растительная стволовая клеточная линия, полученная из покоящегося центра, и способ ее выделения

Формула изобретения

1. Способ выделения клеточной линии из покоящегося центра, включающий культивирование содержащей покоящийся центр ткани корня растения, в среде, содержащей 2,4-D, отбор белой недифференцированной ткани из культивируемой ткани, где упомянутая получаемая из покоящегося центра клеточная линия обладает следующими характеристиками:

(а) клеточная линия в суспензионной культуре находится в одноклеточном состоянии;

(б) для клеточной линии показано, что морфологически ее ядра больше, чем в клеточных линиях корня того же растения;

(в) клеточная линия окружена слизистыми веществами;

(г) клеточная линия растет стабильно и дольше по сравнению с клеточными линиями корня того же растения; и

(д) клеточная линия демонстрирует высокую жизнеспособность при криоконсервации.

2. Способ по п.1, где содержащую покоящийся центр ткань корня растения получают из проросших стерильных растительных семян или из ткани корня, дифференцированной из каллюса, полученного из части растения.

3. Клеточная линия, полученная из покоящегося центра растения, которая обладает следующими характеристиками:

(а) клеточная линия в суспензионной культуре находится в одноклеточном состоянии;

(б) для клеточной линии показано, что морфологически ее ядра больше, чем в клеточных линиях корня того же растения;

(в) клеточная линия окружена слизистыми веществами;

(г) клеточная линия растет стабильно и дольше по сравнению с клеточными линиями корня того же растения; и

(д) клеточная линия демонстрирует высокую жизнеспособность при криоконсервации.

4. Клеточная линия по п.3, где растение выбирают из группы, содержащей рис, кукурузу, Pisum sativum, Avena sativa, Allium сера и Arabidopsis.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение относится к клеточной линии, полученной из покоящегося центра растения, и к способу ее выделения, а более конкретно настоящее изобретение относится к гомогенной клеточной линии клонального происхождения, полученной из покоящегося центра, получение которой из покоящегося центра растения проведено без отдельного процесса дедифференцировки, и к способу выделения этой линии.

Уровень техники

Ранее растения использовались в качестве пищевых ресурсов, но в настоящее время их значимость повысилась за счет использования в качестве источника широкого спектра химических веществ, включая действующие вещества лекарственных препаратов, ароматизирующие вещества, пигменты, сельскохозяйственные химикаты и краски. В особенности из-за того, что наиболее полезные субстанции, получаемые из растений, обладают физиологической активностью, такой как антивирусная, антибактериальная, противоопухолевая и антиоксидантная активности, а растения рассматриваются как идеальные источники ресурсов, которые могут быть превращены в новые лекарственные препараты, и для выяснения отношений между химическими структурами и активностями ведутся активные исследования многих веществ растительного происхождения.

Однако физиологически активные вещества сложны для преобразования в лекарственные препараты, и основными причинами этого является следующее. Во-первых, содержание физиологически активных веществ в растениях весьма ограничено. Во-вторых, скорость роста растений очень низкая. В-третьих, физиологически активные вещества, получаемые из растений, присутствуют только в специфических органах растений в небольших количествах. В-четвертых, имеют место проблемы взаимодействия с окружающей средой, связанные с разрушением природы. В-пятых, физиологически активные вещества, получаемые из растений, обладают очень сложной химической структурой, требующей многостадийных процессов полимеризации, что приводит к экономическим проблемам, связанным с высокими издержками производства. По этим причинам очень тяжело удовлетворять потребности в получаемых из растений физиологически активных веществах в коммерческих целях.

При этом один из биоинженерных подходов, а именно способ культивирования растительных клеток, в течение длительного периода времени рассматривался как наиболее идеальный, способный удовлетворить потребности в полезных веществах растительного происхождения, не вызывая проблем с окружающей средой. В соответствии с Korean Patent Publication 1995-0000870 производство полезных веществ культурой растительных клеток дает множество преимуществ по сравнению с методами экстракции полезных веществ непосредственно из растений. В частности, способ культивирования растительных клеток рассматривается в качестве оптимального способа, позволяющего осуществлять непрерывное производство без влияния внешней среды и позволяющего, в отличие от предшествовавших экстракционных способов, обойти нерешаемые проблемы, такие как разрушение экосистем. Однако несмотря на большой интерес и усилия, предпринимаемые в культивировании растительных клеток, на данный момент существует мало примеров успешной индустриализации культуры растительных клеток. Это происходит потому, что по-прежнему серьезными проблемами являются варьирование роста клеток и производительности в ряде растительных клеточных культур.

В растительных экспрессирующих системах используются растительные клетки, а ткани, такие как, например, листья, стебли и семена, которые дифференцируются из растительных клеток, являются постоянными тканями, и клетки в них больше не делятся. По этой причине, для преобразования тканей в клеточную линию, обладающую способностью к делению, всегда заранее осуществляется процесс дедифференцировки. При культивировании растительной ткани или органа процесс дедифференцировки означает дедифференцировку ткани или клетки, которые уже были дифференцированы для выполнения специфических функций. Однако в процессе дедифференцировки в линии клеток могут происходить серьезные изменения из-за сомаклональной изменчивости.

Таким образом, получение полезных веществ с помощью растительной клеточной культуры может быть индустриализовано, только если в течение продолжительного периода времени стабильно поддерживаются быстрый клеточный рост и высокая метаболическая продуктивность. Однако большинство клеток при субкультивировании подвергаются изменениям. Таким образом, крайне необходимо преодолеть проблему изменчивости в клетках и разработать способ для получения генетически стабильной клеточной линии для получения полезных веществ с помощью культур растительных клеток.

Площадь поверхности корня достаточно большая, т.к. растения должны поглощать необходимые для их роста значительные количества воды и минеральных веществ. На концах корней находятся клетки апикальной меристемы корня, которые делятся, растут, удлиняются и дифференцируют, формируя ткань первичного корня. Апикальная меристема корня закрыта защитным корневым чехликом, а клетки в центре апикальной меристемы корня называются покоящимся центром, т.к. они очень медленно делятся. Покоящийся центр покрыт клетками-предшественниками, которые образуют первичную меристему.

Впрочем, исследований физиологических характеристик апикальной меристемы корня проводится явно недостаточно, даже несмотря на то, что эти характеристики чрезвычайно важны для работы корневой системы растений. Специально проводились исследования, в которых растения, такие как кукуруза, использовались для изучения физиологических характеристик покоящегося центра или апикальных меристем корня, и культивировались в среде для развития корней, однако при этом не было проведено ни одного исследования, в котором, для создания клеточной линии, помимо различных тканей корневой системы, таких как корневой чехлик, сосудистая ткань, перицикл, эндодермис, первичная кора и эпидермис, был использован только покоящийся центр.

Таким образом, покоящийся центр является генетически наиболее стабильной тканью и его выделение сделает возможным изучение развития растений и их генетического происхождения. Соответственно, было необходимо разработать способ выделения гомогенной клеточной линии из покоящегося центра. В последние годы во вновь появившейся области биологии стволовых клеток было проведено множество экспериментов, связанных со стволовыми клетками, включая исследования сигналов, вовлеченных в процессы развития. Однако в случае животных способы выделения и культивирования стволовых клеток были созданы давно, а в случае растений исследования по выделению стволовых клеток не проводятся, либо их проводится очень мало. Таким образом, можно считать, что индукция и выделение полученных из покоящегося центра клеточных линий будет способствовать развитию биологии стволовых клеток.

Соответственно, авторы настоящего изобретения приложили максимум усилий для разработки способа выделения из покоящегося центра клеточной линии клонального происхождения и для получения растительных клеток, которые могут быть использованы в растительных экспрессирующих системах без необходимости проведения процесса дедифференцировки. В результате, настоящие изобретатели выделили клеточную линию из покоящегося центра и обнаружили, что выделенная клеточная линия не подвергается или подвергается минимальным изменениям в течение длительного культивирования, может быть стабильно культивируемой, а также демонстрирует высокую жизнеспособность клеток в процессе криоконсервации, завершив тем самым настоящее изобретение.

Сущность изобретения

Задача настоящего изобретения заключается в предоставлении полученной из покоящегося центра клеточной линии, которую можно стабильно культивировать.

Другая задача настоящего изобретения заключается в предоставлении способа выделения получаемой из покоящегося центра клеточной линии без проведения процесса дедифференцировки.

Для достижения поставленных выше задач, в одном аспекте, настоящее изобретение предоставляет способ выделения получаемой из покоящегося центра клеточной линии, при этом способ содержит: культивирование содержащей покоящийся центр ткани корня растения, и последующий отбор из культивируемой ткани недифференцированной, белой ткани.

В другом аспекте, настоящее изобретение предоставляет полученную из покоящегося центра клеточную линию, которая выделена из покоящегося центра растения и обладает следующими характеристиками:

(а) клеточная линия в суспензионной культуре находится в одноклеточном состоянии;

(б) для нее показано, что морфологически ее ядра больше, чем в клеточных линиях, полученных из тканей, отличных от покоящегося центра;

(в) клеточная линия окружена слизистыми веществами.

(г) при длительной культивации она стабильно поддерживается без морфологических изменений; и

(д) клеточная линия демонстрирует высокую жизнеспособность при криоконсервации.

В еще одном аспекте, настоящее изобретение предоставляет способ сохранения растительной клеточной линии, который содержит этап замораживания упомянутой клеточной линии, полученной из покоящегося центра корня растения.

Другие особенности и аспекты настоящего изобретения будут видны из следующего детального описания и из приложенной формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

На фиг.1А представлена оптическая микрофотография клеточной линии, индуцированной культивированием содержащей покоящийся центр ткани корня риса, и находящейся в состоянии перед выделением из нее покоящегося центра, а на фиг.1В представлена фотография выделенной из ткани клеточной линии покоящегося центра, которую культивировали в течение 4 недель.

На фиг.2 представлено оптическое микроизображение тканей, полученных культивированием содержащей покоящийся центр ткани корня риса, в средах, содержащих 2,4-D(A), CPA(B), IAA(C), IBA(D), NAA(E) и picloram(F).

На фиг.3 представлены оптические микрофотографии, демонстрирующие морфологические наблюдения клеточной линии, полученной из отличных от покоящегося центра тканей корня, (фиг.3(a)) и клеточной линии, полученной из покоящегося центра (фиг, 3(b)).

На фиг.4 представлены оптические микрофотографии тканей, полученных культивированием содержащей покоящийся центр ткани корня риса, в средах, содержащих 2,4-D(A), CPA(B), IAA(C), IBA(D), NAA(E) и picloram(F).

На фиг.5 показаны морфологические изменения, произошедшие в клеточных линиях, полученных из тканей корня, отличных от покоящегося центра, за соответствующий период культивирования.

На фиг.6 показана морфологическая стабильность клеточной линии, полученной из покоящегося центра в соответствии за соответствующий период культивирования.

На фиг.7а представлена оптическая микрофотография (увеличение 400x) клеточной линии, полученной из покоящегося центра, а на 7B представлена оптическая микрофотография (увеличение 400x) клеточной линии, полученной из тканей корня.

На фиг.8 для сравнения представлены оптические микрофотографии клеточной линии, полученной из отличных от покоящегося центра тканей корня (фиг.8(a)), и клеточной линии, полученной из покоящегося центра (фиг.8(b)).

На фиг.9 представлена графическая диаграмма, демонстрирующая скорости агрегации клеточной линии, полученной из отличных от покоящегося центра тканей корня, и клеточной линии, полученной из ткани покоящегося центра.

На фиг.10 для сравнения жизнеспособности после криоконсервации представлены оптические микрофотографии клеточной линии, полученной из отличных от покоящегося центра тканей корня, (фиг.8(a)) и клеточной линии, полученной из покоящегося центра (фиг.8(b)).

На фиг.11 представлена графическая диаграмма, демонстрирующая жизнеспособность после криоконсервации клеточной линии, полученной из отличных от покоящегося центра тканей корня и клеточной линии, полученной из ткани покоящегося центра.

Подробное описание изобретения и предпочтительных вариантов воплощения

Если иное не определено, все использованные здесь технические и научные термины имеют тот же смысл, который вкладывается в них обычным специалистом в данной области. Как правило, определения используемых здесь различных терминов хорошо известны и традиционно используются в данной области.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу выделения получаемой из покоящегося центра клеточной линии, при этом способ содержит: культивирование содержащей покоящийся центр ткани корня растения и последующий отбор из культивируемой ткани белой недифференцированной ткани.

Предпочтительно, если содержащую покоящийся центр ткань корня растения, используемого в настоящем изобретении, получают из проросших стерилизованных семян растения или из ткани корня, дифференцированной из каллюса, полученного из части растения. Также среда, используемая в процессе культивирования, может быть любой известной специалисту в данной области средой для индукции клеточной линии, но предпочтительное культивирование ткани осуществляется в любой из перечисленных сред: среда N6, среда MS, среда Gamborg B5, среда LS и среда KAOM. Более предпочтительно, если культивирование ткани проводится в среде, содержащей 2,4-D. Более того, в настоящем изобретении отбор полученной из покоящегося центра клеточной линии предпочтительно осуществляется по прошествии 3-6 недель с начала культивирования ткани.

Используемый здесь термин "покоящийся центр" относится к группе сферических или дискообразных одиночных клеток, содержащей 500-1000 неактивных клеток и расположенной в центре апикальной меристемы корня. Клетки этой клеточной группы, как известно, задерживаются в G1-фазе клеточного цикла в течение длительного периода и делятся с интервалом около 15-20 дней. Эти клетки обычно существуют в неактивном состоянии и делятся при ранении во время иссечения или после облучения. Как правило, когда корень растения проникает в почву, корневой чехлик эффективно защищает апикальную меристему, но т.к. защита не является совершенной, корневая апикальная меристема иногда повреждается во время роста корня. После этого клетки в покоящемся центре делятся и заново образуют апикальные меристемы и корневые чехлики. Также, после воздействия рентгеновскими лучами, обычные клетки прекращают делиться, а клетки покоящегося центра наоборот немедленно начинают делиться, образуя не подвергшиеся воздействию рентгеновских лучей делящиеся клетки. Другими словами, покоящийся центр является местом, в котором хранятся генетически стабильные клеточные клетки. Покоящийся центр дифференцируется в прокамбий, основную меристему и протодерму, которые являются основными меристемами корня.

Покоящийся центр может быть получен из корней растений. Предпочтительно, если он получен из корня ростка, проросшего из стерилизованных семян, или получен из ткани корня, дифференцировавшей из каллюса, полученного из части растения. Предпочтительно, если эксплантат, полученный путем удаления корневого чехлика с кончика корня и отбора участка толщиной около 1 мм от поверхности до среза, культивируется в среде для индукции клеточной линии. Перед культивированием ткани отобранную ткань корня растения можно подвергнуть стерилизации в соответствии с общими, известными специалистам в данной области, способами. Однако при использовании корня пророщенного из стерилизованных семян ростка отобранная ткань корня не может быть подвергнута отдельному процессу стерилизации. Среда для индукции клеточной линии может быть любой известной специалистам в данной области средой, включая, в качестве неограничивающих примеров, среду N6 (Chu C.C, Proc. Symp. Plant Tissue Cult., Peking, 43, 1978), среду MS (Murashige T. and Skoog F., Physiol. Plant, 15:473, 1962), среду Gamborg B5 (Gamborg O.L. et al., Exp. Cell Res., 50:151, 1968), среду LS (Linsmaier E.M. and Skoog F., Physiol. Plantarum., 18:100, 1965), среду KAOM (Kao K.N. and Michayluk M.R., Planta. (Berl.), 126:105, 1975).

Более предпочтительно, если ткань корня культивируется в среде, содержащей помимо ауксинов 2,4-D. При этом 2,4-D содержится в концентрации 2 мг/л, а более предпочтительно - 2-7 мг/л. Специфические культуральные условия для индукции клеточной линии, период культивирования и т.д., определяются в зависимости от вида и характеристик растительных клеток, и определение таких факторов очевидно для специалиста в данной области.

В культуральной среде наблюдались морфологические различия между клеточной линией, полученной из отличной от покоящегося центра ткани корня, и клеточной линией, полученной из покоящегося центра. Клеточная линия, полученная из отличных от покоящегося центра тканей корня, была гетерогенной и демонстрировала локальную дифференцировку, а клеточная линия, полученная из покоящегося центра, была гомогенной без локальной дифференцировки. Также, при визуальном наблюдении клеточная линия, полученная из отличных от покоящегося центра тканей корня, имела желтый цвет, а клеточная линия, полученная из покоящегося центра, была белой и была окружена слизистыми веществами. Т.е. клеточная линия, полученная из покоящегося центра, имела вид "белой недифференцированной ткани". Под слизистым веществом понимаются муцигены. Муцигены известны как сложные полисахариды, в том числе сахара, органические аминокислоты, витамины, ферменты и аминокислоты, которые секретируются клетками вокруг корневого чехлика и эпидермальными клетками корня.

Соответственно, на основе морфологических различий может быть выбрана только клеточная линия, полученная из покоящегося центра. На фиг.1А представлена фотография, демонстрирующая клеточную линию из покоящегося центра перед выделением. На фиг.1А в красном овале показана клеточная линия из покоящегося центра. На фиг.1В представлена фотография, демонстрирующая полученную из покоящегося центра клеточную линию, которую выделили и культивировали в течение 4 недель.

Отбор клеточной линии, полученной из покоящегося центра, предпочтительно проводится после культивирования в течение 3-6 недель, а более предпочтительно через 4-5 недель культивирования после инокуляции в среду. Через около 3-6 недель после инокуляции, полученная из покоящегося центра клеточная линия индуцируется, и таким образом выделение линии становится легким.

Т.к. покоящийся центр является тканью, которая есть у всех растений, то предложенный способ выделения клеточной линии из покоящегося центра может быть применен ко всем растениям, и, таким образом, клеточная линия покоящегося центра может быть получена из всех растений. Т.е., в одном примере настоящего изобретения клеточную линию изолировали из покоящегося центра ткани корня риса и кукурузы, но для специалиста в данной области будет очевидно, что способ настоящего изобретения может быть применен ко всем растениям, обладающим покоящимся центром. Примерами растений, из которых может быть получена клеточная линия из покоящегося центра, могут являться в качестве неограничивающих примеров рис, кукуруза, Pisum sativum, Avena sativa, Allium сера и Arabidopsis. Примерами растений, у которых были изучены физиологические характеристики покоящегося центра, могут являться кукуруза, Arabidopsis, Allium сера, Avena sativa, Pisum sativum и т.д. [Maize: Georgina Ponce et al., Plant Cell and Environment, 28:719, 2005; Keni Jiang et al., Development, 130:1429, 2003: Arabidopsis: Noriko Kamiya et al., The Plant Journal, 35:429, 2003; Peter Doerner, Current Biology, 8:R42, 1998; Allium сера: R.Liso, New Phytol., 110:469, 1998; Avena sativa: F.A.L. [fuzzy] Clowes, New Phytol., 129, 1982; Pisum sativum: Peter Doerner, Current Biology, 8:R42, 1998].

В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенной из покоящегося центра клеточной линии, полученной из покоящегося центра растения и обладающей следующими характеристиками:

(а) клеточная линия в суспензионной культуре находится в одноклеточном состоянии;

(б) для нее показано, что морфологически ее ядра больше, чем в клеточных линиях, полученных из тканей, отличных от покоящегося центра

(в) клеточная линия окружена слизистыми веществами.

(г) клеточная линия стабильно поддерживается без морфологических изменений в процессе длительного культивирования; и

(д) клеточная линия демонстрирует высокую жизнеспособность при криоконсервации.

Клеточная линия, выделенная из покоящегося центра по настоящему изобретению, демонстрирует в качестве морфологической характеристики относительно крупных ядер. Было отмечено, что размер ядра был равен около 2-4 мкм и был больше, чем ядро в других клеточных линиях, полученных из отличных от покоящегося центра тканей.

Клеточная линия, выделенная из покоящегося центра по настоящему изобретению, также демонстрирует очень стабильный клеточный рост без каких-либо морфологических изменений, даже при длительном культивировании. В другом Примере настоящего изобретения было отмечено, что клеточная линия, полученная из покоящегося центра, стабильно культивировалась без морфологических изменений, даже при культивировании более 16 недель. С другой стороны, при длительном культивировании линии клеток, полученной из отличных от покоящегося центра тканей корня, было отмечена некоторая локальная дифференциация и, в частности, было показано отчетливое развитие придаточных корней.

К тому же клетки растений культивируются в виде клеточных агрегатов, в отличие от микробных клеток, которые культивируются в одноклеточном состоянии. В этих клеточных агрегатах существует определенная разница отношений с окружающей средой внутри и снаружи агрегата, что вносит изменения в рост клеток и в получение из них полезных веществ. Однако подобные изменения невозможны у полученной из покоящегося центра клеточной линии по настоящему изобретению, т.к. она в суспензионной культуре находится в одноклеточном состоянии.

Полученная из покоящегося центра клеточная линия по настоящему изобретению может быть использована в растительной экспрессирующей системе для стабильного получения полезных веществ. Также полученная из покоящегося центра клеточная линия по настоящему изобретению может культивироваться в соответствии со способом культивирования растительных клеток в суспензии, а специфический способ культивирования может быть осуществлен в известной в данной области манере.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу для сохранения растительной клеточной линии, который содержит этап замораживания упомянутой клеточной линии, выделенной из покоящегося центра корней растения.

Обычно растительные клетки демонстрируют низкую жизнеспособность при криоконсервации, но полученная из покоящегося центра клеточная линия по настоящему изобретению демонстрирует более чем на 85% более высокую жизнеспособность при использовании традиционного способа криоконсервации клеток. Возможность криоконсервации клеточных линий позволяет наладить стабильное предоставление сырья и позволяет создавать маточные банки клеток. Таким образом, выделенная из покоящегося центра клеточная линия по настоящему изобретению может предоставляться долгосрочно и стабильно.

Мир сейчас находится в состоянии войны за обеспечение безопасности исследовательских материалов (биологических ресурсов), а также за сохранение и идентификацию ставших важной государственной собственностью биологических ресурсов, таких как ткани человека, семена растений, микроорганизмы, клетки и гены, для разработки различных новых лекарственных средств и для улучшения качества пищи.

Соответственно, поскольку обеспечение безопасности исследовательских материалов ведет к повышению национальной конкурентоспособности, необходимо создавать банки клеточных линий для развития, сбора, сохранения и распространения клеточных линий, используемых в качестве незаменимых материалов в исследованиях в области бионаук. Таким образом, после создания таких банков растительных клеток снабжение исследовательскими материалами становится простым, а время исследований с использованием растительных клеточных линий сокращается.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Далее по тексту настоящее изобретение будет описано более подробно с отсылкой на примеры. Для специалиста в данной области будет очевидно, что эти примеры приведены исключительно в иллюстративных целях и не должны трактоваться с ограничением сферы применения настоящего изобретения, т.к. эти примеры могут модифицироваться в другие различные формы.

Пример 1. Выделение клеточной линии из покоящегося центра риса

1-1: Подготовка растительного материала

Семена риса очищали, поверхностно стерилизовали с помощью 70% этанола в течение 1 минуты, замачивали в 2% растворе гипохлорита натрия в течение 1 часа и затем отмывали один или два раза стерильной водой. Отмытые семена промывали достаточным объемом стерильной воды в течение 30 минут и затем высушивали для полного удаления влаги.

Подсушенные семена высевали в среду N6 (CHU MEDIUM, Chu C.C., Ргос. Symp. Plant Tissue Cult. Peking, 43, 1978) и культивировали при 25°C в течение 5 дней, до их прорастания. Состав среды N6 представлен в таблице 1 ниже.

Таблица 1
Состав	Концентрация
Макроэлементы	CaCl 2*2H2O	1,13 мМ	125,33 мг/л
KH2 PO4	2,94 мМ	400,00 мг/л
KNO3	29,99 мМ	2830,00 мг/л
MgSO4*7H2O	0,75 мМ	90,27 мг/л
(NH4 )2SO4	3,50 мМ	463,00 мг/л
Состав	Концентрация
Микроэлементы	FeNaEDTA	0,10 мМ	36,70 мг/л
H3BO3	25,88 мкМ	1,60 мг/л
KI	4,81 мкМ	0,80 мг/л
MnSO4 *4H2O	19,70 мкМ	3,33 мг/л
ZnSO4 *7H2O	5,22 мкМ	1,50 мг/л
Состав	Концентрация
Витамины	Глицин	26,64 мкМ	2,00 мг/л
Тиамин-HCl	2,96 мкМ	1,00 мг/л
Пиридоксин-HCl	2,43 мкМ	0,50 мг/л
Никотиновая кислота	4,06 мкМ	0,50 мг/л

Затем отбирали содержащую покоящийся центр ткань корня пророщенных в течение 5-6 дней растений. Удаляли с кончика корня корневой чехлик и отбирали в качестве эксплантата фрагмент толщиной 1 мм от поверхности до линии среза.

1-2: Индукция и выделение клеточной линии из покоящегося центра

(1) Эксплантат, отобранный в примере 1-1, инокулировали в среды N6, содержащие по 2 мг/л, 3 мг/л и 4 мг/л 2,4-D, и в среды N6, содержащие другие гормоны-ауксины, а именно: IAA (индолил-3-уксусную кислоту), IBA (индолил-3-маслянную кислоту), NAA (1-нафталенуксусную кислоту), CPA(p-хлорфеноксиуксусную кислоту) или Picloram (4-амино-3,5,6-трихлорпиколиновую кислоту), в указанных выше концентрациях.

В результате, в случае 2,4-D-содержащих сред, индукция клеточных линий наблюдалась через 30 дней после инокуляции. В 2,4-D-содержащих средах скорость индукции полученных из покоящегося центра клеток не увеличивалась пропорционально концентрации химического соединения и демонстрировала сходные скорости индукции при концентрациях 2 мг/л и выше. Соответственно, было видно, что эксплантат целесообразно культивировать при концентрации более чем 2 мг/л. Дополнительно были проведены эксперименты при концентрациях 1 мг/л, 4 мг/л, 5 мг/л, 6 мг/л и 7 мг/л и в результате было показано, что наиболее целесообразно культивировать эксплантат при концентрациях 2-7 мг/л.

С другой стороны, на фиг.2 показано, что индукция не прошла с ауксинами, отличными от 2,4-D, и в эксплантатах появились придаточные корни. На фиг.2: "A" - ткань, культивируемая в средах, содержащих 2,4-D; "B" - ткань, культивируемая в средах, содержащих CPA; "C" - ткань, культивируемая в средах, содержащих IAA; "D" - ткань, культивируемая в средах, содержащих NAA; и "F" - ткань, культивируемая в средах, содержащих Picloram.

Соответственно, видно, что полученная из покоящегося центра клеточная линия, была специфично индуцирована 2,4-D.

(2) На фиг.1A показано, что при культивировании в содержащих 2,4-D средах наблюдались морфологические различия между клеточной линией, полученной из отличных от покоящегося центра тканей корня, и клеточной линией, полученной из покоящегося центра. В частности, клеточная линия, полученная из отличной от покоящегося центра тканей корня, была гетерогенной и была локально дифференцирована, а клеточная линия, полученная из покоящегося центра, была гомогенной без локальной дифференцировки. При визуальном наблюдении было отмечено, что клеточная линия, полученная из отличных от покоящегося центра тканей корня, имела желтый цвет, а клеточная линия, полученная из покоящегося центра, была белой и была окружена слизистыми веществами. Недифференцированную ткань белого цвета, т.е. клеточную линию из покоящегося центра, выделяли через 3-6 недель, основываясь на морфологической разнице. На фиг.1А в красном овале показана клеточная линия, образованная покоящимся центром.

(3) На фиг.3 представлены фотографии, демонстрирующие морфологическое наблюдение клеточной линии, образованной отличными от покоящегося центра тканями корня (a), и морфологическое наблюдение клеточной линии, образованной покоящимся центром (b). На фиг.3 видно, что клеточная линия, образованная отличными от покоящегося центра тканями корня, была гетерогенной и была локально дифференцирована, а клеточная линия, образованная покоящимся центром, была гомогенной, без дифференцированных участков.

(4) При этом, в случае, когда клеточную линию, образованную покоящимся центром, не выделяли через 3-6 недель и позволяли смешаться с клеточной линией, образованной отличными от покоящегося центра тканями корня, происходила денатурация слизистых компонентов. Считается, что эта денатурация происходит из-за фенольных соединений выделяемых образованной другими тканями клеточной линией, т.к. синтез фенольных компонентов активно идет в дифференцированных тканях.

Пример 2. Выделение клеточной линии из покоящегося центра кукурузы.

Семена кукурузы проращивали также, как и в примере 1-1, и эксплантат, содержащий покоящийся центр, отбирали из корня проросшего растения. Затем эксплантат культивировали в средах, содержащих 2,4-D, CPA, IAA, IBA, NAA и Picloram, так же, как и в примере 1-2, и наблюдали, происходит ли индукция клеточной линии из покоящегося центра.

В результате, как показано на фиг.4, при культивировании эксплантата, содержащего покоящийся центр кукурузы, индукция клеточной линии наблюдалась в средах содержащих 2,4-D, так же, как и при культивировании эксплантата, содержащего покоящийся центр риса. Однако в случае ауксинов, отличных от 2,4-D, после инокуляции эксплантата клетки не индуцировались, и в эксплантатах развивались придаточные корни. На фиг.4, "A" - ткань, культивируемая в средах, содержащих 2,4-D; "B" - ткань, культивируемая в средах, содержащих CPA; "C" - ткань, культивируемая в средах, содержащих IAA; "D" - ткань, культивируемая в средах, содержащих NAA; и "F" - ткань, культивируемая в средах, содержащих Picloram.

Соответственно, видно, что даже в случае отличных от риса содержащих покоящийся центр растений, клеточные линии могут быть специфично индуцированы из покоящегося центра при использовании 2,4-D.

Пример 3. Наблюдение характеристик клеточной линии, образованной покоящимся центром риса

3-1: Наблюдение морфологических изменений во время длительного культивирования

Выделенную из покоящегося центра клеточную линию примера 1, инокулировали в культуральную среду того же состава, что и среда для индукции клеточных линий из примера 1-2, т.е. в среду N6, содержащую 2 мг/л 2,4-D, и дали возможность клеточной линии пролиферировать в этой среде. Пролиферировавшие клетки покоящегося центра наблюдали после 4 и 16 недель клеточного роста. При этом для контроля, пролиферировали клеточные линии, полученные из отличных от покоящегося центра тканей корня, так же, как описано выше, и затем наблюдали морфологические изменения клеток.

На фиг.5, показаны морфологические изменения полученной из тканей корня клеточной линии через 4 недели культивирования (фиг.5А) и через 16 недель культивирования (все остальные фотографии фиг.5). После 16 недель культивирования в клеточном агрегате наблюдалось несколько участков локальной дифференцировки, и, в частности, можно было отчетливо наблюдать развитие придаточных корней.

С другой стороны, как показано на фиг.6, при культивировании клеточной линии полученной из покоящегося центра не было видно каких-либо морфологических изменений ни через 4 недели, ни через 16 недель культивирования.

Соответственно, можно констатировать, что клеточные линии, полученные из отличных от покоящегося центра тканей корня, претерпевают с течением времени быстрые морфологические изменения, а клеточная линия, полученная из покоящегося центра, остается морфологически стабильной. Как описано выше, клеточная линия, образуемая покоящимся центром по настоящему изобретению, являясь клональной клеточной линией, в процессе длительного культивирования остается стабильной, не претерпевая изменений. Таким образом, она весьма предпочтительна при выборе клеточной линии с высокой продуктивностью и способностью к стабильному производству веществ.

При этом выделенная из покоящегося центра клеточная линия обладает морфологически большими ядрами. Как показано на фиг.7А, размер клетки клеточной линии составляет около 10-20 мкм, а размер ядра - около 2-4 мкм. С другой стороны, как показано на фиг.7B, размер ядра клеточной линии получаемой из отличных от покоящегося центра тканей корня, был очень мал по сравнению с клеточной линией из покоящегося центра.

3-2: Наблюдение за клеточными агрегатами при суспензионном культивировании

Клетки растений культивировали в виде клеточных агрегатов без культивирования в одноклеточном состоянии, при этом клеточный агрегат состоял из нескольких сотен растительных клеток. Этот клеточный агрегат является причиной возникновения определенной разницы отношений с окружающей средой внутри и снаружи агрегата, что вносит изменения в рост клеток и в процесс получения из них полезных веществ. Соответственно, наблюдали, агрегируют ли при суспензионном культивировании клеточная линия, получаемая из покоящегося центра, и клеточная линия, полученная из отличных от покоящегося центра тканей корня.

В результате, на фиг.8 и фиг.9 было показано, что клеточная линия, полученная из отличных от покоящегося центра тканей корня, культивировалась в виде клеточных агрегатов, состоящих от нескольких клеток до нескольких сотен клеток, а клеточная линия, полученная из покоящегося центра, культивировалась в одноклеточном состоянии. На фиг.8 показаны клеточные уровни клеточной линии получаемой из отличных от покоящегося центра тканей корня (фиг.8(a)) и клеточной линии, полученной из покоящегося центра (фиг.8(b)). На фиг.9 представлена графическая диаграмма, демонстрирующая степень агрегации клеточной линии получаемой из отличных от покоящегося центра тканей корня и клеточной линии, получаемой из покоящегося центра.

3-3: Проверка жизнеспособности в процессе криоконсервации

Способ криоконсервации клеточных линий необходим для снабжения сырьевыми материалами и для создания маточных клеточных банков. Способ криоконсервации широко распространен при работе с клетками животных, но его применение при работе с клетками растений ограничено, т.к. клетки растений обладают низким уровнем жизнеспособности при криоконсервации. Соответственно, жизнеспособность клеточной линии, получаемой из покоящегося центра, при криоконсервации проверялась следующим образом.

Клеточную линию, полученную из покоящегося центра в примере 3-2, инокулировали и культивировали в суспензии в течение 6-7 дней. Суспензионную культуру прекультивировали в среде, содержащей 0,16 М маннитол, при комнатной температуре в течение 3 дней и затем инкубировали при 4°C в течение 3 часов. Обработанные низкой температурой клетки собирали, и переносили в среду с Cryobial (Duran, США), содержащую 40% этиленгликоль (Sigma, США) и 30% сорбитол (DUCHEFA, Нидерланды) и затем культивировали при 4°C в течение 3 минут. Затем, культивируемые клетки, обработанные криоконсервантом, погружали в жидкий азот и замораживали в нем. Затем, для оттаивания, выдержанные в жидком азоте, по меньшей мере 10 минут, культивированные клетки, помещали в водяную баню с температурой 40°C и выдерживали в ней в течение 1-2 минут. Для возобновления роста клеток, фильтрат, содержащий клетки, помещали в среду, содержащую 0,5 М сорбитол, и стабилизировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем клетки культивировали в среде, содержащей 0,1 М сорбитол, в течение 24 часов, затем в среде без сорбитола в течение 24 часов и затем в среде без сорбитола в течение 24 часов. После чего проверяли жизнеспособность клеток.

В результате, как показано на фиг.10 и фиг.11, жизнеспособность клеточной линии, полученной из отличных от покоящегося центра тканей корня, составляла менее чем 10%, а жизнеспособность клеточной линии по настоящему изобретению, полученной из покоящегося центра, составляла более чем около 85%. На фиг.10 представлены фотографии, демонстрирующие уровень жизнеспособности клеточной линии, полученной из отличных от покоящегося центра тканей корня (a) и уровень жизнеспособности клеточной линии, полученной из покоящегося центра (b). На фотографиях клетки окрашены после криоконсервации Синим Эванса, а на фиг.11 представлена графическая диаграмма, демонстрирующая уровни жизнеспособности линий.

Соответственно, видно, что клеточная линия по настоящему изобретению, полученная из покоящегося центра, может быть подвергнута криоконсервации, в отличие от обычных клеток растений, которые не могут быть подвергнуты криоконсервации из-за низкого уровня жизнеспособности. Это наводит на мысль о том, что полученная из покоящегося центра клеточная линия подходит для длительной консервации.

Промышленная применимость

Как описано выше, гомогенная клеточная линия, выделенная из покоящегося центра в соответствии со способом настоящего изобретения, является полезным исследовательским инструментом для изучения эволюционного и генетического происхождения растений и вносит вклад в развитие биологии растительных стволовых клеток. При этом клеточная линия по настоящему изобретению, полученная из покоящегося центра, сохраняется в течение длительного периода времени без морфологических изменений и культивируется в суспензии в виде одноклеточной культуры. Соответственно, клеточная линия позволяет производить различные полезные вещества растительного происхождения безопасно и эффективно и позволяет создавать банки растительных клеток с помощью криоконсервации, т.к. демонстрирует уровень жизнеспособности более 85% при криоконсервации, в отличие от других растительных клеток. В частности, клеточная линия, полученная по настоящему изобретению, обладает преимуществами, заключающимися в том, что из такой клеточной линии могут быть созданы банки растительных клеток, что упрощает снабжение исследовательскими материалами и сокращает время исследований с использованием растительных клеточных линий.

Хотя настоящее изобретение описано в деталях со ссылкой на специфические характеристики, для специалиста в данной области будет очевидно, что это описание является всего лишь предпочтительным воплощением и не лимитирует сферу применения настоящего изобретения. Таким образом, реальная сфера применения настоящего изобретения будет определяться приложенной формулой изобретения или ее эквивалентами.