способ биологической оценки остеоиндуцирующего эффекта белков плазмы крови

Формула изобретения

Способ биологической оценки остеоиндуцирующего эффекта белков плазмы крови, включающий в себя получение модифицированной аутоплазмы из плазмы крови человека, отличающийся тем, что тестируют модифицированную аутоплазму на трех лабораторных животных, которым предварительно осуществляют перелом костей голени, затем через 48 ч внутрибрюшинно вводят модифицированную аутоплазму в объеме 0,02 мл, далее через 72 ч после введения модифицированной аутоплазмы у животных забирают кровь, в сыворотке которой проводят определение активности щелочной фосфатазы, затем оценивают результаты, при этом, если активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови как минимум двух животных увеличена относительно верхней границы нормы, характерной для выбранного вида животных, в 2 и более раза, то делают вывод о наличии остеоиндуцирующего эффекта тестируемых белков плазмы крови, если активность щелочной фосфатазы увеличивается в 2 и более раза, относительно верхней границы нормы, только у одного животного, то делают вывод об отсутствии остеоиндуцирующего эффекта тестируемых белков плазмы крови.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к травматологии и ортопедии, и может применяться для оценки остеоиндуцирующего эффекта белков аутоплазмы крови, вводимых пациентам в целях стимуляции костеобразования.

Известны способ диагностики эндогенной интоксикации организма, способ определения степени тяжести эндогенной интоксикации организма и способ определения этиологии эндогенной интоксикации организма, в которых для выявления эндогенной интоксикации организма исследуют сыворотку или плазму крови методом клиновидной дегидратации и при наличии особенностей из ряда: штриховых, параллельных, концентрических, многолучевых, закругленных и круглых трещин, трещин в виде черной сети, в виде рыбьей чешуи, морщин, линий Валнера и языков Арнольда диагностируют эндогенную интоксикацию. Для оценки степени тяжести эндогенной интоксикации организма определяют наличие совокупности характерных особенностей по десятибалльной шкале и по размеру площади, занимаемой указанными особенностями. Воспалительный характер эндогенной интоксикации определяют при наличии закругленных, круглых трещин в центральной зоне дегидратированной капли. При наличии трещин в виде черной сети в ее центральной зоне определяют некротический характер эндогенной интоксикации. Нарушения липидного обмена определяют по выявлению трещин в виде рыбьей чешуи в промежуточной зоне. При наличии многолучевых трещин в центральной зоне определяют эндогенную интоксикацию, вызванную почечной недостаточностью (Пат. № 2378991 RU. Опубл. 27.04.2009).

Однако известный способ предназначен для повышения точности диагностики эндогенной интоксикации организма и не предусматривает осуществление предварительной биологической оценки остеоиндуцирующего эффекта полученного препарата модифицированной аутоплазмы крови.

Известен способ стимуляции костной регенерации экстракорпорально модифицированной аутоплазмой, включающий взятие определенного объема крови у пациента с замедленным остеогенезом с последующим выделением активных компонентов плазмы, их лиофилизацию и введение в соединительно-тканную прослойку регенерата этого же пациента (Ускорение костной регенерации экстракорпорально модифицированной аутоплазмой: Медицинская технология / ФГУН «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А.Илизарова; Сост.: А.В.Попков, М.А.Ковинька, О.Л.Гребнева, Д.А.Попков, И.А.Талашова. Курган, 2005. С.6-9).

Однако данный способ не подразумевает предварительной биологической оценки остеоиндуцирующего эффекта полученного препарата модифицированной аутоплазмы крови.

Задачей настоящего изобретения является выявление наличия или отсутствия остеоиндуцирующего эффекта при стимуляции костеобразования.

Поставленная задача решается тем, что в способе биологической оценки остеоиндуцирующего эффекта белков плазмы крови, включающем в себя получение модифицированной аутоплазмы из плазмы крови человека, тестируют модифицированную аутоплазму на трех лабораторных мышах, которым предварительно осуществляют перелом костей голени, затем через 48 часов внутрибрюшинно вводят модифицированную аутоплазму в объеме 0,02 мл, далее через 72 часа после введения модифицированной аутоплазмы у мышей забирают кровь, в сыворотке которой проводят определение активности щелочной фосфатазы, затем оценивают результаты, при этом если активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови как минимум двух мышей увеличена относительно верхней границы нормы, характерной для выбранного вида животных, в 2 и более раза, то делают вывод о наличии остеоиндуцирующего эффекта тестируемых белков плазмы крови, если активность щелочной фосфатазы увеличивается в 2 и более раза, относительно верхней границы нормы, только у одной меньше, то делают вывод об отсутствии остеоиндуцирующего эффекта тестируемых белков плазмы крови.

Настоящее изобретение поясняют подробным описанием и примером.

Способ осуществляют следующим образом.

Апирогенно готовят посуду и растворы: насыщенный раствор аммония сульфата, 0,15 М натрия хлорида, 8 М мочевины, трис-НСl 0,005 М рН=4,5. Плазму крови, взятую однократно в количестве 3,0 мл разводят в два раза 0,15 М раствором NaCl, после чего проводят осаждение белков с помощью насыщенного раствора сульфата аммония. На первом этапе добавляют 3 мл насыщенного раствора сульфата аммония и отбрасывают после центрифугирования преципитат.

На втором этапе добавляют 3 мл насыщенного раствора сульфата аммония и отбирают осадившуюся фракцию для дальнейшей работы. Фракцию, осаждающуюся в диапазоне насыщения от 30 до 50%, растворяют в 8 М растворе мочевины и подвергают гельпроникающей хроматографии на Toyoperl HW-55. Собирают фракции, соответствующие белкам с Mr 20-30 кД, диализуют полученный раствор против дистиллированной воды, лиофильно высушивают и стерилизуют, используя гамма-излучение. Полученные компоненты плазмы крови растворяют в 6 мл стерильного 0,15 М раствора NaCl.

Предварительно наркотизированное животное укладывают на приборном столе на животе. Далее фиксируют голень медиальной стороной на краю приборного стола, находят точку перелома кости в верхней трети голени и затем проводят перелом костей голени путем механического воздействия, путем перпендикулярно прикладываемого на продольную ось большеберцовой кости, до появления характерного звука перелома, при наличии которого судят об осуществлении перелома. Отсутствие смещения отломков отмечают визуально по сохраненной после манипуляции продольной оси голени. Далее, через 48 часов после осуществления перелома при помощи инсулинового шприца трем лабораторным мышам внутрибрюшинно в объеме 0,02 мл вводят раствор белков плазмы крови, полученных от больного, которому планируют провести процедуру стимуляции костеобразования. Через 72 часа после введения препарата у животных осуществляют забор крови в пробирку. Затем получают сыворотку, и проводят в ней биохимическое определение активности щелочной фосфатазы. Далее, для каждой мыши полученный результат сравнивают с нормой, равной 122 Е/л (Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А. Киев: Вища школа. 1983. - 383 с.). Если значения активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови как минимум двух животных превышают верхнюю границу нормы в 2 и более раза, то делают заключение о присутствии остеоиндуцирующего эффекта препарата модифицированной плазмы крови. Если значения активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови увеличивается в 2 и более раза, относительно верхней границы нормы, только у одного и менее животного, то делают вывод об отсутствии остеоиндуцирующего эффекта препарата модифицированной плазмы крови. В качестве объекта тестирования можно использовать любое лабораторное животное, с учетом нормальных значений активности щелочной фосфатазы для данного вида животного.

Пример использования.

У пациента с его согласия получили плазму крови в объеме 3 мл. Апирогенно приготовили посуду и растворы: насыщенный раствор аммония сульфата, 0,15 М натрия хлорида, 8 М мочевины, трис-НСl 0,005 М рН=4,5. Полученную плазму развели в два раза 0,15 М раствором NaCl, после чего провели осаждение белков с помощью насыщенного раствора сульфата аммония. На первом этапе добавили 3 мл насыщенного раствора сульфата аммония и отбросили после центрифугирования преципитат.

На втором этапе добавили 3 мл насыщенного раствора сульфата аммония и отобрали осадившуюся фракцию для дальнейшей работы. Фракцию, осаждающуюся в диапазоне насыщения от 30 до 50%, растворили в 8 М растворе мочевины и подвергли гельпроникающей хроматографии на Toyoperl HW-55. Собрали фракции, соответствующие белкам с Mr 20-30 кД, диализовали полученный раствор против дистиллированной воды, лиофильно высушили и стерилизовали, используя гамма-излучение. Полученные компоненты плазмы крови растворили в 6 мл стерильного 0,15 М раствора NaCl.

Предварительно воспроизводили перелом костей голени у трех лабораторных мышей-самцов из одного помета. Для этого последовательно каждую особь наркотизировали, укладывали на приборном столе, далее фиксировали голень на краю приборного стола, находили точку перелома кости и затем проводили перелом путем воздействия на продольную ось большеберцовой кости, до появления характерного звука, по наличию которого судили об осуществлении перелома. Отсутствие смещения отломков отмечали визуально по сохраненной продольной оси голени. Далее, через 48 часов после осуществления перелома при помощи инсулинового шприца мышам внутрибрюшинно вводили 0,02 мл раствора белков плазмы крови, полученных согласно от больного, которому планировалось провести процедуру стимуляции костеобразования. Через 72 часа после введения животных эвтаназировали путем декапитации, кровь самотеком собирали в пробирки, далее, для получения сыворотки, кровь центрифугировали на центрифуге ЦЛР-1 15 мин при 3000 об/мин, затем проводили биохимическое определение активности щелочной фосфатазы на фотометре Stat Fax 1904Plus (США) с использованием наборов реагентов фирмы Vital diagnostics (РФ). Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови у трех тестированных мышей составила 251 Е/л, 514 Е/л, 179 Е/л. Таким образом, превышение верхней границы нормы, равной 122 Е/л, составляло 2,1, 4,2 и 1,5 раза соответственно для каждого животного. Следовательно, у двух из трех мышей активность щелочной фосфатазы превышала верхнюю границу нормы более чем в 2 раза, на основании чего сделали заключение, что тестируемый препарат белков аутоплазмы крови обладает остеоиндуцирующим эффектом и может быть введен пациенту в костный регенерат в целях стимуляции костеобразования.

Предлагаемый способ позволяет оценивать предварительный биологический эффект препарата белков аутоплазмы крови, используемого для стимуляции костной репарации у пациентов с замедленным остеогенезом. Кроме того, он позволяет оптимизировать процесс лечения пациентов ортопедо-травматологического профиля и сокращать сроки их пребывания в стационаре.

Предлагаемый способ может быть использован также для изучения метаболических и структурных изменений в органах и тканях лабораторных животных, происходящих при стимуляции у них остеорепаративных процессов.

Предлагаемый способ используется в клинико-экспериментальном лабораторном отделе и клинических отделениях ФГУ «РНЦ «ВТО им. академика Г.А.Илизарова».