способ культивирования каллусной ткани centaurea scabiosa l

Формула изобретения

Способ культивирования каллусной ткани Centaurea Scabiosa l., включающий получение каллусной культуры из эксплантов интактных растений путем приготовления питательной среды Мурасиге-Скуга с дальнейшим разливом среды и выращиванием каллусной культуры, отличающийся тем, что каллусную культуру получают на среде Мурасиге-Скуга с добавлением 0,5-1 мг/л НУК ( -нафтилуксусной кислоты) и 0,2-0,5 мг/л БАП (6-бензиламинопурин), разливом среды Мурасиге-Скуга в пластиковые чашки Петри, пересадкой каллусной культуры в эти чашки и дальнейшим выращиванием каллусной культуры в пластиковой чашке Петри на синем свету (380-560 нм).

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений. Область применения - медицинская промышленность, получение нового вида сырья биологически активных веществ растительного происхождения.

Известен способ выращивания каллусной культуры Cistanche deserticola (статья Jie Ouyang, Xiaodong Wang, Bing Zhao, Yuchun Wang. Light intensity and spectral quality influencing the callus growth of Cistanche deserticola and biosynthesis of phenylethanoid glycosides // Plant Science - 2003 - Vol.165, pp.657-661). Каллусную культуру Cistanche deserticola получали из интактных растений, выращенных из предварительно простерилизованных семян, на среде Мурасиге-Скуга, содержащей дополнительно 1 мг/л 2,4-Д, 0.5 мг/л кинетина и 1 мг/л гиббереллиновой кислоты. Полученные каллусы переносили на среду В5 в колбы Эрленмейера и выращивали в условиях освещения селективным светом интенсивностью 24 мкмоль/м² с. Установлено, что синий свет стимулировал накопление биомассы каллусной культуры и фенилэтаноидных гликозидов в ней по сравнению с культурой, выращиваемой на белом свету.

Недостатком известного способа является то, что он был использован для культивирования только Cistanche deserticola, относящейся к семейству Orobanchaceae (Заразиховые), в то время как Centaurea scabiosa относится к семейству Asteraceae или Compositae (Астровые или Сложноцветные). Для выращивания каллусной культуры используется среда В5, имеющая измененный состав основных макро- и микросолей по сравнению с средой MS. Дополнительно в среду добавляют гидролизат казеина, что усложняет и увеличивает стоимость приготовления питательной среды, особенно в больших объемах.

Известен способ культивирования in vitro клеточной культуры трансгенного табака Nicotiana tabacum l., содержащего ген интерлейкина-18 человека (патент РФ № 2354692, C12N 5/04, опубл. 10.05.2009 г.) Изобретение может быть использовано в фармакологии для выращивания биомассы клеточной культуры трансгенного табака Nicotiana tabacum L., содержащего ген интерлейкина-18 человека, а также в исследовательских целях. Семена трансгенных растений Nicotiana tabacum L. стерилизуют, переносят на безгормональную питательную среду и проращивают in vitro на свету в течение 28 суток. Полученные проростки рассекают на сегменты размером 0,2-0,3 см², переносят на модифицированную питательную среду, включающую 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту, индолилуксусную кислоту и кинетин. Для стерилизации семян используют раствор, состоящий из 96%-ного этанола, 37%-ной перекиси водорода и воды в объемном соотношении 7,5:1:1. Образовавшийся каллус, содержащий ген интерлейкина-18 человека, культивируют в темноте в течение 21-28 суток и размножают пассированием до требуемого количества.

Недостатком известного способа является то, что для культивирование используется клеточная культура трансгенного табака Nicotiana tabacum, что мешает применить полученные данные к клеточным культурам растений других родов и семейств. Также недостатком является то, что используется трансгенное растение, введение чужеродного гена может отрицательно сказаться на функционировании генома и привести в дальнейшем к генным и хромосомным нарушениям, что будет мешать стабильному выращиванию данной культуры. Получение трансгенных растений для культивирования связано с большим объемом предварительных работ по созданию генетической конструкции и внедрению ее в растительный геном.

Известен способ культивирования Artemisia annua L. (статья Yuchun Wang, Haoxian Zhang, Bing Zhao, Xiaofan Yuan. Improved growth of Artemisia annua L hairy roots and artemisinin production under red light conditions // Biotechnology Letters - 2001 - Vol.23, pp.1971-1973). В настоящем изобретении культуру генетически-модифицированных корней (hairy-root) выращивают в жидкой питательной среде Мурасиге-Скуга, с добавлением сахарозы 30 г/л на орбитальном шейкере (120 об/мин) при 25±1ºС на свету с интенсивностью 25 мкмоль/м ² с и фотопериодом 16 часов. Для ускорения роста культуру освещали красным, синим, зеленым и желтым светом, интенсивностью 25 мкмол/м²с и фотопериодом 16 часов. Установлено, что красный свет стимулирует рост культуры hairy-root и накопление сесквитерпенового лактона артемизинина в отличие от других участков спектра.

Недостатками известного способа является то, что данный способ культивирования применим к определенному виду однолетнего растения - Artemisia annua L., в то время как авторами установлен оптимальный световой режим культивирования для многолетнего растения Centaurea scabiosa L. Кроме того, данный способ культивирования изучен только на культуре hairy-root Artemisia annua L., мало используемой в практической деятельности, не исследовано его применение для выращивания каллусных и суспензионных культур, которые составляют основу промышленной биотехнологии растений. Для получения культуры hairy-root используется генетическая модификация клеток Ti-плазмидой бактериальной культурой Agrobacterium rhizogenes, что может приводить к нарушениям работы генетического аппарата растительных клеток, снижению жизнеспособности, ростовых параметров и продуктивности первичного и вторичного метаболизма.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа культивирования каллусной ткани Centaurea scabiosa L., перспективной в качестве возможного источника сесквитерпеновых лактонов лекарственного действия, с целью ускорения ее роста и высокого выхода биомассы, посредством применения определенного режима освещения.

Поставленная задача решается тем, что культивирование каллусной ткани Centaurea scabiosa L. включает в себя получение каллусной культуры из эксплантов интактных растений путем выращивания эксплантов на питательной среде Мурасиге-Скуга с дальнейшем разливом среды и выращиванием каллусной культуры, но в отличие от прототипа каллусную культуру получают на среде Мурасиге-Скуга с добавлением 0,5-1 мг/л НУК ( -нафтилуксусной кислоты) и 0,2-0,5 мг/л БАП (6-бензиламинопурин). Полученную каллусную культуру затем пересаживают в пластиковые чашки Петри со средой Мурасиге-Скуга без изменения ее состава и в дальнейшем культивируют на синем свету (380-560 нм).

Модифицированная питательная среда Мурасиге-Скуга содержит компоненты в следующем количественном соотношении, мг/л:

KNO3	1900
NH4 NO3	1650
CaCl2	332
MgSO47H 2O	370
KH2 PO4	170
FeSO4 7H2O	27,85
Na2 ЭДTA	37,25
Н3ВО 3	6,2
MnSO45H 2O	24,1
ZnSO4 7H2O	8,6
Na2 MoO4	0,25
KI	0,83
CuSO 45H2O	0,025
CoCl 26H2O	0,025
Пиридоксин	1,0
Тиамин хлорид	1,0
Никотинамид	2,0
НУК	1-0,5
6-БАП	0,5-0,2
Сахароза	15000
Глюкоза	15000
Агар	9000
Вода	До 1 л

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей, при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей, Fe-хелата, витаминов. Макро- и микросоли, Fe-хелат, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют 6-БАП (6-бензиламинопурин), НУК ( -нафтилуксусная кислота), сахарозу и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 250 мл насыпают по 1,35 г агара, разливают среду по 150 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,2-1,4 атм. Простерилизованную питательную среду в асептических условиях разливают в стерильные пластиковые чашки Петри диаметром 90 мм по 15-20 мл на каждую чашку. Ткань высаживают в возрасте 25-30 суток, инокулюм 200-300 мг. Культивирование каллусной ткани проводится при 26±1ºС в условиях освещения синим светом интенсивностью 160 мкМ м ²/с люминесцентными лампами Philips TL-D 36W/18. Световой поток выровнен по падающим квантам.

Примеры осуществления изобретения приведены ниже.

Пример 1

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNО₃ 1900 мг/л, NH₄NO₃ 1650 мг/л, MgSO₄7H₂O 370 мг/л, KH₂ PO₄ 170 мг/л), при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей (Н₃ ВО₃ 6,2 мг/л, MnSO₄5H₂O 24,1 мг/л, ZnSO₄7H₂O 8,6 мг/л, Na₂ MoO₄2Н₂О 0,25 мг/л, KI 0,83 мг/л, CuSO ₄5H₂O 0,025 мг/л, СоСl₂6Н₂ O 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO₄7H₂O 27,85 мг/л, Nа₂ЭДТА 37,25 мг/л), CaCl₂ (CaCl ₂6H₂O 332 мг/л), витаминов (Пиридоксин 1,0 мг/л, Тиамин хлорид 1,0 мг/л, Никотинамид 1,0 мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, СаСl₂, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют 6-БАП (0,5 мг/л), НУК (0,2 мг/л), сахарозу (30000 мг/л) и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 250 мл насыпают по 1,35 г агара, разливают среду по 150 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,2-1,4 атм. Затем в ламинаре простерилизованную питательную среду разливают в стерильные пластиковые чашки Петри диаметром 90 мм по 15-20 мл на каждую чашку. Ткань высаживают в возрасте 25-30 суток, инокулюм 200-300 мг. Культивирование каллусной ткани проводится при 26±1ºС в условиях освещения синим светом интенсивностью 160 мкМ м²/с люминесцентными лампами Philips TL-D 36W/18. Световой поток выровнен по падающим квантам.

Пример 2

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO₃ - 1900 мг/л, NH₄NO₃ - 1650 мг/л, MgSO₄7H ₂O - 370 мг/л, КH₂PO₄ - 170 мг/л), при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей (Н₃ВО₃ - 6,2 мг/л, MnSO₄5H₂O - 24,1 мг/л, ZnSO ₄7H₂O - 8,6 мг/л, Na₂MoO₄ 2H₂O - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, СuSO₄ 5Н₂O - 0,025 мг/л, СоСl₂6Н₂O - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO₄7H₂O - 27,85 мг/л, Nа₂ЭДТА - 37,25 мг/л), CaCl₂ (CaCl ₂6H₂O - 332 мг/л), витаминов (Пиридоксин - 1,0 мг/л, Тиамин хлорид - 1,0 мг/л, Никотинамид - 1,0 мг/л). Макро- и микросоли, Fе-хелат, СаСl₂, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют 6-БАП (1 мг/л), НУК (0,5 мг/л), сахарозу (30000 мг/л) и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 250 мл насыпают по 1,35 г агара, разливают среду по 150 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,2-1,4 атм. Затем в ламинаре простерилизованную питательную среду разливают в стерильные пластиковые чашки Петри диаметром 90 мм по 15-20 мл на каждую чашку. Ткань высаживают в возрасте 25-30 суток, инокулюм 200-300 мг. Культивирование каллусной ткани проводится при 26±1ºС в условиях освещения синим светом интенсивностью 160 мкМ м²/с люминесцентными лампами Philips TL-D 36W/18. Световой поток выровнен по падающим квантам. В Таблице 1 приведен ростовой индекс каллусной культуры Centaurea scabiosa L., выращенной на свету разного спектрального состава.

Таблица 1
Ростовой индекс каллусной культуры Centaurea scabiosa L., выращенной на свету разного спектрального состава
Вариант	Ростовой индекс
Темнота	2,1±0,2
Белый свет	1,8±0,3
Красный свет	2,6±0,2
Синий свет	4,0±0,4
Зеленый свет	2,6±0,6