способ скриннинговой оценки функционального состояния организма человека

Формула изобретения

Способ скриннинговой оценки функционального состояния организма человека, включающий сбор конденсата выдыхаемой влаги (экспирата), подготовку биосенсора - люминесцентных лифилизированных бактерий «Эколюм», добавление к 0,5 см³ биосенсора 0,5 см³ экспирата, 15-минутную экспозицию, измерение интенсивности люминесценции смеси суспензии бактерий и конденсата в течение 1000 с, фиксирование ее максимального уровня (Иоп, имп/с), сопоставление этого значения с аналогичным параметром Ик, имп/с, полученным при внесении в кювету биолюминометра вместо конденсата дистиллированной воды в равном объеме, установление коэффициента К как отношения Иоп/Ик, при значениях которого К=1 констатируют оптимальный окислительный статус, при К>1 - преобладание прооксидантных процессов (высокий уровень образования кислородных радикалов, недостаточный уровень защиты от их повреждающего действия), при К<1 - активные антиоксидантные процессы, достаточные резервы защитных механизмов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, точнее к профилактической медицине и лабораторной диагностике, и может быть использовано для оценки функционального состояния организма человека.

Целью изобретения является упрощение, большая производительность и экономичность способа оценки функционального состояния организма, позволяющего выявить отклонения, сопровождающиеся в его окислительном статусе. Преимущество и новизна разработанного способа состоят в переходе от измерения интенсивности индуцированной хемилюминесценции самой биопробы (экспирата) на биотест, базирующемся на установлении уровня биолюминесценции лифилизированных бактерий, обусловленной окислительным потенциалом исследуемого экспирата. Применение чувствительного бактериального сенсора для определения емкости окислительной системы организма при сохранении информативности способа позволяет в режиме скриннингового наблюдения оценить потенциальный риск развития окислительного стресса для целенаправленной коррекции, в том числе и на ранних стадиях.

Способ включает сбор конденсата выдыхаемой влаги (экспирата), подготовку биосенсора - люминесцентных лифилизированных бактерий «Эколюм», добавление к 0,5 см³ биосенсора 0,5 см³ экспирата, 15-минутную экспозицию, измерение интенсивности люминесценции смеси суспензии бактерий и конденсата в течение 1000 сек, фиксирование ее максимального уровня (Иоп, имп/сек), сопоставление этого значения с аналогичным параметром Ик, имп/сек, полученным при внесении в кювету биолюминометра вместо конденсата дистиллированной воды в равном объеме, установление коэффициента К как отношения Иоп/Ик, при значениях которого К=1 констатируют оптимальный окислительный статус, при К>1 - преобладание прооксидантных процессов (высокий уровень образования кислородных радикалов, недостаточный уровень защиты от их повреждающего действия), при К<1 - активные антиоксидантные процессы, достаточные резервы защитных механизмов.

Технический результат - скриннинговая характеристика функционального состояния организма при воздействии эндогенных и экзогенных неблагоприятных факторов.. Методический подход по использованию люминесцентных бактерий для выявления оксидантных свойств биосреды - экспирата применен впервые. Научный факт изменения люминесценции бактерий в ответ на введение экспирата также установлен впервые.

Известен «Способ оценки функционального состояния организма горнорабочих», включающий исследование неинвазивного биосубстрата - конденсата выдыхаемого воздуха путем измерения в нем интенсивности радикалообразования методом индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции и супероксидперехватывающей активности методом спектрофотометрии, основанным на ингибировании нитросинего тетразолиевого в системе генерации супероксидных анион-радикалов, нахождении соотношения измеренных показателей и оценке функционального состояния организма как преморбидного при возрастании полученного коэффициента в сравнении с нормой [1]. Недостатками способа являются высокая стоимость, сложность и длительность выполнения, обусловленные необходимостью проведения двух видов (биохимического и биофизического) исследования образца.

Существует способ неинвазивной диагностики функционального состояния организма горнорабочих Крайнего Севера [2], предусматривающий сбор конденсата выдыхаемой влаги, определение в нем интенсивности радикалообразования (ИР) по светосумме (S) сигнала люминолзависимой индуцированной хемилюминесценции нахождения коэффициента общей резистентности S/СПА с использованием эмпирической зависимости S/СПА от S и диагностики отклонений в функциональном состоянии организма при возрастании полученного коэффициента в сравнении с нормой, определенной как интервал 50-150%. Недостатком способа является необходимость базирования на эмпирических зависимостях, а также регистрации быстропротекающих процессов, что усложняет способ и снижает его точность.

Наиболее близким по технической сущности является «Способ оценки антиокислительного баланса организма человека» путем сбора конденсата выдыхаемого воздуха, последовательного внесения в кювету биолюминометра 1 мл фосфатного буфера (рН 7,3-7,4), 50 мкл 0,006%-ного раствора люминола (рН 7,3-7,4), 0,2 мл и 0,2 мл свежеприготовленного 10%-ного раствора перекиси водорода с последующим немедленным измерением показаний интенсивности свечения в течение 1-2 минут, графического построения зависимости интенсивности ХЛ от времени, определения из нее ряда показателей формирования в кривой индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции, а именно - максимальных величин спонтанной (Исп) и индуцированной (И) хемилюминесценции, времени достижения максимальной величины (Т1) и времени спада ее на половину (Т2), расчета парных соотношений А=И/Исп и Т-Т1/Т2, а также коэффициента К=Т/А, при значении которого, меньшего единицы, судят о нарушении антиокислительного баланса [3]. Недостатком способа является сложность, вызванная необходимостью фиксирования и получения графического изображения кривой формирования ХЛ - чрезвычайно быстропротекающего процесса и требующего в связи с этим либо наличия дорогостоящих приборов, либо дополнительных временных и трудовых затрат на построение кривых по данным наблюдений и установления большого числа необходимых параметров с использованием компьютерных программ.

Целью изобретения является упрощение способа и повышение его продуктивности.

Цель достигается базированием на впервые установленном факте проявления изменений биолюминесценции бактерий «Эколюм» при контакте с образцом экспирата и интерпретацией этих изменений для скриннинговой оценки окислительного баланса как одной из важнейших сторон функционального состояния организма.

Отличительные особенности способа состоят в том, что выполняются измерения люминесценции не самой биопробы (экспирата), а биосенсора, при этом устраняется необходимость исследования индуцированной хемилюминесценции, что значительно упрощает метод, одновременно повышая его точность, так как быстропротекающий процесс индуцированной хемилюминесценции всегда является искусственным приемом.

Способ позволяет установить состояние функциональных резервов организма для целенаправленного выбора мер профилактики и коррекции, формирования групп риска при обследовании различных контингентов взрослого и детского населения.

В сравнении со способом прототипа предлагаемый способ является более экономичным и доступным в исполнении. Способ сочетает альтернативный (бактериальный тест) и неинвазивный (экспират) методы, что делает его наиболее приемлемым для лабораторной практики.

Применение способа иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕРЫ ВЫПОЛНЕНИЯ СПОСОБА

Пример 1.

Пациент П., 60 лет. Наблюдался в клинике профессиональных заболеваний с диагнозом: подозрение на хронический бронхит.

Для оценки функционального состояния организма в процессе обследования у пациента в течение 20 минут при нефорсированном дыхании был собран экспират (конденсат выдыхаемой влаги). Пробу отбирали в модернизированный поглотитель Полежаева, помещенный в смесь льда с хлористым натрием для лучшей конденсации.

Подготовлена суспензия биосенсора «Эколюм» в соответствии с инструкцией [4].

В одну из кювет биолюминометра «Биотоке - 10 М» добавлено 0,5 мл биосенсора и 0,5 мл дистиллированной воды. После 15-минутной экспозиции произведен замер максимального значения интенсивности хемилюминесценции за период 1200 секунд (Ик), которое составило 2002 имп./сек. В другую кювету добавлено 0,5 мл биосенсора и 0,5 мл исследуемой биопробы. При аналогичных условиях измерения зафиксировано максимальное значение интенсивности Иоп=833 имп/сек.

Коэффициент К=0,41<1. Снижение величины интенсивности биолюминесценции бактерий свидетельствует о преобладании антиоксидантных процессов, связанных с высоким уровнем защитных резервов от повреждающего действия кислородных радикалов.

Одновременно было проведено исследование этой же биопробы по способу прототипа [3]. Для этого в кювету биолюминометра ПХЛ-01 последовательно было внесено: 1 мл фосфатного буфера (рН 7,3-7,4), 50 мкл 0,006%-ного раствора люминола (рН 7,3-7,4), 0,2 мл и 0,2 мл свежеприготовленного 10%-ного раствора перекиси водорода. Сразу после ввода перекиси водорода (инициатора перекисного окисления) проведен отсчет показаний интенсивности ХЛ в течение 2 минут, по полученным данным построена зависимость интенсивности ХЛ от времени. По этой зависимости определены параметры интенсивности спонтанной (Исп) и индуцированной ХЛ (И), время достижения максимальной интенсивности и время спада ее на половину (Т1 и Т2 соответственно), рассчитаны значения А=И/Исп и Т=Т1/Т2, а также коэффициент К=Т/А. При этом получены следующие данные:

Исп=1.0

И=3,53

Т1=2,5 сек

Т2=1,7 сек

А=3,53

Т=1,51

К=0,43

Значение критерия К=0,43 свидетельствует о преобладании процессов антирадикальной защиты, характерных для протекания хронических процессов.

Таким образом, выводы, сделанные по предлагаемому способу и по способу прототипа, сопоставимы. Однако предлагаемый способ более экономичен и прост в исполнении.

Пример 2.

Для проведения скриннинговой оценки функционального состояния организма рабочих металлургического комбината сформирована равновесная группа мужчин в возрасте 45-60 лет со стажем работы не менее 5 лет численностью 12 человек. По экспирату каждого обследуемого была проведена оценка окислительного статуса двумя способами - предлагаемым и по прототипу. Последовательность действий для каждого способа аналогична описанной в примере 1.

Результаты, полученные по предлагаемому способу путем измерения интенсивности биолюминесценции биосенсора показали, что у 5 из 12 обследованных (коэффициент К>1) возможно развитие окислительного стресса. В каждом случае результат исследования получали сразу после выполнения анализа. Этих рабочих рекомендовано включить в «группу риска» для проведения коррекции.

Результаты, полученные по способу прототипа, показали, что из общего числа обследованных у 3-х рабочих отмечен высокий уровень радикалообразования при достаточной емкости антиоксидантной защиты; у 2-х отмечен окислительный стресс, выражающийся в изменениях как со стороны высокого уровня радикалообразования, так и со стороны недостаточности антирадикальной защиты, то есть имеются показания для обязательной коррекции. Выявлены 3 случая снижения показателей, характеризующих степень антиоксидантной защиты, при отсутствии отклонений в интенсивности радикалообразования. Данные изменения также являются показанием для включения в «группу риска».

Таким образом, число включенных в «группу риска» аналогично оценке по предлагаемому способу. Однако дополнительно было необходимо исследование индуцированной хемилюминесценции, а также проведение детального анализа изменений в состоянии окислительного статуса, предусмотренного способом прототипа, что в совокупности ограничивает его применение в скриннинговых исследованиях.

Пример 3.

Пациент К, 62 года., загрузчик электролизной ванны (ГМК г.Норильска). Проживает и работает в Заполярье 22 года. Находился на лечении в клинике профессиональных заболеваний с диагнозом «хронический бронхит».

У данного пациента была проведена оценка функционального состояния при поступления и после назначенного курса лечения. Оценку проводили параллельно по предлагаемому способу и по способу прототипа. Сбор материала для анализа, подготовка и проведение - те же, что и в предыдущих примерах.

В результате были получены следующие данные.

По предлагаемому способу:

перед лечением: Иоп - 7926; Ик - 5825; К=1,36;

после лечения: Иоп - 3770; Ик - 5583; К=0,675.

Таким образом, если при поступлении у пациента можно было ожидать развития окислительного стресса, то по итогам проведенного лечения констатированы активизация системы антирадикальной защиты и повышение устойчивости организма к повреждающему действию радикалов, о чем свидетельствует снижение коэффициента К с 1,36 до 0,675. Результаты исследования по способу прототипа

До лечения	После лечения
Исп - 1.0	Исп - 1.0
И - 1,29	И - 0,88
Т1 - 1,25 сек	Т1 - 1,28 сек
Т2 - 1,5 сек	Т2 - 1,5 сек
А=1,29	А=0,88
Т=0,84	Т-0,85
К=0,65	К=0,96

Интерпретируя полученные данные, можно сделать вывод о том, что в результате лечения у пациента отмечено снижение уровня радикалообразования (индекс активации снизился с 1,29 до 0,88), емкость антиоксидантной защиты практически не изменилась (показатель Т остался на прежнем уровне), но в целом окислительный баланс оптимизировался (К=0,96).

Следовательно, исследования тем и другим способом доказали эффективность проведенного лечения в плане повышения уровня устойчивости организма к действию повреждающих факторов. Однако лабораторные исследования по предлагаемому способу менее трудоемки при сохранении информативности.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Описание изобретения к патенту SU 1811608 A3 «Способ оценки функционального состояния организма горнорабочих», опубликованному 23.04.93. Авторы: Юдина Т.В., Егорова М.В., Борисенкова Р.В., Луценко Л.А., Гальперин А.Ш., Ларькина М.В., Федорова Н.Е., Рушкевич О.П., Скрябин С.Ю.

2. Неинвазивная диагностика функционального состояния организма горнорабочих Крайнего Севера при воздействии комплекса производственных факторов, профилактические мероприятия. Методические рекомендации. - М., 1992. - 28 с.

3. Описание изобретения к патенту RU 2206891 С1 «Способ оценки антиокислительного баланса организма человека», опубликованному 16.10.01. Авторы: Юдина Т.В., Ракитский В.Н., Егорова М.В.

4. Прибор экологического контроля «Биотокс-10М». Руководство по эксплуатации.