способ стабилизации вируса ньюкаслской болезни для хранения в водном растворе и способ сохранения его стабильности

Формула изобретения

1. Способ стабилизации вируса ньюкаслской болезни для хранения в водном растворе в течение 6 месяцев или более при температуре от -30°С до -10°С, включающий в себя приготовление водного раствора, содержащего:

вирус ньюкаслской болезни в концентрации от 1·10¹⁰ БОЕ/мл до 7·10 ¹⁰ БОЕ/мл; и

сахарозу или трегалозу в концентрации от 7,5% (мас./об.) до 15% (мас./об.),

при этом раствор

имеет осмотическое давление 250-300 миллиосмоль;

имеет рН от 7 до 9;

и содержит десять частей на миллион или меньше каждого из восстановителей, антиоксидантов, хлорида натрия, декстрана, маннита, сорбита, твина, глутамата, полиэтиленгликоля, хлорида кальция, фосфатидилхолина, глицина и фосфата.

2. Способ по п.1, в котором раствор дополнительно содержит лизин в концентрации 1% (мас./об.).

3. Способ по п.1, в котором температура хранения составляет -20°С.

4. Способ по п.1, в котором осмотическое давление составляет 300 миллиосмоль.

5. Способ сохранения стабильности имеющего оболочку вируса, включающий в себя хранение раствора, определенного в любом из пп.1, 2 или 4, при температуре от -30°С до -10°С в течение 6 месяцев или более.

6. Способ по п.5, в котором температура равна -20°С.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к препарату живых терапевтических вирусов и к живым вирусным вакцинам.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Имеются сообщения только об очень ограниченном количестве примеров стабилизации замороженных жидких жизнеспособных вирусных вакцин при -20°C. В большинстве из них не используют очищенный жизнеспособный вирус, имеющий оболочку (1, 2, 3, 4, 5). Одним из основных требований к стабилизации вируса, имеющего оболочку при температурах ниже температуры замерзания, является предотвращение физического разрушения структурных и функциональных компонентов (т.е. белков, липидного бислоя и вирусного генома) во время стадий замораживания и хранения. Сообщалось, что белки чувствительны к денатурации (6), а бислои липидов подвержены разрушению во время замораживания (7). Сообщалось, что некоторые типы эксципиентов стабилизируют структуру липидного бислоя и белков во время замораживания и в замороженном состоянии (6, 7). Такие эксципиенты включают: полиолы, сахариды, буферы, аминокислоты и полимеры.

Основной задачей стабилизации вируса, имеющего оболочку при температурах ниже температуры замерзания, является предотвращение физического разрушения структурных и функциональных компонентов вируса как во время стадии замораживания, так и во время стадии хранения. Компоненты вируса, имеющего оболочку, включают: 1) липидную бислойную мембрану оболочки; 2) белки, кодируемые вирусным геномом, и 3) однонитевой или двунитевой ДНК- или РНК-геном.

Чтобы обеспечить стабильность во время хранения, штаммы инфекционного вируса обычно хранили при ультранизкой температуре (например, -60°C) из-за их сложности. В Gould, E.A. («Methods for long-term Virus Preservation», Molecular Biotechnology Vol. 13, pp.57-66, 1999) сообщается, что вирусы, имеющие липидную оболочку, хорошо выживают при ультранизких температурах ниже -60°C, и что хранение при -20°C следует применять только в том случае, если «сохранение инфицирующей способности вируса не является необходимым». D. R. Harper описал условия хранения для широкого множества вирусов, не имеющих оболочку и имеющих оболочку (Virology, Ed. D.R. Harper, BIOS Scientific Publishers Limited, Oxford, UK, 1993). Во всех случаях вирусы необходимо хранить либо при -70°C в жидкой форме, либо при 4°C в лиофильно высушенной форме, чтобы сохранить инфекционность. Конкретно указаны условия хранения жидких препаратов вируса ньюкаслской болезни при -70°C.

В Yannarell et al. («Stabilizing cold-adapted influenza virus vaccine under various storage conditions», J. Virol. Meth. Vol.102, pp.15-25, 2002) описаны условия хранения адаптированной к холоду вакцины вируса гриппа при -20°C с использованием SPG, смеси сахарозы, фосфата и глутамата (0,218 М сахароза, 0,0038 М одноосновный фосфат калия, 0,0072 М двухосновный фосфат калия, 0,0049 М глутамат калия). Вирус гриппа, полученный в аллантоисной жидкости для интраназального введения, разбавляли до 10% 10X раствором SPG. Конечная концентрация сахарозы в такой смеси составляла 7,5%. Присутствие фосфата не помогало стабилизировать NDV, тогда как глутамат препятствовал стерильной фильтрации, и таким образом оба соединения вредны для препарата NDV и хранение при -20°C.

Парентеральное введение создает дополнительные проблемы приготовления препарата. По причинам безопасности продукты для парентерального применения должны быть подвергнуты стерильному фильтрованию через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм, так как термическая стерилизация не возможна для препаратов живых вирусов. Вирионы ньюкаслской болезни являются плеоморфными, но приблизительно сферическими частицами с примерным размером в диапазоне от 0,1 до 0,5 нм в диаметре. Степень извлечения NDV, профильтрованного через стерильный 0,2 мкм-фильтр, зависит от препарата и является важным фактором, который необходимо учитывать при разработке жидкого препарата NDV для хранения при -20°C.

Факторы, влияющие на способность NDV проходить через стерильный 0,2 мкм-фильтр, включают диаметр вируса, размер пор фильтра и способности NDV адсорбироваться на фильтре. На видимый диаметр NDV могут влиять: 1) тоничность препарата; и 2) поверхностный заряд NDV, который может влиять на конфигурацию молекул и адсорбцию белков или нуклеиновой кислоты на поверхности NDV в присутствии различных буферов.

Адсорбция NDV на мембране фильтра также может оказывать существенное влияние на способность вируса стерильно фильтроваться. Несколько факторов могут сильно влиять на поверхностные свойства NDV и таким образом оказывать влияние на способность NDV адсорбироваться на фильтре. Такие факторы включают: 1) pH, 2) ионную силу, 3) поверхностные взаимодействия, включая гидрофобные взаимодействия или взаимодействия Ван-дер-Ваальса и ионные взаимодействия, и 4) присутствие поверхностно-активных агентов, таких как поверхностно-активные вещества.

Библиографические ссылки к разделу «Уровень техники»:

1. Protocol Methods for Long Term Virus Preservation , E.A. Gould, Molecular Biotechnology, Vol. 13, 1999, pp.57-66.

2. T. Barrett, et al., Growth, Purification and Titration of Influenza Viruses in Virology: A practical Approach, Ed. B.W.J. Mahy; Raven Press Books, 1985, Ch. 6, pp.119-146.

3. Virology Lab Fax: Ed. D.R. Harper; Bios Scientific Publishers Limited, 1993.

4. Lowrence D. Gelb, Varicella-Zoster Virus in Virology: Ed. B. N. Fields; Raven Press, 1985, Ch. 28, pp.591-626.

5. Stabilizing cold-adapted influenza virus vaccine under various storage conditions: D. A. Yannarell et al.; Journal of Virological Methods; 102: 15-25, 2002.

6. Separation of Freezing- and Drying-induced denaturation of Lyophilized Proteins using Stress-Specific Stabilization, Prestrelski, et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 303, No.2, June 1993, pp.465-473.

7. Trehalose expression confers desiccation tolerance on human cells, N. Guo et al., Nature Biotechnology, Vol.18 Feb. 2000, pp.168-171.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу стабилизации имеющих оболочку вирусов в случае хранения при умеренно низкой температуре, включающему в себя приготовление водного раствора, содержащего: имеющий оболочку вирус в концентрации от 10⁶ БОЕ/мл до 10¹² БОЕ/мл; и невосстанавливающий сахарид. В том случае, когда невосстанавливающим сахаридом является дисахарид, он присутствует в растворе в концентрации от 5% (мас./об.) до 50% (мас./об.), а в том случае, когда он является моносахаридом, он присутствует в растворе в концентрации от 2,5% (мас./об.) до 25% (мас./об.). Раствор, используемый согласно настоящему изобретению, имеет осмотическое давление примерно 250 миллиосмоль или выше и имеет pH от 5 до 10.

Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии того, что приготовление препаратов имеющих оболочку вирусов в водном растворе, содержащем невосстанавливающий сахарид, является эффективным способом достижения как стерильной фильтрации, так и долговременной стабильности при умеренно низких температурах.

ОПИСАНИЕ ФИГУРЫ

Фиг. 1: Фильтруемость NDV в разных буферах.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В используемом в данном описании смысле вспомогательный термин «содержащий» не является ограничивающим. Пункт формулы изобретения, в котором используют данный термин, может содержать элементы дополнительно к элементам, перечисленным в таком пункте. Таким образом, например, пункты формулы изобретения могут гласить о схемах лечения, в которые также включены другие терапевтические средства или дозы терапевтического вируса, специально в них не указанные, при условии, что присутствуют перечисленные элементы или их эквивалент.

В используемом в данном описании смысле «NDV» является сокращением названия вируса ньюкаслской болезни. Согласно настоящему изобретению в том случае, когда вирус представляет собой вирус ньюкаслской болезни, он может быть вирусом низкой (лентогенный), умеренной (мезогенный) или высокой (велогенный) вирулентности. Уровень вирулентности определяют согласно тесту среднего периода времени гибели в яйцах (MDT). (Alexander, «Chapter 27: Newcastle Disease» in Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens, 3rd ed., Purchase, et al. eds. (Kendall/Hunt, Iowa), page 117). Вирусы классифицируют в тесте MDT как лентогенные (MDT>90 часов); мезогенные (MDT от 60 до 90 часов) и велогенные (MDT<60 часов).

В используемом в данном описании смысле «по существу в отсутствии» данного соединения или примеси означает, что соединение присутствует в растворе в концентрации десять частей на миллион или меньше.

Принимая во внимание вариабельность, свойственную анализу по бляшкообразующим единицам, вирус считают «стабильным» в течение данного времени, если происходит потеря менее 50% инфекционности, которую измеряют по изменению количества БОЕ/мл между более ранней временной точкой и более поздней временной точкой. Сохранение только ферментативной активности отдельных вирусных белков без сохранения также и инфекционности не считается сохранением «стабильности» в используемом в данном изобретении смысле.

В изобретении используют водный раствор, так как вода важна для поддержания трехмерной структуры и стабильности имеющих оболочку вирусов в жидком препарате.

Растворы, в которых вирус слишком разбавлен, нежелательны, поскольку имеющий оболочку вирус менее стабилен, тогда как высокая концентрация вируса, по-видимому, не мешает стабильности во время хранения. В процессе замораживания имеющий оболочку вирус будет концентрироваться в интерстициальной области, и такое состояние имеющего оболочку вируса считается высококонцентрированным состоянием. Согласно настоящему изобретению концентрация имеющего оболочку вируса составляет от 10⁶ БОЕ/мл до 10¹² БОЕ/мл, предпочтительно от 1×10¹⁰ БОЕ/мл до 7×10¹⁰ БОЕ/мл.

Любой имеющий оболочку вирус может быть приготовлен в виде препарата с использованием водного раствора согласно настоящему изобретению. Например, могут быть использованы парамиксовирусы, такие как вирус ньюкаслской болезни. В настоящее время предпочтительным является мезогенный штамм вируса ньюкаслской болезни.

Существуют два важных фактора, которые необходимо учитывать для защиты имеющих оболочку вирусов от инактивации при умеренно низких температурах (например, -20°C): изотоничность в жидком состоянии и предотвращение денатурации белков и разрушения липидной мембраны во время замораживания. Если осмотическое давление намного ниже, чем изотоническая точка, это может вызвать разрыв мембраны вируса. Высокое осмотическое давление, по-видимому, не влияет на стабильность имеющих оболочку вирусов во время хранения. Согласно настоящему изобретению подходящим является осмотическое давление примерно 250 миллиосмоль или выше. Предпочтительно осмотическое давление составляет примерно 300 миллиосмоль. Когда концентрация сахарида в растворе намного ниже 10% (мас./об.), то может требоваться добавлением других эксципиентов, чтобы достичь требуемого осмотического давления.

Другим важным фактором, который может влиять на стабильность, является разрушение структурных и функциональных компонентов во время замораживания и хранения. Невосстанавливающие сахариды, особенно дисахариды, являются наиболее эффективными для защиты имеющих оболочку вирусов от инактивации во время замораживания. Не намереваясь ограничиваться механизмом, полагают, что защита осуществляется в результате предотвращения денатурации трехмерной структуры белков и разрушения структуры липидного бислоя. Невосстанавливающие сахариды также можно использовать для корректировки осмотического давления в конечном препарате. Напротив, восстанавливающий сахарид лактоза не проявляет такого же стабилизирующего эффекта. Любой невосстанавливающий сахарид можно использовать в растворе согласно данному изобретению. В том случае, когда сахарид представляет собой дисахарид, он присутствует в растворе в концентрации от 5% (мас./об.) до 50% (мас./об.). В конкретном варианте дисахарид присутствует в концентрации от 7,5% (мас./об.) до 15% (мас./об.). В предпочтительном варианте дисахарид присутствует в концентрации от 10% (мас./об.) до 20% (мас./об.), более конкретно примерно 10% (мас./об.). Примеры подходящих дисахаридов включают сахарозу или трегалозу. В том случае, когда сахарид является моносахаридом, он присутствует в растворе в концентрации от 2,5% (мас./об.) до 25% (мас./об.); предпочтительно от 4% (мас./об.) до 7% (мас./об.), более предпочтительно примерно 5% (мас./об.).

Согласно настоящему изобретению раствор необязательно может дополнительно содержать лизин (подходящими являются L-лизин и D-лизин) или аргинин в концентрации от 0,1% (мас./об.) до 5% (мас./об.), или лизин и аргинин в суммарной концентрации от 0,1% (мас./об.) до 5% (мас./об.). Предпочтительно концентрация лизина и/или аргинина составляет примерно 1% (мас./об.).

На стабильность вируса влияет pH. Согласно настоящему изобретению раствор может иметь значение pH от 5 до 10, предпочтительно от 6,5 до 9, более предпочтительно от 7 до 9, более конкретно примерно 7,5.

Различные соединения оказывают негативное влияние на стабильность, фильтруемость или и то и другое, и их присутствие в растворе должно быть минимизировано. Для оптимальной стабильности раствор согласно настоящему изобретению по существу не должен содержать восстановителей (например, восстанавливающих сахаридов, цистеина) или антиоксидантов (например, EDTA, аскорбиновой кислоты). Некоторые другие соединения менее опасны и соответственно не требуется их полное исключение. Например, допустимо, чтобы раствор, используемый согласно настоящему изобретению, содержал до 0,1% (мас./об.) хлорида натрия; 1% (мас./об.) декстрана; 0,5% (мас./об.) маннита; 0,1 % (мас./об.) сорбита; 0,01% (мас./об.) твина; 0,01% (мас./об.) глутамата; 0,5% (мас./об.) полиэтиленгликоля; 0,1 мМ хлорида кальция; 0,5% (мас./об.) фосфатидилхолина; 0,05% (мас./об.) глицина и 0,01% (мас./об.) фосфата. Однако предпочтительно, чтобы раствор по существу не содержал хлорида натрия, декстрана, маннита, твина, глутамата, полиэтиленгликоля, хлорида кальция, фосфатидилхолина, глицина и фосфата. Наличие глицина, а также отрицательно заряженных буферов, таких как глутаматный или фосфатный буферы, плохо влияет на стерильную фильтрацию и извлечение.

Когда раствор необходимо вводить парентерально, он должен быть стерильным. Стерильность не является критической для местного или перорального введения. Раствор можно и предпочтительно необходимо стерилизовать перед хранением при низкой температуре с использованием фармацевтически чистого стерилизующего фильтра. Предпочтительным способом стерилизации является фильтрация по размеру с использованием фильтра, имеющего более крупный размер пор, чем эффективный размер имеющего оболочку вируса, но меньший, чем размер бактерий. Предпочтительным является стерильный фильтр с размером пор 0,2 микрон. Обычно вязкость раствора увеличивается с увеличением концентрации, что может затруднить фильтрацию NDV. Чтобы получить хорошую степень извлечения вируса во время стерильной фильтрации необходимо поддерживать давление предпочтительно в диапазоне от 10 до 15 фунтов/кв.дюйм. В случае выбранных параметров высокой вязкости и низкого давления может быть очень трудно профильтровать имеющие оболочку вирусы. Проблему высокой вязкости можно преодолеть, используя асептическое смешивание после стерильной фильтрации вируса. Чтобы избежать высокой вязкости, предпочтительно не использовать высокие концентрации эксципиентов. Например, декстран, основанный на глюкозе полимер, может влиять на фильтрацию и извлечение вируса во время фильтрации.

Хотя ранее предполагалось, что жидкие препараты имеющих оболочку вирусов стабильны только при ультранизких температурах, таких как -60°C или -70°C, неожиданно было обнаружено, что имеющие оболочку вирусы, приготовленные в виде препарата согласно настоящему изобретению, стабильны в течение длительных периодов времени при -20°C. Например, имеющие оболочку вирусы, приготовленные согласно настоящему изобретению, стабильны при температурах от -4°C до -30°C, предпочтительно от -10°C до -30°C, более предпочтительно от -15°C до -25°C, еще более предпочтительно при -20°C. Подходящим является хранение примерно при

-20°C. Способность поддерживать стабильность при -20°C сделает возможным создание запасов терапевтического продукта в больницах и аптеках, которые обычно имеют морозильные камеры на -20°C, но обычно не имеют морозильных камер на

-70°C. Кроме того, поскольку традиционные крышки для емкостей лучше сохранят эластичность при -20°C, чем при -70°C, то сохранение стерильности и, следовательно, безопасности для пациентов обеспечивается хранением при -20°C. В случае применения способа согласно настоящему изобретению имеющие оболочку вирусы стабильны в течение 6 месяцев, 12 месяцев, 24 месяцев или более.

Изобретение будет более понятно при обращении к следующим примерам, которые иллюстрируют, но не ограничивают изобретение, описанное в данной публикации. В следующих примерах NDV является трижды очищенным из бляшек штаммом MK107, который представляет собой аттенуированный (мезогенный) вариант вируса ньюкаслской болезни, более полно описанный в международной публикации патента WO 00/62735, опубликованной 26 октября 2000 (Pro-Virus, Inc.). Полное содержание WO 00/62735 таким образом включено в данное описание в виде ссылки.

ПРИМЕРЫ

ML означает 5% (мас./об.) маннит/1% (мас./об.) лизин при pH 8,0

Пример 1: Стабильность NDV в растворе, содержащем 5% (мас./об.) маннита/1% (мас./об.) лизина

NDV получали из мезогенного штамма вируса ньюкаслской болезни Mass-MK107 посредством тройной очистки бляшек и посредством инокуляции вируса в полость с аллантоисной жидкостью 10-дневных содержащих эмбрионы куриных яиц. После инкубации при 36°C в течение 2 суток яйца охлаждали и собирали аллантоисную жидкость. Собранную аллантоисную жидкость подвергали диафильтрации с использованием буфера с 5% (мас./об.) D-маннита и 1% (мас./об.) L-лизина, pH 8,0 (ML), осветляли и очищали фильтрацией в тангенциальном потоке и эксклюзионной хроматографией по размеру до концентрации 1-4 E+10 БОЕ/мл, делили на аликвоты и хранили при -20°C. Титр NDV измеряли анализом бляшек и выражали в виде количества инфекционных бляшкообразующих единиц (БОЕ) NDV в миллилитре. Для указанного анализа клетки фибросаркомы человека HT1080 высевали на чашки для культуры ткани и выращивали до слияния в монослой. Среду роста удаляли, монослои клеток промывали средой и добавляли 0,5 мл образца NDV. Чашки инкубировали на качалке в течение 90 минут при 37°C и в атмосфере 5% CO₂. Монослои промывали, как описано, и в каждую лунку сверху наслаивали 3 мл полутвердой среды с агаром. Культуры инкубировали в течение 48 часов при 37°C и 5% CO₂. Монослои клеток красили нейтральным красным, подсчитывали бляшки и определяли титры вирусов в БОЕ/мл. Результаты (таблица I) показали, что NDV, который хранили при -20°C в 5% манните/1% лизине, был нестабильным, теряя в среднем более 80% активности. Стабильность выражали в процентах сохранившегося титра по отношению к титру в нулевой временной точке.

Таблица I
Стабильность NDV, приготовленного в 5% D-манните (мас./об.) и 1% L-лизине (мас./об.), при -20°C
№ партии	% сохранившейся активности
4 месяца	8 месяцев	12 месяцев	18 месяцев	24 месяца
1	26	NT*	17	NT	NT
2	18	15	9	NT	NT
3	11	6	0,3	0,9	1,4
*NT: не тестировали

Пример 2: Стабильность NDV в 10% (мас./об.) растворе сахарозы

NDV получали способ, описанном в примере 1, буфер заменяли на 10% (мас./об.) раствор сахарозы фильтрацией в тангенциальном потоке и эксклюзионной хроматографией по размеру, делили на аликвоты и хранили при -20°C. Стабильность измеряли в анализе бляшек, как описано в примере 1. Результаты (таблица II) показали, что NDV, который хранили при -20°C в 10% (мас./об.) сахарозе, был стабилен до 24 месяцев.

Таблица II
Стабильность препарата NDV в 10% (мас./об.) сахарозе при -20°C
№ партии	% сохранившейся активности
3 месяца	6 месяцев	12 месяцев	18 месяцев	24 месяца
1	100	100	82	91	100
2	83	NT	96	NT	NT
3	79	93	72	NT	NT
*NT: не тестировали

Пример 3: Стабильность NDV в 10% (мас./об.) растворе сахарозы, содержащем другие эксципиенты

NDV получали способом, описанным в примере 1, и буфер заменяли на 10% (мас./об.) раствор сахарозы фильтрацией в тангенциальном потоке и эксклюзионной хроматографией по размеру. Отдельные препараты NDV в 10% (мас./об.) сахарозе, содержащие аминокислоту, готовили добавлением либо L-лизина, либо L-глицина, либо L-глутаминовой кислоты до конечной концентрации 1% (мас./об.). Препараты делили на аликвоты и хранили при -20°C. Стабильность измеряли в анализе бляшек, как описано в примере 1. Результаты (таблица III) показали, что NDV, который хранили при -20°C в 10% (мас./об.) сахарозе, содержащей 1% лизина, 1% глицина или 1% глутаминовой кислоты, был стабильным вплоть до 14 месяцев.

Таблица III
Стабильность NDV в 10% (мас./об.) сахарозе, содержащей аминокислоты, при -20°C
NDV/буфер	% сохранившейся активности
4 месяца	14 месяцев
10% сахароза/1% (мас./об.) L-Лизин (pH 6,5)	100%	138%
10% сахароза/1% (мас./об.) L-Глицин (pH 6,5)	105%	115%
10% сахароза/1% (мас./об.) L-Глутаминовая кислота (pH 6,5)	100%	107%

Пример 4: Стабильность NDV в других буферных растворах

NDV получали способом, описанным в примере 1. В отдельных частях образца NDV буфер заменяли разными составами, включая: 5% (мас./об.) маннит/1% (мас./об.) L-лизин/2% (мас./об.) гидролизат желатина, 10% (мас./об.) трегалозу/1% (мас./об.) L-лизин, 200 мМ ацетат натрия в смеси 5% (мас./об.) маннит/1% (мас./об.) лизин и 2% сывороточный альбумин человека (HSA) в смеси 5% (мас./об.) маннит/1% (мас./об.) лизин, делили на аликвоты и хранили при -20°C. Стабильность измеряли в анализе бляшек, как описано в примере 1. Добавление 2% (мас./об.) гидролизата желатина к NDV, полученному в 5% (мас./об.) манните/1% (мас./об.) L-лизине, значимо улучшало стабильность по сравнению с NDV, полученном в препарате, содержащем маннит/L-лизин (см. пример 1), тогда как добавление 2% HSA давало более умеренный уровень защиты.

Таблица IV
Стабильность препарата NDV в буферах, содержащих гидролизат желатина, HSA, ацетат Na и трегалозу, при -20°C
NDV/Буфер	% сохранившейся активности
4 месяца	8 месяцев	12 месяцев	18 месяцев	24 месяца
2% Гидролизат желатина ML	78	71	64	66	80
10% Трегалоза/1% Лизин	35	NT		NT	NT
200 мМ Ацетат натрия ML				NT	NT
2% HSA/ML					NT

Пример 5: Стабильность NDV в буферах с декстраном при -20°C

NDV получали способом, описанным в примере 1. В отдельных частях образца NDV буфер заменяли разными составами, включая: 0,9% (мас./об.) NaCl/5% (мас./об.) декстран и 10% (мас./об.) трегалозу/20% (мас./об.) декстран. Обнаружено, что декстран обеспечивает невысокий уровень защиты NDV (таблица V) при хранении NDV при -20°C.

Таблица V
Стабильность NDV в буферах с декстраном при -20°C
Препарат	% сохранившейся активности
3 месяца	6 месяцев	9 месяцев	12 месяцев	18 месяцев
NDV 0,9% NaCl/0,5% Декстран	61%	55%	52%	NA	22%
NDV 10% Трегалоза/20% Декстран (70К)	64%	61%	50%	26%	17%

Пример 6: Стабильность NDV в других буферных растворах

NDV очищали способом, описанным в примере 1, буфер заменяли разными буферами (см. пример 4 и 5), делили на аликвоты и хранили при -20°C. Стабильность измеряли в анализе бляшек, как описано в примере 1. Результаты (таблица VI) показали, что NDV, приготовленные в таких буферах, которые описаны в таблице VI, были нестабильными при хранении при -20°C.

Таблица VI
NDV в буферах, в которых обнаружена низкая стабильность при -20°C
Препарат	% сохранившейся активности
4М	8М	12М
5% (мас./об.) Манит/1% (мас./об.) L-Лизин	18%	15%	9%
0,1% (мас./об.) Твин/ML	<1%	NT	NT
10% (мас./об.)Раствор лактозы	<1%	NT	NT
2% (мас./об.) Желатин/5% (мас./об.) Маннит/1% (мас./об.)Лизин	13%	NT	NT
1% (мас./об.)Аргинин/5% (мас./об.) раствор Манита	2,3%	NT	NT
1% (мас./об.)Глутаминовая кислота/5% (мас./об.) Маннит	<1%	NT	NT
5% (мас./об.) PEG/5% (мас./об.) Манит/1% (мас./об.) Лизин	3,7%	NT	NT
10 мМ CaCl2/ML	6%	NT	NT
5% Фосфатидилхолин ML	14%	NT	NT
1% Глицин/5% (мас./об.) Маннит	5%	NT	NT
0,05% EDTA/5% (мас./об.) Манит/1% (мас./об.) Лизин	31%	17%	NA
*NT: не тестировали

Пример 7: Стерильная фильтрация NDV, приготовленного в манните

NDV в 5% (мас./об.) манните/1% (мас./об.) лизине готовили, как описано в примере 1. Часть подвергали диафильтрации в 5% (мас./об.) маннит. К другой части NDV ML добавляли декстран, чтобы получить образец NDV в ML, содержащем 10% (мас./об.) декстрана. Полученные образцы тестировали в отношении их способности подвергаться стерильной фильтрации пропусканием примерно 30 мл каждого образца последовательно через предварительный фильтр 0,45 мкм Sartobran и фильтр 0,22 мкм Sartobran при 15 фунтах/кв.дюйм. Фильтры предварительно смачивали буфером ML. Фильтраты каждого образца собирали и анализировали в анализе бляшек в отношении общего количества извлеченной активности вирусных бляшек (БОЕ), как описано в примере 1. NDV, приготовленный в буфере ML или в 5% (мас./об.) манните, легко фильтровался, тогда как NDV, приготовленный в буфере ML, содержащем 10% (мас./об.) декстрана, существенно не проходил через фильтр (таблица VII).

Таблица VII
Сводные результаты исследований фильтрации препаратов NDV, содержащих маннит/лизин/декстран
Препарат	Общее извлечение (процент нагрузки, нормализованный)
ML	82±17
5% (мас./об.) Маннит	83±17
10% (мас./об.) Декстран/5% (мас./об.) Манит/1% (мас./об.) Лизин	4±3

Пример 8: Стерильная фильтрация NDV в буфере с маннитом, содержащем лизин/фосфат/NaCl

NDV получали, как описано в примере 1, буфер заменяли буферами, описанными на фигуре 1, и тестировали в отношении их способности подвергаться стерильной фильтрации, как описано в примере 7. Фильтры предварительно смачивали буфером, используемым в препарате. Для каждого препарата объем буфера с NDV, который проходил через фильтр, собирали и рассчитывали накопленный объем. NDV, приготовленный в 5% (мас./об.) манните/1% (мас./об.) лизине, хорошо фильтровался. NDV, приготовленный в NaCl с осмотическим давлением 324 миллиосмоль, в некоторой степени подвергался фильтрованию, но NDV плохо стерилизовался в приготовления в 5% (мас./об.) манните, содержащем 1% (мас./об.) L-лизина, 20 мМ фосфата, или 5% (мас./об.) манните/1% (мас./об.) лизине, содержащем 0,9% NaCl или 20 мМ фосфата.

Пример 9: Стерильная фильтрация NDV, приготовленного в буфере, содержащем 10% (мас./об.) сахарозы или 10% (мас./об.) трегалозы

Образцы NDV получали, как описано в примере 1, и подвергали диафильтрации в 10% (мас./об.) сахарозу или 10% (мас./об.) трегалозу. Из полученных растворов готовили дополнительные образцы NDV, содержащие 10% (мас./об.) сахарозы/1% L-лизина, 10% (мас./об.) сахарозы/1% L-лизина/10% (мас./об.) декстрана, и 10% (мас./об.) трегалозы/1% L-лизина, добавлением соответствующих компонентов. Образцы тестировали в отношении их способности повергаться стерильной фильтрации, как описано в примере 6. NDV, приготовленный в 10% (мас./об.) сахарозе, 10% (мас./об.) сахарозе/1% (мас./об.) L-лизине или 10% (мас./об.) трегалозе, стерильно фильтровался с очень хорошей степенью извлечения. NDV, приготовленный в 10% (мас./об.) трегалозе/1% (мас./об.) L-лизине, фильтровался с умеренной степенью извлечения, тогда как NDV, приготовленный в 10% (мас./об.) сахарозе/1% (мас./об.) L-лизине/10% (мас./об.) декстране, плохо подвергался стерильной фильтрации (таблица VIII).

Таблица VIII
Сводные результаты исследований фильтрации препаратов NDV, содержащих сахарозу/трегалозу/лизин/декстран
Препарат	Общее извлечение (процент нагрузки, нормализованный)
10% Сахароза	69±7
10% Сахароза/1% Лизин	83±3
10% Трегалоза	74±3
10% Трегалоза/1% Лизин	60±7
10% Декстран/10% Сахароза/1% Лизин	11±1

Пример 10: Стерильная фильтрация NDV, приготовленного в 10% сахарозе, содержащей 1% L-лизин, 1% L-глутамат или 1% L-глицин

Образцы NDV получали, как описано в примере 1, и подвергали диафильтрации в 10% (мас./об.) сахарозу. Полученный материал делили на четыре части. L-лизин, L-глутамат или L-глицин добавляли к каждой из трех таких частей, получая образцы, содержащие 10% (мас./об.) сахарозы и 1% (мас./об.) L-лизина, L-глутамата или L-глицина. Полученные образцы тестировали в отношении их способности подвергаться стерильной фильтрации, как описано в примере 6. NDV, приготовленные в 10% (мас./об.) сахарозе или 10% (мас./об.) сахарозе, содержащей 1% L-лизин, быстро фильтровались, тогда NDV, приготовленные в 10% (мас./об.) сахарозе, содержащей 1% (мас./об.) L-глутамата или глицина, фильтровались в небольшой степени (таблица IX).

Таблица IX
Сводные результаты исследований фильтрации препаратов NDV, содержащих сахарозу/лизин/глутаминовую кислоту/глицин
Препарат	Общее извлечение (процент нагрузки, нормализованный)
10% Сахароза	66±11
10% Сахароза/1% Лизин	55±16
10% Сахароза/1% Глутаминовая кислота	35±5
10% Сахароза/1% Глицин	25±1

Пример 11: Стабильность NDV в 10% сахарозе/лизине при разных значениях pH

NDV получали способами, описанными в примере 1, и буфер заменяли на 10% (мас./об.) сахарозу. Тестируемые образцы NDV/10% раствор сахарозы при разных pH готовили добавлением буфера сахароза/лизин, имеющего скорректированное значение pH (разные pH) и хранили при -20°C. Стабильность образцов тестировали в анализе бляшек, как описано в примере 1. Результаты показали, что NDV/10% раствор сахарозы более стабилен в диапазоне от pH 7,3 до pH 8,8, чем при более низких значениях pH.

Таблица Х
Стабильность NDV, приготовленного в 10% сахарозе (мас./об.)/1% лизине (мас./об.) при разных pH, при -20°C
Препарат (0-время: 10/22/05)	% сохранившейся активности
6 месяцев	6 месяцев	9 месяцев	12 месяцев
NDV 10% Сахароза контроль (pH 5,7)	41%	26%	35%	29%
NDV Сахароза/1% Лизин рН 5,3	50%	38%	28%	42%
NDV Сахароза/1% Лизин рН 5,7	68%	71%	52%	39%
NDV Сахароза/1% Лизин рН 6,3	109%	58%	52%	52%
NDV Сахароза/1% Лизин рН 6,6	49%	49%	51%	35%
NDV Сахароза/1% Лизин рН 7,3	72%	85%	64%	62%
NDV Сахароза/1% Лизин рН 8,3	89%	68%	74%	58%
NDV Сахароза/1% Лизин рН 8,8	69%	64%	TNTC	64%
TNTC: слишком много для подсчета

Пример 12: Стабильность NDV при разных концентрациях сахарозы

NDV получали способами, описанными в примере 1, и буфер заменяли 10% (мас./об.) сахарозой. Тестируемые образцы NDV с разными концентрациями раствора сахарозы готовили добавлением в разной степени концентрированной сахарозы или добавлением воды для инъекций и хранили при -20°C. Конечные титры каждого препарата доводили примерно до 2E10. Стабильность образцов тестировали в анализе бляшек, как описано в примере 1. Результаты показывают, что вирус, приготовленный в 10-20% (мас./об.) сахарозе, был более стабильным, чем вирус, приготовленный при более низких концентрациях сахарозы.

Таблица XI
Концентрация сахарозы влияет на стабильность NDV при -20°C
Препарат	% сохранившейся активности
6 месяцев	9 месяцев
NDV 2,5% (мас./об.)	63%	51%
Сахароза
NDV 5,0% (мас./об.) Сахароза	67%	76%
NDV 7,5% (мас./об.) Сахароза	60%	55%
NDV 10% (мас./об.) Сахароза	100%	84%
NDV 15% (мас./об.) Сахароза	81%	71%
NDV 20% (мас./об.) Сахароза	89%	83%