октапептид для получения радиофармацевтических средств, радиофармацевтическое средство на его основе и способ диагностики опухолей, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы

Формула изобретения

1. Октапептид для получения радиофармацевтических средств общей формулы (I):

,

где Х и Y=Н или хелатирующая группа, при этом хелатирующая группа ковалентно связана с или аминогруппами N-концевого лизина.

2. Октапетид по п.1, где в качестве хелатирующей группы используют тетраазациклододекантерауксусную кислоту (DOTA).

3. Радиофармацевтическое средство в виде комплекса соединения формулы (1) из п.1 формулы с радионуклидами ⁶⁶Ga, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga.

4. Способ диагностики опухолей, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы, или их метастазов с помощью радиофармацевтического средства, отличающийся тем, что в качестве радиофармацевтического средства используют радиофармацевтическое средство по п.3.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается радиофармацевтических препаратов (далее РФП) как диагностических, так и терапевтических на основе пептидных носителей с адресной доставкой.

В настоящее время в качестве наиболее перспективных носителей для РФП в онкологии рассматриваются пептиды, имеющие сродство к рецепторам опухолевых клеток. Применение РФП на основе пептидных носителей повышает эффективность ранней диагностики и контроля лечения целого ряда опухолей.

Исторически первый препарат для диагностики нейроэндокринных опухолей (НЭО) - ¹¹¹In-DTPA-D-Phe¹-Tyr³-октреотид (Octreoscan, российский аналог «Октреотид, ¹¹¹ In») выпускается в промышленном масштабе и широко используется, несмотря на недостатки, связанные, в первую очередь, с ядерно-физическими свойствами и ценой радионуклида ¹¹¹In [1]. При этом Октреотид, ¹¹¹In имеет высокий диагностический потенциал для обнаружения первичных НЭО и метастазов в гастроэнтеропанкреатической области и печени, но меньший в случае метастазов в легкие, средостение и кости.

Важным достижением в использовании аналогов соматостатина в ядерной медицине было получение РФП на основе производных октреотида, содержащих в качестве радионуклида ⁶⁸Ga [2] - позитронный эммитер для диагностики НЭО с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), получаемый с помощью генератора ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga. В настоящее время ⁶⁸Ga рассматривается как один из наиболее перспективных изотопов, способный, благодаря своим ядерно-физическим свойствам и доступности, значительно снизить зависимость ПЭТ-центров от циклотронов, на которых нарабатываются широко используемые в клинических учреждениях позитронные эмиттеры ¹⁸F, ¹¹С.

Известен целой ряд октапептидов - структурных аналогов октреотида, содержащих различные хелатирующие группировки [3].

Структурные формулы этих соединений (аналогов октреотида с хелатирующей группой DOTA) представлены ниже.

Compound	R1	R2
DOTA-OC	Phe	Thr(ol)
DOTA-TOC	Туr	Thr(ol)
DOTA-TATE	Туr	Thr
DOTA-NOC	NaI-1	Thr(ol)
DOTA-NOC-ATE	NaI-1	Thr
DOTA-BOC	BzThi	Thr(ol)
DOTA-BOC-ATE	BzThi	Thr

Ряд работ [4-5] был посвящен исследованиям различных препаратов данной группы, содержащих хелатирующую группу в виде остатка тетраазациклододекантерауксусной кислоты (ДОТА) и радионуклид ⁶⁸Ga. Было показано, что эти препараты превосходят Октреотид, ¹¹¹In при обнаружении НЭО и их метастазов в легких, средостении и костях.

Задачей настоящего изобретения является получение новых РФП с улучшенными радиофармацевтическими свойствами, обеспечивающими повышенное качество визуализации опухолей, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы.

Поставленная техническая задача достигается новым октапептидом, как производным октреотида, для получения радиофармацевтических средств, а также радиофармацевтическим средством на его основе и способом диагностики опухолей с использованием этого радиофармацевтического средства.

Таким образом, заявленное изобретение описывает группу изобретений, в которую входит новый октапептид, являющийся производным октреотида, радиофармацевтическое средство (РФП) на его основе и способ диагностики опухолей с использованием полученного радиофармацевтического средства.

Итак, одним изобретением заявленной группы является октапептид общей формулы (1) для получения радиофармацевтических средств

где X и Y - Н или хелатирующая группа, способная образовать комплекс с радионуклидом и ковалентно связанная с L- или -аминогруппами N-концевого лизина.

Представленный в изобретении октапептид отличается от известных пептидных аналогов октреотида общей формулы D-Phe¹-Tyr³(октреотид) тем, что в нем D-Phe¹ заменен на Lys¹. При этом в качестве хелатирующей группы может быть использована, например, ДОТА, ковалентно связанная с - или -аминогруппой N-концевого лизина, представляющая собой тетраазациклододекантетрауксусную кислоту (ДОТА) (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid).

Помимо этого хелатирующего агента в заявленном изобретении могут использоваться также и другие хелатирующие группы, известные в этой области техники для получения радиофармацевтических препаратов, широко описанных в различных источниках, например RU 233557, RU 2010146497, RU 2006105644, US 4647447, US 5362475, EP 230893, WO 95/24225 и др., а также в статьях:

- Bioconjug Chem. 2011 Aug 17; 22(8): 1650-62. Epub 2011 Jul 26. Multivalent bifunctional chelator scaffolds for gallium-68 based positron emission tomography imaging probe design: signal amplification via multivalency;

- Bioconjug Chem. 2010 Fev 22. [Epub ahead of print].

Evaluation of Bifunctional Chelates for the Development of Gallium-Based Radiopharmaceuticals

и др.

К ним, в частности, относятся полиаминополикислотные, бифункциональные хелатирующие группы: производные тетраацетоуксусной кислоты (названия приведены в латинице):

- NOTA (1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid);

- Oxo (1-oxa-4,7,10-triazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid);

- РСТА (3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1]pentadeca-1(15),11,13-triene-3,6,9-triacetic acid);

- Упомянутая ранее (DOTA) (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid).

Получаемые результаты от использования других хелатирующих агентов при получении радиофармпрепаратов и комплексов октреотида формулы (1) по изобретению будут аналогичные, как и с использованием ДОТА.

Другим изобретением заявленной группы является радиофармацевтическое средство, представляющее собой комплекс (металлокомплекс) октапептида формулы (1) с радионуклидами в виде изотопов галлия: ⁶⁶Ga, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga. Это позволяет использовать РФП с ⁶⁷Ga для ОФЭКТ и РНТ, а РФП с ⁶⁶Ga и ⁶⁸Ga для ПЭТ диагностики опухолей и их метастазов.

Поставленная техническая задача достигается также в способе диагностики опухолей и их метастазов, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы, характеризующимся использованием указанного выше РФП.

Описываемые соединения - октапептиды формулы (1), как производные октреотида, могут быть также использованы в качестве диагностических и терапевтических РФП в случае их комплексов и с другими - и -излучающими радионуклидами.

В результате реализации заявленной группы изобретений как технического решения будет создана современная система ранней диагностики злокачественных опухолей, имеющих высокую плотность соматостатиновых рецепторов (нейроэндокринные опухоли, опухоли центральной нервной системы, рак молочной железы, мелкоклеточный рак легкого и т.д.). Это позволит увеличить выявляемость опухолей, отслеживать динамку проводимой терапии, улучшить уровень медицинского обслуживания населения и повысить качество жизни больных.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется соответствующими примерами, не ограничивающими его.

Синтез октапептидов общей формулы 1

Список использованных сокращений:

DMF - диметилформамид

DIPEA - N,N'-диизопропилэтиламин

НОВТ - N-гидроксибензотиазол

TBTU - тетрафторборат 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония

TFA - трифторуксусная кислота

Fmoc - флуоренилоксикарбонил

DCC - дициклогексилкарбодиимид

Trt - тритил

Boc - трет-бутилоксикарбонил

But - трет-бутил

DOTA - тетраазациклододекантерауксусная кислота

DОТА(But)₃ОН - три-трет-бутиловый эфир

тетраазациклододекантерауксусной кислоты

Р - полимер.

В синтезе использовали защищенные производные фирмы Bachem (Швейцария). Синтез аналогов октапептидов формулы I проводили твердофазным методом.

Пример 1. Осуществляют синтез Fmoc-гептапептидил-полимера:

Cys(Trt)-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys(Trt)-Thr-P.

Примечание: под символом «Р» обозначен полимер (матрица), на котором выращивают Fmoc-гептапептидил-полимер и который после этого отделяют и удаляют, в частности полимер Ванга фирмы Bachem.

Синтез пептидил-полимера - предшественника октапептидов с хелатирующей группой DOTA проводили твердофазным способом, исходя из 6.0 г Fmos-Thr(But)-полимера Ванга фирмы Bachem с содержанием стартовой аминокислоты 0.61 ммоль/г. Реакции конденсации проводили дициклогексилкарбодиимидным методом в присутствии N-гидроксибензотриазола (DCC/HOBT) в DMF с использованием двукратных избытков производных: Fmoc-Cys(Trt)-ОН, Fmoc-Thr(But)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-D-Trp-OH, Fmoc-Tyr(But)-OH. Для деблокирования аминогруппы использовали 20% пиперидин в диметилформамиде. Все операции проводили в соответствии с протоколом, приведенным в таблице 1.

Таблица 1
Протокол синтеза
№	Операция	Количество обработок (раз)	Время данной обработки (мин)
1	Активация 0.0074 моль Fmoc аминокислоты в присутствии 0.0074 моль DCC и 0.0074 моль НОВТ в 30 мл DMF	1	20
2	Промывка пептидил-полимера 50 мл DMF перед деблокированием	3	1
3	Деблокирование 30 мл 20% пиперидина в DMF	1	5
1	15
4	Промывки 50 мл DMF	5	1
5	Конденсация	1	120
6	Промывки 50 мл DMF	3	1

По окончании синтеза пептидил-полимер отфильтровывали, промывали DMF (3×80 мл), дихлорметаном (5×80 мл), сушили на воздухе. Полученные 10.36 г Fmoc-гептапептидил-полимера использовали на следующих стадиях.

Пример 2. Синтез отвечающего общей формуле октапептида формулы (1).

Соединение (1а) получали путем наращивания пептидной цепи на последней стадии по протоколу, приведенному в таблице 1, с использованием на последней стадии синтеза Fmoc-Lys(Boc)-OH. 1.0 г (0.5 ммоль) защищенного октапептидил-полимера деблокировали 10 мл 20% пиперидина DMF и промывали DMF, как описано в пп.(3 и 4) таблицы 1. Пептидил-полимер суспендировали в 30 мл DMF, добавляли 0.47 г (1.0 ммоль) соответствующего производного лизина, 0.15 г (1.0 ммоль) НОВТ, 0.32 г (1.0 ммоль) TBTU и 0.5 мл DIPEA. Реакционную смесь перемешивали 2 часа при комнатной температуре, растворитель удаляли фильтрованием, Fmoc-пептидил-полимер промывали, деблокировали и опять промывали в соответствии с пп.3 и 4 таблицы 1. Присоединяли DОТА(But)₃ОН с использованием тех же реагентов, что и в случае производных лизина. Пептидил-полимер отфильтровывали, промывали DMF (3×30 мл), дихлорметаном (5×30 мл), сушили на воздухе. 1.1 г пептидил-полимера суспендировали в 10.0 мл смеси TFA - тиоанизол - триизобутилсилан - этандитиол - вода (8.5:0.5:0.5:0.25:0.25), перемешивали 4 часа при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали TFA (2 раза по 0.5 мл). Прибавляли к фильтрату 50 мл диэтилового эфира, выпавший осадок отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром (5×15 мл), этилацетаом (2×15 мл). Сырой продукт растворяли в 0.5 л воды, добавляли водный раствор аммиака до pH 9, оставляли на ночь при слабом перемешивании при комнатной температуре. К реакционной смеси добавляли 1 мл 5% раствора H₂O₂, перемешивали 15 мин. Полноту образования дисульфидной связи проверяли при помощи реактива Элмана. Реакционную смесь упаривали, предварительно добавив 1 мл уксусной кислоты (pH 4-5). Продукт вычищали методом ВЭЖХ на Диасорбе-130 (25×250 мм), элюция в градиенте от 0 до 20% за 10 мин и от 20% до 60% за 40 мин буфера Б в буфере А (А - 0.1% TFA и Б - 80% ацетонитрила в А), скорость потока 12 мл/мин, детекция - при 226 нм. Фракции, соответствующие целевому веществу, объединяли и лиофилизовали. Выход соединения 1а 0.108 г, что соответствует 15% в расчете на стартовую аминокислоту, m/z 1416.7 (вычислено 1416.0), R_t=13.32 мин (аналитическая ВЭЖХ на хроматографе Gilson, Франция, колонка Gromasil С 18, 4.6×250 мм, градиент концентрации буфера Б в буфере А от 20% до 80% за 30 мин, где А - 0.1% TFA и Б - 80% ацетонитрила в А, скорость потока 1 мл/мин).

Пример 3. Синтез отвечающего формуле октапептида формулы (1).

Соединение 1б получали аналогично 1а с тем отличием, что на последней стадии твердофазного синтеза использовали Bos-Lys(Fmoc)-OH. Выход (Iб) 0.099 г, что соответствует 13% в расчете на стартовую аминокислоту, m/z 1416.7 (вычислено 1416.0), R_t=13.37 мин в условиях, алогичных для соединения 1а.

Ниже представлен пример получения радиофармацевтического средства в виде комплекса соединений формулы (1а) и (1б) с радионуклидом, в частности с радионуклидом ⁶⁸Ga.

Аналогичные РФП получают и с радионуклидами - другими изотопами галлия - ⁶⁶Ga, ⁶⁷Ga.

Нижеследующие примеры 4-6 иллюстрируют получение радиофармацевтического средства (препарата) по изобретению и его свойства.

Пример 4. Получение РФП на основе DOTA-конъюгированных пептидов 1а и 1б, меченных радионуклидом ⁶⁸Ga.

Данная методика описывает проведение реакции мечения радионуклидом ⁶⁸ Ga DOTA-конъюгированных пептидов - аналогов октреотида 1а и 1б, полученных в примерах 2 и 3.

Исходный пептид (в виде сухого вещества) растворяют в деионизованной воде (18 МОм) в концентрации 1 мг/мл. Полученный раствор пептида автоматическим дозатором фасуют по 20 мкл в полипропиленовые пробирки типа Eppendorf Safe-Lock Tubes (1,5 мл). Расфасованный раствор пептида хранят в морозильной камере при температуре не выше -18°C. Перед проведением реакции мечения раствор пептида размораживают при комнатной температуре в течение 1-2 мин. К размороженному пептиду в ту же пробирку дозатором добавляют ацетатный буфер и переносят за защиту, где в пробирку добавляют элюат генератора ⁶⁸ Ge/⁶⁸Ga (раствор хлоридных комплексов радионуклида ⁶⁸Ga в соляной кислоте концентрации 0,1 моль/л) в определенном для используемого пептида количестве, так чтобы кислотность (pH) реакционной среды составляла 2,6-3,5 и 3,2-4,2 для пептидов 1a и 1б соответственно. Реакционную смесь инкубируют при температуре 80°C в течение 20 минут. По истечении 20 мин реакция мечения считается завершенной.

Пример 5. Определение радиохимической чистоты DOTA-конъюгированных пептидов, меченных радионуклидом ⁶⁸Ga.

Радиохимическую чистоту полученного продукта (РХЧ) определяли тонкослойной хроматографией (радио-ТСХ) двумя методами.

Метод 1.

В качестве неподвижной фазы используют полоски ITLC-SG (Pall Corporation). В качестве элюента используют водный раствор лимонной кислоты концентрации 0,05 моль/л.

R_f ⁶⁸ _{Ga-свободный}=0,8-1,0.

R_f ⁶⁸ _{Ga-связанный}=0,0-0,2.

Метод 2.

В качестве неподвижной фазы используют полоски ITLC-SG (Pall Corporation). В качестве элюента используют смесь водного раствора ацетата аммония концентрации 1 моль/л и метанола в соотношении 1:2.

R_f ⁶⁸ _{Ga-свободный}=0,0-0,2.

R_f ⁶⁸ _{Ga-связанный}=0,8-1,0.

При использовании обоих методов РХЧ составила 95±4%.

Пример 6. Состав РФП на основе соединений 1а, 1б, меченых ⁶⁸ Ga.

Состав РФП, полученных в примере 4, представлен в таблице 2.

Таблица 2
Состав РФП на основе соединений 1а и 1б, меченных 68 Ga
№	Компоненты состава	Ед. измерения	Соединение 1а	Соединение 1б
1	Пептид	Мкг	20	20
2	Ацетат натрия	Мг	8,2-10,6	9,4-11,9
3	Кислота соляная 0,1 М	Мл	1,0	1,0
4	Активность 68 Ga	МБк	100-1500	100-1500

Нижеследующие примеры 7-8 иллюстрируют способ диагностики опухолей с использованием РФП по изобретению.

Пример 7. Изучение специфичности РФП на основе соединений 1а, 1б, меченных ⁶⁸Ga, по отношению к опухолевым клеткам in vitro.

В экспериментах in vitro была использована культура мышиной меланомы В 16 из коллекции Российского Онкологического Научного Центра им. Н.Н.Блохина. Использованная культура характеризуется следующими показателями: морфология - фибробластоподобная, жизнеспособность 98% (окраска трипановым синим на нулевом пассаже). Клетки выращивали в культуральных флаконах с площадью поверхности 25 см² с использованием среды следующего состава: среда DMEM с добавлением эмбриональной бычьей сыворотки - 10%, L-глутамина - 200 мМ, пирувата натрия 1 мМ, бычьего инсулина 10 мкг/мл и гентамицина (ICN) 10 ед./мл. Клетки инкубировали при 37°C до получения полноценного монослоя, количество клеток в котором составляло 2*10⁶ клеток/флакон. В полноценные монослои клеток (2 млн. клеток в культуральном флаконе с площадью поверхности 25 см²) вносили меченые соединения 1а, 1б и препарат сравнения DOTA ТАТЕ (ДЕ) по 0,1 мл с концентрацией 20 мкг пептида в 1 мл ацетатного буфера. РФП на основе ДЕ широко применяется для визуализации опухолей, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы [6]. Мечение ДЕ ⁶⁸Ga осуществляли известным методом [7]. Клетки с радиоактивным соединением инкубировали в термостате при 37°C в течение 10, 30 и 60 минут, затем радиоактивный раствор удаляли, монослой промывали 3-кратным объемом раствора Хэнкса. Аккумулированную в клетках меланомы В 16 активность измеряли методом прямой радиометрии культурального флакона. В качестве эталона использовали такой же флакон, в котором содержалось 5 мл культуральной среды и такое же количество препарата. На культуре меланомы В 16 проведено 7 экспериментов в отдельном исследовании, при этом каждая экспериментальная точка бралась в триплете.

Полученные результаты накопления меченых соединений (⁶⁸Ga меченными соединениями 1а, 1б и ДЕ) представлены на фигуре 1 в процентах от внесенной активности, нормированной на 1 млн. клеток.

Результаты проведенного эксперимента показывают, что изученные соединения специфически связываются с опухолевыми клетками. Следует отметить, что уровень накопления для соединений 1а и 1б выше, чем в экспериментах, проведенных с препаратом сравнения ДЕ.

Пример 8. Изучение накопления РФП на основе соединений 1а, 1б, меченных ⁶⁸Ga, у животных с перевитой опухолью, экспрессирующей соматостатиновые рецепторы.

Эксперименты in vivo проводились на лабораторных самках мышей (гибриды F1 СВАxС57В1 весом 18-20 г). Животные были получены из питомника Научного центра биомедицинских технологий РАМН "Андреевка". Мышам перевивали пигментированную меланому В16. В асептических условиях подкожно вводили взвесь клеток меланомы В16. Рост опухоли отмечали визуально. Животных включали в эксперимент спустя 9-12 суток после перевивки, при достижении размера опухоли 8-12 мм в диаметре.

Во время экспериментов животных содержали в стандартных условиях (специальное помещение, рекомендованный рацион, свободный доступ к питьевой воде, естественное освещение).

Растворы соединений 1а, 1б и ДЕ, меченных ⁶⁸ Ga, вводили в хвостовую вену, через 30 и 60 минут животных декапитировали, отбирали пробы крови, мышечной и опухолевой тканей, а также основные органы: печень, почки и наполненный мочевой пузырь. Наполнение мочевого пузыря выполняли путем наложения лигатуры на наружное отверстие мочевыделительного канала. Радиоактивность в выбранных органах и тканях измеряли методом прямой радиометрии. Выполнено 5 экспериментов, в каждом эксперименте на каждую временную точку использовали не менее 3 животных. Полученные данные представлены в таблице 3.

Таблица 3
Распределение активности в организме мышей с перевитой меланомой В 16 (% от введенной дозы)
Активность Орган, ткань	ДЕ, меченный 68Ga	1а, меченный 68Ga	16, меченный 68Ga
Время после введения, мин
30	60	30	60	30	60
Кровь	2,6±0,5	2,6±0,6	3,5±0,7	1,8±0,5	2,4±0,4	0,5±0,07
Печень	2,8±1,5	2,8±0,5	2,6±0,4	3,0±0,6	1,8±0,7	1,1±0,1
Почки	1,6±0,6	1,6±0,6	7,6±1,1	15,3±2,2	3,4±0,3	5,4±0,6
Мочевой пузырь	21,6±3,2	29,2±2,4	50,4±4,7	72,0±11,9	53,4±7,7	35,5±3,1
Опухоль, %/г	1,0±0,2	0,5±0,24	2,6±0,9	1,5±0,3	2,5±0,7	1,2±0,2
Мышца, %/г	0,6±0,04	0,5±0,04	1,1±0,5	0,2±0,07	0,6±0,1	0,06±0,01
Отношение опухоль/мышца	1,7	1,0	2,4	7,5	4,2	20,0

Как видно из полученных данных, все исследованные соединения обладают тропностью к опухоли меланомы В16 in vivo. Однако более предпочтительно распределение в организме имеют меченные ⁶⁸Ga соединения 1а и 1б, по сравнению с меченным ⁶⁸Ga препаратом сравнения ДЕ: более быстрый клиренс из крови, ускоренное выведение через почки, большее накопление РФС 1а и 1б в опухоли. Так, на 60 мин после введения накопление РФС в опухоли на основе 1а и 1б было выше соответственно в 3 и 2,4 раза по сравнению с ДЕ, меченным ⁶⁸Ga. При этом отношение накопления меченных соединений в опухоли к накоплению в мышце, определяющее качество визуализации опухолей и их метастазов, было также выше у 1а и 1б, чем у ДЕ как на 30 мин, так и на 60 мин после их введения. При этом наибольшая разница наблюдалась на 60 мин после введения (1,0 для ДЕ, 7,5 и 20,0 для 1а и 16 соответственно. Это особенно важно для ПЭТ диагностики с короткоживущим изотопом ⁶⁸Ga.

Полученные данные указывают на существенно лучшее качество визуализации опухоли с использованием РФС на основе октапептидов 1а и 1б, чем РФС на основе известного соединения DOTA ТАТЕ (ДЕ).

Радиофармацевтическое средство используют для диагностики опухолей, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы, или их метастазов.

Источники информации

1. Q J. Nucl. Med., Mol. Imaging., 49(3):225-35(2005).

2. Q J. Nucl. Med.,46, 172S-178S (2005).

3. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging., 34, 982-993 (2007).

4. Q J. Nucl. Med. Mol. Imaging., 51: 244-50 (2007).

5. Eur J. Nucl. Med. Mol. Imaging., 34: 1617-1626 (2007).

6. J. Nucl. Med., 51: 875-882 (2010).

7. J. Clin Oncol., 23: 2754-2762 (2005).