клеточный продукт для аутологичных и аллогенных трансплантаций, полученный из пуповины человека, и способ его получения

Формула изобретения

1. Клеточный продукт для аутологичных и аллогенных трансплантаций, состоящий из мезенхимальных стволовых клеток, полученных из пуповины человека после родов на 38-40 неделе гестации, и среды для транспортировки, содержащей физиологический раствор, отличающийся тем, что среда для транспортировки включает также лекарственное средство в виде раствора, выбранное из следующего ряда: лекарственное средство на основе янтарной кислоты, или лекарственное средство, стимулирующее анаэробный гликолиз, или лекарственное средство, оказывающее протективное действие, при следующем соотношении, об.%:

лекарственное средство	20-80
физиологический раствор	остальное до 100,

при этом продукт содержит клетки в количестве от 0,1 до 5 млн клеток в 1 мл среды для транспортировки.

2. Клеточный продукт по п.1, отличающийся тем, что в качестве лекарственного средства на основе янтарной кислоты включает средство из ряда: цитофлавин, мексидол, реамберин.

3. Клеточный продукт по п.1, отличающийся тем, что в качестве лекарственного средства, стимулирующего анаэробный гликолиз, включает средство из ряда: актовегин, кортексин, церебролизин, солкосерил.

4. Клеточный продукт по п.1, отличающийся тем, что в качестве лекарственного средства, оказывающего протективное действие, включает средство из ряда: цитиколин, левокарнитин, милдронат, берлитион, рибофлавин, пиридоксин, фолиевую кислоту, натрия дезоксирибонуклеат, эпоэтин-альфа.

5. Способ получения клеточного продукта для аутологичных и аллогенных трансплантаций из пуповины человека, заключающийся в том, что выделенные из пуповины человека после родов на 38-40 неделе гестации и культивированные мезенхимальные стволовые клетки переводят в суспензию и помещают в среду для транспортировки, содержащую физиологический раствор, отличающийся тем, что используют среду для транспортировки, включающую также лекарственное средство в виде раствора, выбранного из следующего ряда: лекарственное средство на основе янтарной кислоты, или лекарственное средство, стимулирующее анаэробный гликолиз, или лекарственное средство, оказывающее протективное действие, при следующем их соотношении, об.%:

лекарственное средство	20-80
физиологический раствор	остальное до 100,

при этом готовый продукт содержит от 0,1 до 5 млн клеток в 1 мл среды для транспортировки.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что в качестве лекарственного средства на основе янтарной кислоты используют средство из ряда: цитофлавин, мексидол, реамберин.

7. Способ по п.5, отличающийся тем, что в качестве лекарственного средства, стимулирующего анаэробный гликолиз, используют средство из ряда: актовегин, кортексин, церебролизин, солкосерил.

8. Способ по п.5, отличающийся тем, что в качестве лекарственного средства, оказывающего протективное действие, используют средство из ряда: цитиколин, левокарнитин, милдронат, берлитион, рибофлавин, пиридоксин, фолиевую кислоту, натрия дезоксирибонуклеат, эпоэтин-альфа.

Описание изобретения к патенту

Группа изобретений относится к области медицины и может использоваться для получения клеточного материала, применяемого для аутологичных и аллогенных трансплантаций в широком спектре клинических технологий для лечений многих патологических состояний.

Современным шагом в направлении клеточной терапии являются исследования тканей пуповины, плаценты человека, которые рассматриваются в настоящее время в качестве одного из оптимальных источников стволовых клеток, обладающих высоким прогениторным потенциалом.

Пуповинная кровь, ткани пуповины и плаценты являются источником стволовых клеток для трансплантации при многих заболеваниях, в т.ч. таких тяжелых как заболевания крови, наследственные нарушения метаболизма, патологии центральной нервной системы и т.д., и могут использоваться для аллогенной и аутологичной трансплантации.

Стволовые клетки, в больших количествах присутствующие в пуповинной крови, тканях пуповины и плаценты, обладают высокой пролиферативной активностью, а также характеризуются наличием высокого титра маркера плюрипотентности и функциональной активности стволовых клеток, так называемых CD34+.

До настоящего времени продолжаются широкие эксперименты in vivo, подтверждающие высокую плюрипотентность, способность к дифференцировке и высокий уровень метаболизма стволовых клеток, полученных из плаценты, пуповинной крови и тканей пуповины.

ООО «Медицинские технологии» был разработан и защищен патентом (RU 2347579 С1, опуб. 27.02.2009) способ получения клеточной культуры для лечения заболеваний нервной системы, включающий выделение из пуповины новорожденного после нормальных родов культуры мезенхимальных стволовых клеток для парентерального введения их пациенту с неврологической патологией, культивацию их до формирования монослоя, а перед проведением клеточной терапии монослой переводят в суспензию путем обработки смесью раствора Версена и раствора трипсина, которую затем трижды промывают физиологическим раствором, затем суспензию осаждают центрифугированием, осадок клеток ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе, получая аллогенные мезенхимальные стволовые клетки пуповины человека в количестве от 0,5-5 млн. клеток в 5 мл физиологического раствора.

В том же патенте описана технология получения клеточных культур для лечения заболеваний нервной системы, полученных вышеуказанными способами и содержащие от 0,5 до 5 млн. клеток в 5 мл физиологического раствора.

Недостатком известных способов и полученных с их помощью клеточных материалов является то, что эффект от введения клеточных материалов начинает проявляться только через месяц, в лучшем случае после 2-х недель, а также малыми сроками хранения клеточного материала.

Задачей группы изобретений является улучшение потребительских свойств клеточного материала.

Техническим результатом группы изобретений является сокращение срока до наступления эффекта при лечении клеточным материалом при одновременном обеспечении большого срока хранения клеточного материала.

Технический результат достигается тем, что клеточный материал, состоящий из клеток, полученных из пуповины человека после родов на 38-40 неделе гестации, и среды для транспортировки, содержащей физиологический раствор, отличается от известного тем, что среда для транспортировки включает также лекарственное средство в виде раствора, выбранное из следующего ряда в зависимости от патологии, для лечения которой предназначен клеточный материал: лекарственное средство на основе янтарной кислоты, или лекарственное средство, стимулирующее анаэробный гликолиз, или лекарственное средство, оказывающее протективное действие, при следующем соотношении, об.%:

физиологический раствор	20-80
лекарственное средство	20-80,

при этом материал содержит клетки в количестве от 0, 1 до 5 млн. клеток в 1 мл среды для транспортировки.

Клеточный материал в качестве лекарственного средства на основе янтарной кислоты может включать средство из ряда: цитофлавин, мексидол, реамберин.

Клеточный материал в качестве лекарственного средства, стимулирующего анаэробный гликолиз, может включать средство из ряда: актовегин, кортексин, церебролизин, солкосерил.

Клеточный материал в качестве лекарственного средства, оказывающего протективное действие, может включать средство из ряда: цитиколин, левокарнитин, милдронат, берлитион, рибофлавин, пиридоксин, фолиевую кислоту, натрия дезоксирибонуклеат, эпоэтин-альфа.

Технический результат также достигается тем, что в способе получения клеточного материала из пуповины человека, заключающемся в том, что выделенные из пуповины человека после родов на 38-40 неделе гестации и культивированные клетки переводят в суспензию и помещают в среду для транспортировки, содержащую физиологический раствор, отличающийся тем, что используют среду для транспортировки, включающую также лекарственное средство в виде раствора, выбранного из следующего ряда в зависимости от патологии, для лечения которой предназначен клеточный материал: лекарственное средство на основе янтарной кислоты, или лекарственное средство, стимулирующее анаэробный гликолиз, или лекарственное средство, оказывающее протективное действие, при следующем их соотношении, об.%:

физиологический раствор	20-80
лекарственное средство	20-80,

при этом готовый материал содержит от 0,1 до 5 млн. клеток в 1 мл среды для транспортировки.

При этом в качестве лекарственного средства на основе янтарной кислоты могут использовать средство из ряда: цитофлавин, мексидол, реамберин.

Кроме того, в качестве лекарственного средства, стимулирующего анаэробный гликолиз, могут использовать средство из ряда: актовегин, кортексин, церебролизин, солкосерил.

Кроме того, в качестве лекарственного средства, оказывающего протективное действие, могут использовать средство из ряда: цитиколин, левокарнитин, милдронат, берлитион, рибофлавин, пиридоксин, фолиевую кислоту, натрия дезоксирибонуклеат, эпоэтин-альфа.

Сущность предложенных изобретений заключается в том, что выделенный и культивированный клеточный материал помещают в транспортировочную среду, содержащую наряду с физиологическим раствором одно из разрешенных к применению лекарственных средств из вышеуказанных групп в зависимости от патологии, для лечения которой предназначен клеточный материал. Используют готовое лекарственное средство в виде раствора для инъекций или для инфузий. При этом обеспечивается значительное сокращение срока наступления эффекта от лечения, а также большой срок хранения клеточного материала.

Ниже приведен пример осуществления предложенного способа приготовления клеточного материала из плаценты человека и его применения. Стадии выделения и культивирования клеточного материала осуществляются таким же образом, как в известном способе (RU 2347579).

1. Забор и транспортировка в лабораторию биоматериала.

Забор биоматериала должен осуществлялся сразу после родов на 38-40-ой неделе гестации в условиях стерильного родильного бокса с соблюдением всех правил антисептики.

Пуповину человека (биоматериал), не позднее, чем через 10 мин после перевязки и перерезания пуповины, помещали в стерильный герметичный контейнер, содержащий раствор Хенкса с добавлением пенициллина 100 мг/мл, стрептомицина 100 мг/мл, амфотерицина 100 мг/мл, который помещали в сумку-холодильник или термос со льдом.

Биоматериал транспортировали в лабораторию стерильно и при температурном режиме от +2-8°С.

2. Выделение и культивирование стволовых клеток из пуповины человека (далее - клеточный материал), включая технологию постоянного поддержания клеточной культуры.

Все манипуляции по выделению и культивированию мезенхимальных стволовых клеток из пуповины человека проводились стерильно в условиях специально оборудованного культурального бокса.

Пуповину нарезали на небольшие кусочки (но не менее 1×1 см).

Полученные кусочки ткани промывали раствором Хенкса. Для этого каждый кусочек помещали в отдельную изопропиленовую пробирку объемом 50 мл, заполненную 40 мл раствора Хенкса, и энергично встряхивали. Затем обрабатываемый образец переносили в новую пробирку с раствором Хенкса. Манипуляции проводили с каждым кусочком ткани троекратно.

Промытые кусочки ткани измельчали и инкубировали 2 ч при 37°С в 0,1% растворе коллагеназы I-го типа в чашках Петри диаметром 10 см из расчета 1 кусочек ткани: 1 чашка Петри: 8 мл раствора коллагеназы.

Полученную суспензию из каждой чашки Петри переносили в отдельную изопропиленовую пробирку объемом 15 мл и осаждали центрифугированием (5 мин 300 g).

Полученные осадки 5 ресуспендировали каждый в 10 мл ростовой среды: DMEM F12; 10% фетальная телячья сыворотка; 100 Ед. гентамицина; 2 мМ глютамина.

Содержимое каждой пробирки переносили в отдельный культуральный флакон площадью 75 см² и культивировали со сменой ростовой среды (состав см. выше) каждые 3 дня до достижения полученной первичной культурой клеток 80%-ной конфлюэнтности.

При достижении монослоем 80%-ной конфлюэнтности клетки переводили в суспензию с использованием раствора 0,25%-го трипсина с версеном (1:1) и рассевали в культуральные флаконы площадью 75 см² в соотношении 1:3.

Проводили иммунохимический анализ клеточного материала на содержание мезенхимальных клеток (цитофенотип CD45^-CD34^-CD90 ⁺CD105⁺) и тестирование процента жизнеспособных клеток.

3. Приготовление клеточного материала для перевозки и применения.

Отобранные образцы клеточных культур, не старше V пассажа, переводили в суспензию с использованием раствора 0,25%-го трипсина с версеном (1:1). Для этого ростовая среда удалялась, а монослой троекратно промывали раствором 0,25%-го трипсина с версеном, а затем инкубировали в нем при 37°С из расчета 3 мл раствора на культуральный флакон площадью 75 см².

Полученную суспензию переносили в изопропиленовую пробирку объемом 50 мл, после чего осуществляли подсчет количества клеток при помощи камеры Горяева.

Затем суспензию промывали физиологическим раствором. Для этого клетки осаждали центрифугированием (5 мин 300 g), а осадок ресуспендировали в физиологическом растворе. Манипуляцию повторяли три раза.

Полученный осадок клеток ресуспендировали в стерильной среде транспортировки, содержащей 50% физиологического раствора с глюкозой (об. 0,5%) и 50% лекарственного средства актовегин, выбранное с учетом патологии, для лечения которой предназначается клеточный материал, а именно возрастные изменения кожи лица второй степени. Физиологический раствор и актовегин брали в количестве по 1,5 мл.

Приготовление суспензий с другими лекарственными средствами осуществляли аналогичным образом.

Полученную суспензию переносили стерильно в вакуумную пробирку для забора крови (вакутейнер, «Beckman Dickenson», США).

Клеточный материал для перевозки и применения сопровождался паспортом клеточного материала, включающим в себя:

- общую информацию: время изготовления, срок хранения, описание внешнего вида, объем клеточного материала, условия хранения и маркировка образца;

- описание клеточного материала: жизнеспособность клеток (%),

стерильность, общая концентрация клеток (кл/мл).

4. Транспортировка и временное хранение клеточного материала.

А. Вакутейнер с готовым клеточным материалом помещали в термос со льдом и транспортировали к месту назначения.

Б. Транспортировку и хранение клеточного материала осуществляли стерильно и при температурном режиме +2-8°С.

В. В случае, если процедура применения клеточного материала происходила не сразу после его поступления к месту назначения, вакутейнер либо оставляли в термосе на льду, либо переносили в бытовой холодильник (но ни в коем случае не в морозильную камеру!).

Г. Срок годности клеточного материала для медицинского применения указывался в сопровождающем его Паспорте Клеточного материала.

Пример лечения пациентки П., 49 лет.

Все лечебные мероприятия проводились в процедурном кабинете.

Подготовку клеточного материала для введения осуществляли с соблюдением правил асептики и антисептики.

Непосредственно перед введением содержимое пробирки несколько раз встряхивали для равномерного распределения клеточного материала и переносили клеточный материал в шприц для проведения инъекций.

Перед проведением клеточной терапии очищение кожи осуществляли при помощи растворов, содержащих поверхностно-активные моющие вещества. Дезинфекцию кожи проводили в месте инъекции ватным диском, смоченным в 0,05% растворе хлоргексидина биглюконата. После этого раствор антисептика смывали стерильным физиологическим раствором, кожу и рану осушали стерильной салфеткой и зону обкалывания обкладывали стерильным материалом.

Введение клеточного материала осуществляли с помощью шприцов объемом 5,0 мл со специальными иглами для внутридермальных инъекций.

Клеточный материал вводили с помощью множественных внутрикожных инъекций (методикой мезотерапии) в кожу на глубину сосочкового слоя дермы (2 мм), при этом объем вводимого препарата должен составлять 0,02-0,05 мл на 1 точку введения. При введении использовали технику микропапул, так как при использовании этой методики создается необходимое депо препарата в тканях.

Техника микропапул. Клеточный материал вводили отдельными уколами с образованием папул. Инъекции проводили по всей поверхности обкалываемой зоны на расстоянии 8-10 мм друг от друга. 1-2 иньекции на 1 см ² кожи. Шприц и иглу располагали по касательной к коже, срез иглы был направлен вверх. Давление на поршень осуществляли большим пальцем рабочей руки.

Длительность курса: лечебный курс с использованием клеточного материала рассчитан на 2 процедуры с интервалом 1 месяц. Количество клеточного материала, вводимого за 1 сеанс, составляло от 1,0×10⁶ клеток до 5,0×10⁶ клеток и зависело от степени выраженности проблемы.

С целью поддержания достигнутого эффекта целесообразно проведение еще одной процедуры через 6 месяцев после проведения основного курса.

На второй день после проведения первой процедуры как по мнению пациентки, так и по данным инструментального обследования начал проявляться клинический эффект.

В таблице 1 приведены примеры составов клеточных материалов по предложенному изобретению, предназначенных для лечения различных патологий.

Таблица 1.
Вид патологии	Лекарственное средство	Объем клеток, млн.	Объем транспор-тировочной среды, мл	Состав транспортировочной среды, % лек. средства
1. Возрастные изменения 2-ой степени.	Актовегин	3	3	50%
2. Возрастные изменения 3-ей степени.	Солкосерил	5	3	80%
3. Возрастные изменения, веки.	Целебролизин	1	2	20%
4. Аллопеция.	Реамберин	2	5	50%
5. Очаговая аллопеция.	Реамберин	1	2	20%
6. Рубцы.	Мексидол	0,5	1	50%
7. Трофическая язва, до 1% тела.	Цитофлавин	3	5	50%
8. Ожоговая рана, до 1% тела.	Рибофлавин	3	3	50%
9. Ожоговая рана, до 3% тела.	Милдронат	5	5	80%
10. Пролежни, до 1% тела.	Берлитион	3	4	50%

Эффективность применения предложенного клеточного материала основывается на физиологическом стимулировании неоангиогенеза - роста новых молодых и неповрежденных сосудов, а также активации сверх физиологического уровня восстановительного и регенераторного потенциала собственных структур (клеток) организма пациента. Эффект начинает проявляться уже через 2-4 недели и далее плавно нарастает.

Применение клеточного материала в транспортировочной среде, содержащей физиологический раствор с глюкозой (об. 0,1%-20%) и одно из разрешенных лекарственных средств из приведенных групп, в зависимости от патологии позволяет существенно сократить срок до наступления эффекта (см. таблицу 2).

Таблица 2.
Вид лекарственного средства	Срок наступления эффекта
Клеточный материал в среде с лекарственным средством	Клеточный материал в физиологическом растворе
Актовегин (возрастные изменения 2-ой степени)	Со 2-го дня	С 14-го дня
Солкосерил (возрастные изменения 2-ой степени)	Со 2-го дня	С 14-го дня
Целебролизин (возрастные изменения 2-ой степени)	Со 2-го дня	С 14-го дня
Реамберин (трофическая язва до 1% тела)	Со 4-го дня	С 16-го дня
Мексидол (трофическая язва до 1% тела)	Со 4-го дня	С 16-го дня
Цитофлавин (трофическая язва до 1% тела)	Со 4-го дня	С 16-го дня
Рибофлавин (ожоговая рана, до 1% тела).	Со 2-го дня	С 6-го дня.
Берлитион (ожоговая рана, до 1% тела).	Со 2-го дня	С 6-го дня.
Милдронат (ожоговая рана, до 1% тела).	Со 2-го дня	С 6-го дня.

Предложенные способ и клеточный материал обеспечивают увеличение срока хранения клеточного материала (стандартный срок хранения 6 часов в транспортировочной среде - физиологический раствор). Аналогичный результат получен и для других лекарственных средств указанных групп: кортексин, цитиколин, левокарнитин, пиридоксин, фолиевая кислота, натрия дезоксирибонуклеат, эпотин-альфа.

Результаты тестирования выживаемости клеточного материала при использовании разных транспортировочных сред (точность шага 5%, норма не менее 80%) приведены в таблице 3.

Таблица 3.
Группы препаратов	Количество жизнеспособных клеток, %
6 ч	14 ч	24 ч	36 ч	48 ч
Физиологический раствор	85%	20%	0%	0%	0%
На основе янтарной кислоты:
- реамберин;	95%	90%	85%	75%	65%
- мексидол;	95%	90%	84%	74%	65%
- цитофлавин.	96%	91%	87%	76%	68%
Стимулирующие анаэробный гликолиз:
- актовегин;	98%	95%	90%	85%	70%
- церебролизин;	97%	94%	90%	83%	68%
- солкосерил.	98%	94%	90%	83%	68%
Оказывающих протективное действие:
- рибофлавин;	95%	95%	90%	80%	65%
- милдронат;	95%	95%	91%	80%	67%
- берлитион.	96%	95%	91%	82%	68%

Увеличение процента выживаемости клеток наблюдалось и для других лекарственных средств указанных групп: кортексин, цитиколин, левокарнитин, пиридоксин, фолиевая кислота, натрия дезоксирибонуклеат, эпотин-альфа.