способ получения наночастиц ферригидрита

Формула изобретения

Способ получения наночастиц ферригидрита, включающий культивирование бактерий Klebsiella oxytoca, выделенных из сапропеля озера Боровое Красноярского края, выращивание биомассы, центрифугирование с получением осадка, содержащего ферригидрит, и ультразвуковое разрушение биомассы для выделения магнитных наночастиц ферригидрита, отличающийся тем, что культивирование и выращивание биомассы ведут с использованием цитрата железа в течение 7-10 дней с получением осадков бактериальных культур, после ультразвукового разрушения биомассы осадки центрифугируют, отмывают водой, затем ацетоном, обрабатывают NaOH до получения 20%-ного раствора, инкубируют в течение часа, промывают дистиллированной водой с добавлением NaCl до достижения нейтрального значения рН, отделяют осадок наночастиц ферригидрита, промывают его с получением устойчивого водного золя на основе наночастиц ферригидрита и полученный золь сливают.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способам получения магнитных железосодержащих наночастиц, для использования в медицинских целях.

Известен способ получения наночастиц металлов и ионов металла в водном растворе (Бутенко А.В. и др. Атомы, молекулы и кластеры, 1990, т.17, с.283). При этом способе в качестве восстановителя используют гидразин и водород в среде инертного газа.

Недостаток этого способа заключается в малой стабильности полученных частиц.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ введения наночастиц для проведения местной терапии при заболеваниях организма в эксперименте [РФ, п. № 2381030, МПК А61К 33/26, опубл. 10.10.2009 г. (прототип)], включающий использование наночастиц ферригидрита, полученных в результате культивирования бактерий Klebsiella oxytoca, выделенных из сапропеля озеро Боровое Красноярского края.

Недостаток способа заключается в быстрой агрегации наночастиц в водном растворе и выпадением в осадок, что ограничивает области их применения.

Техническим результатом изобретения является разработка способа приготовления устойчивого водного золя на основе магнитных наночастиц ферригидрита биологического происхождения.

Технический результат достигается тем, что в способе получения наночастиц ферригидрита, включающем культивирование бактерий Klebsiella oxytoca, выделенных из сапропеля озера Боровое Красноярского края, выращивание биомассы, центрифугирование с получением осадка, содержащего ферригидрит, и ультразвуковое разрушение биомассы для выделения магнитных наночастиц ферригидрита, новым является то, что культивирование и выращивание биомассы ведут с использованием цитрата железа в течение 7-10 дней с получением осадков бактериальных куьтур, после ультразвукового разрушения биомассы осадки центрифугируют, отмывают водой, потом ацетоном и обрабатывают NaOH до получения 20%-го раствора, инкубируют в течение часа, промывают дистиллированной водой с добавлением NaCl до достижения нейтрального значения рН, отделяют осадок, промывают его с получением устойчивого водного золя на основе наночастиц ферригидрита и полученный золь сливают.

Таким образом, заявляемый способ получения наночастиц ферригидрита отличается от прототипа тем, что полученные осадки бактериальных культур выращенных в течение 7-10 дней, разрушают ультразвуком, центрифугируют, отмывают водой, потом ацетоном и обрабатывают NaOH до получения 20%-го раствора, инкубируют в течение часа, промывают дистиллированной водой с добавлением NaCI до достижения нейтрального значения рН, отделяют осадок, промывают его с получением устойчивого водного золя на основе наночастиц ферригидрита и полученный золь сливают.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, не выявлены в других технических решениях при изучении данных и смежных областей техники и, следовательно, обеспечивают заявляемому решению соответствие критерию «изобретательский уровень».

Изобретение поясняется чертежами.

На фиг.1 представлен снимок бактерии культуры выращенной в течение 15 дней (увеличение 30000). На фиг.2 - Мессбауэровские спектры и вероятности квадрупольных расщеплений, P(QS) бактерий, которых выращивали на цитрате Fe³⁺ в зависимости от продолжительности культивирования. На фиг.3 дано распределение по размерам, полученное методом малоуглового рентгеновского рассеяния. На фиг.4 представлена температурная зависимость обратной восприимчивости ^-1(T), измеренная при H=10 кЭ.

Процесс наращивания биомассы

Используемые микроорганизмы (фиг.1) были выделены из сапропеля озера Боровое (Красноярского края). Озеро характеризуется отсутствием процессов сульфатредукции и наличием денитрификации и железовосстановления. Отобранный в озере сапропель пропускали через магнитный сепаратор. Выделенная таким образом культура рассевалась на агаризованную среду Lovley.

Идентификация выделенной культуры до вида были выполнены в ФГУ ВГНКИ (г.Москва) лабораторией молекулярной диагностики отделом бактериологии. Исследования включали определение морфологических, тинктуриальных и ферментативных свойств культуры, определение патогенности на белых мышах, определение антибиотикограммы в качестве генетических маркеров у штамма. В основе метода идентификации культуры был использован [Определитель бактерий Берджи" 9 издание. М.: Мир 1997 г. (2 тома)] и руководство "Энтероид-плюс" - система автоматизированной идентификации бактерий и грибов.

При бактериологическом исследовании трех проб материала выделена культура грамотрицательной палочки семейства Enterobacteriaceae, род Klebsiella, вид Klebsiella oxytoca, патогенная для белых мышей в дозе 250 млн./см³ микробных тел. (см. табл.1 и 2).

Таблица 1
Ферментативные свойства исследуемой культуры
№	Свойство	Результат	№	Свойство	Результат
1	Образование индола	+	19	Утилизация цитрата	+
2	Гидролиз мочевины	+	20	Образование сероводорода	-
3	Подвижность	-	21	Реакция Фогес-Проскауэра	+
4	Рост в присутствии KCN	+	22	Оксидаза	-
5	Образование газа из глюкозы	+	23	Нитратредуктаза	+
6	Образование кислоты из: адонита	+	24	Лизиндекарбоксилаза	+
7	инозита	+	25	Аргининдекарбоксилаза	-
8	лактозы	+	26	Орнитиндекарбоксилаза	-
9	сахарозы	+
10	маннита	+
11	дульцита	+
12	салицина	+
13	сорбита	+
14	арабинозы	+
15	раффинозы	+
16	рамнозы	+
17	мальтозы	+
18	ксилозы	+

Таблица 2
Чувствительность к антибиотикам штамма Klebsiella oxytoca
№	Антибиотик	Чувствительность	№	Антибиотик	Чувствительность
1	бензилпенициллин	у	19	рифампицин	У
2	ампициллин	у	20	канамицин	ч
3	оксациллин	у	21	неомицин	сч
4	цефазолин	ч	22	гентамицин	ч
5	цефотаксим	вч	23	тобрамицин	ч
6	цефтриаксон	ч	24	сизомицин	ч
7	цефоперазон	ч	25	фурадонин	ч
8	цефалексин	ч	26	фурагин	ч
9	цефиксим	вч	27	ципрофлоксацин	вч
10	ванкомицин	ч	28	офлоксацин	ч
11	фузидин	у	29	рокситромицин	У
12	линкомицин	у	30	кларитромицин	у
13	клиндамицин	у	31	имипенем	вч
14	олеандомицин	у	32	Налидиксовая кислота	ч
15	эритромицин	у	33	норфлоксацин	ч
16	азитромицин	сч	34	энрофлоксацин	ч
17	доксициклин	ч	35	пефлоксацин	ч
18	левомицетин	вч

у - выделенная культура устойчива; ч - чувствительна; сч - слабо чувствительна; вч - высоко чувствительна.

Микроорганизмы рассевались на агаризованную среду Lovley [Lovley D.R., Philips E.J.P. Novel mode of microbial energy metabolism: organic carbon oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron or manganese // Appl. Environ. Microbiol, 1988, v.54. P.1472-1480] и выращивали в анаэробных условиях для получения колоний. Выращенная в жидкой среде биомасса проверялась на наличие магнитных частиц на ФМР-спектрометре. Для дальнейших экспериментов использовался изолят микроорганизмов mbp3. Изолят mbp3 сохраняет культуральные, а биомасса бактерий магнитные свойства на протяжении более 5 лет. Бактериальная биомасса изолята mbp3 наращивалась в микроаэрофильных условиях на среде Lovley следующего состава: (в г/л): NaHCO₃ - 2.5, CaCl₂·H₂О - 0.1, КСl - 0.1, NH ₄Cl - 1.5, NaH₂PO₄·H₂ O - 0.6. Концентрация цитрата Fe³⁺ варьировалась от 0,2 до 5 г/л, дрожжевой экстракт 0.05, бензольная кислота варьировалась от 0.2 до 0.5. Отбор проб производился через 5-90 дней после засева микроорганизмов в питательную среду.

Бактерии выращивали в периодическом режиме без аэрации и перемешивания на минерально-солевой среде, содержащей необходимые для их роста азот, фосфор, калий магний и серу. В качестве источника углерода и энергии испытаны глюкоза, бензойная кислота, цитрат железа и калия. При культивировании на среде с глюкозой бактерии имели максимальную удельную скорость роста 0,144 ч^-1, на среде с цитратом калия 0,08 ч^-1, бензойной кислоты - 0,06 ч^-1 в аэробных и 0,02 ч^-1 в микроаэрофильных условиях роста. Энергетически наиболее приемлемым для синтеза биомассы Klebsiella oxytoca из проверенных субстратов оказался цитрат калия, а для накопления ферригидрита - цитрат железа.

Синтез ферригидрита в одностадийном процессе культивирования происходит в период от 7 до 30 суток, т.е. в период активного размножения и в стационарной фазе культуры бактерий. Нанокристаллический гидроксид железа сохраняется в культуре покоящихся клеток до 90 суток. Синтез ферригидрита происходит также в двухстадийном процессе наращивания биомассы бактерий и накопления наночастиц. Двухстадийный процесс обеспечивает высокую воспроизводимость синтеза и интенсивное накопление ферригидрита. Суть его в том, что на первой стадии бактерии выращиваются на минеральной среде с цитратом калия в качестве источника углерода и энергии. Титр клеток на этой стадии выше на 1-2 порядка, чем при одностадийном культивировании. На второй стадии культура переносится в среду с цитратом железа, где и происходит образование ферригидрита.

Для выделения ферригидрита из осадка, полученного при центрифугировании (10 минут, 10 тыс. оборотов в минуту) 7-10 дневной культуры Klebsiella oxytoca, выращенной на среде Lovley, клетки бактерий разрушаются ультразвуком (ультразвуковой дезинтегратор УЗДН (1 мин, 44 кГц, 20 Вт)) 3 раза по 3 мин в дистиллированной воде с интервалом 10 минут. В течение всего процесса выделения наночастиц при обработке суспензии ультразвуком температура нагревания не должна превышать 50°С для того, чтобы предотвратить процесс распада органических соединений, покрывающих минеральное ядро ферригидрита. Затем проводится центрифугирование осадка при 10000g в течение 10 мин, осадок снова заливают дистиллированной водой и повторяют цикл 3 раза. Далее полученный осадок для удаления жирных кислот заливают ацетоном, диспергируют ультразвуком, инкубируют 30 минут, затем центрифугируют при 10000g в течение 10 мин. Полученный осадок промывают дистиллированной водой и опять центрифугируют. После этого полученный осадок диспергируют ультразвуком в водной среде и обрабатывают NaOH до получения 20%-го раствора и инкубируют в течение часа, центрифугируют при 10000g в течение 10 мин. Собранный материал несколько раз диспергируют в дистиллированной воде, добавляя каждый раз NaCl до конечной концентрации 50 мМ, для осаждения наночастиц, до получения нейтрального рН супернатанта. Полученный конечный осадок снова заливают дистиллированной водой, диспергируют ультразвуком, центрифугируют при 10000g в течение 10 мин, для получения устойчивого водного золя золь на основе наночастиц ферригидрита сливают в колбу. При необходимости повторяют процедуру.

На фиг.2 представлены мессбауэровские спектры и вероятности квадрупольных расщеплений, наблюдаемых в наночастицах бактерий Klebsiella oxytoca, в зависимости от времени культивирования за период от 3-х до 56 дней. На этом рисунке представлены результаты для бактерий, культивируемых на среде, содержащей только трехвалентное железо (цитрат Fe ³⁺). Из этих зависимостей видно, что на 14-й день культивирования бактерий в ферригидрите возникают дефектные позиции ионов железа с большой величиной квадрупольного расщепления. На ~ 50-й день эти позиции исчезают. Этот эффект наблюдается на бактериях, культивируемых как при круглосуточном освещении, так и в темноте. На фиг.2 слева представлены результаты, полученные на бактериях, культивируемых при круглосуточном освещении, а справа - результаты при культивировании в темноте.

Временные параметры изменения наночастиц примерно совпадают для этих двух режимов культивирования.

Идентификация кристаллической структуры синтезированных наночастиц была выполнена в работе [Столяр С.В., Баюков О.А., Гуревич Ю.Л., Денисова Е.А., Исхаков Р.С., Ладыгина В.П., Пузырь А.П., Пустошилов П.П., Битехтина М.А. Железосодержащие наночастицы, образующиеся в результате жизнедеятельности микроорганизмов // Неорганические материалы. - 2006, - том 42, № 7. - С.1-6]

На фиг.3 приведено распределение наночастиц по размерам, полученное методом малоуглового рентгеновского рассеяния (дифрактометр XRD-6000 на СuК -излучении). Видно, что размер синтезированных наночастиц составляет 2-5 nm.

Кривые намагничивания высушенной биомассы показали линейную зависимость намагниченности от внешнего магнитного поля на фиг.4, что характерно для парамагнетиков или магнитных частиц, находящихся в суперпарамагнитном состоянии. Обратная восприимчивость ^-1(Т) имеет линейную зависимость в диапазоне температур от 100 до 300 К. Данная зависимость представлена на фиг. 4. Асимптотическая температура Кюри, ~ T_N= - 600 К, указывает на наличие антиферромагнитного взаимодействия в исследуемых наночастицах.

В наночастицах ферригидрита сосуществуют антиферромагнитный порядок и эффективный магнитный момент, обусловленный декомпенсацией спинов в магнитных подрешетках наночастицы вследствие малых размеров и развитой поверхности. Наличие эффективного магнитного момента у наночастицы позволяет управлять движением наночастицы. В неоднородном поле магнитные частицы, кроме ориентации вектора намагниченности вдоль силовых линий поля, испытывают воздействие магнитной силы притяжения, которая втягивает частицы в более интенсивные участки поля.

Цитотоксичность магнитных наночастиц in vitro

Одним из первых этапов при взаимодействии организма с чужеродным объектом являются реакции так называемого «неспецифического иммунитета», в частности «дыхательный взрыв». Под этим термином понимают резкое увеличение потребления кислорода за счет преобразования его в активные формы кислорода (АФК) клетками-фагоцитами. В крови подавляющее количество АФК при контакте с чужеродными объектами производится полиморфно-ядерными нейтрофилами и незначительная часть - моноцитами и другими клетками нелимфоидного ряда. Выделение АФК направлено на обезвреживание чужеродного объекта, однако чрезмерное их образование способно повредить собственные ткани организма. С другой стороны, недостаточное образование АФК свидетельствует о слабости защитных сил организма. Таким образом, образование АФК может служить прогностическим признаком для оценки хода взаимодействия организма с чужеродным объектом или оценки «степени чужеродности» тестируемого объекта, а ответ на стандартный стимул может характеризовать активность защитных сил организма.

Интенсивность респираторного взрыва при фагоцитозе можно оценивать с помощью параметров хемилюминесцентной реакции. Уменьшение этих параметров свидетельствует о снижении активности клеток, что говорит о токсическом поражении.

Поэтому, была изучена цитотоксичность магнитных наночастиц с помощью реакции хемилюминесценции. Хемилюминесцентный анализ проводился на нейтрофилах здоровых людей при воздействии на них магнитными наночастицами in vitro в 30 исследованиях.

В результате, при изучении цитотоксичности магнитных наночастиц было выявлено, что основные параметры хемилюминесценции: время выхода на пик и площадь под кривой в обоих опытах (опыт-контроль, опыт - с наночастицами) достоверно не различались. Следовательно, магнитные наночастицы не влияют на активность нейтрофилов, что свидетельствует об отсутствии у них цитотоксического действия.

Преимущества практического использования биосинтезированных наночастиц заключается в следующем: крайне малая дисперсия размеров и физических свойств частиц, уникальная сорбционная способность, отсутствие цитотоксичности, возможность создавать направленное перемещение частиц внешним магнитным полем.