульсия, и LF-эмульсии, в частности LF2-эмульсия (относительно и TS-, и LF-эмульсий смотри WO-A-04/024027). Другие подходящие вспомогательные средства представляют собой, например, витамин Е, сапонины и полимеры сшитой акриловой или метакриловой кислоты, например Carbopol® (Noveon; смотри WO-A-99/51269; WO-A-99/44633), Havlogen®, гидроокись алюминия или алюминия фосфат («Vaccine Design, The subunit and adjuvant approach», Pharmaceutical Biotechnology, vol. 6, Edited by Michael F. Powell and Mark J. Newman, 1995, Plenum Press New York), биологические вспомогательные средства (например, C4b, в частности мышиный C4b (Ogata R Т et al., J.Biol. Chem. 1989, 264(28): 16565-16572) или лошадиный C4b, GM-CSF, в частности лошадиный GM-CSF (US-A-6,645,740)), токсины (например, холерные токсины СТА или СТВ, термолабильные токсины Escherichia coli LTA или LTB (Olsen С W et al., Vaccine, 1997, 15(10): 1149-1156; Fingerut E et al., Vaccine, 2005, 23(38): 4685-4696; Zurbriggen R et al., Expert Rev Vaccines, 2003, 2(2): 295-304; Peppoloni S et al., Expert Rev Vaccines, 2003, 2(2): 285-293)), и CpG (например, CpG #2395 (смотри Jurk M et al., Immunobiology 2004, 209(1-2): 141-154), CpG #2142 (смотри SEQ. ID. NO: 890 в EP-B1-1,221,955), CpG #2135, CpG #2007, CpG #2336). Полимеры сшитой акриловой или метакриловой кислоты, в особенности сшитые с помощью простых полиалкениловых эфиров сахаров или полиспиртов, известны под названием карбомер (Pharmeuropa, vol.8, no.2, June 1996). Специалист в этой области техники также может обратиться к патенту США U.S. Patent No.2,909,462, который предоставляет такие акриловые полимеры, сшитые с помощью полигидроксильного соединения, имеющего в своем составе, по меньшей мере, три гидроксильные группы, предпочтительно не более чем восемь таких групп, атомы водорода, по меньшей мере, трех гидроксильных групп заменены ненасыщенными алифатическими радикалами, имеющими в своем составе, по меньшей мере, два атома углерода. Предпочтительные радикалы также содержат от 2 до 4 атомов углерода, например это винилы, аллилы и другие этиленовые ненасыщенные группы. Ненасыщенные радикалы могут также содержать другие заместители, такие как метил. Особенно подходят продукты торговой марки Carbopol® (Noveon). Они сшиты с помощью аллилсахарозы или с помощью аллилпентаэритритола. Среди них можно сослаться на Carbopol 974P, 934Р, 934, 940 и 971Р.

Иммуногенные композиции и вакцины в соответствии с изобретением могут быть лиофильно высушенными, преимущественно со стабилизатором. Лиофильное высушивание можно проводить в соответствии с хорошо известными стандартными методами лиофильного высушивания. Фармацевтически или ветеринарно-приемлемые стабилизаторы могут быть углеводами (например, сорбитом, маннитом, лактозой, сахарозой, глюкозой, декстраном, трегалозой), глутаматом натрия (Tsvetkov Т et al., Cryobiology 1983, 20(3); 318-23; Israeli E et al., Cryobiology 1993, 30(5): 519-23), белками, такими как пептон, альбумин, лактальбумин или казеин, веществами, содержащими белки, такими как обезжиренное молоко (Mills С К et al., Cryobiology 1988, 25(2): 148-52; Wolff E et al., Cryobiology 1990, 27(5): 569-75), и буферами (например, фосфатным буфером, фосфатным буфером щелочных металлов). Чтобы растворять лиофилизированные препараты можно использовать вспомогательное средство.

Примеры полезных масел включают, но не ограничиваются только ими, минеральное масло, такое как парафиновое масло, Drakeol® 6VR, Marcol® 80; Marcol® 52; терпеновые масла, такие как сквален и сквалан; растительные масла, такие как соевое масло, оливковое масло, кукурузное масло, масло жожоба, арахисовое масло, хлопковое масло, подсолнечное масло, сафроловое масло, кунжутное масло, абрикосовое масло, масло авокадо, масло зародышей пшеницы, масло канолы, льняное масло и миндальное масло; рыбий жир, такой как масло акулы, масло хорлостета, масло американской сельди и жир печени трески; животные масла, такие как норковое масло, лярдовое сало и куриный жир.

Примеры поверхностно-активных соединений, применяемых в эмульсионных вакцинах, включают Arlacel® 80 (сорбитана моноолеат), Tween® 80 (Polysorbate 80), Span® 80, Span® 85, Arlacel® 83 (сорбитана сесквиолеат), Arlacel® 85 (сорбитана сесквиолеат) и, например, Tween® 61 (полиоксиэтиленовый эфир сорбита). Поверхностно-активные соединения, пригодные для эмульсионных вакцин типа вода-в-масле (животном и растительном), включают, например, неочищенный желтый и очищенный пчелиный воск. Кроме того, поверхностно-активные соединения, пригодные для вакцин, содержащих сквален или сквалан, включают Arlacel® и Tween® 80.

Предпочтительно вспомогательное средство представляет собой масло для образования эмульсии вода-в-масле, включающее парафиновой масло и поверхностно-активные соединения, в частности парафиновое масло, сложный эфир полиспиртов и жирных кислот и сложный эфир этоксилированных полиспиртов и жирных кислот.

Животные/птицы, которые могут быть вакцинированы с помощью способа настоящего изобретения, включают цыплят, куриц, индюков, уток, утят, гусей, гусят, цесарок, фазанов, бентамок, перепелок, голубей.

Способы настоящего изобретения относятся, по меньшей мере, к одному первичному введению аттенуированной иммуногенной композиции или вакцины на основе Salmonella и, по меньшей мере, к одному бустерному введению иммуногенной композиции или вакцины на основе инактивированной Salmonella. Животное/птица однодневного возраста может быть вакцинировано с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением, это означает, что животному/птице однодневного возраста можно делать единственное или первое первичное введение. Предпочтительно единственное или первое первичное введение делают животным/птицам в возрасте от одного дня до примерно 28 дней и более предпочтительно в возрасте от одного дня до примерно 15 дней. Если проводят, по меньшей мере, два первичных введения, то эти первичные введения осуществляют предпочтительно с интервалом от 2 до 4 недель. Бустерное введение осуществляют спустя от 2 до 18 недель после единственного или первого первичного введения, предпочтительно спустя от 3 до 10 недель после единственного или первого первичного введения и более предпочтительно спустя от 3 до 6 недель после единственного или первого первичного введения. Если проводят, по меньшей мере, два бустерных введения, то эти бустерные введения осуществляют предпочтительно с интервалом от 2 до 12 недель.

В предпочтительном воплощении способы настоящего изобретения включают два первичных введения и два бустерных введения. Первичные введения осуществляют предпочтительно с интервалом от 2 до 4 недель. Первое бустерное введение проводят спустя от 6 до 10 недель после первичного введения и предпочтительно спустя от 8 до 10 недель после первого первичного введения. Второе бустерное введение проводят спустя от 14 до 18 недель после первого первичного введения и предпочтительно спустя от 15 до 16 недель после первого первичного введения.

В другом предпочтительном воплощении способы настоящего изобретения включают два первичных введения и одно бустерное введение. Первичные введения проводят предпочтительно с интервалом от 2 до 4 недель. Бустерное введение проводят спустя от 6 до 18 недель после первого первичного введения, и предпочтительно спустя от 6 до 16 недель после первого первичного введения, и более предпочтительно спустя от 11 до 16 недель после первого первичного введения.

В другом предпочтительном воплощении способы настоящего изобретения включают одно первичное введение и два бустерных введения. Первое бустерное введение проводят спустя от 2 до 10 недель после первичного введения и предпочтительно спустя от 3 до 6 недель после первичного введения. Второе бустерное введение проводят спустя от 12 до 18 недель после первичного введения и предпочтительно спустя от 14 до 16 недель после первичного введения.

В другом предпочтительном воплощении способы настоящего изобретения включают одно первичное введение и одно бустерное введение. Бустерное введение проводят спустя от 2 до 18 недель после первичного введения, и предпочтительно спустя от 3 до 10 недель после первичного введения, и более предпочтительно спустя от 3 до 6 недель после первичного введения.

Подходящие способы введения иммуногенных композиций или вакцин в соответствии со способами настоящего изобретения для первичного введения включают пероральные способы, например с помощью питьевой воды, или офтальмологические пути, например с помощью распыления.

Дозы аттенуированных иммуногенных композиций или вакцин для первичного введения в соответствии со способами настоящего изобретения включают примерно от 0,1 мл до примерно 2,0 мл, предпочтительно примерно от 0,2 мл до примерно 1,0 мл и более предпочтительно примерно от 0,4 мл до примерно 0,6 мл. Эти дозы содержат примерно от 10⁶ колониеобразующих единиц на дозу (КОЕ/дозу) до примерно 10¹⁰ КОЕ/дозу каждого штамма Salmonella и предпочтительно около 10⁸ КОЕ/дозу каждого штамма Salmonella. Если животному/птице вводят аттенуированную иммуногенную композицию или вакцину с питьевой водой, то эти дозы разбавляют примерно от 1 мл до примерно 5 мл питьевой воды на животное/птицу.

Подходящие пути введения иммуногенных композиций или вакцин в соответствии со способами настоящего изобретения для бустерного введения включают подкожные (SC) пути и внутримышечные (IM) пути. Иммуногенную композицию или вакцину в соответствии со способами настоящего изобретения можно вводить с помощью шприца с иглой или с помощью безыгольного приспособления (такого, например, как Pigjet, Avijet, Dermojet, Vitajet или Biojector (Bioject, Oregon, USA), смотри US-A-2006/0034867).

Дозы инактивированных иммуногенных композиций или вакцин для бустерного введения в соответствии со способами настоящего изобретения могут составлять примерно от 0,05 мл до примерно 2,0 мл, предпочтительно примерно от 0,1 мл до примерно 1,0 мл и более предпочтительно примерно от 0,2 мл до примерно 0,4 мл. Эти дозы содержат примерно от 10⁶ КОЕ/дозу перед инактивацией до примерно 10 ¹⁰ КОЕ/дозу перед инактивацией каждого штамма Salmonella и предпочтительно около 10⁸ КОЕ/дозу перед инактивацией каждого штамма Salmonella.

Другой аспект изобретения представляет собой набор для вакцинации животных/птиц в соответствии с настоящим изобретением. В одном воплощении набор включает, по меньшей мере, два флакона и листок-вкладыш с инструкциями по введению, первый флакон включает аттенуированную иммуногенную композицию или вакцину на основе Salmonella для первичного введения в соответствии со способами настоящего изобретения, а второй флакон включает иммуногенную композицию или вакцину на основе инактивированной Salmonella для бустерного введения в соответствии со способами настоящего изобретения. Необязательно, набор может включать флаконы, которые включают аттенуированную иммуногенную композицию или вакцину на основе Salmonella для многократного первичного введения, и/или флаконы, которые включают иммуногенную композицию или вакцину на основе инактивированной Salmonella для многократного бустерного введения.

В другом воплощении набор для вакцинации животных/птиц включает, по меньшей мере, два флакона и листок-вкладыш с инструкциями по введению, первый флакон, включающий аттенуированную иммуногенную композицию или вакцину на основе Salmonella D-группы, и второй флакон, включающий иммуногенную композицию или вакцину на основе инактивированной Salmonella В-группы и инактивированной Salmonella D-группы. Необязательно, набор может включать флаконы, которые включают аттенуированную иммуногенную композицию или вакцину на основе Salmonella D-группы для многократного первичного введения, и/или флаконы, которые включают иммуногенную композицию или вакцину на основе инактивированной Salmonella В-группы и инактивированной Salmonella D-группы для многократного бустерного введения.

Изобретение теперь будет детально описано с помощью приведенных ниже неограничивающих примеров.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Пример 1

Для получения аттенуированной вакцины использовали ауксотрофный по аденину/гистидину мутантный штамм Salmonella Enteritidis фаготип 4 (РТ4) с двойным маркером, полученный с помощью N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидинового мутагенеза. Этот штамм Salmonella был назван штаммом Е 3/49 (Martin G. et al., Berl. Münch. Tierärztl. Wschr., 1996, 109(10): 325-9).

Штамм Salmonella Е 3/49 культивировали в неаэрируемой питательной среде, содержащей дрожжевой экстракт, триптон, Na₂HPO₄×2Н₂О, MgSO₄×7Н₂О и воду для инъекции, рН 7,6±0,2, в течение 18-24 часов при 37°С±1°С. Культуры стабилизировали с помощью 10%-ного (об/об) глицерина, заполняли контейнеры аликвотами объемом 1,8 мл и хранили при - 80°С±5°С.

Ту же самую питательную среду с добавлением глюкозы использовали для культивирования бактериального штамма. Культуры были неаэрируемыми культурами в течение от 8 до 24 часов или культурами во встряхиваемых колбах в течение 8-16 часов при 37°С±1°С. Инокулят составлял 0,2-10 об.%.

Культуры хранили при температуре от +2°С до +8°С до 4 дней.

Полученные бактерии собирали и разводили забуференным физиологическим раствором в зависимости от количества организмов и 20%-ным (об/об) раствором сахарозы (максимальная концентрация 60%). Значение рН вакцины доводили до 7,0±0,5 с помощью NaOH или СН₃СООН.

Бактериальную суспензию затем лиофилизировали для хранения.

Лотки пошагово охлаждали до 0°С от дна по направлению вверх. Вакцину замораживали в лиофилизаторе при минимальной температуре -40°С в течение примерно 3-4 часов. После того как достигалось необходимое пониженное давление, начинали основной процесс сушки (температуру лотков контролировали при максимальном значении, составляющем +10°С), до тех пор пока не достигали температуры продукта, составляющей +5°С. Затем проводили вторичную сушку при максимальной температуре в лотке +35°С в течение максимально 12 часов.

После высушивания флаконы заполняли сухим стерильным азотом, автоматически запечатывали, чистили и хранили в холодной комнате.

В аттенуированной вакцине, полученной после растворения в 0,5 мл питьевой воды для введения животному/птице, титр аттенуированной Salmonella Enteritidis составлял 10⁸ колониеобразующих единиц (КОЕ) на дозу.

Пример 2

Для получения инактивированной вакцины использовали два различных штамма Salmonella: штамм Salmonella Enteritidis PT 4 и штамм Salmonella Typhimurium DT 104.

Каждый штамм Salmonella культивировали в триптиказном соевом питательном бульоне в 0,25%-ном мягком агаре (TSA).

Полученную бактерию собирали, разводили в воде для инъекции и замораживали при выбранной температуре -70°С в полиэтиленовых пакетах в присутствии криопротектора (20%-ного глицерина и 5%-ной сахарозы) для хранения.

Для инактивации штамма Salmonella Enteritidis PT 4, пакеты, содержащие штамм Salmonella Enteritidis PT 4, оттаивали и бактериальную суспензию переносили в стерильный сосуд. К бактериальной суспензии добавляли 35%-ный раствор инактивирующего агента формальдегида до концентрации 3,88% (объем раствора формальдегида/объем культуры). После составления смеси путем перемешивания суспензию переносили в другой стерильный сосуд. Инактивацию проводили при перемешивании в течение 24 часов при 24°С.

Для инактивации штамма Salmonella Typhimurium DT 104 проводили ту же самую процедуру, которая была описана для штамма Salmonella Enteritidis PT 4.

Инактивированную бактерию хранили при температуре +5°С +/-3°С до применения в композиции.

Инактивированную бактерию Salmonella Enteritidis PT 4 и инактивированную бактерию Salmonella Typhimurium DT 104 смешивали и составляли композицию с помощью эмульсионного вспомогательного средства вода-в-масле, включающего парафиновое масло, сложный эфир полиола и жирной кислоты и сложный эфир этоксилированного полиола и жирной кислоты.

В конечный продукт добавляли консервант (например, тимеросал) в конечной концентрации 100 мкг на мл.

В инактивированной вакцине титр штамма Salmonella Enteritidis PT 4 составлял 10^8,3 КОЕ/дозу до инактивации, а для штамма Salmonella Typhimurium DT 104 - 10⁸ КОЕ/дозу до инактивации.

Пример 3

В нулевой день исследования D0 случайным образом отбирали 30-дневных SPF (не содержащих специфических патогенов) цыплят, затем распределяли их на три группы, по 10 цыплят в каждой.

Группы обозначали следующим образом:

- G.00 = контрольная группа

- G.01 = аттенуированная вакцина примера 1 (возраст 1 день) + инактивированная вакцина примера 2 (возраст 21 день)

- G.02 = инактивированная вакцина примера 2 (возраст 21 день)

После идентификации каждую группу размещали в отдельные секции вплоть до 53-го дня D53.

В нулевой день D0 животных группы G.01 вакцинировали одной дозой (по меньшей мере, 10⁸ КОЕ) аттенуированной вакцины примера 1 объемом 0,5 мл с помощью перорального способа, доставляя вакцину непосредственно в ротовую полость.

На 21-й день (D21) животных группы G.01 и группы G.02 вакцинировали с помощью одной дозы инактивированной вакцины примера 2 с помощью внутримышечного способа в левый глубокий участок грудной мышцы в количестве 0,3 мл/дозу, титр Salmonella Enteritidis составлял 10^8,3 КОЕ на дозу перед инактивацией, титр Salmonella Typhimurium составлял 10⁸ КОЕ на дозу перед инактивацией.

Группу G.01 вакцинировали последней, чтобы не допустить перекрестного загрязнения аттенуированным вакцинным штаммом.

На 49-й день (D49) во всех группах непосредственно перед контрольным заражением отбирали кровь, затем собранную сыворотку крови тестировали на специфические антитела. Группы G.00, G.01 и G.02 анализировали с помощью теста IDEXX ELISA и с помощью теста Slow Agglutination Test (SAT).

За день до контрольного заражения (D48) при комнатной температуре оттаивали одну аликвоту Salmonella Heidelberg (Salmonella группы В), затем суспендировали в 100 мл триптоновой среды с соевым питательным бульоном фирмы Bio Mérieux (TSB) и инкубировали при 37°С в течение 14 часов.

Полученную бактериальную суспензию центрифугировали и осадок штамма засевали в свежую предварительно прогретую среду TSB и инкубировали при 37°С в течение оптимального времени роста (5 часов).

Как только титр растущей бактериальной культуры, оцениваемой с помощью оптического поглощения (измеряемого при 620 нм), становился достаточно высоким и составлял 10⁹ КОЕ/0,2 мл, ее использовали для инфицирования цыплят.

Серийные 10-кратные разведения инокулята в TSB засевали в триптиказо-соевый агар (TSA) и инкубировали 24 часа при 37°С для подсчета в 3 повторах.

На 49-й день (D49) все группы заражали бульонной культурой Salmonella Heidelberg с титром 10^8,9 КОЕ в 0,2 мл. Каждого цыпленка инфицировали пероральным способом.

Через четыре дня после инфицирования (D53) всех цыплят подвергали эвтаназии. В стерильных условиях собирали образцы селезенки и слепой кишки от каждого цыпленка и помещали их в предварительно помеченные отдельные пробирки. По окончании сбора образцы пробирок обрабатывали для повторного выделения Salmonella:

- каждую селезенку измельчали в шприце на 10 мл и разводили в 10 мл забуференного водного раствора пептона (BPW),

- 200 мкл из разведения помещали на чашку со средой XLT4 + ампицйллин (добавляя из расчета 50 мкг/мл) для счета (посевной материал распределяли по поверхности агара). Чашки инкубировали при 37°С в течение 48 часов.

Фаза предварительного обогащения (РЕ)

- все разбавленные селезенки затем инкубировали при 37°С в течение 16-20 часов,

- полной обработке в последующих фазах подвергали только селезенки, негативные при прямом определении.

Фаза обогащения (Е)

- инокуляция суспензии селезенок «РЕ» в соевый бульон Раппапорта-Вассилиадиса (RVS) в соотношении 1:100 (5 мкл в 500 мкл) и инкубация при 42°С в течение 24 часов.

Селективное выделение

- культивирование суспензии селезенок «Е» на среде XLT4 + ампициллин, затем инкубация при 37°С в течение 48 часов - объем посева 10 мкл. Типичная колония Salmonella была черной или имела черный центр; и если присутствовал такой тип колонии, то образец оценивали как позитивный.

Результаты выражали в ccu/орган.

Собранное содержимое слепой кишки (около 1 г) в асептических условиях помещали в стерильную пробирку, взвешивали и разводили 1:10 мас./об в среде BPW вплоть до 10е-7.

Разведения 10^-2, 10^-3, 10^-5 и 10^-7 инкубировали при 37°С в течение 16-20 часов (РЕ) и затем проводили фазу обогащения (Е) и селективного выделения так же, как для образцов селезенки.

Идентифицировали колонии Salmonella и отмечали позитивные чашки.

Результаты повторного выделения анализировали следующим образом:

для селезенки:

- негативные образцы после предварительного обогащения и обогащения оценивали как 0 ccu/орган,

- образцы, негативные при прямом культивировании, которые были позитивными после предварительного обогащения и обогащения, оценивали как 10 ccu/образец,

для содержимого слепой кишки:

- полуколичественный результат выражали в ccu/г содержимого органа с помощью метода разведения и позитивности (т.е. 50 мкл + 450 мкл вплоть до разведений

10^-2, 10^-3, 10^-5 и 10^-7 при положительном результате соответствовали 10^2,3, 10^3,3, 10^5,3 и 10 ^7,3 ccu Salmonella/г содержимого слепой кишки соответственно).

Данные по титрам специфических антител для всех иммунизированных и неиммунизированных цыплят через 4 недели после вакцинации суммированы в таблице 1.

Значения выражены с помощью средних геометрических титров (GMT) для анализа SAT и с помощью средних арифметических титров (АМТ) для результатов S/N и IP теста Salmonella Enteritidis ELISA.

Таблица 1
Группы	SAT-GMT	SALMONELLA ENTEMTIDIS ELISA-AMT
SALMONELLA TYPHIMURIUM	Соотношение S/N	Единицы IP
G.00	<10	0,72	28
G.01	197	0,37	63
G.02	171	0,41	59

Серологические результаты SAT и ELISA, полученные для невакцинированной группы, были постоянно отрицательными.

Что касается результатов SAT для Salmonella Typhimurium, то инактивированная вакцина сама по себе демонстрировала постоянную сероконверсию (171 единица SAT) с неожиданным синергическим эффектом (15,2%) аттенуированной вакцины на основе Salmonella Enteritidis на компонент Salmonella Typhimurium (197 единиц SAT).

Что касается результатов теста Salmonella Enteritidis ELISA в группах G.01 и G.02, то АМТ демонстрирует большее значение единиц IP (6,8%) для аттенуированной плюс инактивированной вакцины, чем для только инактивированной вакцины, 63 и 59 соответственно, с 10/10 положительными результатами на группу.

Таблица 2 суммирует результаты повторного выделения Salmonella Heidelberg из селезенок и содержимого слепых кишок через 4 дня после инфекции (выраженные в виде отношения положительные пробы/общее количество проб и log₁₀ ccu/селезенку или г).

Таблица 2
Группы	Селезенка	Содержимое слепой кишки
-/Tot.	+/Tot. d. p.	+/Tot a. е.	log10 ccu/ селезенку	-/Tot.	+/Tot. разведение а. е.	log10 ccu/ грамм
-2	-3	-5	-7
G.00	3/10	3/10	4/10	1.2	0/10	10/10	10/10	7/10	0/10	4,7
G.01	10/10	0/10	0/10	0.0	2/10	8/10	1/10	0/10	0/10	1,9
G.02	8/10	1/10	1/10	0.3	0/10	10/10	8/10	1/10	0/10	3,5
-: отрицательные пробы
+: положительные пробы
d.p.: прямое культивирование
а.е.: после обогащения

Как указано в таблице 2, через 4 дня после инфекции штамм для контрольного заражения Salmonella Heidelberg демонстрировал свою способность проникать и заселять внутренние органы контрольной группы с 0/10 отрицательными образцами и значительным счетом Salmonella, составляющим 10е1,2 ccu/орган и 10е4,7 ccu/г в селезенке и содержимом слепой кишки соответственно.

Относительно результатов для селезенки, наилучшая защита от заражения Salmonella Heidelberg была получена с помощью инактивированной вакцины, объединенной с аттенуированной вакциной (G.01) с =10^1,2 сси/селезенку по сравнению с контрольной группой. Значительные результаты были достигнуты в группе G:02 с помощью применения только инактивированной вакцины ( =10^0,9 сси/селезенку по сравнению с контрольной группой).

Относительно результатов для содержимого слепой кишки, инактивированная вакцина, объединенная с аттенуированной вакциной (G.01), демонстрировала очень хороший уровень защиты с =10^2,8 сси/селезенку по сравнению с контрольной группой. Инактивированная вакцина демонстрировала значительный уровень защиты содержимого слепой кишки с =10^1,2 по сравнению с контрольной группой.

Серологические результаты для группы G.01 показали синергический эффект инъекции аттенуированной вакцины в первый день жизни на сероконверсию инактивированной вакцины. Определяемый количественно прайминг-эффект составлял 6,8% для компонента Salmonella Enteritidis (63 единицы ELISA IP) и неожиданно 15,2% для компонента Salmonella Typhimurium (197 единиц SAT) no сравнению с применением только инактивированной вакцины.

Инактивированная вакцина вместе с аттенуированной вакциной демонстрировала полный защитный эффект в отношении селезенки и также против инвазии содержимого слепой кишки Salmonella Heidelberg по сравнению с инактивированной вакциной самой по себе с =10^1,2 сси/селезенку и =10^2,8 сси/грамм содержимого слепой кишки по сравнению с контрольными результатами. Среди групп существует отчетливое усиление защиты, индуцированное предварительной иммунизацией аттенуированной вакциной на основе Salmonella Enteritidis, относительно инактивированной вакцины Salmonella Enteritidis+Salmonella Typhimurium.

Пример 4

Проводили эксперимент, аналогичный эксперименту, описанному в примере 3, с тем лишь различием, что штаммом Salmonella для контрольного заражения была не Salmonella Heidelberg, a Salmonella Infantis.

Данные по титрам специфических антител для всех иммунизированных и неиммунизированных цыплят через 4 недели после вакцинации суммированы в таблице 3.

Значения выражены с помощью средних геометрических титров (GMT) для анализа SAT и с помощью средних арифметических титров (АМТ) для результатов S/N и IP теста Salmonella Enteritidis ELISA.

Таблица 3
Группы	SAT-GMT	SALMONELLA ENTERITIDIS ELISA-AMT
SALMONELLA TYPHIMURIUM	Соотношение S/N	Единицы IP
G.00	<10	1,27	00
G.01	184	0,40	60
G.02	139	0,44	56

Серологические результаты SAT и ELISA, полученные для невакцинированной группы, были постоянно отрицательными.

Что касается результатов SAT для Salmonella Typhimurium, то инактивированная вакцина сама по себе демонстрировала постоянную сероконверсию (139 единиц SAT) с неожиданным синергическим эффектом аттенуированной вакцины на основе Salmonella Enteritidis на компонент Salmonella Typhimurium (184 единиц SAT).

Что касается результатов теста Salmonella Enteritidis ELISA в группах G.01 и G.02, то АМТ демонстрирует большее значение единиц IP для аттенуированной плюс инактивированной вакцины, чем только для инактивированной вакцины, 60 и 56 соответственно, с 10/10 положительными результатами на группу.

Таблица 4 суммирует результаты повторного выделения Salmonella Infantis из селезенок и содержимого слепых кишок через 7 дней после инфекции (выраженные в виде отношения положительные пробы/общее количество проб и log₁₀ ccu/селезенку или г).

Как указано в таблице 4, через 7 дней после инфекции штамм для контрольного заражения Salmonella Infantis демонстрировал свою способность проникать и заселять внутренние органы контрольной группы с 0/10 отрицательными образцами и значительным счетом Salmonella, составляющим 10^2,3 ccu/орган и 10^6,1 ccu/г в селезенке и содержимом слепой кишки соответственно.

Относительно результатов для селезенки, хорошая защита от заражения Salmonella Infantis была получена с помощью инактивированной вакцины, объединенной с аттенуированной вакциной (G.01) с =10^1,4 ccu/селезенку по сравнению с контрольной группой.

Относительно результатов для содержимого слепой кишки, инактивированная вакцина, объединенная с аттенуированной вакциной (G.01), демонстрировала очень хороший уровень защиты с =10^3,2 ccu/селезенку по сравнению с контрольной группой. Инактивированная вакцина демонстрировала значительный уровень защиты содержимого слепой кишки с =10^2,2 по сравнению с контрольной группой.

Серологические результаты для группы G.01 показали синергический эффект инъекции аттенуированной вакцины в первый день жизни на сероконверсию инактивированной вакцины. Определяемый количественно прайминг-эффект составлял 7% для компонента Salmonella Enteritidis (60 единиц ELISA IP) и 32% для компонента Salmonella Typhimurium (184 единицы SAT) по сравнению с применением только инактивированной вакцины.

Инактивированная вакцина вместе с аттенуированной вакциной демонстрировала более выраженный защитный эффект, главным образом, в отношении содержимого слепой кишки ( =10^3,2 ccu/грамм) и сходную защиту инактивированной вакциной самой по себе в отношении селезенки с =10^1,4 ccu/орган по сравнению с контрольными результатами.

Пример 5

Проводили эксперимент, аналогичный эксперименту, описанному в примере 3, с тем лишь различием, что штаммом Salmonella для контрольного заражения была не Salmonella Heidelberg, a Salmonella Virchow.

Данные по титрам специфических антител для всех иммунизированных и неиммунизированных цыплят через 4 недели после вакцинации суммированы в таблице 5.

Значения выражены с помощью средних геометрических титров (GMT) для анализа SAT и с помощью средних арифметических титров (АМТ) для результатов S/N и IP теста Salmonella Enteritidis ELISA.

Таблица 5
Группы	SAT-GMT	SALMONELLA ENTERITIDIS ELISA-АМТ
SALMONELLA TYPHIMURIUM	Соотношение S/N	Единицы IP
G.00	<10	1,07	00
G.01	160	0,44	56
G.02	149	0,50	50

Серологические результаты SAT и ELISA, полученные для невакцинированной группы, были постоянно отрицательными.

Что касается результатов SAT для Salmonella Typhimurium, то инактивированная вакцина сама по себе демонстрировала постоянную сероконверсию (149 единиц SAT) с неожиданным синергическим эффектом аттенуированной вакцины на основе Salmonella Enteritidis на компонент Salmonella Typhimurium (160 единиц SAT).

Что касается результатов теста Salmonella Enteritidis ELISA в группах G.01 и G.02, то АМТ демонстрирует большее значение единиц IP для аттенуированной плюс инактивированной вакцины, чем только для инактивированной вакцины, 56 и 50 соответственно, с 10/10 положительными результатами на группу.

Таблица 6 суммирует результаты повторного выделения Salmonella Virchow из селезенок и содержимого слепых кишок через 4 дня после инфекции (выраженные в виде отношения положительные пробы/общее количество проб и log₁₀ ccu/селезенку или г).

Как указано в таблице 6, через 4 дня после инфекции штамм для контрольного заражения Salmonella Virchow демонстрировал свою способность проникать и заселять внутренние органы контрольной группы с 0/10 отрицательными образцами и значительным счетом Salmonella, составляющим 10^2,4 ccu/орган и 10^6,5 ccu/г в селезенке и содержимом слепой кишки соответственно.

Относительно результатов для селезенки, наилучшая защита от заражения Salmonella Virchow была получена с помощью инактивированной вакцины, объединенной с аттенуированной вакциной (G.01) с =10^2,3 ccu/селезенку по сравнению с контрольной группой. Хорошие результаты были достигнуты также в группе G:02 с помощью применения только инактивированной вакцины ( =10^1,8 ccu/селезенку по сравнению с контрольной группой).

Относительно результатов для содержимого слепой кишки, инактивированная вакцина, объединенная с аттенуированной вакциной (G.01), демонстрировала очень хороший уровень защиты с =10^2,0 ccu/селезенку по сравнению с контрольной группой. Инактивированная вакцина демонстрировала значительный уровень защиты содержимого слепой кишки с =10^1,0 по сравнению с контрольной группой.

Серологические результаты для группы G.01 показали синергический эффект инъекции аттенуированной вакцины в первый день жизни на сероконверсию инактивированной вакцины. Определяемый количественно прайминг-эффект составлял 12% для компонента Salmonella Enteritidis (56 единиц ELISA IP) и неожиданно 7,4% для компонента Salmonella Typhimurium (160 единиц SAT) no сравнению с применением только инактивированной вакцины.

Инактивированная вакцина вместе с аттенуированной вакциной демонстрировала более выраженный защитный эффект главным образом в отношении защиты селезенки, но также против инвазии содержимого слепой кишки Salmonella Virchow по сравнению с инактивированной вакциной самой по себе с =10^2,3 ccu/селезенку и =10^2,0 ccu/грамм содержимого слепой кишки по сравнению с контрольными результатами.

Пример 6

Проводили эксперимент, аналогичный эксперименту, описанному в примере 3, с тем лишь различием, что штаммом Salmonella для контрольного заражения была не Salmonella Heidelberg, a Salmonella Hadar. Конечное титрование инокулума для контрольного заражения составило 10⁹ КОЕ/0,2 мл.

Данные по титрам специфических антител для всех иммунизированных и неиммунизированных цыплят через 4 недели после вакцинации суммированы в таблице 7.

Значения выражены с помощью средних геометрических титров (GMT) для анализа SAT и с помощью средних арифметических титров (АМТ) для результатов S/N и IP теста Salmonella Enteritidis ELISA.

Таблица 7
Группы	SAT - GMT	SALMONELLA ENTERITIDIS ELISA-АМТ
SALMONELLA TYPHIMURIUM	Соотношение S/N	Единицы IP
G.00	<10	0,88	12
G.01	211	0,42	58
G.02	171	0,49	51

Серологические результаты SAT и ELISA, полученные для невакцинированной группы, были постоянно отрицательными.

Что касается результатов SAT для Salmonella Typhimurium, то инактивированная вакцина сама по себе демонстрировала постоянную сероконверсию (171 единица SAT) с неожиданным синергическим эффектом аттенуированной вакцины на основе Salmonella Enteritidis на компонент Salmonella Typhimurium (211 единиц SAT).

Что касается результатов теста Salmonella Enteritidis ELISA в группах G.01 и G.02, то АМТ демонстрирует большее значение единиц IP (6.8%) для аттенуированной плюс инактивированной вакцины, чем только для инактивированной вакцины, 58 и 51 соответственно, с 10/10 положительными результатами на группу.

Таблица 8 суммирует результаты повторного выделения Salmonella Hadar из селезенок и содержимого слепых кишок через 4 дня после инфекции (выраженные в виде отношения положительные пробы/общее количество проб и log₁₀ ccu/селезенку или г).

Как указано в таблице 8, через 4 дня после инфекции штамм для контрольного заражения Salmonella Hadar демонстрировал свою способность проникать и заселять внутренние органы контрольной группы с 2/10 и 0/10 отрицательными образцами и значительным счетом Salmonella, составляющим 10^1,3 ccu/орган и 10^5,1 ccu/г в селезенке и содержимом слепой кишки соответственно.

Что касается результатов для селезенки, то наилучшая защита от заражения Salmonella Hadar была получена с помощью инактивированной вакцины, объединенной с аттенуированной вакциной (G.01) с =10^0,9 ccu/селезенку по сравнению с контрольной группой. Незначительные результаты были достигнуты также в группе G:02 с помощью применения только инактивированной вакцины ( =10^0,2 ccu/селезенку по сравнению с контрольной группой).

Что касается результатов для содержимого слепой кишки, то инактивированная вакцина, объединенная с аттенуированной вакциной (G.01) или инактивированной вакцины (G.02), демонстрировала одинаковый уровень защиты с =10^0,8 ccu/селезенку по сравнению с контрольной группой.

Серологические результаты для группы G.01 показали синергический эффект инъекции аттенуированной вакцины в первый день жизни на сероконверсию инактивированной вакцины. Определяемый количественно прайминг-эффект составлял 14% для компонента Salmonella Enteritidis (58 единиц ELISA IP) и неожиданно 23% для компонента Salmonella Typhimurium (211 единиц SAT) no сравнению с применением только инактивированной вакцины.

Инактивированная вакцина вместе с аттенуированной вакциной демонстрировала более выраженный защитный эффект, главным образом, против инвазии содержимого слепой кишки Salmonella Hadar по сравнению с инактивированной вакциной самой по себе по сравнению с контрольными результатами.

Таблица 9 суммирует результаты примеров 3-6 относительно выделения Salmonella из селезенки инфицированных цыплят после контрольного заражения гетерологичным сероваром Salmonella.

Таблица 9
Количество образцов селезенки для выявления положительных проб/отрицательных проб после контрольного заражения для различных типов обработки
Обрабатываемые группы	Положительные селезенки	Отрицательные селезенки	Всего
Аттенуированная + инактивированная вакцина	10	30	40
Только инактивированная вакцина	18	22	40
Всего	28	52	80

Эти результаты показывают достоверную разницу с риском 6,5% в К2-тесте и достоверную разницу с односторонним риском 5% в точном тесте Фишера между группой, вакцинированной дважды в соответствии со способом настоящего изобретения (например, первый раз аттенуированной вакциной на основе Salmonella и второй раз инактивированной вакциной на основе Salmonella), и группой, вакцинированной только инактивированной вакциной на основе Salmonella.

Способ применения первичного введения аттенуированной вакцины на основе Salmonella Enteritidis (группа D) повышал эффективность бивалентной масляной инактивированной вакцины на основе Salmonella Enteritidis/Salmonella Typhimurium против контрольного заражения гетерологичным сероваром из группы В, а также из групп С1 и С2, которые не присутствовали в применяемых вакцинных составах. Это усиление в значительной степени продемонстрировано с помощью снижения инвазии селезенки после контрольного заражения гетерологичным сероваром Salmonella, путем сравнения с группой, вакцинированной дважды в соответствии со способом настоящего изобретения, и группой, вакцинированной только инактивированной вакциной на основе Salmonella.