поперечносшитая гиалуроновая кислота и способ ее изготовления

Формула изобретения

1. Способ получения поперечносшитой гиалуроновой кислоты, содержащий:

- активирование гиалуроновой кислоты с использованием сшивающего агента и вспомогательного сшивающего агента для получения активированной гиалуроновой кислоты;

- реакцию активированной гиалуроновой кислоты с нуклеофильным сшивающим агентом, содержащим, по меньшей мере, 50 мас.% олигопептида или полипептида, в среде реакции, отрегулированной до pH от 8 до 12, чтобы получить поперечносшитую гиалуроновую кислоту;

- регулирование pH среды реакции до значения от 5 до 7;

- осаждение поперечносшитой гиалуроновой кислоты в органическом растворителе для получения волокон поперечносшитой гиалуроновой кислоты.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сшивающий агент выбирают из: 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC), 1-этил-3-(3-триметиламинопропил)карбодиимида (ETC) и 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимида (CMC), а также их солей и смесей.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что вспомогательный сшивающий агент выбирают из: N-гидроксисукциимида (NHS), N-гидроксибензотриазола (HOBt), 3,4-дигидро-3-гидрокси-4-оксо-1,2,3-бензотриазола (HOOBt), 1-гидрокси-7-азабензотриазола (HAt) и N-гидроксисульфосукциимида (сульфо-NHS) и их смесей.

4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что молярное отношение сшивающего агента с звеньями карбоновых кислот гиалуроновой кислоты составляет от 5% до 100% включительно.

5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что молярное отношение вспомогательного сшивающего агента с сшивающим агентом составляет от 1:1 до 3:1 включительно.

6. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что реакцию активирования гиалуроновой кислоты сшивающим агентом проводят при pH от 3 до 6.

7. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что полипептидом является гомо- или сополимер лизина.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что гомополимером лизина является дилизин.

9. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что сшивающий агент используют в стехиометрическом количестве относительно функциональных аминогрупп сшивающего агента.

10. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что сшивающий агент используют в стехиометрическом количестве относительно функциональных карбоксильных групп гиалуроновой кислоты.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что количество сшивающего агента, используемого на втором этапе, меньше 30% по числу молей сшивающего агента относительно числа молей функциональных карбоксильных групп.

12. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что реакцию сшивания проводят при pH от 8 до 10.

13. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что pH осаждения составляет от 5 до 7.

14. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что органическим растворителем является этанол или изопропанол.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что способ дополнительно содержит сушку полученных волокон поперечносшитой гиалуроновой кислоты.

16. Поперечносшитая гиалуроновая кислота, полученная способом по п.1 или 2.

17. Гидрогель, отличающийся тем, что он содержит поперечносшитую гиалуроновую кислоту по п.16 в буферном водном растворителе.

18. Использование поперечносшитой гиалуроновой кислоты по п.16 для производства инъецируемых имплантатов для использования в эстетической и/или пластической хирургии или для производства наполнителей для заполнения морщин, мелких складок, шрамов или впадин на коже.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к новой поперечносшитой гиалуроновой кислоте, а также к способу ее изготовления и ее использованию, в частности, в косметических целях.

Гиалуроновая кислота является полисахаридом, состоящим из звеньев D-глюкуроновой кислоты и звеньев N-ацетил-D-глюкозамина, который, как известно, используется в пластической хирургии и глазной хирургии, а также в косметологии как продукт для заполнения морщин. В последнем виде применения, в частности, гиалуроновая кислота предпочтительна перед другими заполнителями из-за ее биосовместимости и физико-химических свойств. Однако она имеет недостаток в том, что она быстро разлагается, что требует повторных инъекций. Для устранения этого недостатка предлагались различные способы поперечного сшивания гиалуроновой кислоты, направленные на то, чтобы сделать ее менее чувствительной к различным факторам разложения, таким как ферментативные и/или бактериальные воздействия, температура и свободные радикалы, и, таким образом, на улучшение ее стойкости к разложению in vivo и, следовательно, на увеличение продолжительности ее действия. Эти способы включают, в частности, эстерификацию или амидирование гидроксила и/или кислотные функции натуральной гиалуроновой кислоты.

Известные способы поперечного сшивания гиалуроновой кислоты, в частности амидированием, однако имеют тот недостаток, что возникают производные гиалуроновой кислоты, которые трудно вводить в водную среду и/или которые недостаточно стойкие к факторам разложения, в частности после стерилизации продукта.

Это относится к нерастворимой в воде гиалуроновой кислоте, изготовленной согласно заявке США 2001/0393369 путем реакции в кислой среде гиалуроновой кислоты с активатором, таким как 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодимид (EDC) и нуклеофилом, которым может являться полилизин.

Фактически считается, что при pH ниже или равном 7 ожидаемая реакция амидирования завершается реакцией внутримолекулярной эстерификации, которая приводит к самостоятельному поперечному сшиванию первичного спирта гиалуроновой кислоты на активированном сложном эфире гиалуроновой кислоты. Такая паразитная реакция, в частности, выражается в значительном увеличении вязкости (загустевании) и помутнении смеси реакции, которая таким образом находится в форме гетерогенной смеси воды и нерастворимого полимера. Затем становится невозможным выделить полученную гиалуроновую кислоту.

Кроме того, в заявке EP-1535952 раскрыто покрытие, состоящее из поперечносшитой гиалуроновой кислоты, образованной in situ путем реакции полилизина с гиалуроновой кислотой в присутствии EDC и NHS при pH от 2 до 9, предпочтительно от 4 до 7,5. Изделие, снабженное таким покрытием, может, в частности, служить в качестве протеза в эстетической хирургии. Этот документ не раскрывает поперечносшитую гиалуроновую кислоту, осажденную в органическом растворителе, для того чтобы получить ее в сухом виде и сразу же изготовить в форме гидрогеля.

Также в патенте США № 6630457 описана модифицированная гиалуроновая кислота, изготовленная путем реакции первичного амина с гиалуроновой кислотой, активированной карбодиимидом, таким как EDC, и производным N-гидроксисульфосукциимида, таким как NHS, при pH от 7,0 до 8,5. Полученное соединение может быть поперечно сшито в физиологических условиях, например глютаральдегидом, для получения гидрогеля, который остается чувствительным к гликозидазам и практически полностью разлагается менее чем за 50 часов. Кинетика такого разложения совместима с рассматриваемым использованием как вектор для клеток и факторов роста, но не подходит для использования в качестве наполнителя, например, в эстетической хирургии.

В заключение, в заявке WO 2006/021644 описан способ изготовления поперечносшитой гиалуроновой кислоты путем активирования гиалуроновой кислоты сшивающим агентом, таким как EDC, и катализатором, таким как NHS, и последующей реакции с полипептидом, таким как дилизин, при pH от 4 до 10, предпочтительно от 4 до 6. Значение pH может быть по желанию повышено в конце реакции до значения от 6 до 7 для повышения выхода экстракции на этапе осаждения. Таким образом, поперечное сшивание осуществляется или в кислой среде, которая затем по желанию нейтрализуется, или в щелочной среде без последующей модификации pH.

Заявитель выявил, что использование кислого pH на этапе реакции не всегда благоприятно для реакции амидирования и может, как сказано выше, приводить к паразитным реакциям, в частности реакциям внутримолекулярной эстерификации, способным повлиять на физико-химические свойства полученного продукта.

Поэтому остается необходимость предложить поперечносшитую гиалуроновую кислоту, которая может быть получена в сухой форме и затем легко повторно получена в водной среде для образования гидрогеля с подходящими физико-химическими свойствами, выраженными, в частности, модулем упругости G и углом потерь дельта меньше 30, причем указанный гидрогель может быть подвергнут тепловой обработке, в частности стерилизации, для использования в производстве имплантата, достаточно стабильного по отношению к различным факторам разложения, таким как ферментативное и/или бактериальное воздействие, температура и свободные радикалы, для того чтобы не полностью ресорбироваться in vivo меньше чем за 4 месяца.

Заявитель абсолютно случайно обнаружил, что pH осаждения гиалуроновой кислоты, поперечносшитой с полипептидом, в органическом растворителе определяет ее реологические свойства и чувствительность к факторам разложения, таким как температура, свободные радикалы и ферменты, такие как гиалуронидазы. После многих экспериментов заявитель определил оптимальные условия осаждения для получения поперечносшитой гиалуроновой кислоты, относительно нечувствительной к тепловому разложению, т.е. сохраняющей свои реологические свойства после повторного растворения осажденного соединения и стерилизации. Происходит так, как если бы поперечносшитая гиалуроновая кислота, после повторного получения, сохраняла бы "память" о своей молекулярной организации на время осаждения. Более того, было продемонстрировано, что такое молекулярное расположение также влияет на способность полимера к повторному растворению.

Без необходимости привязки к теории, считается, что вышеуказанный процесс дает возможность сгущать и отверждать макромолекулярную сеть гиалуроновой кислоты не только посредством ковалентных связей со сшивающим агентом, но и посредством ионного взаимодействия и/или водородных связей, которые развиваются во время осаждения.

Целью настоящего изобретения поэтому является поперечносшитая гиалуроновая кислота, которая может быть получена способом, который включает:

- активирование гиалуроновой кислоты с использованием сшивающего агента и вспомогательного сшивающего агента для получения активированной гиалуроновой кислоты;

- реакцию активированной гиалуроновой кислоты со сшивающим агентом, содержащим, по меньшей мере, 50 мас.% олигопептида или полипептида, в среде реакции, отрегулированной до pH от 8 до 12, чтобы получить поперечносшитую гиалуроновую кислоту;

- регулирование pH среды реакции до значения от 5 до 7;

- осаждение поперечносшитой гиалуроновой кислоты в органическом растворителе для получения волокон поперечносшитой гиалуроновой кислоты и,

- по желанию, сушку полученных таким образом волокон поперечносшитой гиалуроновой кислоты.

Поперечносшитая гиалуроновая кислота, полученная согласно изобретению, является водорастворимой. Это выражение должно означать, что 1 г упомянутых дегидрированных волокон, полученных как сказано выше, распадается в течение нескольких минут и полностью растворяется в одном литре физраствора спустя несколько часов без перемешивания.

Гиалуроновую кислоту, используемую в данном способе, обычно используют в естественном состоянии, т.е. в состоянии, естественно присутствующем в живом организме или выделенном бактериями при производстве бактериальной ферментацией. Обычно она имеет молекулярную массу от 500000 до 7000000 Дальтона и обычно используется в форме натриевой соли.

Гиалуроновую кислоту активируют перед сшиванием, используя сшивающий агент и вспомогательный сшивающий агент.

Примерами сшивающих агентов являются растворимые в воде карбодиимиды, такие как 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC), 1-этил-3-(3-триметиламинопропил)карбодиимид (ETC) и 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимид (CMC), а также их соли и смеси. В настоящем изобретении предпочтительно используют EDC.

Примерами вспомогательных сшивающих агентов являются N-гидроксисукциимид (NHS), N-гидроксибензотриазол (HOBt), 3,4-дигидро-3-гидрокси-4-оксо-1,2,3-бензотриазол (HOOBt), 1-гидрокси-7-азабензотриазол (HAt) и N-гидроксисульфосукциимид (сульфо-NHS) и их смеси. Без ограничения по выбору NHS в настоящем изобретении предпочтительно используют последний.

Роль агента и вспомогательного сшивающего агента проиллюстрирована в Примере 1 ниже.

Согласно изобретению молярное отношение между сшивающим агентом и звеньями карбоновых кислот гиалуроновой кислоты предпочтительно составляет от 2% до 200%, более предпочтительно от 5% до 100%.

Кроме того, молярное отношение между вспомогательным сшивающим агентом и сшивающим агентом предпочтительно составляет от 1:1 до 3:1, более предпочтительно от 1,5:1 до 2,5:1 включительно и наиболее предпочтительно равно 2.

Реакция для активации гиалуроновой кислоты со сшивающим агентом может быть проведена при pH, например, от 3 до 6, предпочтительно от 4 до 5.

Концентрация гиалуроновой кислоты в среде реакции составляет, например, от 0,1 до 5 мас.%, например, от 0,1 до 1 мас.% включительно.

Сшивающий агент содержит, по меньшей мере, 50 мас.% и предпочтительно состоит из олигопептида или полипептида, который может быть неупорядоченным, блок-сополимером, сегментированным, привитым или звездообразным гомо- или сополипептидом. Сшивающим агентом обычно является соль, в частности гидрохлорид или, по желанию, гидробромид или особенно трифторацетат.

Примерами полипептидов, подходящих для использования в настоящем изобретении, являются гомо- и сополимеры лизина, гистидина и/или аргинина, в частности полилизины, имеющие, по меньшей мере, два или даже по меньшей мере пять звеньев лизина, такие как, например, дилизин, полигистидины и полиаргинины. Эти аминокислоты могут быть в форме D и/или L. Для использования в настоящем изобретении предпочтительны дилизин и его соли и производные.

Согласно изобретению количество функциональных аминогрупп полипептида составляет от 1% до 100%, предпочтительно от 10% до 50% от числа функциональных групп карбоновых кислот используемой гиалуроновой кислоты.

В первом предпочтительном варианте осуществления изобретения сшивающий агент используется в стехиометрическом количестве относительно функциональных аминогрупп сшивающего агента. Таким образом, в конце первого этапа способа согласно изобретению количество активированных функциональных групп карбоновых кислот гиалуроновой кислоты будет равно количеству функциональных аминогрупп, которые будут добавлены на втором этапе.

Во втором варианте осуществления изобретения сшивающий агент используется в стехиометрическом количестве относительно функциональных групп карбоновых кислот гиалуроновой кислоты. В этом случае в конце первого этапа способа согласно изобретению все функциональные группы карбоновых кислот гиалуроновой кислоты активируются, и количество сшивающего агента, используемого на втором этапе, может, например, быть меньше 30%, предпочтительно меньше 10% или даже приблизительно 5% (по числу молей сшивающего агента относительно числа молей функциональных групп карбоновых кислот).

Реакцию сшивания обычно проводят при температуре и с продолжительностью, которые полностью понятны специалисту, например при температуре 0-45°C, предпочтительно 5-25°C в течение 1-10 часов, предпочтительно 1-6 часов. Чтобы содействовать образованию амидных связей, pH реакции составляет от 8 до 12, предпочтительно от 8 до 10 (включительно). Это значение pH можно корректировать, используя любое основание, предпочтительно слабое нуклеофильное основание, например диизопропилетиламин (DIEA).

Эту реакцию обычно проводят в растворителе, например в водном растворе хлорида натрия.

Концентрация гиалуроновой кислоты в среде реакции составляет, например, от 0,01 до 5 мас.%, например, от 0,1 до 1 мас.% включительно.

После реакции pH среды реакции корректируется до значения от 5 до 7, предпочтительно от 5,5 до 7, используя любую кислоту, например соляную, до осаждения поперечносшитой гиалуроновой кислоты. Этап осаждения осуществляют в органическом растворителе, таком как этанол, изопропанол, простой эфир или ацетон или в их смеси, причем в настоящем изобретении предпочтителен этанол. Растворитель предпочтительно используют в количестве, превышающем объем среды реакции в 5-20 раз, например, приблизительно в 10 раз.

Затем по желанию проводят этап сушки для того, чтобы получить дегидрированную форму поперечносшитой гиалуроновой кислоты, с которой легче обращаться и которую можно хранить более удобно. Хранение может осуществляться в условиях отрицательных температур.

Предметом изобретения также является способ изготовления поперечносшитой гиалуроновой кислоты, который описан выше.

Этот способ также может содержать другие этапы, чем сказано выше, и, в частности, этап смешивания упомянутой дегидрированной поперечносшитой гиалуроновой кислоты с водным растворителем, например раствором хлорида натрия, физраствором или буферным раствором для инъекций (в частности, фосфатным буферным физраствором), для образования гидрогеля. Концентрация гиалуроновой кислоты в гидрогеле может составлять от 1 до 4 мас.% и предпочтительно от 1,5 до 3 мас.%/объем.

Поэтому целью изобретения также является такой гидрогель, содержащий поперечносшитую гиалуроновую кислоту, в водном растворителе.

Полученный таким образом гидрогель имеет после стерилизации, например при 118-130°C в течение 2-30 минут, согласно изобретению модуль упругости G' по меньшей мере 100, например в диапазоне от 200 до 600 Па включительно, и изменение модуля упругости меньше 30%, предпочтительно меньше 20%, после нагрева при 93°C в течение 1 часа. Предпочтительно он также имеет модуль вязкости G'' от 50 до 200 Па; угол потерь [=Inv tan(G''/G')] от 15 до 35° и вязкость от 1000 до 3000 Па·с. Измерение модуля упругости, модуля вязкости и угла потерь может быть осуществлено следующим образом: используют вискозиметр с конусом и пластинкой 4 см, 4°, при температуре 25°C. Гидрогель подвергают неразрушающему испытанию вязкости-упругости при 1 Гц, с приложенной деформацией 1%. Измерение модуля упругости проводят, используя реометр AR 1000 компании ТА Instruments. To же устройство можно использовать для измерения вязкости с использованием градиента сдвига 5×10 ^-2 c^-1.

Целью изобретения также является стерилизованный гидрогель, содержащий гиалуроновую кислоту, поперечносшитую сшивающим агентом, содержащим, по меньшей мере, 50 мас.% олигопептида или полипептида, отличающийся тем, что он имеет изменение в модуле упругости меньше 30% после нагрева при 93°C в течение 1 часа.

Этот гидрогель предпочтительно используют для производства имплантатов.

Такие имплантаты могут, в частности, быть введены подкожно или внутрикожно в волокнистую ткань.

Они могут содержать, в дополнение к вышеупомянутому гидрогелю, векторную жидкость, содержащую, по меньшей мере, один полисахарид, например, по меньшей мере, одно производное целлюлозы, такое как карбоксиметилцеллюлоза, и/или, по меньшей мере, один гликозаминогликан, такой как гиалуронат натрия, и/или частицы биосовместимого, биоресорбируемого материала, такого как полимолочная кислота (PLA), полигликолевая кислота (PGA), поли(молочная-со-гликолевая) кислота (PLGA), трикальцийфосфат (TCP) или гидроксиапатит (НАР) и их смеси.

Примеры таких материалов для имплантатов, содержащих их, описаны, в частности, в заявке WO 2004/069090.

Имплантаты согласно изобретению являются биоресорбируемыми в том смысле, что они способы распадаться в организме за 6-18 месяцев.

Они могут быть, в частности, использованы для:

- восполнения дефицита гиалуроновой кислоты в полости или органе (обычно в дерматологии, эстетической медицине или ортопедических операциях);

- восстановления объема, истекшего во время хирургических вмешательств (обычно в глазной хирургии) или

- нанесения сверху на нормальную или поврежденную дерму (обычно в косметологии и дерматологии).

Вышеупомянутый имплантат особенно подходит для использования в заполнении лицевых морщин и мелких складок и/или шрамов на теле человека.

Поэтому целью настоящего изобретения также является использование поперечносшитой гиалуроновой кислоты, которая описана выше, для производства инъецируемых имплантатов для использования в эстетической и/или пластической хирургии или для производства наполнителей, в частности продуктов для заполнения морщин, мелких складок, шрамов или впадин на коже, например, при липодистрофии.

Теперь изобретение будет проиллюстрировано следующими неограничительными примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Синтез гиалуроновой кислоты, поперечносшитой полипептидом согласно изобретению

1. Схема реакции

Следующая схема реакции может быть проиллюстрирована следующим образом (в качестве примера взят дилизин):

Реакция сшивания (схема 1) состоит из образования двойных пептидных связей между функциональными группами двух цепей гиалуроновой кислоты и функциональных аминогрупп дилизина. В качестве сшивающих реагентов используют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC) и N-гидроксисукциимид (NHS).

Механизм реакции сшивания может быть проиллюстрирован следующим образом:

Первый этап состоит из нуклеофильного воздействия функциональной группы карбоновой кислоты гиалуроновой кислоты на карбодиимидную функциональную группу сшивающего агента EDC. Получаемая O-ацилмочевина затем замещается NHS для образования более стабильного активированного сложного эфира (продукт 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)мочевины). Фактически 0-ацилмочевина может перегруппироваться в инертную N-ацилмочевину в слабо кислой водной среде и во время длительного времени реакции. Последний этап заключается в нуклеофильном воздействии одной из функциональных аминогрупп дилизина (предпочтительно конечной, пространство благоприятной) на активированный сложный эфир, чтобы образовать амидную связь с высвобождением NHS.

2. Протокол

1-й этап: этап набухания

3 г хлорида натрия последовательно добавляли к 300 мл воды milliQ в стеклянном реакторе объемом 500 мл. После растворения хлорида натрия в соникаторе 2 г гиалуроновой кислоты (HTL Sarl, партия № РН 1016, Mw=2.6×10⁶ Daltons, именуется ниже «НА») ввели в реактор, содержащий солевой раствор, тщательно и максимально возможно разделяя волокна вручную. После перемешивания гетерогенной среды шпателем в течение 1 минуты реактор оставили при температуре 4°C на 15 часов без перемешивания и закрыли алюминиевой фольгой для защиты среды реакции.

2-й этап: этап сшивания

Смесь реакции удалили из холодильника и перемешивали при окружающей температуре (18-25°C) в течение 10 минут (визуально раствор должен быть полностью прозрачным и однородным, немного вязким, как жидкий мед).

Перемешивание было механическим с использованием тефлоновой мешалки в форме полумесяца. Частота вращения составляла 60 об/мин.

Далее раствор 464 мг (4,03 ммоль) N-гидроксисукциимида (ACROS, чистота 98%, именуется ниже «NHS») в 5 мл воды milliQ приготовили в пробирке для гемолиза и встряхивали круговыми движениями для растворения всего NHS. Этот раствор добавляли капельно к среде реакции со скоростью 5 мл/мин.

Эту смесь оставили перемешиваться на 5 минут, затем 313 мг (2,02 ммоль) раствора N-(3-диметиламинопропил)-N-этилкарбодиимидгидрохлорида (компания Sigma-Aldrich, № 03450-5G, именуется ниже «EDC») добавили в 4 мл воды milliQ. Растворение проводили путем встряхивания круговыми движениями и затем добавляли капельно со скоростью 5 мл/мин.

Смесь оставили перемешиваться на 30 минут и затем водный раствор дилизина добавляли к среде реакции со скоростью 1 мл/мин. Этот раствор готовили путем растворения в 1 мл воды milliQ, при встряхивании круговыми движениями, 233 мг (0,67 ммоль) гидрохлорида дилизина (поставщик ВАСНЕМ, № G2675) и затем 1302 мкл (10,08 ммоль) диизопропилэтиламина (поставщик ACROS № 115225000, именуется ниже «DIEA»), все в пробирке для гемодиализа. Эта смесь представляет две различные фазы, формирующие обратимую эмульсию после интенсивного перемешивания. Была сделана попытка смешать максимально возможное количество эмульсии при добавлении ее к среде реакции. Значение pH среды реакции должно составлять от 8,5 до 10,5.

Все оставили перемешиваться на 3 часа.

3-й этап: этап очистки

После остановки перемешивания pH раствора корректировали до осаждения с помощью 1M HCl для снижения pH до 5,7.

Затем готовили реактор объемом 1 л с механической мешалкой и перемешивающим стержнем в форме гребня. 420 мл 95° этанола залили в реактор и включили механическое перемешивание на очень высокой скорости (приблизительно 1000 об/мин).

42 мл смеси реакции, содержащей поперечносшитый гиалуронат, затем отобрали с использованием шприца емкостью 50 мл и затем вводили непрерывно как тонкий слой в реактор. Раствор должен быть прозрачным, бесцветным и вполне вязким.

Сразу же после завершения введения перемешивание продолжили еще в течение двух минут. Затем перемешивающий стержень удалили из реактора и полученный полимер разложили на фритте с пористостью II, используя пару пинцетов. Полимер быстро высох в вакуумной колбе максимум за 15 секунд и был оставлен досыхать в сушильном шкафу под вакуумом на срок не меньше 12 часов. Конечный продукт должен быть абсолютно белым.

4-й этап: этап повторного изготовления

Для изготовления 10 мл геля с концентрацией 2,4%, 240 мг высушенного поперечносшитого полимера ввели в стандартный полипропиленовый шприц с колпачком (на выходном отверстии). Затем к твердому материалу добавили 10 мл буферного** раствора и все оставили набухать при 4°С на 12-15 часов.

После удаления шприца из холодильника продукт быстро перемешали с использованием механической мешалки на 1000 об/мин. В качестве перемешивающего стержня использовали лабораторную лопаточку из нержавеющей стали в форме ложки. Для этого продукта время перемешивания составило приблизительно 5 минут, но оно может изменяться в зависимости от вязкости. Конечный гель должен быть бесцветным и полностью однородным.

Пример 2: Проверка на разложение или стойкость

Принцип:

Проверки на ускоренное разложение, которые дают сведения о стойкости полимера к различным факторам разложения in vivo, проводит специалист (см., в частности, документ FR 2861734).

В этом примере провели одну такую проверку, которая заключалась в измерении реологических характеристик поперечносшитых, заранее стерилизованных продуктов, которые затем подвергали нагреву при 93°C в течение одного часа. Затем вычисляли потерю модуля упругости (G') в процентах после нагрева. Чем ниже этот процент, тем более стойкий продукт к воздействию тепла и тем, как считается, он более стоек к воздействию других факторов разложения. Поэтому такая проверка является прогнозом степени разложения in vivo поперечносшитой гиалуроновой кислоты и, следовательно, прогнозом продолжительности заполнения морщин, которой можно добиться.

Проверенные продукты:

Все проверенные продукты были стерильными.

Несколько имеющихся в продаже продуктов были проверены вместе с:

- Продуктом 1, которым была гиалуроновая кислота, полученная согласно Примеру 1, и

- Продуктом 2, которым была гиалуроновая кислота, полученная согласно Примеру 1 за тем исключением, что были использованы 45 мол.% EDC; 90 мол.% NHS и 15 мол.% дилизина относительно количества молей звеньев СООН гиалуроновой кислоты и отношение 2,22 DIEA/NHS.

Результаты:

В таблице 1 приведены результаты, полученные для различных проверенных поперечносшитых гиалуроновых кислот.

Таблица 1
Проверка на разложение поперечносшитой гиалуроновой кислоты
Стерильные образцы	Т0	Т1 после 1 часа при 93°С	% потери G'
Модуль упругости (G')	Угол потерь	Модуль упругости (G')	Угол потерь
PERLANE''	500	8,5	360	8,4	28%
JUVEDERM® 30HV®	63,5	22	43,5	25	31%
ESTHELIS Basic®	89	25	43	27	52%
Продукт 1	262	26	224	30	14%
Продукт 2	206	25	199	30	3%

Из этой таблицы следует, что модифицированные гиалуроновые кислоты согласно изобретению проявляют меньшее снижение модуля упругости, чем имеющиеся в продаже поперечносшитые гиалуроновые кислоты, что подтверждает их большую стойкость к факторам разложения.

Пример 3: Влияние pH осаждения

Сравнили физико-химические свойства поперечносшитых гиалуроновых кислот, синтезированных, в сущности, как сказано в Примере 1, и осажденных при разных значениях pH в этаноле. Параметры способов синтезирования таких соединений приведены в таблице 2.

Таблица 2
Параметры синтезирования поперечносшитых гиалуроновых кислот
Продукт	% EDC		% дилизина	Отношение DIEA/NHS	pH при осаждении
Продукт	40%	80%	13,33%	2,5	5,7
Продукт А	40%	80%	13,33%	2,5	9,0
Продукт В	40%	80%	13,33%	2,5	4,0
Продукт 3	100%	200%	5%	2,0	5,7
Продукт С	100%	200%	5%	2,0	4,0
Продукт 4	45%	90%	15%	2,22	5,20
Продукт D	45%	90%	15%	2,22	4,0
* относительно числа молей функциональных групп карбоновых кислот гиалуроновой кислоты.

Оценивали физико-химические свойства вышеуказанных продуктов после повторного изготовления, как сказано в Примере 1, до и после одного часа в инкубаторе при 90°C. Более конкретно, оценивали вязкость гидрогеля и измеряли его модуль упругости. Результаты представлены в таблице 3.

Использовали классы от 1 до 5, которые представляют суммарную оценку, учитывающую упругость и вязкость геля. Чем более упругим считался гель, тем выше оценка. И наоборот, неоднородный и/или жидкий гель получал низкую оценку.

Таблица 3
Физико-химические свойства поперечносшитых гиалуроновых кислот
Продукт	Внешний вид гидрогеля (Т0)	G' (Т0)	Внешний вид гидрогеля (Т60)	G' (Т60)	% потери G'
Продукт 1	Прозрачный, немного зернистый (Класс 5)	262	Прозрачный, упругий (Класс 5)	224	14%
Продукт А	Почти не вязкоупругий (Класс 2)	-	-	-	-
Продукт В	Прозрачный, вязкий (Класс 4)	-	Прозрачный (Класс 3)	-	-
Продукт 3	Очень прозрачный (Класс 5)	296	Очень прозрачный (Класс 5)	215	27%

Продукт C	Очень прозрачный (Класс 5)	-	Очень прозрачный (Класс 2)	-	-
Продукт 4	Прозрачный, немного зернистый (Класс 5)	206	Прозрачный, упругий (Класс 5)	199	%
Продукт D	Очень прозрачный, вязкоупругий (Класс 5)	-	Почти не вязкоупругий (Класс 2)	-	-

Из таблицы следует, что поперечносшитые гиалуроновые кислоты, осажденные при щелочном pH, хотя и могут быть легко повторно получены как гидрогели, не дают гидрогелей, подходящих для продукта, применяемого для заполнения морщин. Предполагается, что такое явление вызвано недостаточным развитием ионных связей во время осаждения.

Кроме того, поперечносшитые гиалуроновые кислоты, осажденные при чрезмерно кислом pH, дают гидрогели с хорошей вязкоупругостью (при условии, что они могут быть повторно изготовлены, что не всегда возможно), но которые явно разлагаются при помещении в инкубатор и поэтому будут чувствительны к эндогенным факторам разложения.

Фактически кажется, что только значения pH осаждения от 5 до 7 дают возможность легко получить однородный гидрогель с очень удовлетворительной вязкоупругостью, которая не снижается значительно после проверки на разложение. Это подтверждает, что в этом диапазоне pH макромолекулярная сеть, сформированная электростатическими и ковалентными связями, является оптимальной для применения в качестве наполнителя.