микроорганизмы и их фракции, индуцирующие специфичный к углеводу клеточный иммунитет

Классы МПК:	G01N33/53 иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого G01N33/554 носителем, представляющим собой биологическую клетку или часть клетки, например бактерии, дрожжевые клетки
Автор(ы):	ГОЛЕТЦ Штеффен (DE), ЮЛЬСЕМЕ Филипп (DE), ЛЕФФЛЕР Аня (DE)
Патентообладатель(и):	ГЛИКОТОП ГМБХ (DE)
Приоритеты:	подача заявки: 2007-11-12 публикация патента: 27.08.2012

Изобретение относится к проведению теста на клеточный иммунный ответ в целях профилактики и лечения заболеваний, связанных с наличием определенных углеводных эпитопов, в частности положительному по углеводному эпитопу опухолей. Тест включает нагружение дендритной клетки (ДК) положительным по углеводу соединением (1), несущим углеводный эпитоп, контактирование нагруженной клетки с иммунными клетками, способными активироваться или ингибироваться дендритной клеткой. После культивирования добавляют антигенпрезезентирующие клетки (АРС), нагруженные соединением (2), несущим тот же углеводный эпитоп и культивируют для повторной стимуляции иммунных клеток. Изобретение касается способа получения функциональной ДК против углеводного эпитопа, при этом ДК может быть человеческой. Раскрыт способ получения активированных Т-клеток, линий и клонов, а также применение функциональной дендритной клетки и активированных Т-клеток для индукции иммунного ответа против заболеваний, характеризующихся наличием определенных углеводных эпитопов. Использование изобретения позволит получить новые средства для индукции эффективного специфичного к углеводу клеточного иммунного ответа. 6 н. и 5 з.п. ф-лы, 23 ил., 8 табл., 12 пр.

микроорганизмы и их фракции, индуцирующие специфичный к углеводу клеточный иммунитет, патент № 2460074

Формула изобретения

1. Тест на клеточный иммунный ответ, включающий

a) нагружение как минимум одной дендритной клетки первым положительным по углеводу соединением, где указанное положительное по углеводу соединение несет интересующий углеводный эпитоп;

b) создание контакта между соответствующим количеством указанной как минимум одной дендритной клетки, нагруженной указанным положительным по углеводу соединением, и соответствующим количеством иммунных клеток, которые могут активироваться или ингибироваться дендритной клеткой;

c) культивирование для осуществления взаимодействия указанных иммунных клеток с указанными нагруженными дендритными клетками;

d) добавление соответствующего количества антигенпрезентирующих клеток (АРС), нагруженных соответствующим количеством как минимум одного второго соединения, несущего тот же углеводный эпитоп, что и указанное первое соединение, где указанное второе соединение отличается от указанного первого положительного по углеводу соединения;

e) культивирование для повторной стимуляции указанных иммунных клеток;

f) определение того, произошла ли повторная стимуляция иммунных клеток.

2. Тест на клеточный иммунный ответ по п.1, где как минимум часть АРС, нагруженных соответствующим количеством указанного второго соединения, находится в контакте с иммунными клетками в присутствии связывающей углевод молекулы, узнающей указанный интересующий углевод.

3. Тест на клеточный иммунный ответ по п.1 или 2, где повторную стимуляцию устанавливают, определяя

- продукты секреции иммунных клеток, которые секретируются, если указанные иммунные клетки являются стимулированными или повторно стимулированными, такие как интерферон альфа, интерферон гамма или GM-CSF, и/или

- пролиферацию иммунных клеток.

4. Способ получения функциональной дендритной клетки против интересующего углеводного эпитопа, включающий создание контакта между соответствующим количеством дендритной клетки или смеси дендритных клеток, или смеси клеток, содержащей как минимум одну дендритную клетку, и соответствующим количеством положительного по углеводу микроорганизма, или его фракции, или лизата, содержащие интересующий углеводный эпитоп, который узнается как минимум одной связывающей углевод молекулой, специфически узнающей указанный интересующий углеводный эпитоп, при этом указанный микроорганизм, указанная фракция или указанный лизат индуцирует эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, в течение соответствующего времени при соответствующих условиях для получения как минимум одной функциональной дендритной клетки против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп.

5. Способ по п.4, где указанная дендритная клетка является человеческой.

6. Способ по п.4 или 5, где указанный углеводный эпитоп не является биполярным углеводным эпитопом.

7. Способ получения активированной Т-клетки, Т-клеток, Т-клеточного клона или Т-клеточной линии против углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, включающий

(a) создание контакта между соответствующим количеством как минимум одной функциональной дендритной клетки, полученной способом по любому из пп.4-6, и соответствующим количеством как минимум одной Т-клетки, или смеси Т-клеток, или смеси клеток, содержащей как минимум одну Т-клетку, культивирование указанной Т-клетки или смеси Т-клеток вместе с указанными нагруженными функциональными дендритными клетками для активации или примирования Т-клетки или Т-клеток против указанного углеводного эпитопа, и

(b) повторную стимуляцию указанных Т-клеток соответствующим количеством антигенпрезентирующих клеток (АРС), предпочтительно как минимум одной функциональной дендритной клеткой, нагруженной клеткой человека или животного, либо молекулой, несущей указанный углеводный эпитоп.

8. Применение функциональной дендритной клетки, полученной способом по любому из пп.4-6, активированной Т-клетки, Т-клеток, Т-клеточного клона или Т-клеточной линии, полученных способом по п.7, где активированная Т-клетка, Т-клетки, Т-клеточный клон или Т-клеточная линия направлены против углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, для индукции иммунного ответа у человека или животного против заболеваний, характеризующихся наличием определенных углеводных эпитопов.

9. Способ иммунизации или вакцинации человека или животного против углеводного эпитопа, присутствующего на молекуле из клетки человека или животного, включающий

(i) введение человеку или животному эффективного количества функциональной дендритной клетки, полученной способом по любому из пп.4-6, активированной Т-клетки, Т-клеточного клона или Т-клеточной линии, полученных способом по п.7, либо смеси указанных клеток, направленных против интересующего углеводного эпитопа, и индукцию иммунного ответа указанной клеткой у человека или животного (примирование) против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, и

(ii) активацию иммунного ответа путем введения эффективного количества препарата, содержащего как минимум один положительный по углеводу микроорганизм, узнаваемый как минимум одной связывающей углевод молекулой, специфически узнающей углеводный эпитоп, присутствующий на молекуле из клетки человека или животного, либо его фракцию или лизат, при этом указанный микроорганизм, указанная фракция или указанный лизат, либо указанный содержащий их препарат индуцируют эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что препарат выбирают из группы, включающей нутрицевтики и фармацевтические композиции, содержащие как минимум один положительный по углеводу микроорганизм, углеводную структуру, включающую любой из данных углеводных эпитопов или его части.

11. Способ профилактики и/или лечения положительной по углеводному эпитопу опухоли и/или болезни, характеризующейся наличием определенных углеводных эпитопов, включающий введение человеку или животному соответствующего количества функциональной дендритной клетки, полученной способом по любому из пп.4-6, или активированной Т-клетки, Т-клеточной линии или Т-клеточного клона против углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, полученных способом по п.7.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к области профилактики и лечения заболеваний, которые характеризуются наличием определенных углеводных эпитопов. Изобретение относится к нутрицевтикам и фармацевтическим композициям, содержащим микроорганизм, положительный по углеводному эпитопу, а также его фракции, которые индуцируют эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ против положительных по углеводу клеток и заболеваний. Кроме того, оно относится к способам отбора, выделения и идентификации положительных по углеводу микроорганизмов, которые являются подходящими в качестве эффективной составляющей нутрицевтика или фармацевтической композиции. Оно относится к способам получения специфичных к углеводу дендритных клеток и клеточных линий, а также специфичных к углеводу T-клеток, T-клеточных клонов и T-клеточных линий. Изобретение дополнительно относится к препаратам и способам профилактики и лечения заболеваний, связанных с определенными углеводными эпитопами.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Часто наблюдается связь между углеводными антигенами и заболеваниями человека. Например, аберрантное гликозилирование является типичным признаком раковых клеток, при этом возникает новая углеводная структура, которая отсутствует или редко присутствует на нормальных клетках человека. Такие углеводные структуры считают подходящими кандидатами для получения противоопухолевых вакцин, однако сами по себе углеводы являются слабоиммуногенными структурами, относящимися к независимым от Т-клеток антигенам. Вследствие этого, разработка вакцин направлена на создание противоопухолевых вакцин, основанных на синтетических углеводах, когда углеводные эпитопы присоединяют к структурам-носителям, потенцирующим иммунитет, либо природным белкам или олигопептидам (таким как MUC1) и комбинируют с дополнительными адъювантами для индукции иммунного ответа, особенно для индукции клеточного иммунного ответа. Полисахарид связывают с иммуногенными полипептидами, такими как столбнячный или дифтерийный анатоксин или KLH, или T-хелперные эпитопы, чтобы изменить иммунный ответ с независимого от Т-клеток на зависимый от Т-клеток для создания иммунологической памяти. Производство таких вакцин является чрезвычайно сложным и дорогим. Кроме того, такие вакцины представляют собой неприродные или искусственные антигены с неизвестными или вредными побочными эффектами.

До недавнего времени считалось, что углеводы не презентируются антигенпрезентирующими клетками (например, дендритными клетками) иммунным эффекторным клеткам и не опосредуют T-клеточный иммунный ответ.

В настоящее время в некоторых публикациях продемонстрировано, что сложный углевод не удаляется во время процессирования гликопротеинов антигенпрезентирующими клетками и может быть презентирован рестрицированным по главному комплексу гистосовместимости II T-клеткам совместно с пептидом.

В случае антигена MUC1 можно продемонстрировать интернализацию, процессирование и презентацию гликопептидов на дендритных клетках. MUC1, несущий короткие сиалилированные углеводы, индуцировал активацию и созревание дендритных клеток, фенотипически сходное с тем, которое индуцирует бактериальный LPS, вследствие этого, лишенное специфичности, однако данные DC были не способны индуцировать иммунный ответ Th1-типа после совместного культивирования с аллогенными CD4+ T-клетками или цитотоксические CD8-ответы (Carlos et al. (2005) J. Immunol. 175:1628-1635).

О-гликозилированные пептиды из MUC1 с эпитопом Tn индуцируют клеточный иммунный ответ у мышей, однако иммунизация нагруженными гликопептидом дендритными клетками не приводила к иммунотерапевтическому эффекту, отсутствовал избирательный лизис мышиных линий клеток, экспрессирующих MUC1 человека, и активированные CTL проявляли перекрестную реактивность как с гликозилированными, так и с негликозилированными формами тех же пептидов, таким образом, иммунный ответ не был эффективным и не являлся специфичным к углеводу (Stepensky et al. (2005) Clin Exp Immunol 143:139-149).

Связанный с раком MUC1, несущий короткие сахарные фрагменты, от моно- до тетрасахаридов (такие как опухолевые антигены Tn, TF, S-Tn и S-TF), способен даже вызывать подавление T-клеточных ответов человека (Agrawal et al. Nat Med 1998 Jan; 4(1):43-9).

Бактериальное гликозилирование полностью отличается от эукариотического гликозилирования вследствие различного профиля ферментов, вовлеченных в механизм гликозилирования. Большинство полисахаридов бактерий являются отрицательно заряженными полисахаридами, которые, несомненно, не способны активировать T-клетки и, следовательно, обычно классифицируются как независимые от T-клеток антигены типа 2. Совсем недавно показано, что цвиттерионные капсулярные полисахариды из определенных бактерий обладают способностью активировать CD4+ T-клетки. Однако рестрикция по MHC II для цвиттерионных полисахаридных антигенов не определена, и T-клетки активируются поликлональным, неспецифическим для антигена образом, который не является антиген- или эпитопспецифичным, однако при этом демонстрируют широкую вовлеченность V микроорганизмы и их фракции, индуцирующие специфичный к углеводу клеточный иммунитет, патент № 2460074 и перекрестную реактивность, очевидно напоминающую обширную активацию, индуцированную митогенами (Cobb and Kasper, Cell Microbiol 2005; Eyon, Zenewicz, Flavell, Cell, 2005).

Кроме того, углеводы и углеводные антигены, как правило, известны как слабые иммуногены.

Иммунитет Th1-типа считают важным и необходимым для отторжения опухоли и для вызывания сильных иммунных ответов при различных заболеваниях (Kobayashi et al., 1998, J. Immunol. 160:5869-5873). Показано, что некоторые короткие опухолевые углеводы могут презентироваться и узнаваться совместно с определенными аминокислотами в виде комбинированных необходимых для связывания мотивов. Однако это не приводит к иммунному ответу Th1-типа. Напротив, в случае MUC1, десиалилированный MUC1 (презентирующий короткие сахарные фрагменты, такие как Tn или TF) неспособен индуцировать продукцию цитокинов T-клетками и, следовательно, вызывать активацию T-клеток, или, в случае сиалилированных сахаров, индукция секреции цитокинов, таких как TNFальфа вместе с IL-6, которые связаны с метастазом опухоли, прогрессированием опухоли и неблагоприятным прогнозом, имеет место и, следовательно, невозможна активация необходимого TH1-ответа и даже считают, что существует связь со способностью опухоли ускользать от иммунных ответов (Carlos et al., J. Immunol).

Уровень знаний в данной области указывает на то, что природные молекулы, содержащие углеводные опухолевые антигены человека, не способны вызывать сильный клеточный Th1 и цитотоксический иммунитет, направленный против углеводных эпитопов, и что полисахариды из бактерий, в частности капсулярные полисахариды, не способны вызывать антигенспецифический иммунный ответ.

Таким образом, использование данных углеводных молекул не применимо для подходов к созданию противоопухолевых вакцин, где используют (i) дендритные клетки для презентации углеводных антигенов, которые не индуцируют сильный цитотоксический иммунный ответ при введении людям, и не применимо для подходов к созданию противоопухолевых вакцин, где используют (ii) APC, такие как DC, для презентации углеводных антигенов с целью создания антигенспецифических T-клеток при Th1-ответе для адоптивной T-клеточной терапии у пациентов.

Однако, ввиду важности углеводных антигенов в развитии патологических заболеваний, таких как рак, было бы весьма полезно получить средства для индукции эффективного специфичного к углеводу клеточного иммунного ответа.

Целью настоящего изобретения является предложение соответствующих средств.

ОПИСАНИЕ

Для преодоления вышеуказанных недостатков в настоящем изобретении предлагают средства для индукции эффективного специфичного к углеводу клеточного иммунного ответа против углеводного эпитопа или эпитопов, присутствующих на молекуле из клетки человека или животного, связанной с заболеванием указанного человека или животного.

Насколько известно авторам изобретения, данный удивительный факт является первым сообщением об индукции специфичного к углеводу иммунного ответа Th1-типа, вызванной природной молекулой.

Еще более удивительно, что авторы изобретения впервые продемонстрировали, что эффективный специфичный к углеводу клеточный ответ Th1-типа и цитотоксический T-клеточный иммунный ответ можно индуцировать введением соответствующих количеств как минимум одного микроорганизма, который экспрессирует связанный с заболеванием человека или животного углеводный эпитоп, или как минимум одной его фракции.

Использование бактерий, которые обычно населяют пищеварительный тракт людей, позволяет создавать профилактическое или терапевтическое средство, которое не вызывает нежелательные побочные эффекты. Благодаря углеводной природе отсутствует соответствующая толерогенность и соответствующие аллергические реакции.

Поскольку гликозилирование у микроорганизмов полностью отличается от гликозилирования у людей и животных, удивительно, что микроорганизмы, предлагаемые и получаемые по настоящему изобретению, экспрессируют «человеческий» углеводный эпитоп или его часть так, как это происходит на поверхности клеток человека, или продуцируется клеткой человека, и что данный человеческий антиген или его часть презентируется дендритными клетками после нагружения указанными микроорганизмами и индуцирует эффективный клеточный иммунный ответ против указанного углеводного антигена, который по смыслу данного изобретения может также являться или заключать в себе эффективный клеточный иммунный ответ против углеводных структур, углеводных конъюгатов или клеток млекопитающих, содержащих указанный углеводный эпитоп. Такие нагруженные дендритные клетки являются функционально активными и стимулируют и активируют T-клетки.

Наиболее удивительно то, что данный иммунный ответ является также специфичным к углеводу и, например, не является преимущественно инициированным лежащей в основе пептидной последовательностью.

Одним из важных аспектов настоящего изобретения является то, что положительный по углеводу микроорганизм узнается как минимум одной связывающей углевод молекулой, такой как, например, антитело, специфичное к углеводному эпитопу. Следовательно, положительный по углеводу микроорганизм специфически связывается специфичным к углеводному эпитопу антителом при контакте с указанным антителом. Таким образом, углеводная структура в положительном по углеводу микроорганизме по настоящему изобретению является доступной для указанного специфичного к углеводному эпитопу антитела и не «скрыта» другими структурами. Эта важная характеристика, которую можно определять при тестировании, соответствующие тесты описаны ниже, является гарантией того, что положительный по углеводу микроорганизм, и/или его положительные по углеводу фракция или лизат, несет интересующий углеводный эпитоп и, таким образом, является как минимум иммунохимически по существу идентичным интересующему углеводному эпитопу, а не является эпитопом, который лишь сходен с интересующим углеводным эпитопом. Данная особенность важна для гарантии того, что иммунный ответ инициирован указанным положительным по углеводу микроорганизмом и является достаточно специфичным к интересующему углеводному эпитопу. Такие специфичные к углеводному эпитопу антитела, которые можно использовать для определения того, что микроорганизм несет интересующий углеводный эпитоп, специфически узнают углеводный эпитоп, например, в опухоли - в соответствующем окружении и, следовательно, как естественный. Это дополнительно гарантирует, что микроорганизм содержит интересующий углеводный эпитоп в форме, которая инициирует желательный иммунный ответ.

Антитела, специфичные к углеводному эпитопу, соответственно, можно использовать для определения того, что положительные по углеводу микроорганизмы по настоящему изобретению несут углеводные структуры, имитирующие интересующий углеводный эпитоп, например, присутствующий на опухолях. Данная характеристика - специфичность углеводного эпитопа - является решающей для способности микроорганизма по настоящему изобретению инициировать желательный иммунный ответ.

Благодаря тому факту, что микроорганизмы по настоящему изобретению действительно являются положительными по углеводу и соответствующим образом отбираются - что можно определять/осуществлять при помощи специфичных к углеводным эпитопам антител - изобретение относится к положительным по углеводу микроорганизмам, которые индуцируют или усиливают специфический, и потому сильный, иммунный ответ против интересующего углеводного эпитопа. Как указано выше, указанный углеводный эпитоп предпочтительно является человеческим углеводным эпитопом и, следовательно, углеводным эпитопом, присутствующим на, или презентируемым человеческой клеткой. Препарат по настоящему изобретению активирует иммунную систему специфическим в отношении опухоли образом путем индукции высоких уровней антител против углеводного эпитопа, которые являются специфичными. Насколько известно авторам изобретения, настоящее изобретение относится к первой антигенспецифической пищевой добавке/нутрицевтику или фармацевтическому препарату, способным активировать специфическую иммунную защиту против опухолей, и к первой пищевой добавке, способной индуцировать иммунный ответ, специфичный к углеводному и, в частности опухолевому антигену Core-1.

По одному варианту осуществления изобретение относится к способу идентификации положительного по углеводу микроорганизма по настоящему изобретению, каковой микроорганизм, таким образом, способен инициировать специфический иммунный ответ.

Таким образом, предлагается способ выделения положительного по углеводу микроорганизма, несущего предпочтительно интересующий углеводный эпитоп человека, из смеси микроорганизмов, включающий

(a) создание контакта между связывающей углевод молекулой, специфичной к интересующему углеводному эпитопу, и смесью микроорганизмов и

(b) выделение как минимум одного микроорганизма, связавшегося с указанной связывающей углевод молекулой, из указанной смеси,

(c) при желании, проверка того, что выделенный микроорганизм является положительным по углеводу микроорганизмом, путем тестирования выделенного микроорганизма на специфическое связывание с указанной связывающей углевод молекулой.

Этот способ отбора позволяет идентифицировать микроорганизмы, несущие интересующий углеводный эпитоп и, таким образом, являющиеся подходящими компонентами для препаратов по настоящему изобретению. Как подчеркивалось выше, указанный углеводный эпитоп предпочтительно представляет собой углеводный эпитоп человека, такой как, например, опухолевый маркер.

Как становится ясно из примеров, существует несколько углеводных эпитопов, связанных с заболеваниями и, в частности, с раком (см., например, таблицу 1). Кроме того, известны также связывающие молекулы, которые специфически связывают указанные интересующие углеводные эпитопы человека (см. таблицу 2). Кроме того, способы получения связывающих углеводы молекул, специфичных к интересующему углеводному эпитопу, также описаны в данном документе.

По предпочтительному варианту осуществления указанный способ дополнительно включает тестирование индукции эффективного специфичного к углеводу клеточного иммунного ответа и/или гуморального иммунного ответа против указанного углеводного эпитопа указанным микроорганизмом и/или его фракцией и/или лизатом in vivo или in vitro. По данному предпочтительному варианту осуществления указанный положительный по углеводу микроорганизм индуцирует или усиливает иммунный ответ против интересующего углеводного эпитопа как минимум у одного человека или животного, при котором узнается интересующий углеводный эпитоп и/или опухолевая клетка, положительная по указанному углеводному эпитопу. Благодаря тому факту, что микроорганизм является положительным по интересующему углеводному эпитопу, иммунный ответ против интересующего углеводного эпитопа индуцируется/усиливается при введении идентифицированного микроорганизма. Благодаря этому создается механизм иммунологического надзора, который может, например, элиминировать вновь возникающие опухолевые клетки, несущие интересующий углеводный эпитоп, тем самым предотвращая рост первичной опухоли, и/или укреплять иммунную систему и/или усиливать иммунный ответ.

Вследствие этого, по предпочтительному варианту осуществления, этап (d) включает тестирование индукции эффективного специфичного к углеводу клеточного иммунного ответа против указанного углеводного эпитопа указанным положительным по углеводу микроорганизмом и/или его фракцией, и/или лизатом для активации CD4-положительных Т-клеток Th1-типа и/или для активации цитотоксических CD8-положительных T-клеток, предпочтительно как минимум у одного животного или человека и/или in vitro.

По одному из вариантов осуществления указанный тест на клеточный иммунный ответ, выполняемый на этапе (d), включает

i) нагружение как минимум одной дендритной клетки положительной по углеводу клеткой, идентифицированной на этапах (a)-(c);

ii) создание контакта между соответствующим количеством указанной как минимум одной дендритной клетки, нагруженной указанным положительным по углеводу микроорганизмом, и соответствующим количеством иммунных клеток, которые могут активироваться или ингибироваться дендритной клеткой;

iii) культивирование для осуществления взаимодействия указанных иммунных клеток с указанными нагруженными дендритными клетками;

iv) добавление соответствующего количества антигенпрезентирующих клеток (APC), нагруженных соответствующим количеством как минимум одного второго соединения, несущего тот же углеводный эпитоп, что и положительный по углеводу микроорганизм, где указанное второе соединение отличается от указанного положительного по углеводу микроорганизма;

v) культивирование для повторной стимуляции указанных иммунных клеток;

vi) определение того, произошла ли повторная стимуляция иммунных клеток.

При проведении данного теста на клеточный ответ можно определять, способен ли определенный углеводный эпитоп, присутствующий на указанном положительном по углеводу микроорганизме, инициировать клеточный иммунный ответ. До последнего времени в данной области считалось, что углеводы не способны инициировать клеточный иммунный ответ. Однако в настоящее время установлено, что определенные углеводные эпитопы способны вызывать клеточный иммунный ответ. Таким образом, важно предоставить системы тестирования для определения того, действительно ли положительный по углеводу микроорганизм, идентифицированный способом по настоящему изобретению, способен инициировать соответствующий иммунный ответ, тем самым определяя, подходит ли указанный микроорганизм, например, для терапии. В указанном тесте используют дендритные клетки, так как дендритные клетки способны примировать и, таким образом, стимулировать иммунные клетки, такие как T-клетки. Дендритные клетки процессируют соединения, с которыми они сталкиваются, и презентируют процессированные соединения/антигены на своей поверхности. Однако клетки с MHC, такие как дендритные клетки, могут презентировать только определенные виды антигенов, и важно определять, может ли интересующий антиген/эпитоп презентироваться дендритными клетками, поскольку только такие антигены/эпитопы способны вызывать клеточный иммунный ответ.

Вследствие этого, дендритные клетки нагружают положительным по углеводу микроорганизмом, идентифицированным на этапах (a)-(c). Подходящие для нагружения условия описаны в данном документе.

Указанные нагруженные дендритные клетки затем приводят в контакт с иммунными клетками, в частности, с лимфоцитами, такими как T-клетки. Иммунные клетки можно получать, например, от людей-доноров. Дендритные клетки, презентирующие антигены, соответствующие рецепторам иммунных клеток, активируют и, таким образом, стимулируют лимфоциты, тем самым способствуя их пролиферации и выживанию. Лимфоциты, не соответствующие антигенам, презентируемым дендритными клетками, не активируются и погибают.

Данный первый цикл стимуляции приводит к появлению активированных лимфоцитов, которые специфичны к любому соответствующему антигену, презентированному указанными нагруженными дендритными клетками. Однако задача настоящего этапа заключается в определении того, способен ли положительный по углеводу микроорганизм стимулировать клеточный ответ, специфичный к углеводному эпитопу.

Вследствие этого, проводят этап отбора, когда лимфоциты повторно стимулируют для определения того, стимулирует ли углеводный эпитоп положительного по углеводу микроорганизма лимфоциты и, тем самым, инициирует клеточный ответ. На указанном этапе отбора антигенпрезентирующие клетки, такие как, например, дендритные клетки, нагружают вторым соединением, которое также содержит интересующий углевод. Однако указанное второе соединение отличается от положительного по углеводу микроорганизма. Данное второе соединение также процессируется APC и антигены презентируются указанными APC. Поскольку второе соединение отличается от положительного по углеводу микроорганизма, большинство презентируемых антигенов, предпочтительно все антигены, кроме интересующего углевода, отличаются от антигенов, презентированных во время первого цикла. Эффект состоит в том, что только те лимфоциты выживают во время второго цикла повторной стимуляции, которые встречают подходящий им антиген, презентированный указанными APC. В случае, когда и дендритные клетки из первого цикла, и APC из второго цикла презентируют антиген, содержащий или состоящий из интересующего углеводного эпитопа, лимфоциты, узнающие указанный антиген, стимулируются и, таким образом, выживают, поскольку они также повторно стимулируются. Те лимфоциты, которые не встретили подходящего партнера при контакте с указанными APC, нагруженными указанным вторым соединением, содержащим интересующий углеводный эпитоп, погибают без повторной стимуляции. Этот этап отбора гарантирует, что клеточный ответ против интересующего углевода обнаружен.

Дополнительные варианты осуществления, касающиеся предложенных систем тестирования, которые можно использовать в связи с настоящим изобретением, описаны в формуле изобретения и далее в тексте.

Положительные по углеводу микроорганизмы, идентифицированные указанным способом, которые обладают описанными характеристиками и преимуществами, можно использовать в препарате по настоящему изобретению. Препарат по настоящему изобретению можно использовать для профилактических и/или терапевтических целей, и/или для поддержания иммунологических активностей.

Данное изобретение также относится к препаратам, которые можно применять в виде фармацевтической композиции и в виде нутрицевтиков, и которые могут индуцировать иммунные ответы против углеводных эпитопов на клетках человека или животных, либо против заболевания, при множестве различных путей введения, включая системное введение, такое как, но без ограничений, внутрибрюшинное, внутривенное, внутрикожное, подкожное, и даже более удивительно, при пероральном введении, способствуя системному иммунному ответу даже в случае введения микроорганизмов или их фракций перорально.

Препарат по изобретению представляет собой нутрицевтик или фармацевтическую композицию, которые содержат как минимум один микроорганизм, специфически связывающийся как минимум одной связывающей углевод молекулой, связывающей углеводный эпитоп, присутствующий на молекуле из клетки человека или животного, либо его фракцию или лизат, при этом указанный микроорганизм, либо его фракция или лизат, либо указанный препарат, указанный нутрицевтик, либо указанная фармацевтическая композиция индуцирует эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ против указанного углеводного антигена, предпочтительно цитотоксический Т-клеточный ответ, как минимум у одного животного или человека.

В одном варианте осуществления изобретения препарат по настоящему изобретению может представлять собой нутрицевтик и обеспечивает средство для индукции специфической иммунной защиты против заболеваний, связанных с определенными углеводными эпитопами или антигенами. Это отличается от обычных пробиотиков и пребиотиков, применение которых приводит не к антигенспецифическому иммунному ответу, а к общей неспецифической индукции иммунной системы. Использование препарата по настоящему изобретению в качестве нутрицевтика имеет множество преимуществ по сравнению с обычными стратегиями вакцинации. Одним из них является важное удобство для пациента или человека, использующего его. Иммуностимуляция является специфической для углеводного эпитопа или антигена и даже может быть индуцирована задолго до развития заболевания или опухоли для создания специфической иммунной защиты для предотвращения, ингибирования или ослабления развития подобных заболеваний, либо для использования в сочетании с другими видами терапии или лечения заболевания. Благодаря этому можно избежать агрессивных видов терапии (таких как химиотерапия, лучевая терапия или хирургическое вмешательство) с серьезными побочными эффектами. В предпочтительном варианте осуществления индивидууму необязательно посещать врача, чтобы активно заниматься профилактикой заболевания, он может получать необходимый препарат в составе пищи, тем самым снижая психологический барьер против других возможностей профилактики.

Фармацевтические композиции по изобретению также имеют то преимущество, что они могут быть направлены на заболевания, требующие серьезного лечения, в которых углеводы или углеводные маркеры играют важную роль.

Примеры таких заболеваний и связанных углеводных эпитопов человека, без намерения ограничиваться ими, приведены в таблице 1.

Таблица 1
Заболевание	Углеводный эпитоп
Меланома	GM2, GD2, GD3L, GD3, 9-O-ацетил GD2, 9-O-ацетил GD3
В-клеточная лимфома	GM2, GD2
Мелкоклеточный рак легких	GM2, фукозил GM1, Globo H, полисиаловая кислота, sLe a (сиалил-Lewis a)
Рак молочной железы	GM2, Globo H, TF, Core-1, Galbeta 1-3GalNAc-, Le y (Lewis-Y)
Рак предстательной железы	GM2, Globo H, Tn, sTn, TF, Le y, sLe a, Core-1
Рак легких	GM2, Globo H, Le y, Core-1
Рак толстой кишки	GM2, sTn, TF, Le y, Core-1
Рак яичников	GM2, Globo H, sTn, TF, Le y, Core-1
Рак желудка	GM2, Le y, Le a, sLe a, Core-1
Нейробластома	GM2, GD2, GD3L, полисиаловая кислота
Саркома	GM2, GD2, GD3L, GD3
Рак поджелудочной железы	sLe a, sLe x (сиалил-Lewis x)
Желудочно-кишечные формы рака	sLe a, sLe x
CD4+CD56+ неоплазия	sLe x (CD15)

Однако углеводный эпитоп также может быть пригоден в качестве индикатора других форм рака, таких как, но не ограничиваясь ими, TF для рака легких, рака печени, рака желудка, рака почек, рака предстательной железы и Core-1 для рака почек и печени.

На удивление, препарат по настоящему изобретению действует как механизм иммунной защиты против положительных по углеводу заболеваний или опухолевых клеток после введения человеку или животному. При применении для человека или животных он индуцирует или усиливает специфичный к углеводу иммунный ответ у людей или животных, который предотвращает или снижает частоту возникновения заболевания или опухолевых клеток, отличающихся экспрессией углеводного антигена.

Препарат по настоящему изобретению индуцирует высокие титры специфического антиуглеводного антитела и/или, что еще более удивительно, эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ с узнаванием углеводного антигена или углеводных структур, углеводных конъюгатов или клеток млекопитающего, содержащих указанный углеводный эпитоп. Подходящие положительные по углеводу микроорганизмы можно идентифицировать при помощи способов скрининга и систем тестирования, описанных в данном документе.

Благодаря биологической природе препарата его производство дешевле и требует меньше времени, чем производство обычных иммунофармацевтических препаратов.

Что удивительно, препарат по настоящему изобретению обладает собственными адъювантными свойствами, таким образом, нет необходимости применения дополнительных адъювантов или иммунопотенцирующих носителей во всех случаях.

A) Нутрицевтики и фармацевтическая композиция

Настоящее изобретение относится к препарату, выбираемому из группы, включающей нутрицевтики и фармацевтические композиции, содержащему как минимум один положительный по углеводу микроорганизм, который узнается и, таким образом, связывается при контакте как минимум с одной связывающей углевод молекулой, специфически узнающей углеводный эпитоп, присутствующий на молекуле из клетки человека или животного, либо его фракцию или лизат, при этом указанный микроорганизм, указанная фракция или указанный лизат, либо указанный препарат, содержащий их, индуцирует эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп.

Одним из важных аспектов настоящего изобретения является то, что положительный по углеводу микроорганизм и/или его положительный по углеводу лизат или фракция узнается как минимум одной связывающей углевод молекулой, предпочтительно специфичным к углеводному эпитопу антителом. Таким образом, положительный по углеводу микроорганизм и/или его положительный по углеводу лизат или фракция специфически связывается связывающей углевод молекулой при контакте с указанной связывающей углевод молекулой. Вследствие этого, углеводная структура, сходная с, или идентичная интересующему углеводному эпитопу, который предпочтительно представляет собой углеводный эпитоп человека, таким образом, является доступной для указанной связывающей углевод молекулы в положительном по углеводу микроорганизме по настоящему изобретению и не «скрыта» другими структурами. Эта важная характеристика, которую можно определять при тестировании, соответствующие тесты описаны ниже, является гарантией того, что положительный по углеводу микроорганизм, и/или его положительные по углеводу фракция или лизат, несет интересующий углеводный эпитоп и, таким образом, является как минимум иммунохимически по существу идентичным интересующему углеводному эпитопу, а не является эпитопом, который лишь сходен с интересующим углеводным эпитопом. Данная особенность важна для гарантии того, что иммунный ответ инициирован указанным положительным по углеводу микроорганизмом и является достаточно специфичным к интересующему углеводному эпитопу. Такая связывающая углевод молекула, которую можно использовать для определения того, что микроорганизм несет интересующий углеводный эпитоп, специфически узнает углеводный эпитоп, например, в опухоли - в соответствующем окружении. Также охвачены микроорганизмы, которые в природе не являются положительными по углеводу, но могут быть превращены в положительные по углеводу микроорганизмы при помощи химической обработки, такой как, например, периодатная обработка. Соответствующие микроорганизмы можно, например, использовать после периодатной обработки (открывающей Core-1) в качестве компонентов препаратов по настоящему изобретению, если они, благодаря химической обработке, впоследствии узнаются связывающими углевод молекулами и, таким образом, превращаются в положительные по углеводу микроорганизмы.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная индукция указанного эффективного специфичного к углеводу клеточного иммунного ответа происходит как минимум у одного человека или животного.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанную индукцию указанного эффективного специфичного к углеводу клеточного иммунного ответа проводят in vitro.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ включает активацию CD4-положительных T-клеток Th1-типа и/или активацию CD8-положительных цитотоксических T-клеток, направленных против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ включает активацию CD4-положительных T-клеток Th1-типа и активацию CD8-положительных цитотоксических T-клеток, направленных против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп.

Настоящее изобретение относится к препаратам, содержащим микроорганизмы, презентирующие углеводные эпитопы человека или животных, и/или их лизаты, и/или фракции, которые индуцируют эффективный специфичный к углеводу иммунный ответ, более предпочтительно эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ, еще более предпочтительно указанный клеточный иммунный ответ включает активацию хелперных T-клеток Th1-типа и цитотоксических T-клеток.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к препарату, выбираемому из группы, включающей нутрицевтик и фармацевтическую композицию, который содержит как минимум один микроорганизм, специфически связывающийся как минимум одной связывающей углевод молекулой, связывающей углеводный эпитоп, присутствующий на молекуле из клетки человека или животного, либо его фракцию или лизат, при этом указанный микроорганизм, либо его фракция или лизат, либо указанный препарат, указанный нутрицевтик, либо указанная фармацевтическая композиция индуцирует эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к нутрицевтику, содержащему как минимум один микроорганизм, несущий или презентирующий как минимум один углеводный эпитоп человека или животного, и/или его лизаты, и/или фракции, который индуцирует эффективный специфичный к углеводу иммунный ответ, более предпочтительно эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, еще более предпочтительно указанный клеточный иммунный ответ включает активацию хелперных T-клеток Th1-типа и цитотоксических T-клеток.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей как минимум один микроорганизм, несущий или презентирующий как минимум один углеводный эпитоп человека или животного, и/или его лизат, и/или фракцию, который индуцирует эффективный специфичный к углеводу иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, более предпочтительно эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ, еще более предпочтительно указанный клеточный иммунный ответ включает активацию хелперных T-клеток Th1-типа и цитотоксических T-клеток.

Предпочтительно фармацевтическую композицию по настоящему изобретению применяют для предотвращения или снижения частоты появления болезнетворных клеток, которые экспрессируют углеводный эпитоп человека или животного, и/или для предотвращения или уменьшения распространения метастазов указанных клеток, таких как, но не ограничиваясь ими, опухолевые клетки или раковые клетки, экспрессирующие или содержащие углеводный эпитоп человека или животного.

В другом варианте осуществления изобретения фармацевтическую композицию применяют для лечения заболевания или опухоли, экспрессирующих углеводный эпитоп человека или животного.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения нутрицевтик или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению применяют в качестве вакцины против клеток или заболевания, отличающихся наличием углеводного эпитопа или его части, которая определяет специфичность.

Указанные заболевания или опухоли, связанные с, или экспрессирующие углеводный эпитоп, перечислены где-либо еще в данном документе.

Фармацевтический препарат по изобретению содержит как минимум один положительный по углеводу микроорганизм и фармацевтически приемлемый носитель. Получение и введение препарата по данному изобретению (например, лекарственного средства, содержащего положительный по углеводу микроорганизм) осуществляют известными методами. Например, препарат можно сочетать с общепринятыми галеновыми адъювантами для получения композиции, подходящей для желательного способа применения. Например, соединения по данному изобретению можно использовать в смеси с общепринятыми эксципиентами, то есть фармацевтически приемлемыми органическими и неорганическими веществами-носителями, подходящими для парентерального или энтерального применения, которые не будут неблагоприятным образом реагировать с активными соединениями. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваясь ими, воду, солевые растворы, спирты, растительные масла, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, вязкий парафин, парфюмерное масло, моноглицериды и диглицериды жирных кислот, пентаэритроловые сложные эфиры жирных кислот, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон, тальк и так далее.

Нутрицевтик или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить человеку или животному различными путями применения или введения. Предпочтительные пути введения по смыслу данного изобретения описаны далее в данном документе.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения нутрицевтик или фармацевтическую композицию применяют перорально человеку или животному.

Данное изобретение относится к препарату, выбираемому из группы, включающей нутрицевтик и фармацевтическую композицию, содержащему как минимум один микроорганизм, связывающийся как минимум одной связывающей углевод молекулой, специфически узнающей углеводный эпитоп, присутствующий на молекуле из клетки человека или животного, либо его фракцию или лизат, при этом указанный микроорганизм, указанная фракция или указанный лизат, или указанный препарат, содержащий их, индуцирует эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа как минимум у одного животного или человека. Вследствие этого, в любом месте данного документа иммунный ответ против углеводного эпитопа также означает иммунный ответ против углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп.

В предпочтительном варианте осуществления указанный препарат индуцирует или усиливает специфический иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа у человека или животного, при этом указанный углеводный эпитоп ассоциирован с заболеванием человека или животных.

В другом предпочтительном варианте осуществления указанный специфический иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа включает гуморальный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа.

Указанный гуморальный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа приводит к продукции специфичных к углеводу антител у человека или животного, и его можно определять при помощи тестов на гуморальный иммунный ответ, как описано ниже. Усиление гуморального иммунного ответа означает возрастание титра уже присутствующих антител против указанного углеводного эпитопа после введения препарата по изобретению.

В другом предпочтительном варианте осуществления указанный специфический иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа включает эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа.

В другом предпочтительном варианте осуществления указанный эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ включает активацию CD4-положительных T-клеток Th1-типа и активацию CD8-положительных цитотоксических T-клеток, направленных против указанного углеводного эпитопа.

В другом предпочтительном варианте осуществления указанный специфический иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа включает эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ и гуморальный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения углеводный эпитоп выбирают из группы, включающей TF, Core-1, Tn, сиалил-Tn, сиалил-TF, Globo-H, Lewis-Y, сиалил-Lewis-A, сиалил-Lewis-X, полисиаловую кислоту, Lewis-X, GM2, GD2, GD3, 9-O-ацетил GD3, 9-O-ацетил GD2, GD3L, фукозил GM1, фукозил GM1, Lewis-A, Lewis-B, sLac, сиалилированную цепь типа 1, антиген CA 19-9, антиген CA 72-4 и антиген CA-50.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения связывающую углевод молекулу выбирают из группы, включающей как минимум один лектин, как минимум один селектин и/или как минимум одно антитело и/или как минимум одну молекулу, производную от них, которая связывает TF, Core-1, Tn, сиалил-Tn, сиалил-TF, Globo-H, Lewis-Y, сиалил-Lewis-A, сиалил-Lewis-X, полисиаловую кислоту, Lewis-X, GM2, GD2, GD3, 9-O-ацетил GD3, 9-O-ацетил GD2, GD3L, фукозил GM1, Lewis-A, Lewis-B, sLac, сиалилированную цепь типа 1, антиген CA 19-9, антиген CA 72-4 или CA-50, либо эпитоп, включающий любую из данных углеводных структур или ее части.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к препарату, выбираемому из группы, включающей нутрицевтики и фармацевтические композиции, содержащему как минимум один положительный по углеводу микроорганизм, связывающийся как минимум одной связывающей углевод молекулой, специфически узнающей углеводный эпитоп, присутствующий на молекуле из клетки человека или животного, либо его фракцию или лизат, при этом указанный микроорганизм, указанная фракция или указанный лизат, или указанный препарат, содержащий их, индуцирует эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, как минимум у одного животного или человека, где

(i) указанный эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ включает активацию CD4-положительных T-клеток Th1-типа и/или активацию CD8-положительных цитотоксических T-клеток, направленных против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, и

(ii) углеводный эпитоп выбирают из группы, включающей TF, Core-1, Tn, сиалил-Tn, сиалил-TF, Globo-H, Lewis-Y, сиалил-Lewis-A, сиалил-Lewis-X, полисиаловую кислоту, Lewis-X, GM2, GD2, GD3, 9-O-ацетил GD3, GD3L, фукозил GM1, фукозил GM1, Lewis-A, Lewis-B, sLac, сиалилированную цепь типа 1, антиген CA 19-9, антиген CA 72-4 и антиген CA-50, и

(iii) связывающую углевод молекулу выбирают из группы, включающей лектины, селектины и/или антитела и/или производные от них молекулы, которые связывают TF, Core-1, Tn, сиалил-Tn, сиалил-TF, Globo-H, Lewis-Y, сиалил-Lewis-A, сиалил-Lewis-X, полисиаловую кислоту, Lewis-X, GM2, GD2, GD3, 9-O-ацетил GD3, GD3L, фукозил GM1, фукозил GM1, Lewis-A, Lewis-B, sLac, сиалилированную цепь типа 1, антиген CA 19-9, антиген CA 72-4 или антиген CA-50, либо углеводную структуру, содержащую любой из данных углеводных эпитопов или его частей.

Примеры углеводных структур и соответствующих связывающих углевод молекул, без намерения ограничиваться ими, приведены в таблице 2.

Таблица 2
Углеводный эпитоп	Связывающая углевод молекула
Лектин	Моноклональное антитело
TF или Core-1	Галектин, лектины C-типа из макрофагов, сиалоадгезин, PNA³, джакалин³, MAL³, EEL³, ECL³	Nemod-TF1², Nemod-TF2², A78-G/A7², HB-T1¹¹, HH8¹⁴, A68-B/A11²
Tn	Лектины C-типа из макрофагов, сиалоадгезин, BPL³, DBA³, GSLI³, MPL³, RCA³ , SJS³, SBA³	HB-Tn1¹¹
Сиалил-Tn		CA 72-4¹, TKH2¹, HB-STn1¹¹
Globo-H		A69-A/E8², VK9¹³
Lewis-Y		A46-B/B10², A63-D/B12², A51-B/A6², A70-C/C8², A70-A/A9²
сиалил-Lewis-A	E-селектин	CA 195¹, CA 50¹, 121SLE¹²
сиалил-Lewis-X	E-селектин	CA19-9¹, KM931¹⁰, T174¹⁰
Lewis-X		73-30⁴, BG-7 (P12)⁴
Lewis-A		CA 195¹, MAB2108 (7LE)⁴, BG-5 (T174)⁴, PR5C5¹²
Lewis-B		MAB2102 (2.25LE)⁴, BG-6 (T218)⁴
Сиалилированная цепь типа 1		CA 242¹
sLac		CA 50¹, DU-PAN-2¹
Полисиаловая кислота	MAL II³, SNA³	Mab735⁹, 5A5¹³
Фукозил GM1		F12¹³
GM2		BP283⁵, PGNX¹³
GD2		Mab 126¹, 3F8⁸, ME 36.1¹
GD3		R24⁶ , MAB2053⁷, ME 36.1¹
9-O-ацетил GD2		3F8⁸
9-O-ацетил GD3		ME3.11¹
¹Orntoft et al. Electrophoresis 1999, 20, 362-371 ² Glycotope GmbH Berlin, www.glycotope.com ³ vector laboratories, www.vectorlabs.com ⁴ Amano et al. Clin Diagn Lab Immunol 1997(Sep), 540-544 ⁵ Acris Antibodies GmbH, www.acris-antibodies.com ⁶ Reaman et al. Cancer Res 1990 50 (1):202-5 ⁷ CHEMICON International, Inc. www.chemicon.com ⁸ Ye et al. 1992; 50 (2): 197-201 ⁹ Husmann et al. J. Histochem Cytochem 1990; 38 (2):209-15 ¹⁰ Calbiochem www.Calbiochem.com ¹¹ DakoCytomation Dako Deutschland GmbH, Germany, www.dakogmbh.de ¹² Dianova, Hamburg, Germany ¹³ Livingston et al. Cancer Immunol Immunother (2005) 54:1018-1025 ¹⁴ Clausen et al. Mol Immunol (1988) 25:199-204.

Указанный положительный по углеводу микроорганизм, а также фракции и лизаты положительного по углеводу микроорганизма и их сочетания подробно описаны в разделе «Определения» и в других разделах данного документа, как и способы определения и выделения указанных микроорганизмов или их фракций.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к нутрицевтику или фармацевтической композиции, содержащим как минимум один положительный по углеводу микроорганизм, либо его фракцию или лизат, которые индуцируют или усиливают специфичный к углеводу иммунный ответ против углеводного эпитопа как минимум у одного человека или животного, действующий как защита против положительных по углеводному эпитопу раковых клеток благодаря способности разрушать раковые клетки, которые несут или содержат указанный углеводный эпитоп.

Положительные по углеводному эпитопу раковые клетки, по смыслу данного изобретения, означают раковые клетки, которые экспрессируют, несут или содержат указанный углеводный эпитоп, или которые продуцируют указанный углеводный эпитоп, или которые ассоциированы с углеводным эпитопом.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к нутрицевтику или фармацевтической композиции, содержащим как минимум один положительный по углеводу микроорганизм, либо его фракцию или лизат, которые индуцируют или усиливают специфичный к углеводу иммунный ответ как минимум у одного человека или животного, действующий как защита против болезнетворных клеток при заболевании, связанном с указанным углеводным эпитопом благодаря способности разрушать указанные клетки.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения используют нутрицевтик для создания указанного специфичного к углеводу иммунного ответа, который действует как защита против клеток с углеводом, обладая способностью разрушать такие клетки, как описано выше, при пероральном введении нутрицевтика здоровым индивидуумам (как минимум одному).

В следующем предпочтительном варианте осуществления нутрицевтик по изобретению используют для снижения вероятности или, в еще более предпочтительном варианте осуществления, для предотвращения положительной по углеводу болезни или опухоли путем перорального введения нутрицевтика как минимум одному здоровому индивидууму.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтическую композицию, содержащую как минимум один положительный по углеводу микроорганизм, либо его фракцию или лизат, используют для создания специфического к углеводу иммунного ответа, который действует как защита против положительных по углеводному эпитопу раковых клеток благодаря способности разрушать такие клетки, как представлено в данном документе, например, путем индукции специфичных к углеводному эпитопу антител, специфичной к углеводному эпитопу комплементзависимой цитотоксичности специфичных к углеводному эпитопу антител против положительных по углеводному эпитопу опухолевых клеток, что приводит к их эффективному лизису, либо путем секреции TNF-альфа и/или INF-гамма при специфичном к углеводным эпитопам Т-клеточном ответе, каковые являются научно признанными специалистами в данной области суррогатными маркерами специфического опосредованного цитотоксическими Т-клетками лизиса опухолевых клеток, для тех опухолевых клеток, которые несут углеводный эпитоп, как показано на примерах и описано в данном документе.

Нутрицевтик или фармацевтическую композицию по изобретению используют для лечения положительной по углеводу болезни или опухоли как минимум у одного человека или животного.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения нутрицевтик, содержащий как минимум один положительный по углеводу микроорганизм, либо его фракцию, используют для лечения положительной по углеводу болезни или опухоли путем перорального введения нутрицевтика пациентам, страдающим от данной болезни.

В следующем предпочтительном варианте осуществления нутрицевтик или фармацевтическую композицию по изобретению используют для снижения вероятности или, в еще более предпочтительном варианте осуществления, для предотвращения положительной по углеводу болезни или опухоли или метастаза.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к нутрицевтику или фармацевтической композиции, содержащим как минимум один положительный по углеводу микроорганизм, либо его фракцию, которые при введении уменьшают или предотвращают распространение метастазов положительной по углеводу болезни или опухоли как минимум у одного человека или животного.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к препарату, выбираемому из группы, включающей нутрицевтик или фармацевтическую композицию, содержащему как минимум один положительный по углеводу микроорганизм, либо его фракцию, который используют для профилактики и лечения заболевания человека или животных, связанного с углеводным эпитопом.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, которую используют для предотвращения или уменьшения распространения опухоли или метастаза, или распространения метастазов, или времени до развития рецидива положительной по углеводному эпитопу опухоли или опухолевых клеток, для улучшения качества жизни или среднего времени выживания или показателя времени до развития рецидива, или для лечения пациента с опухолью, который имеет или имел положительную по углеводному эпитопу опухоль, путем введения фармацевтической композиции пациентам, страдающим от данного заболевания.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения нутрицевтик или фармацевтическая композиция содержат как минимум два различных положительных по углеводу микроорганизма или их фракции.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения нутрицевтик или фармацевтическая композиция содержат как минимум два различных положительных по углеводу микроорганизма или их фракции, где положительные по углеводу микроорганизмы или фракции являются положительными по одному и тому же углеводу.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения вышеуказанный нутрицевтик или фармацевтическая композиция по изобретению содержат как минимум один положительный по углеводу микроорганизм и как минимум одну фракцию положительного по углеводу микроорганизма, предпочтительно из более чем одного положительного по углеводу микроорганизма, при этом положительный по углеводу микроорганизм и фракция положительного по углеводу микроорганизма являются положительными по одному и тому же или по различным углеводам.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения нутрицевтик или фармацевтическая композиция содержат как минимум один положительный по углеводу микроорганизм или его фракцию в сочетании как минимум с одним другим полезным микроорганизмом.

Указанный полезный микроорганизм предпочтительно выбирают из группы, включающей Lactobacillus и Bifidobacterium.

В другом предпочтительном варианте осуществления нутрицевтик или фармацевтическая композиция по изобретению содержат как минимум одну фракцию положительного по углеводу микроорганизма и как минимум один положительный по углеводу микроорганизм.

В следующем предпочтительном варианте осуществления нутрицевтик или фармацевтическая композиция по изобретению содержат как минимум одну фракцию положительного по углеводу микроорганизма в сочетании как минимум с одним другим полезным микроорганизмом, таким как, но не ограничиваясь ими, молочнокислые бактерии и/или бифидобактерии, даже более предпочтительно сочетание фракций положительных по углеводу микроорганизмов различных штаммов в сочетании с другими полезными микроорганизмами.

Препарат по настоящему изобретению, выбираемый из группы, включающей нутрицевтик и фармацевтическую композицию, может состоять только из микроорганизма или его фракции или может содержать дополнительные ингредиенты или компоненты, такие как, но не ограничиваясь ими, более чем один микроорганизм или его фракция, либо другие микроорганизмы или их фракции, или буферные растворы, или носители, или фармацевтически приемлемые носители, или пищевые продукты, как описано где-либо еще в данном документе.

Указанный нутрицевтик по изобретению может состоять только как минимум из одного положительного по углеводу микроорганизма или его фракции, такого как, но не ограничиваясь ими, микроорганизм, который является живым или убитым, лиофилизированным, или пастеризованным, или лизатами, или компонентами, или его фракциями, или находится как минимум в частично солюбилизированной форме в жидкости, либо может содержать дополнительные компоненты, такие как, но не ограничиваясь ими, другие питательные вещества, пищевые добавки или добавки к пище или напиткам, растворы или эмульсии, известные специалистам в данной области. Указанный нутрицевтик можно принимать перорально в различных формах, таких как капсулы, таблетки, эмульсии, порошки, жидкости. Нутрицевтик можно принимать отдельно или смешивать с пищей или напитками. Указанный нутрицевтик может также представлять собой любой пищевой продукт, напиток, компонент напитка или пищи, пищевую добавку или отдельный нутрицевтик.

В предпочтительном варианте осуществления нутрицевтик используют в виде капсулы или таблетки. В другом предпочтительном варианте осуществления нутрицевтик смешивают с пищевыми продуктами или напитками, такими как, но не ограничиваясь ими, перечисленные в другом разделе данного изобретения.

Настоящее изобретение относится также к нутрицевтику, содержащему как минимум один микроорганизм, связывающийся как минимум одной связывающей углевод молекулой, специфически узнающей углеводный эпитоп, присутствующий на молекуле из клетки человека или животного, либо его фракцию или лизат, при этом указанный микроорганизм, указанная фракция или указанный лизат, или указанный препарат, содержащий их, индуцирует эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа как минимум у одного животного или человека.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный нутрицевтик человек или животное употребляют в виде пищи или пищевой добавки.

Пища, в контексте изобретения, представляет собой любое вещество, поглощаемое живыми организмами, включая жидкие напитки. Пища является основным источником энергии и питания для животных/людей и обычно бывает животного или растительного происхождения. Пища является предпочтительно вегетарианской пищей, которая включает в основном все типы пищи, свободные от животных продуктов, таких как мясо, молоко или яйца. Пища, в контексте изобретения, также предпочтительно является не вегетарианской пищей, включающей животные продукты. Пища, в контексте изобретения, представляет собой:

(i) любое вещество или продукт, либо переработанный, частично переработанный, либо не переработанный, предназначенный для, или имеющий основание считаться употребляемым в пищу людьми, обладающий или не обладающий пищевой ценностью;

(ii) воду и другие напитки;

(iii) жевательную резинку или кондитерские изделия; и/или

(iv) изделия или вещества, используемые в качестве ингредиентов или компонентов при приготовлении пищи.

Пищу, в контексте изобретения, обычно получают в результате сельскохозяйственного производства, скотоводства и рыбной ловли, путем охоты, собирательства или другими способами снабжения продовольствием, важными в данной местности для некоторых народов, но незначительными для других. В современную эпоху в развитых странах пищевые ресурсы в возрастающей степени зависят от земледелия, сельского хозяйства на промышленной основе, технологий разведения и выращивания рыбы, которые имеют целью максимально увеличить количество производимой пищи, при этом сводя к минимуму ее стоимость. Для достижения этого применяют механизированные устройства, которые были разработаны, от молотилки, сеялки до трактора и комбайна, и так далее. В дополнение к данным устройствам применяют пестициды, чтобы собирать большой урожай и бороться с насекомыми или млекопитающими, которые наносят ущерб урожаю. В последнее время наблюдается растущая тенденция к применению более экологически безопасных сельскохозяйственных методов. Такой подход, которому в определенной степени способствует потребительский спрос, содействует биологическому разнообразию, самостоятельному экономическому развитию на местах и применению методов органического земледелия.

Типы обработанных пищевых продуктов (пищи, которая содержит как минимум один положительный по углеводу микроорганизм или его фракцию) в контексте данного изобретения представляют собой:

напитки: пиво, сок, безалкогольные напитки, фруктовые напитки, вино, напитки, содержащие молоко, молочные продукты или другие алкогольные или безалкогольные напитки, например, воду, включая простую газированную воду, фруктовые соки и овощные соки, безалкогольные напитки, свежеприготовленные фруктовые напитки, лимонад, колу, имбирный эль, айрон брю, шипучий напиток из корнеплодов, шипучий напиток с экстрактом сарсапарели, крем-соду, напитки из одуванчика и лопуха, фруктовый напиток, фруктовый ароматизированный сироп, разведенный водой, спортивные напитки, настойки, кофе, чай, молочные напитки, например, молоко, питьевой йогурт, шоколадное молоко, молочный коктейль, эг-ног, миндальное молоко, оршад, алкогольные напитки, коктейли - смешанные напитки, горячие напитки, например, горячий шоколад, горячий сидр, капучино или перламутровый молочный чай;

хлеб, который является основным продуктом питания во многих странах, выпеченный из поднявшегося теста из пшеничной муки или муки других злаков, например, ржано-пшеничный, хлеб для тостов (белый хлеб), цельнозерновой, пшенично-ржаной, белый хлеб, многозерновой, ржаной, с семенами подсолнечника, с тыквенными семенами, пицца, чапати, кукурузные лепешки, багеты, питы, лаваш, бисквиты, соленые крендельки, лепешка наан, баранки, пурис, пирог, хлеб из ржаного шрота, хлеб из непросеянной муки, хлеб с зародышами пшеницы, цельнозерновой, гранарный хлеб, а также многие другие варианты;

пироги и печенья, например, ангельский пирог, яблочный пирог, бабка, итальянский крендель, кекс, масляный торт, торт в виде бабочки, морковный пирог, творожный кекс, шоколадный кекс, рождественский кекс, кекс из взбитого теста на растительном масле, французское пирожное с кремом, кекс, шоколадный торт, эклсская слойка, небольшое пирожное в бумажной обертке, фруктовый торт, немецкий шоколадный кекс, генуэзский торт, имбирный пряник, гоб, мягкий масляный торт, американский бисквит на горячем молоке, торт из мороженого, бисквитные печенья с шоколадом, хлеб из дрожжевого теста, китайский лунный пирог, кулич, ананасовый торт, круглый фунтовый кекс, торт королевы Елизаветы, пирог из красной фасоли, красный бархатный торт, торт «Захер», пасхальный кекс, кекс с пряностями, бисквит, овсяное печенье, кекс к чаю, французский яблочный пирог, слоеный торт с кремом или свадебный торт;

сыр, который получают из створоженного молока; существует много разновидностей сыра, например, сыр сардо, сыр тестури, сыр бокмакири, сыр квайто, сыр вуки, сыр акави, корзинный сыр, творог, сыр джибнех, сыр кенафа, сыр набулси, панир, аффинор, немецкий горный сыр, брынза, дачстейнер, тирольский серый сыр, люнеберг, сыр бовурд, брюссельский сыр, сыр эрв, сыр лимбургер, сыр маредсу, сыр пассендейл, сыр плато д'Эрв, сыр постел, сыр ремеду, датский голубой сыр, датский тильзит или тильзит гаварти, сыр алгау эмменталь, сыр камбозола, сыр харцер, сыр лимбургер, сыр спундекас, сыр фета, сыр халуми или сыр моцарелла;

десерт, который представляет собой блюдо, как правило, сладкое, и обычно подается после основного блюда, например, мороженое, например, бисквиты или печенье, торты, пироги, сладкие кремы, фрукты, сладкое желе, мороженое, меренги, мучные кондитерские изделия, торты или пироги, пудинги, шербеты, суфле или пропитанный вином бисквит;

картофель фри, чипсы, например, картофельные чипсы или «криспы», чипсы тортийя или кукурузные чипсы;

функциональные продукты питания (функциональные продукты питания называют нутрицевтиками, слово-гибрид, образованное из слов питание (nutrition) и фармацевтический препарат, они могут включать генетически модифицированные продукты питания; основная категория включает переработанные продукты питания, полученные из функциональных пищевых ингредиентов, либо обогащенные целебными добавками, такие как «витаминизированные» продукты, а также свежие продукты (например, овощи), для которых прилагаются пункты формулы изобретения, характеризующие конкретное воплощение);

варенье и желе, например, варенье из крыжовника, красной смородины, черной смородины, цитрусов, яблок, малины, земляники и зрелой ежевики, или маточное желе;

пасту, например, фигурная пасту, кампанелли, казареччи, кавателли, кончигли, кончиглиони, фарталле, фиори, фузилли, фузилли букати, джемелли, джигли, граминья, люмаче, люмакони, мальтаглиати, оречиетте, в виде трубок, квадрефиоре, радиатори, риччиолини, ротелле, ротини, спиралини, галушки, торчио или трофи;

пирог, например, пирог с беконом и яйцами, пирог с цыпленком и грибами, пирог с солониной, корнуэльский пирожок, пирог с рыбой, калакукко, кулебяка, пицца, пирог со свининой, пирог, испеченный в форме, шотландский пирог, картофельная запеканка с мясом, рождественский пирог, пирог со стейком, пирог со стейком и почками, яблочный пирог, пирог с банановым кремом, ежевичный пирог, черничный пирог, бостонский пирог с кремом, пирог со смесью ягод, вишневый пирог, пирог с шоколадным кремом, пирог с кокосовым кремом, ватрушка, голландский яблочный пирог, виноградный пирог, лаймовый пирог, лимонный пирог с меренгами, лимонный пирог, пирог со смесью ягод, апельсиновый пирог, персиковый пирог, пирог с ревенем, пирог с земляникой и ревенем, земляничный пирог или уксусный пирог;

пиццу, например, классические виды и их соответствующие начинки включают: с морепродуктами или по-неаполитански: помидоры, оливковое масло, орегано и чеснок; маргарита: помидоры, оливковое масло, свежие листья базилика и сливки (моцарелла из коровьего молока) или моцарелла из буйволиного молока; сырная с помидорами: помидоры, оливковое масло и тертый сыр пармезан, по желанию добавляют листья базилика; с начинкой или кальцони: сливки или моцарелла из буйволиного молока, иногда добавляют сыр рикотта, оливковое масло и салями, другие виды мяса, овощи и так далее, или стромболи: моцарелла, мясо, овощи и так далее;

подвергнутое обработке мясо, например, мясо амфибий, жаб, искусственное мясо, имитация мяса, in vitro мясо, говядина, мясо буйвола, крупного рогатого скота, бифштексы, телятина (мясо телят), мясо яка, домашняя птица (мясо птицы), цыплята, утки, пернатая дичь, индейка, мясо собак, морепродукты, рыба, акулье мясо, ракообразные, крабы, кролики, баранина (мясо овцы), мясо ягненка, свинина (мясо свиньи), ветчина (окорок), бекон (консервированные полоски мяса) или насекомые;

сандвичи, например, сандвич арам, багет с начинкой, с копченой свиной грудинкой, сдобная булочка, гамбургер, буррито, чипсы, клубный сандвич, сыр-гриль, донер кебаб, джорджийские хот-доги, сандвичи с растопленным сыром: с растопленным сыром и тунцом и так далее, панини, сандвич с бифштексом, тако, сандвичи к чаю, поджаренные сандвичи, сладкий пирог или завертка;

салат, например, салат цезарь, шеф-салат, Кобб-салат, греческий салат, итальянский салат, месклун-салат, салат нисуаз, салат с бобами, такой как салат с зеленой фасолью, салат с семью видами бобов, куриный салат, яичный салат, фруктовый салат (очищенные порезанные ломтиками фрукты в собственном соку или с заправкой), ларб, макаронный салат, картофельный салат, сомен-салат, сом тарн, табули, уолдорфский салат или уотергейтский салат;

соус, например, белые соусы, грибной соус, миндальный соус, американский соус, соус супрем, нежные коричневые соусы, бордосский соус, бургундский соус, соус шатобриан, африканский соус, соус роберт, соус бешамель, соус морней, эмульгированные соусы, соус бернез, голландский соус, майонез, соус тартар, сливочная салатная заправка, масляные соусы, белый соус, соус «кафе де Пари», сладкие соусы, соус к рыбе, самбал, соус барбекю, мол, томатный соус или цацики;

колбасы, например, колбаса из свиных внутренностей, кровяная крупяная колбаса, кровяная колбаса, буреворс, братвурст, закусочная колбаса, свиная колбаса, чоризо, камберлендская колбаса, фалукорв, фуэт, хаггис, киска, колбаса, кишка, внутренности, сарделька с чесноком, колбаса, ландджагер, лингвика, ливерная колбаса, луканка, метвурст, фарш, мортаделла, салями, суджук, тюрингер, вейливурст или ливерная колбаса;

закуски: кондитерские изделия, картофельные чипсы, шоколад, галеты, конфеты, неполноценная пища, например, вареный арахис, конфеты, читос, чекс микс, печенье, крекеры, хрустящие смеси, печенье с помадкой, хула-хупы, мороженое, мун пай, «пиратский трофей», попкорн, шкварки, картофельные чипсы, соленые крендельки, смарт пафс, безалкогольные напитки, взбитые белки с сахаром, студенческие закуски, бисквитные рулеты, тингз, бисквиты с кремовой начинкой, вегетарианские закуски или торт «зебра»;

суп, например, десертные супы (гинатан, филиппинский суп, сделанный из кокосового молока, молока, фруктов и крупы тапиоки); ошируко, японский суп из бобов адзуки или фруктовые супы, суп из зимней дыни, суп мисо, вьетнамский суп-лапша, рамен, саймин, румынский картофельный суп, авголемоно, борщ, буйабез, калалу, кокки-ликки, фанеска, гаспачо, чечевичная похлебка, овощной суп, густой острый суп с пряностями, шотландская похлебка, гороховый суп, солянка, таратор или ватерзой;

сахар или сахарные продукты, например, золотой сироп, конфеты или шоколад;

йогурт, творог, сметану, взбитые сливки, например, ласси, кефир, айран, жидкий газированный йогурт или таратор;

сухие напитки или таблетки, например, витаминные напитки или минеральные напитки;

капсулы или таблетки;

лечебную пищу (лечебная пища представляет собой продукты, созданные для определенных, как правило, относящихся к питанию терапевтических целей), функциональную пищу, лекарственную пищу, энтеральную пищу, парентеральную пищу, пищу специального оздоровительного применения.

Примерами являются «Ensure», обогащенный молочный коктейль, разработанный в основном для пожилых людей, и «Plumpy'nut», продукт из арахиса, разработанный для экстренного кормления сильно истощенных детей.

В другом предпочтительном варианте осуществления препарат по изобретению производят как лекарственное средство, отпускаемое без рецепта.

Указанный гуморальный ответ против углеводного эпитопа представляет собой продукцию антител против углеводного эпитопа, что можно определять как минимум одним из тестов на гуморальный иммунный ответ: 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Соответствующие тесты также можно использовать совместно со способом идентификации подходящего положительного по углеводу микроорганизма по настоящему изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к тесту на гуморальный иммунный ответ (тест 1 на гуморальный иммунный ответ) против углеводного эпитопа, включающему тестирование методом ELISA связывания антитела, антител в сыворотке или антител, извлеченных из сыворотки, плазмы или фекалий, с соединениями, такими как белки или пептиды, несущими углеводный эпитоп , при этом при положительном гуморальном иммунном ответе против углеводного эпитопа наблюдают значительно более сильное связывание антител с соединением, несущим указанный углеводный эпитоп, таким как белок или пептид, чем с указанным соединением, таким как, например, белок или пептид, не имеющим углеводного эпитопа, или с указанным соединением (например, белком или пептидом ) после ферментативной или химической обработки, которая разрушает углеводный эпитоп. В предпочтительном варианте осуществления связывание указанного антитела или антител является значительно более сильным после введения нутрицевтика, фармацевтической композиции, положительного по углеводу микроорганизма или его фракции, либо препаратов, содержащих их, чем связывание соответствующего антитела, антител в сыворотке или антител, извлеченных из сыворотки, плазмы или фекалий, полученное до указанного введения.

Указанная ферментативная или химическая обработка углеводного эпитопа разрушает углеводную структуру углеводного эпитопа. Указанную ферментативную или химическую обработку углеводного эпитопа можно проводить, используя методы, известные специалистам в данной области, такие как, но не ограничиваясь ими, обработку нейраминидазой, сиалидазой, глюкозидазой, галактозидазой, гликозидазой, экзогликозидазой, фукозидазой, гексНКазой или йодной кислотой (мягкое периодатное окисление/периодатная обработка, как описано в примерах).

Например, углеводные эпитопы Core-1 и Tn разрушают обработкой йодной кислотой, как описано в примерах.

Пример предпочтительного варианта осуществления теста 1 на гуморальный иммунный ответ подробно описан в примере 11. В примере 11 описано тестирование методом ELISA гуморального иммунного ответа против углеводного эпитопа Core-1 в отношении асиалогликофорина, белка, содержащего углеводный эпитоп, в отношении гликофорина, того же белка, но в котором Core-1 замаскирован сиаловой кислотой, а также в отношении обработанного йодной кислотой асиалогликофорина, при этом обработка йодной кислотой разрушает структуру Core-1.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к тесту на гуморальный иммунный ответ (тест 2 на гуморальный иммунный ответ) против углеводного эпитопа , включающему тестирование методом ELISA связывания антитела, антител в сыворотке или антител, извлеченных из сыворотки, плазмы или фекалий, с углеводными структурами, связанными с полиакриламидом (PAA-конъюгаты), при этом при положительном гуморальном иммунном ответе против углеводного эпитопа наблюдают значительно более сильное связывание антитела или антител с PAA-конъюгатом, содержащим углеводный эпитоп, чем с тем же PAA-конъюгатом после ферментативной или химической обработки, разрушающей углеводный эпитоп, и/или более сильное связывание антитела или антител с PAA-конъюгатом, содержащим углеводный эпитоп, по сравнению с PAA-конъюгатом, не содержащим углеводный эпиоп, предпочтительно, в обоих случаях. В предпочтительном варианте осуществления связывание указанного антитела или антител с PAA-конъюгатом, содержащим углеводный эпитоп, является значительно более сильным после введения нутрицевтика, фармацевтической композиции, положительного по углеводу микроорганизма или его фракции, либо препаратов, содержащих их, чем связывание соответствующего антитела, антител в сыворотке или антител, извлеченных из сыворотки, плазмы или фекалий, полученное до указанного введения.

Предпочтительный вариант осуществления теста 2 на гуморальный иммунный ответ подробно описан в примере 11.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к тесту на гуморальный иммунный ответ (тест 3 на гуморальный иммунный ответ) против углеводного эпитопа, включающему тестирование методом проточной цитометрии связывания антитела, антител в сыворотке или антител, извлеченных из сыворотки, плазмы или фекалий, с клетками, содержащими углеводный эпитоп, и с клетками, не содержащими углеводный эпитоп, при этом при положительном гуморальном иммунном ответе против углеводного эпитопа наблюдают значительно более сильное связывание антител с клетками, содержащими углеводный эпитоп, чем с клетками, отрицательными по углеводному эпитопу. В предпочтительном варианте осуществления связывание указанного антитела или антител с клетками, содержащими углеводный эпитоп, является значительно более сильным после введения нутрицевтика, фармацевтической композиции, положительного по углеводу микроорганизма или его фракции, либо препаратов, содержащих их, чем связывание соответствующего антитела, антител в сыворотке или антител, извлеченных из сыворотки, плазмы или фекалий, полученное до указанного введения. Предпочтительный вариант осуществления теста 3 на гуморальный иммунный ответ подробно описан в примере 11.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к тесту на гуморальный иммунный ответ (тест 4 на гуморальный иммунный ответ) против углеводного эпитопа, включающему тестирование методом иммунофлуоресценции связывания антитела, антител в сыворотке или антител, извлеченных из сыворотки, плазмы или фекалий, с клетками, содержащими углеводный эпитоп, и с клетками, отрицательными по углеводному эпитопу, при этом при положительном гуморальном иммунном ответе против углеводного эпитопа наблюдают значительно более сильное связывание антитела или антител с клетками, содержащими углеводный эпитоп, чем с клетками, не содержащими углеводный эпитоп, и/или с клетками, содержащими углеводный эпитоп после ферментативной или химической обработки, разрушающей углеводный эпитоп. В предпочтительном варианте осуществления связывание с клетками, содержащими углеводный эпитоп, является значительно более сильным после введения нутрицевтика, фармацевтической композиции, положительного по углеводу микроорганизма или его фракции, либо препаратов, содержащих их, чем связывание соответствующего антитела, антител в сыворотке или антител, извлеченных из сыворотки, плазмы или фекалий, полученное до указанного введения. Иммунофлуоресцентный тест можно сделать более количественным, используя серийные разведения антисыворотки и/или фотографируя при одинаковых условиях фотоэкспозиции.

Специалисты в данной области способны определять подходящие молекулы-носители и соединять подходящие структуры для получения желаемой углеводной структуры, связанной с молекулами-носителями при помощи или без помощи линкера. Специалисты в данной области также способны выбирать такие клетки или антигены, с ферментативной или химической обработкой, либо без нее, а также выбирать и модифицировать подходящие способы тестирования гуморального иммунного ответа против углеводного эпитопа. Однако вышеупомянутые тесты 1-4 на гуморальный иммунный ответ и, особенно, их предпочтительные сочетания, предложенные по настоящему изобретению, являются, несомненно, предпочтительными и имеют очевидные преимущества в плане специфичности, что также видно из примеров.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к тесту на гуморальный иммунный ответ (тест 5 на гуморальный иммунный ответ) против углеводного эпитопа, включающему:

a) инкубацию соответствующего количества клеток, содержащих углеводный эпитоп, меченных соответствующим количеством маркера, такого как европий или хром-51, с соответствующим количеством антитела, антител в сыворотке или антител, извлеченных из сыворотки, плазмы или фекалий, с соответствующим количеством комплемента в течение соответствующего времени (как правило, от 3 до 5 часов или в течение ночи);

b) измерение лизиса клеток путем определения высвобождения маркера, такого как европий или хром-51, после инкубации по п. (a), при этом при положительном гуморальном иммунном ответе против углеводного эпитопа наблюдают значительно более сильный лизис клеток, содержащих углеводный эпитоп, чем клеток, не содержащих углеводный эпитоп, и/или наблюдают значительно более сильный лизис клеток, содержащих углеводный эпитоп, чем лизис без комплемента и/или чем лизис без антител, и/или чем лизис с антителом или антителами, которые не связываются или которые меньше связываются с клетками, содержащими углеводный эпитоп.

В указанном тесте 5 на гуморальный иммунный ответ проверяют специфичную к углеводу комплементзависимую цитотоксичность (CDC), эффекторный механизм, опосредованный определенными антителами, индуцированного гуморального иммунного ответа, или специфичные к углеводу антитела в тесте на лизис клеток-мишеней. Тест включает инкубацию соответствующего количества клеток, содержащих углеводный эпитоп, меченных соответствующим количеством маркера, такого как европий или хром-51, с соответствующим количеством антитела, антител в сыворотке или антител, извлеченных из сыворотки, плазмы или фекалий, с соответствующим количеством комплемента в течение соответствующего времени (как правило, от 3 до 5 часов или в течение ночи). Клетки, содержащие углеводный эпитоп, метят указанным маркером, таким как европий или хром-51, что позволяет определять количество лизированных клеток. Количество лизированных клеток предпочтительно определяют, измеряя высвобождение маркера (например, европия или хрома-51) после инкубации. Подходящий контроль может быть определен специалистами в данной области, например, отрицательные по углеводу клетки, антитело или смесь антител, не связывающих клетки-мишени, и/или не использование комплемента. Тест может быть оптимизирован специалистами в данной области в плане соответствующего количества антител, количества меченых опухолевых клеток, концентрации комплемента и времени инкубации для его использования по изобретению и так, как описано.

Комплементзависимую цитотоксичность (CDC) по изобретению предпочтительно определяют, используя анализ с высвобождением европия. Клетки-мишени инкубируют в течение 10 минут при 4°C в 800 мкл буферного раствора с европием (50 мМ HEPES, pH 7,4, 93 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ MgCl₂, 10 мМ диэтилентриаминпентауксусная кислота, 2 мМ ацетат европия (III)), подвергают электропорации (710 В, 1 импульс, 30 мкс) в устройстве Multiporator (Eppendorf), а затем инкубируют на льду в течение следующих 10 минут. Затем клетки промывают 5 раз в RPMI/5% FCS и высевают в лунки 96-луночного круглодонного планшета (Nunc; 5×10³/лунку). После добавления 20 мкл раствора, содержащего антитела в различных разведениях, или соответствующих контролей (среда, контрольные по изотипу IgM человека), образцы инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре. 10 мкл разведенного 1:10 комплемента (комплемент крольчонка-сосунка) добавляют в соответствующие лунки. В контрольные лунки добавляют 10 мкл RPMI/5% FCS вместо раствора комплемента. Для определения спонтанного высвобождения клетки-мишени инкубируют с одной только средой, а максимальное высвобождение определяют путем полного лизиса мишеней этанолом. После инкубации при 37°C в течение 4 часов планшет центрифугируют при 500×g в течение 5 минут, и по 20 мкл бесклеточного супернатанта из каждой лунки переносят пипеткой в предварительно подготовленный плоскодонный планшет (Nunc-Immunoplate Maxisorp), содержащий по 200 мкл на лунку усиливающего раствора (Perkin-Elmer Wallac). После инкубации в течение 15 минут при комнатной температуре определяют флуоресценцию (флуориметр Victor, Perkin-Elmer Wallac). Специфическую цитотоксичность определяют, используя уравнение (экспериментальный лизис - спонтанный лизис)/(максимальный лизис - спонтанный лизис)×100%.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к тесту на гуморальный иммунный ответ (тест 6 на гуморальный иммунный ответ) против углеводного эпитопа, включающему:

a) инкубацию соответствующего количества клеток, содержащих углеводный эпитоп, и/или клеток, не содержащих углеводный эпитоп, меченных соответствующим количеством маркера, такого как европий или хром-51, с соответствующим количеством антитела, антител в сыворотке или антител, извлеченных из сыворотки, плазмы или фекалий, с соответствующим количеством как минимум одной иммунной эффекторной клетки или смеси клеток, содержащей иммунные эффекторные клетки, или мононуклеаров периферической крови в течение соответствующего времени, как правило, от 3 до 5 часов или в течение ночи, и

b) измерение лизиса клеток путем определения высвобождения маркера, такого как европий или хром-51, после инкубации по п. (a), при этом при положительном гуморальном иммунном ответе против углеводного эпитопа наблюдают значительно более сильный лизис клеток, содержащих углеводный эпитоп, чем клеток, отрицательных по углеводному эпитопу, чем лизис без антител, и/или чем лизис с антителом или антителами, которые не связываются, или которые меньше связываются с клетками, содержащими углеводный эпитоп.

В указанном тесте 6 на гуморальный иммунный ответ проверяют антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC), эффекторный механизм, опосредованный определенными антителами, индуцированного гуморального иммунного ответа, или специфичные к углеводному эпитопу антитела в тесте на лизис клеток-мишеней в сочетании с иммунными эффекторными клетками. Тест включает инкубацию соответствующих количеств меченых положительных по углеводному эпитопу клеток-мишеней с соответствующими количествами антител в сыворотке или антител, извлеченных из сыворотки, или выделенного антитела к углеводному эпитопу в присутствии соответствующих количеств иммунных эффекторных клеток, таких как те, что имеются среди PBMC (мононуклеары периферической крови), в течение соответствующего времени, как правило, от 3 до 5 часов или в течение ночи. Клетки, содержащие углеводный эпитоп, метят европием или хромом-51, что позволяет определять количество лизированных клеток. Количество лизированных клеток предпочтительно определяют, измеряя высвобождение европия или хрома-51 после инкубации. Подходящий контроль может быть определен специалистами в данной области, например, отрицательные по углеводному эпитопу клетки, антитело или смесь антител, не связывающих клетки-мишени, и/или не использование иммунных эффекторных клеток (например, PBMC). Тест может быть оптимизирован специалистами в данной области в плане соответствующего количества антител, количества меченых опухолевых клеток, количества иммунных эффекторных клеток и времени инкубации для его использования по изобретению.

Антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC) по изобретению предпочтительно определяют, используя анализ с высвобождением европия. Клетки-мишени инкубируют в течение 10 минут при 4°C в 800 мкл буферного раствора с европием (50 мМ HEPES, pH 7,4, 93 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ MgCl₂, 10 мМ диэтилентриаминпентауксусная кислота, 2 мМ ацетат европия (III)), подвергают электропорации (710 В, 1 импульс, 30 мкс) в устройстве Multiporator (Eppendorf), а затем инкубируют на льду в течение следующих 10 минут. Затем клетки промывают 5 раз в RPMI/5% FCS и высевают в лунки 96-луночного круглодонного планшета (Nunc; 5×10³/лунку). После добавления 20 мкл специфичных к Core1 антител в различных концентрациях (конечная концентрация 0,05-50 мкг/мл в 200 мкл объема инкубационной смеси) или соответствующих контролей (среда, контрольные по изотипу IgG), добавляют PBMC (мононуклеары периферической крови человека, 80 мкл) в качестве эффекторных клеток, используя различные соотношения эффекторные клетки/клетки-мишени от 100:1 до 10:1, предпочтительно 50:1. Для определения спонтанного высвобождения добавляют 80 мкл RPMI/5% FCS без эффекторных клеток. Максимальное высвобождение определяют после полного лизиса мишеней этанолом.

После инкубации при 37°C в течение 4 часов планшет центрифугируют при 500×g в течение 5 минут, и по 20 мкл бесклеточного супернатанта из каждой лунки переносят пипеткой в предварительно подготовленный плоскодонный планшет (Nunc-Immunoplate Maxisorp), содержащий по 200 мкл на лунку усиливающего раствора (Perkin-Elmer Wallac). После инкубации в течение 15 минут при комнатной температуре, определяют флуоресценцию (флуориметр Victor², Perkin-Elmer Wallac). Специфическую цитотоксичность определяют, используя уравнение (экспериментальный лизис - спонтанный лизис)/(максимальный лизис - спонтанный лизис)×100%.

В предпочтительном варианте осуществления указанные тесты 1-6 на гуморальный иммунный ответ дополнительно включают перед самим тестом

a) введение нутрицевтика, фармацевтической композиции, положительного по углеводу микроорганизма, либо его фракции или лизата, либо препарата, содержащего их, человеку или животному;

b) выделение антитела, антител в сыворотке или антител, извлеченных из сыворотки, плазмы или фекалий.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения нутрицевтик или фармацевтический препарат, содержащий как минимум один положительный по углеводу микроорганизм, либо его фракцию или лизат, индуцирует гуморальный иммунный ответ против углеводного эпитопа, который является положительным как минимум в двух тестах на гуморальный иммунный ответ из тестов 1-6 на гуморальный иммунный ответ, предпочтительно положительным в тестах 1 и 3 на гуморальный иммунный ответ, и более предпочтительно в тестах 1, 2 и 3 на гуморальный иммунный ответ, и более предпочтительно в тестах 1, 2, 3 и 4 на гуморальный иммунный ответ, и более предпочтительно в тестах 1, 2, 3, 4 и 6 на гуморальный иммунный ответ, и даже более предпочтительно в тестах 1, 2, 3, 4 и 5 на гуморальный иммунный ответ, и наиболее предпочтительно положительным во всех 6 тестах на гуморальный иммунный ответ.

Также предложены тесты на клеточный иммунный ответ. Указанный клеточный иммунный ответ против углеводного эпитопа представляет собой T-клеточный ответ против углеводного эпитопа, который можно определять как минимум одним из тестов 1-5 на клеточный иммунный ответ. Более предпочтительным является клеточный иммунный ответ против углеводного эпитопа, который представляет собой ответ цитотоксических T-клеток или ответ хелперных T-клеток Th1-типа против углеводного эпитопа. Наиболее предпочтительным является клеточный иммунный ответ против углеводного эпитопа, который представляет собой ответ цитотоксических T-клеток и ответ хелперных T-клеток Th1-типа против углеводного эпитопа, который можно определять в тестах 1, 2, 3, 4 и 5 на клеточный иммунный ответ. Указанные тесты можно также использовать в сочетании со способами идентификации подходящего положительного по углеводу микроорганизма, описанными в данном документе, для проверки/анализа, какие положительные по углеводу микроорганизмы способны также инициировать клеточный иммунный ответ.

Указанные тесты на клеточный иммунный ответ включают создание контакта между дендритными клетками, нагруженными положительным по углеводу микроорганизмом, и иммунными клетками и культивирование в течение соответствующего времени и в соответствующих условиях с последующим добавлением для повторной стимуляции дендритных клеток, нагруженных как минимум одной несущей углеводный эпитоп молекулой, и культивирование в течение соответствующего времени и в соответствующих условиях с последующим измерением количества секретированного GM-CSF, TNFальфа или INFгамма, либо измерением пролиферации T-клеток, либо ингибирования секреции GM-CSF, TNFальфа или INFгамма, или пролиферации при помощи антител против углеводного эпитопа, или измерением презентации углеводного эпитопа на дендритных клетках, или измерением лизиса положительных по углеводному эпитопу клеток активированными иммунными клетками, предпочтительно активированными T-клетками.

Указанные дендритные клетки, также называемые в данном документе DC, могут являться любой дендритной клеткой или смесью дендритных клеток, либо смесью клеток, включающей дендритные клетки, или как минимум одной дендритной клеткой. Их можно получать от людей-доноров, которые здоровы или которые страдают от заболевания, такого как, но не ограничиваясь ими, опухолевое образование или болезнь Крона или положительное по углеводному эпитопу заболевание, или одно из заболеваний, перечисленных где-либо еще в данном документе, либо от животных. Указанные DC можно получать и нагружать известными специалистам в данной области методами, и их, как правило, получают из CD34-положительных клеток-предшественников или CD14-положительных моноцитов из крови или костного мозга человека, дифференцирование которых в незрелые дендритные клетки (iDC) проводят при помощи определенных сочетаний соответствующих молекул, известных специалистам в данной области. Клетки iDC нагружают положительным по углеводу микроорганизмом или несущей углеводный эпитоп молекулой, либо соответствующими контролями, и проводят их дальнейшее созревание при помощи определенных сочетаний соответствующих молекул, известных специалистам в данной области, для получения нагруженных дендритных клеток, которые соответствуют нагруженным зрелым дендритным клеткам (mDC), которые способны активировать T-клетки. Такие DC могут также соответствовать типу клеток Лангерганса.

В предпочтительном варианте осуществления указанные DC происходят из дендритной клеточной линии, такой как, но не ограничиваясь ими, дендритная клеточная линия человека NEMOD-DC (поставщик Glycotope GmbH Berlin, Germany; www.glycotope.com) или Mutz-3.

Указанное нагружение дендритных клеток означает, что дендритные клетки инкубируют в соответствующем состоянии дифференциации и зрелости с соответствующими количествами положительного по углеводу микроорганизма, либо его фракций или лизатов, или как минимум одной несущей углеводный эпитоп молекулы в течение соответствующего времени, как правило, это происходит во время этапа созревания, описанного выше, в сочетании с соответствующими молекулами, как правило, в течение 24-48 часов, получая нагруженные дендритные клетки, способные активировать иммунные клетки, предпочтительно T-клетки, представляющие собой специфичные к углеводному эпитопу T-клетки.

Указанные иммунные клетки могут представлять собой PBMC (мононуклеары периферической крови) или другие клеточные популяции, включающие CD4+ и/или CD8+ T-клетки, предпочтительно CD4+ и CD8+ T-клетки. Специалистам в данной области известно, как получать такие клетки от человека или животного, и производство таких клеток может включать получение при помощи градиента фиколла из крови человека или из клеток крови при лейкоферезе и иногда может включать дополнительное обогащение методом специфического для Т-клеток магнитного сортинга.

В предпочтительном варианте осуществления дендритные клетки совместимы как минимум по одной молекуле класса MHC с иммунными клетками, предпочтительно по молекуле MHC класса I или молекуле MHC класса II, более предпочтительно как минимум по одной MHC класса I и одной MHC класса II молекуле, более предпочтительно по большему количеству молекул MHC и наиболее предпочтительно по всем молекулам MHC. Последний вариант достижим при получении дендритных клеток и иммунных клеток от одного и того же индивидуума.

Указанные соответствующие периоды времени и условия для культивирования иммунных клеток с нагруженными дендритными клетками и для последующего добавления нагруженных дендритных клеток известны специалисту в данной области и могут быть им оптимизированы с учетом условий, в которых находятся клетки. Как правило, время инкубации составляет 7-10 дней для каждого из двух этапов (первичной активации и повторной стимуляции).

Указанная несущая углеводный эпитоп молекула , по смыслу описанных тестов на клеточный иммунный ответ, означает достаточные количества клеток или опухолевых клеток, несущих углеводный эпитоп, белок, несущий углеводный эпитоп, или полипептид, несущий углеводный эпитоп. Указанные клетки или опухолевые клетки, несущие углеводный эпитоп, могут быть живыми или убитыми, или лизатами данных клеток, либо их фракциями, более предпочтительным является лизат. Белок, несущий углеводный эпитоп, может представлять собой любой белок, несущий углеводный эпитоп, такой как белки-носители, где углеводный эпитоп связан на опухолях. Полипептид, несущий углеводный эпитоп, может представлять собой любой полипептид, несущий углеводный эпитоп, предпочтительно такой, который может быть презентирован с углеводным эпитопом на mDC.

Указанный положительный по углеводу микроорганизм, по смыслу описанных тестов на клеточный иммунный ответ, означает достаточные количества конкретного положительного по углеводу микроорганизма, который может быть живым или мертвым, либо лизатом данных клеток, или их фракцией, более предпочтительным является их лизат или фракция.

Контроли используют для дополнительного подтверждения положительности иммунного ответа. Специалисты в данной области способны использовать подходящие контроли, например, как те, которые описаны подробно ниже в примере 12. Примерами являются использование контролей, которые нагружают на DC, как описано для несущих углеводный эпитоп молекул, и используют для повторной стимуляции, и которые могут включать (i) клетки, которые являются отрицательными по углеводному эпитопу или не содержат его, предпочтительно такие, которые родственны или имеют максимально возможное сходство с положительными по углеводному эпитопу клетками, в соответствующем формате, например, живые или мертвые, либо лизаты из этих клеток, или их фракции; (ii) белок, не несущий углеводный эпитоп, предпочтительно тот же белок, который используют в качестве несущей углеводный эпитоп молекулы, но без углеводного эпитопа, предпочтительно совсем без гликозилирования или с удлиненной или укороченной углеводной структурой, не содержащей углеводный эпитоп; (iii) полипептид, не несущий углеводный эпитоп, предпочтительно тот же полипептид, который используют в качестве несущей углеводный эпитоп молекулы, но без углеводного эпитопа, предпочтительно совсем без гликозилирования или с удлиненной или укороченной углеводной структурой, не содержащей углеводный эпитоп. Дополнительными контролями могут являться (iv) ненагруженные mDC, обработанные таким же образом, что и mDC, нагруженные несущими углеводный эпитоп молекулами, включая необходимые молекулы и условия для созревания, но совсем без дополнительных молекул, соответствующих несущим углеводный эпитоп молекулам, или вышеупомянутые контроли (i-iii). В примерах и предпочтительных вариантах осуществления описаны подробно наиболее подходящие контроли, тогда как другие подходящие контроли могут быть выбраны специалистами в данной области.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения дендритные клетки представляют собой функциональные дендритные клетки, полученные из клеточной линии MUTZ-3 лейкоза [как описано в DE10139428 A1, WO2003/023023 A1, EP01419240, US20040265998, CA2457287, 10139428.4 (DE), PCT/EP02/09260, 02758474.7 (EP), US10/486966, CA2457287)], или клетки, происходящие от MUTZ-3, такие как NEMOD-DC (например, NMD-100 или NMD-200, поставщик Glycotope GmbH Berlin, Germany [www.Glycotope.com]). Данные дендритные клетки являются активными дендритными клетками, которые полностью способны активировать T-клетки и процессировать и/или презентировать антигены на своей поверхности с молекулами класса MHC. В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения дендритные клетки представляют собой функциональные дендритные клетки, полученные из MUTZ-3 или клеток, происходящих от MUTZ-3, таких как NMD-100 или NMD-200, и иммунные клетки совместимы по молекуле MHC класса I, такой как HLA-A2 или HLA-B44, предпочтительно HLA-A2 и HLA-B44. В следующем предпочтительном варианте осуществления лизат клеток, содержащих углеводный эпитоп, используют в качестве несущей углеводный эпитоп молекулы.

Вследствие различий, наблюдающихся от эксперимента к эксперименту, которые являются обычными для клеточных иммунологических методов, что известно специалистам в данной области, контроли следует ставить параллельно с тестами, как известно специалистам в данной области.

По одному варианту осуществления изобретение относится к in vitro тесту на клеточный иммунный ответ против интересующего углеводного эпитопа, включающему

a) нагружение как минимум одной дендритной клетки первым положительным по углеводу соединением, где указанное положительное по углеводу соединение несет интересующий углеводный эпитоп;

b) создание контакта между соответствующим количеством указанной как минимум одной дендритной клетки, нагруженной указанным положительным по углеводу соединением, и соответствующим количеством иммунных клеток, которые могут активироваться или ингибироваться дендритной клеткой;

c) культивирование для осуществления взаимодействия указанных иммунных клеток с указанными нагруженными дендритными клетками;

d) добавление соответствующего количества антигенпрезентирующих клеток (APC), нагруженных соответствующим количеством как минимум одного второго соединения, несущего тот же углеводный эпитоп, что и указанное первое соединение, где указанное второе соединение отличается от указанного первого положительного по углеводу соединения;

e) культивирование для повторной стимуляции указанных иммунных клеток;

f) определение количества повторно стимулированных иммунных клеток.

Изобретение относится к способу определения того, способен ли определенный углеводный эпитоп инициировать клеточный иммунный ответ. До последнего времени в данной области считалось, что углеводы не способны инициировать клеточный иммунный ответ. Однако в настоящее время установлено, что определенные углеводные эпитопы способны вызывать клеточный иммунный ответ. Таким образом, важно предложить системы тестирования для определения, действительно ли определенный углеводный эпитоп способен инициировать соответствующий ответ, тем самым определяя, является ли указанный углеводный эпитоп подходящей целью, например, для терапии. Таким образом, в изобретении используют дендритные клетки, поскольку дендритные клетки способны примировать и, следовательно, стимулировать иммунные клетки, такие как T-клетки. Дендритные клетки процессируют соединения, с которыми они сталкиваются, и презентируют процессированные соединения/антигены на своей поверхности. Однако клетки с MHC, такие как дендритные клетки, могут презентировать только определенные виды антигенов, и важно определять, может ли интересующий антиген/эпитоп презентироваться дендритными клетками, поскольку только такие антигены/эпитопы способны вызывать клеточный иммунный ответ. Принципы такого клеточного иммунного ответа также проиллюстрированы на фигуре 22.

Вследствие этого, дендритные клетки нагружают интересующим соединением, которое предположительно или действительно несет интересующую углеводную структуру/эпитоп. Указанное соединение может, например, представлять собой микроорганизм, несущий интересующий углеводный эпитоп, как описано в данном документе, опухолевую клетку или любое другое соединение, несущее интересующий углеводный эпитоп. Соответствующие условия для нагружения и соответствующие соединения, несущие углеводные структуры, описаны в данном документе.

Данный первый цикл стимуляции приводит к появлению активированных лимфоцитов, которые специфичны к любому соответствующему антигену, презентированному указанными нагруженными дендритными клетками. Однако задача настоящего способа заключается в определении того, способен ли интересующий углеводный эпитоп/антиген стимулировать клеточный ответ.

Вследствие этого, проводят этап отбора, когда лимфоциты повторно стимулируют для определения того, стимулирует ли интересующий углевод лимфоциты и, тем самым, инициирует клеточный ответ. На указанном этапе отбора антигенпрезентирующие клетки, такие как, например, дендритные клетки, нагружают вторым соединением, которое также содержит интересующий углевод. Однако указанное второе соединение отличается от первого соединения. Данное второе соединение также процессируется APC и антигены презентируются указанными APC. Поскольку второе соединение отличается от первого соединения, большинство презентируемых антигенов, предпочтительно все антигены, кроме интересующего углеводного эпитопа, отличаются от антигенов, презентированных во время первого цикла. Эффект состоит в том, что только те лимфоциты выживают во время второго цикла повторной стимуляции, которые встречают подходящий им антиген, презентированный указанными APC. В случае, когда и дендритные клетки из первого цикла, и APC из второго цикла презентируют антиген, содержащий или состоящий из интересующего углеводного эпитопа, лимфоциты, узнающие указанный антиген, стимулируются и, таким образом, выживают, поскольку они также повторно стимулируются. Те лимфоциты, которые не встретили подходящего партнера при контакте с указанными APC, нагруженными указанным вторым соединением, несущим интересующий углеводный эпитоп, погибают без повторной стимуляции. Этот этап отбора гарантирует, что клеточный ответ против интересующего углевода обнаружен.

На последнем этапе определяют, действительно ли лимфоциты повторно стимулированы. Это можно осуществить, например, определяя

- продукты секреции лимфоцитов, которые секретируются, если указанные лимфоциты являются повторно стимулированными, такие как интерферон альфа, интерферон гамма или GM-CSF;

- пролиферацию T-клеток.

Соответствующие тесты для определения того, произошла ли повторная стимуляция, описаны в данном документе.

Специфичность указанного теста можно повысить, используя связывающую углевод структуру, которая специфически узнает указанный интересующий углеводный эпитоп, презентированный дендритными клетками/APC. По указанному варианту осуществления как минимум часть указанных стимулированных лимфоцитов этапа c) приводят в контакт с соответствующим количеством антигенпрезентирующих клеток (APC), нагруженных соответствующим количеством как минимум одного второго соединения, несущего тот же углеводный эпитоп, что и указанное первое соединение, где указанное второе соединение отличается от указанного положительного по углеводу соединения, в присутствии связывающей углевод молекулы, узнающей указанный интересующий углеводный эпитоп. Указанная связывающая углевод молекула, узнающая указанный интересующий углеводный эпитоп, блокирует взаимодействие APC с указанными лимфоцитами, тем самым предотвращая повторную стимуляцию, а следовательно, выживание клеток. Этот добавочный этап дополнительно гарантирует, что интересующий углевод специфически стимулирует лимфоциты, и тем самым инициирует специфический клеточный иммунный ответ. Данный этап усиления/подтверждения специфичности можно проводить или параллельно - разделяя стимулированные лимфоциты этапа c) - или проводить указанный этап усиления/подтверждения дополнительно, а следовательно, позже.

По первому варианту осуществления (тест 1 на клеточный иммунный ответ) количество/долю повторно стимулированных лимфоцитов определяют, измеряя секрецию GM-CSF. Например, количество секретированного GM-CSF можно измерять методом ELISA или ELISPOT.

По предпочтительному варианту осуществления предлагается тест на клеточный иммунный ответ (вариант осуществления теста 1 на клеточный иммунный ответ) против углеводного эпитопа, включающий

a) создание контакта между соответствующим количеством дендритных клеток, включающих как минимум одну дендритную клетку, дендритные клетки или смесь клеток, содержащих как минимум одну дендритную клетку, нагруженных соответствующим количеством положительного по углеводу микроорганизма, его лизата или фракции, препаратов, содержащих их, нутрицевтика или фармацевтической композиции по изобретению, и соответствующим количеством иммунных клеток, включающих как минимум одну иммунную клетку, CD4+ T-клетку, CD8+ T-клетку, смесь клеток, содержащих как минимум одну T-клетку, или мононуклеары периферической крови, которые могут активироваться или ингибироваться дендритной клеткой;

b) культивирование в течение соответствующего времени и при соответствующих условиях;

c) добавление соответствующего количества дендритных клеток, включающих как минимум одну дендритную клетку, дендритные клетки или смесь клеток, содержащих как минимум одну дендритную клетку, нагруженных соответствующим количеством как минимум одной несущей углеводный эпитоп молекулы;

d) культивирование в течение соответствующего времени и при соответствующих условиях для повторной стимуляции;

e) измерение количества секретированного GM-CSF методом ELISA или ELISPOT, при этом при положительном клеточном иммунном ответе против углеводного эпитопа наблюдают (i) значительно более высокую секрецию GM-CSF указанных иммунных клеток, повторно стимулированных указанными дендритными клетками, нагруженными несущей углеводный эпитоп молекулой, чем секреция GM-CSF соответствующих иммунных клеток, повторно стимулированных соответствующими ненагруженными дендритными клетками, и/или чем секреция GM-CSF соответствующих иммунных клеток, повторно стимулированных соответствующими дендритными клетками, нагруженными молекулой, не несущей или не содержащей углеводный эпитоп, и/или (ii) значительно более высокую секрецию GM-CSF указанных иммунных клеток, повторно стимулированных указанными дендритными клетками, нагруженными белком, пептидом или молекулой, несущими или содержащими углеводный эпитоп, чем секреция GM-CSF соответствующих иммунных клеток, повторно стимулированных соответствующим белком, пептидом или молекулой, не несущими или не содержащими углеводный эпитоп, и/или (iii) значительно более высокую секрецию GM-CSF указанных иммунных клеток, повторно стимулированных указанными дендритными клетками, нагруженными белком, пептидом или молекулой, несущими или содержащими углеводный эпитоп, чем секреция GM-CSF соответствующих иммунных клеток, повторно стимулированных соответствующими дендритными клетками, нагруженными соответствующим белком, пептидом или молекулой, несущими или содержащими углеводный эпитоп, но подвергнутыми ферментативной или химической обработке для разрушения углеводного эпитопа, и/или (iv) значительно более высокую секрецию GM-CSF указанных иммунных клеток, повторно стимулированных указанными дендритными клетками, нагруженными лизатом или фракциями клеток, содержащих углеводный эпитоп, чем секреция GM-CSF соответствующих иммунных клеток, повторно стимулированных соответствующими дендритными клетками, нагруженными лизатом клеток, отрицательных по углеводному эпитопу, или не содержащих его.

Соответствующие иммунные клетки означают, что те же самые иммунные клетки, которые представляют собой или включают как минимум одну иммунную клетку, CD4+ T-клетку, CD8+ T-клетку, смесь клеток, содержащих как минимум одну T-клетку, или мононуклеары периферической крови, либо другие описанные где-либо еще клетки или смеси клеток, которые могут активироваться или ингибироваться дендритной клеткой, используют в качестве контроля или сравнительного теста с контрольной или тестируемой молекулой, смесью молекул, клетками, клеточными лизатами или фракциями, микроорганизмами или их фракциями, что и те, которые используют как указанные иммунные клетки, с целью проведения сравнения.

Соответствующие дендритные клетки означают, что те же самые дендритные клетки, которые представляют собой или включают как минимум одну дендритную клетку, дендритные клетки или смесь клеток, содержащих как минимум одну дендритную клетку, либо другие описанные где-либо еще клетки или смеси клеток, которые могут активировать T-клетки, нагруженные соответствующим количеством как минимум одной несущей углеводный эпитоп молекулы, используют в качестве контроля или сравнительного теста с контрольной или тестируемой молекулой, смесью молекул, клетками, клеточными лизатами или фракциями, микроорганизмами или их фракциями, либо без них, что и те, которые используют как указанные дендритные клетки, с целью проведения сравнения.

Это известно специалистам в данной области, и их могут выбирать специалисты в данной области. Более подробно это продемонстрировано в примерах. Для пояснения: например, то же количество иммунных клеток из того же препарата приводят в контакт с тем же количеством дендритных клеток из того же препарата, нагруженных тем же количеством асиалогликофорина, и, параллельно, с тем же количеством гликофорина или обработанного периодатом асиалогликофорина, и используют в тесте для получения оптимальной сопоставимости.

Варианты известны специалистам в данной области и могут быть определены ими, или описаны более подробно в примерах.

В указанном тесте 1 на клеточный иммунный ответ проверяют активацию CD4+ и/или CD8+ T-клеток, специфичных к углеводному эпитопу, положительным по углеводу микроорганизмом, измеряя специфическую индуцированную секрецию GM-CSF, что включает создание контакта между дендритными клетками, нагруженными положительным по углеводу микроорганизмом, его лизатом или фракцией, и иммунными клетками и культивирование в течение соответствующего времени и при соответствующих условиях, с последующим добавлением дендритных клеток, нагруженных несущей углеводный эпитоп молекулой, для повторной стимуляции и культивированием в течение соответствующего времени и при соответствующих условиях, а затем измерение количества секретированного GM-CSF в ответ на данную повторную стимуляцию. Указанное измерение количества секретированного GM-CSF предпочтительно проводят методом ELISA или ELISPOT, более предпочтительно методом ELISA, и это известно специалистам в данной области. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения тест 1 на клеточный иммунный ответ включает создание контакта между функциональными дендритными клетками, полученными из клеток, происходящих от MUTZ-3, NMD-100 или NMD-200, нагруженными положительным по углеводу микроорганизмом, и PBMC (мононуклеарами периферической крови), совместимыми как минимум по MHC класса I (HLA-A2) и (HLA-B44), и культивирование данных клеток в течение соответствующего времени и при соответствующих условиях, как правило, 7-10 дней, а затем добавление для повторной стимуляции функциональных дендритных клеток, полученных из клеток, происходящих от MUTZ-3, нагруженных лизатом клеток, содержащих углеводный эпитоп, или несущей углевод молекулой, и культивирование в течение соответствующего времени и при соответствующих условиях, как правило, 7-9 дней, с последующим измерением количества секретированного GM-CSF в анализе ELISA или ELISPOT. Анализ высвобождения GM-CSF методами ELISA и ELISPOT известен специалистам в данной области и подробно описан в примерах. При положительном иммунном ответе против углеводного эпитопа наблюдают более высокую секрецию GM-CSF иммунных клеток, повторно стимулированных DC, нагруженными лизатом клеток, содержащих углеводный эпитоп, чем секреция иммунных клеток, повторно стимулированных DC, нагруженными лизатом отрицательных по углеводному эпитопу клеток, и/или наблюдают более высокую секрецию GM-CSF иммунных клеток, повторно стимулированных DC, нагруженными несущей углеводный эпитоп молекулой, чем у иммунных клеток, повторно стимулированных DC, нагруженными отрицательной по углеводному эпитопу молекулой. Предпочтительный вариант осуществления теста 1 на клеточный иммунный ответ подробно описан в примере 12.

По второму варианту осуществления (тест 2 на клеточный иммунный ответ) количество/долю повторно стимулированных лимфоцитов определяют, измеряя количественно секрецию INFгамма или TNFальфа. В предпочтительном варианте осуществления указанный тест 2 на клеточный иммунный ответ против углеводного эпитопа включает

b) культивирование в течение соответствующего времени и при соответствующих условиях;

d) культивирование в течение соответствующего времени и при соответствующих условиях для повторной стимуляции; и

e) измерение количества секретированного IFNгамма и/или секретированного TNFальфа методом ELISA или ELISPOT, при этом при положительном клеточном иммунном ответе против углеводного эпитопа наблюдают (i) значительно более высокую секрецию IFNгамма и/или TNFальфа указанных иммунных клеток, повторно стимулированных указанными дендритными клетками, нагруженными несущей или содержащей углеводный эпитоп молекулой, чем секреция IFNгамма и/или TNFальфа соответствующих иммунных клеток, повторно стимулированных соответствующими ненагруженными дендритными клетками, и/или более высокую секрецию IFNгамма и/или TNFальфа указанных иммунных клеток, повторно стимулированных указанными дендритными клетками, нагруженными несущей или содержащей углеводный эпитоп молекулой, чем секреция IFNгамма и/или TNFальфа соответствующих иммунных клеток, повторно стимулированных соответствующими дендритными клетками, нагруженными молекулой, не несущей или не содержащей углеводный эпитоп, и/или (ii) значительно более высокую секрецию IFNгамма и/или TNFальфа указанных иммунных клеток, повторно стимулированных указанными дендритными клетками, нагруженными белком, пептидом или молекулой, несущими или содержащими углеводный эпитоп, чем секреция IFNгамма и/или TNFальфа соответствующих иммунных клеток, повторно стимулированных соответствующими дендритными клетками, нагруженными соответствующим белком, пептидом или молекулой, не несущими или не содержащими углеводный эпитоп, и/или (iii) значительно более высокую секрецию IFNгамма и/или TNFальфа указанных иммунных клеток, повторно стимулированных указанными дендритными клетками, нагруженными белком, пептидом или молекулой, несущими или содержащими углеводный эпитоп, чем секреция IFNгамма и/или TNFальфа соответствующих иммунных клеток, повторно стимулированных соответствующими дендритными клетками, нагруженными соответствующим белком, пептидом или молекулой, несущими или содержащими углеводный эпитоп, но подвергнутыми ферментативной или химической обработке для разрушения углеводного эпитопа, и/или (iv) значительно более высокую секрецию IFNгамма и/или TNFальфа указанных иммунных клеток, повторно стимулированных указанными дендритными клетками, нагруженными лизатом или фракциями клеток, содержащих углеводный эпитоп, чем секреция IFNгамма и/или TNFальфа соответствующих иммунных клеток, повторно стимулированных соответствующими дендритными клетками, нагруженными лизатом клеток, отрицательных по углеводному эпитопу, или не содержащих его.

В указанном тесте 2 на клеточный иммунный ответ проверяют активацию положительным по углеводу микроорганизмом цитотоксических T-клеток, таких как CTL (цитотоксические T лимфоциты), и/или цитотоксических хелперных Т-клеток Th1 типа до специфичных к углеводному эпитопу активированных цитотоксических T-клеток. Указанное измерение количества секретированного IFNгамма и/или TNFальфа предпочтительно проводят методом ELISA или ELISPOT, более предпочтительно методом ELISPOT, и это известно специалистам в данной области. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения тест 2 на клеточный иммунный ответ включает создание контакта между функциональными дендритными клетками, полученными из клеток, происходящих от MUTZ-3, или NMD-100 или NMD-200, нагруженными положительным по углеводу микроорганизмом, и PBMC (мононуклеарами периферической крови), совместимыми как минимум по MHC класса I (HLA-A2) и (HLA-B44), и культивирование данных клеток в течение соответствующего времени и при соответствующих условиях, как правило, 7-10 дней, а затем добавление для повторной стимуляции функциональных дендритных клеток, полученных из клеток, происходящих от MUTZ-3, NMD-100 или NMD-200, нагруженных лизатом клеток, содержащих углеводный эпитоп, или несущей углевод молекулой, и культивирование в течение соответствующего времени и при соответствующих условиях, как правило, 7-9 дней, с последующим измерением количества секретированного IFNгамма методом ELISPOT и/или секретированного TNFальфа методом ELISA. Анализы TNFальфа и IFNгамма методом ELISA и ELISPOT известны специалистам в данной области и описаны подробно в примерах. Предпочтительный вариант осуществления теста 2 на клеточный иммунный ответ подробно описан в примере 12.

По третьему варианту осуществления (тест 3 на клеточный иммунный ответ) количество/долю повторно стимулированных лимфоцитов определяют, измеряя пролиферацию и/или индукцию пролиферации. В предпочтительном варианте осуществления указанный тест 3 на клеточный иммунный ответ против углеводного эпитопа включает

b) культивирование в течение соответствующего времени и при соответствующих условиях;

e) измерение пролиферации и/или индукции пролиферации, предпочтительно с использованием реакции WST в сочетании с колориметрическими измерениями (как описано в примерах), при этом при положительном клеточном иммунном ответе против углеводного эпитопа наблюдают (i) значительно более высокую пролиферацию иммунных клеток или значительно большее количество T-клеток через определенное время культивирования при повторной стимуляции указанными дендритными клетками, нагруженными несущей или содержащей углеводный эпитоп молекулой, чем пролиферация или количество при повторной стимуляции соответствующими ненагруженными дендритными клетками, и/или чем пролиферация или количество при повторной стимуляции соответствующими дендритными клетками, нагруженными молекулой, не несущей или не содержащей углеводный эпитоп, и/или (ii) значительно более высокую пролиферацию иммунных клеток или значительно большее количество T-клеток через определенное время культивирования при повторной стимуляции указанными дендритными клетками, нагруженными белком, пептидом или молекулой, несущими или содержащими углеводный эпитоп, чем пролиферация или количество при повторной стимуляции соответствующими дендритными клетками, нагруженными соответствующим белком, пептидом или молекулой, не несущими или не содержащими углеводный эпитоп, и/или (iii) значительно более высокую пролиферацию иммунных клеток или значительно большее количество T-клеток через определенное время культивирования при повторной стимуляции указанными дендритными клетками, нагруженными белком, пептидом или молекулой, несущими или содержащими углеводный эпитоп, чем пролиферация или количество соответствующих иммунных клеток, повторно стимулированных соответствующими дендритными клетками, нагруженными соответствующим белком, пептидом или молекулой, несущими или содержащими углеводный эпитоп, но подвергнутыми ферментативной или химической обработке для разрушения углеводного эпитопа, и/или (iv) значительно более высокую пролиферацию иммунных клеток или значительно большее количество T-клеток через определенное время культивирования при повторной стимуляции указанными дендритными клетками, нагруженными лизатом или фракциями клеток, несущих или содержащих углеводный эпитоп, чем пролиферация или количество соответствующих иммунных клеток, повторно стимулированных соответствующими дендритными клетками, нагруженными лизатом клеток, отрицательных по углеводному эпитопу, или не содержащих его.

В указанном тесте 3 на клеточный иммунный ответ проверяют активацию CD4+ и CD8+ T-клеток до специфичных к углеводному эпитопу активированных T-клеток положительным по углеводу микроорганизмом, либо его фракцией или лизатом, измеряя индукцию пролиферации T-клеток, что включает создание контакта между дендритными клетками, нагруженными положительным по углеводу микроорганизмом, и иммунными клетками и культивирование в течение соответствующего времени и при соответствующих условиях, с последующим добавлением дендритных клеток, нагруженных несущей углеводный эпитоп молекулой для повторной стимуляции, и культивированием в течение соответствующего времени и при соответствующих условиях, а затем измерение пролиферации. Указанное измерение индукции пролиферации предпочтительно проводят, используя реакцию WST в сочетании с колориметрическими измерениями и вычитая только DC и только нестимулированные иммунные клетки, что известно специалистам в данной области и описано в примере 12. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения тест 3 на клеточный иммунный ответ включает создание контакта между функциональными дендритными клетками, полученными из клеток, происходящих от MUTZ-3, или NMD-100 или NMD-200, нагруженными положительным по углеводу микроорганизмом, либо его лизатом или фракцией, и PBMC (мононуклеарами периферической крови), совместимыми как минимум по MHC класса I (HLA-A2) и (HLA-B44), и культивирование данных клеток в течение соответствующего времени и при соответствующих условиях, как правило, 7-10 дней, а затем добавление для повторной стимуляции функциональных дендритных клеток, полученных из клеток, происходящих от MUTZ-3, NMD-100 или NMD-200, нагруженных лизатом клеток, содержащих углеводный эпитоп, или несущей углевод молекулой, и культивирование в течение соответствующего времени и при соответствующих условиях, как правило, 7-9 дней, с последующим измерением скорости пролиферации, как описано выше, и более подробно - в примере 12. При положительном клеточном иммунном ответе против углеводного эпитопа наблюдают более высокую пролиферацию T-клеток, повторно стимулированных DC, нагруженными несущей углеводный эпитоп молекулой, чем скорость пролиферации только DC и T-клеток, приведенных в контакт с ненагруженными mDC или с DC, нагруженными соответствующим контролем. Предпочтительный вариант осуществления теста 3 на клеточный иммунный ответ описан подробно в примере 12.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к тесту на клеточный иммунный ответ (тест 4 на клеточный иммунный ответ) против углеводного эпитопа, включающему

(a) создание контакта между соответствующим количеством дендритной клетки, дендритных клеток или смеси клеток, содержащих как минимум одну дендритную клетку, нагруженных соответствующим количеством

(i) положительного по углеводу микроорганизма, его лизата или фракции,

(ii) препаратов, содержащих их,

(iii) нутрицевтика или фармацевтической композиции по изобретению или

(iv) несущей или содержащей углеводный эпитоп молекулы,

(v) смеси, содержащей несущую углеводный эпитоп молекулу,

(vi) клеток, положительных по, или содержащих углеводный эпитоп, их лизата или фракции,

и соответствующим количеством как минимум одной связывающей углевод молекулы;

(b) тестирование связывания указанной связывающей углевод молекулы.

Положительная презентация углеводного эпитопа на указанной дендритной клетке или клетках имеет место, когда связывание связывающей углевод молекулы выше с указанной дендритной клеткой или клетками, нагруженными несущей углеводный эпитоп молекулой, чем ее связывание с соответствующей ненагруженной дендритной клеткой или клетками и/или с соответствующей дендритной клеткой или клетками, нагруженными молекулой, не несущей или не содержащей углеводный эпитоп, или несущей или содержащей углеводный эпитоп молекулой после ферментативной или химической обработки, которая разрушает углеводный эпитоп, и/или когда связывание связывающей углевод молекулы выше с указанной дендритной клеткой или клетками, нагруженными положительным по углеводу микроорганизмом, его лизатом или фракцией, нутрицевтиком, фармацевтической композицией или препаратами из них, чем с соответствующей ненагруженной дендритной клеткой или клетками, или чем с соответствующей дендритной клеткой или клетками, нагруженными микроорганизмом, который не связывается связывающей углевод молекулой, или чем с соответствующей дендритной клеткой или клетками, нагруженными положительным по углеводу микроорганизмом после ферментативной или химической обработки, которая разрушает углеводный эпитоп.

В указанном тесте 4 на клеточный иммунный ответ проверяют способность дендритных клеток презентировать углеводный эпитоп на своей поверхности после нагружения положительным по углеводу микроорганизмом, его фракцией или лизатом, демонстрирующую способность нагруженных дендритных клеток процессировать и презентировать углеводный эпитоп микробного происхождения иммунным клеткам, таким как T-клетки, что включает создание контакта между соответствующими количествами положительного по углеводу микроорганизма, либо его фракции или лизата, и дендритными клетками в соответствующем состоянии дифференциации и созревания, предпочтительно незрелыми DC, которые затем созревают в mDC при использовании соответствующего коктейля молекул, известных специалистам в данной области, и измерение презентации углеводного эпитопа нагруженными DC путем тестирования связывания связывающей углевод молекулы по изобретению с указанными нагруженными DC. Указанное тестирование связывания проводят соответствующими методами, предпочтительно методами иммуноцитохимии, иммунофлуоресценции или проточной цитометрии, и более предпочтительно методами иммуноцитохимии, которые известны специалистам в данной области и описаны в примерах.

Тест свидетельствует о положительной презентации нагруженных DC, когда связывание связывающей углевод молекулы выше с DC, нагруженными положительным по углеводу микроорганизмом, чем с ненагруженными DC, или более предпочтительно с DC, нагруженными микроорганизмом, который не связывается связывающей углевод молекулой, или с DC, нагруженными положительным по углеводу микроорганизмом после ферментативной или химической обработки, которая разрушает углеводный эпитоп. В предпочтительном варианте осуществления изобретения тест 4 на клеточный иммунный ответ включает создание контакта между соответствующими количествами функциональных незрелых дендритных клеток, полученных из клеток, происходящих от MUTZ-3 или NMD-100, или NMD-200, и лизатами положительного по углеводу микроорганизма, и последующее культивирование и созревание в течение 24-48 часов с использованием соответствующего коктейля молекул так, как описано в примере 12, и тестирование презентации углеводного эпитопа методом иммунофлуоресцентной микроскопии (иммуноцитохимии) с использованием специфичных к углеводному эпитопу антител.

Предпочтительный вариант осуществления теста 4 на клеточный иммунный ответ описан подробно в примере 12.

Изобретение также относится к тесту на клеточный иммунный ответ (тест 5 на клеточный иммунный ответ) против углеводного эпитопа, включающему

a) инкубацию соответствующего количества клеток-мишеней из линии клеток, содержащих углеводный эпитоп, меченных соответствующим количеством маркера, такого как европий или хром-51, как минимум с одной иммунной клеткой, направленной против углеводного эпитопа, или смесью клеток, содержащей как минимум одну иммунную клетку, направленную против углеводного эпитопа, в течение соответствующего времени (как правило, от 3 до 6 часов или в течение ночи) и при соответствующих условиях, и

b) измерение лизиса клеток-мишеней путем определения высвобождения маркера, такого как европий или хром-51, при этом при положительном клеточном иммунном ответе против углеводного эпитопа наблюдают значительно более сильный лизис клеток, содержащих углеводный эпитоп, чем отрицательных по углеводному эпитопу клеток и/или наблюдают значительно более сильный лизис клеток, содержащих углеводный эпитоп, инкубированных с направленными против углеводного эпитопа иммунными клетками, чем лизис клеток, содержащих углеводный эпитоп, инкубированных с соответствующими контрольными иммунными клетками, не направленными против углеводного эпитопа.

В указанном тесте 5 на клеточный иммунный ответ проверяют специфичную к углеводному эпитопу цитотоксичность иммунных эффекторных клеток, направленных против углеводного эпитопа, таких как, но не ограничиваясь ими, T-клетка, T-клетки, T-клеточный клон, T-клеточная линия, CD4-положительные T-клетки, CD8-положительные T-клетки, клетки NK и/или PBMC.

Получение направленных против углеводного эпитопа иммунных клеток описано где-либо еще в данном документе.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения направленные против углеводного эпитопа иммунные клетки получают введением препарата по изобретению, положительного по углеводу микроорганизма, либо его фракции или лизата, человеку или животному, более предпочтительно введением препарата по изобретению, положительного по углеводу микроорганизма, либо его фракции или лизата, человеку или животному и последующим выделением иммунных клеток из человека или животного.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения направленные против углеводного эпитопа иммунные клетки повторно стимулируют как минимум один раз дендритными клетками, нагруженными препаратом по изобретению, положительным по углеводу микроорганизмом, либо его фракцией или лизатом, либо несущей углеводный эпитоп молекулой или опухолевой клеткой до их использования в тесте 5 на клеточный иммунный ответ.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения направленные против углеводного эпитопа иммунные клетки повторно стимулируют более чем один раз дендритными клетками, нагруженными препаратом по изобретению, положительным по углеводу микроорганизмом, либо его фракцией или лизатом, либо несущей углеводный эпитоп молекулой или опухолевой клеткой до их использования в тесте 5 на клеточный иммунный ответ, при этом углеводный эпитоп на разных носителях (такой как, но не ограничиваясь ими, углеводный эпитоп на микроорганизме, или из него, на молекуле, белке или опухолевой клетке) используют для разных циклов повторной стимуляции.

Тест включает инкубацию соответствующих количеств меченых положительных по углеводному эпитопу клеток-мишеней с соответствующими количествами иммунных клеток, направленных против углеводного эпитопа, в течение соответствующего времени, как правило, от 3 до 6 часов или в течение ночи. Положительные по углеводному эпитопу клетки метят европием или хромом-51, что позволяет определять количество лизированных клеток. Количество лизированных клеток предпочтительно определяют, измеряя высвобождение европия или хрома-51 после инкубации. Подходящий контроль может быть определен специалистами в данной области, например, отрицательные по углеводному эпитопу клетки, или соответствующие контрольные иммунные клетки, не направленные против углеводного эпитопа. Тест может быть оптимизирован специалистами в данной области в плане соответствующего количества меченых опухолевых клеток, количества иммунных эффекторных клеток и времени инкубации для его использования по изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления тест 5 на клеточный иммунный ответ проводят, используя анализ с высвобождением европия. Клетки-мишени инкубируют в течение 10 минут при 4°C в 800 мкл буферного раствора с европием (50 мМ HEPES, pH 7,4, 93 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ MgCl₂, 10 мМ диэтилентриаминпентауксусная кислота, 2 мМ ацетат европия (III)), подвергают электропорации (710 В, 1 импульс, 30 мкс) в устройстве Multiporator (Eppendorf), а затем инкубируют на льду в течение следующих 10 минут. Затем клетки промывают 5 раз в RPMI/5% FCS и высевают в лунки 96-луночного круглодонного планшета (Nunc; 5×10³/лунку). Затем добавляют направленные против углеводного эпитопа иммунные клетки или соответствующие иммунные клетки в качестве эффекторных клеток (100 мкл/лунку), используя различные соотношения эффекторные клетки/клетки-мишени от 100:1 до 5:1, предпочтительно соотношения эффекторные клетки/клетки-мишени от 50:1 до 20:1. Для определения спонтанного высвобождения добавляют 100 мкл RPMI/5% FCS без эффекторных клеток. Максимальное высвобождение определяют после полного лизиса мишеней этанолом.

После инкубации при 37°C в течение 4 часов планшет центрифугируют при 500×g в течение 5 минут, и по 20 мкл бесклеточного супернатанта из каждой лунки переносят пипеткой в предварительно подготовленный плоскодонный планшет (Nunc-Immunoplate Maxisorp), содержащий по 200 мкл на лунку усиливающего раствора (Perkin-Elmer Wallac). После инкубации в течение 15 минут при комнатной температуре определяют флуоресценцию (флуориметр Victor², Perkin-Elmer Wallac). Специфическую цитотоксичность определяют, используя уравнение (экспериментальный лизис - спонтанный лизис)/(максимальный лизис - спонтанный лизис)×100%.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения нутрицевтик или фармацевтическая композиция, содержащая как минимум один положительный по углеводу микроорганизм, либо его лизат или фракцию, индуцирует эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ против углеводного эпитопа, который является положительным как минимум в двух тестах на клеточный иммунный ответ из тестов 1-5 на клеточный иммунный ответ.

В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения нутрицевтик или фармацевтическая композиция, содержащая как минимум один положительный по углеводу микроорганизм, либо его лизат или фракцию, индуцирует гуморальный и клеточный иммунный ответ против углеводного эпитопа, который является положительным как минимум в двух тестах на гуморальный иммунный ответ и двух тестах на клеточный иммунный ответ, предпочтительно положительным в тестах 1 и 3 на гуморальный иммунный ответ и тестах 1 и 3 на клеточный иммунный ответ, и более предпочтительно в тестах 1, 2 и 3 на гуморальный иммунный ответ и тестах 1, 2 и 3 на клеточный иммунный ответ, и даже более предпочтительно в тестах 1, 2, 3 и 4 на гуморальный иммунный ответ и тестах 1, 2, 3 и 4 на клеточный иммунный ответ, и даже более предпочтительно в тестах 1, 2, 3, 4 и 6 на гуморальный иммунный ответ и во всех 5 тестах на клеточный иммунный ответ, и даже более предпочтительно в тестах 1, 2, 3, 4 и 5 на гуморальный иммунный ответ и во всех 5 тестах на клеточный иммунный ответ, и наиболее предпочтительно положительным во всех 6 тестах на гуморальный иммунный ответ и во всех 5 тестах на клеточный иммунный ответ.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к тестам 1-5 на клеточный иммунный ответ, где дендритная клетка, дендритные клетки или смесь клеток, содержащая дендритную клетку, содержит как минимум одну дендритную клетку, которая становится зрелой дендритной клеткой, будучи приведена в контакт с указанными иммунными клетками.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к тестам 1-5 на клеточный иммунный ответ, где дендритная клетка, дендритные клетки или смесь клеток включают функциональные дендритные клетки, полученные из клеток, происходящих от MUTZ-3.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к тестам 1-5 на клеточный иммунный ответ, где указанные иммунные клетки совместимы с указанными дендритными клетками как минимум по одной молекуле MHC класса I.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к тестам 1-5 на клеточный иммунный ответ, где несущая углеводный эпитоп молекула представляет собой лизат или фракцию клеток, содержащих углеводный эпитоп.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к использованию любого из тестов на иммунный ответ, как описано выше, для определения иммунного ответа против углеводного эпитопа, индуцированного или усиленного нутрицевтиком, фармацевтической композицией, положительным по углеводу микроорганизмом или его фракцией, либо препаратами, содержащими их, по данному изобретению, как минимум у одного человека или животного.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к использованию любого из тестов на иммунный ответ, как описано выше, для проверки естественного существующего иммунного ответа у человека или животного без, или до введения нутрицевтика, фармацевтической композиции, положительного по углеводу микроорганизма или его фракции, либо препаратов, содержащих их, по данному изобретению, как минимум одному человеку или животному.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к использованию любого из тестов на иммунный ответ, как описано выше, для определения и оптимизации эффективного количества, максимального эффективного количества, дозы, режима дозирования, пути введения, композиции, препарата, носителей и других молекул, используемых совместно с нутрицевтиком, фармацевтической композицией, положительным по углеводу микроорганизмом или его фракцией, либо препаратами, содержащими их, по данному изобретению.

B) Получение положительных по углеводу микроорганизмов и способы тестирования способности положительного по углеводу микроорганизма индуцировать иммунные ответы, способы выделения положительного по углеводу микроорганизма, способы идентификации соответствующего положительного по углеводу микроорганизма для нутрицевтиков и фармацевтических композиций

Изобретение относится к положительному по углеводу микроорганизму, который узнается/связывается как минимум одной связывающей углевод молекулой, которая также специфически узнает углеводный эпитоп, присутствующий на молекуле из клетки человека или животного, при этом указанный микроорганизм индуцирует эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа как минимум у одного животного или человека.

Характеристики и преимущества соответствующих положительных по углеводу микроорганизмов и способы их получения описаны выше и ниже. Поскольку положительный по углеводу микроорганизм связывается и, таким образом, узнается как минимум одной связывающей углевод молекулой, которая также специфически узнает интересующий углеводный эпитоп в его «естественном» окружении (например, на клетке человека или животного, например, на опухолевой клетке), есть гарантия того, что положительный по углеводу микроорганизм и/или его положительные по углеводу фракция или лизат несут углеводную структуру, которая как минимум иммунохимически является практически идентичной интересующему углеводному эпитопу. Эта особенность важна для гарантии того, что указанным положительным по углеводу микроорганизмом инициируется ответ, который является достаточно специфичным к интересующему углеводному эпитопу. Такие связывающие углевод молекулы, предпочтительно антитела, которые можно использовать для определения того, что микроорганизм несет интересующий углеводный эпитоп, специфически узнают углеводный эпитоп, например, в характерном для опухоли окружении.

Изобретение относится к положительному по углеводу микроорганизму, его фракции или лизату, которые узнаются и, таким образом, связываются при контакте как минимум с одной связывающей углевод молекулой, специфически узнающей углеводный эпитоп, присутствующий на молекуле из клетки человека или животного, что индуцирует эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ и/или гуморальный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, как минимум у одного животного или человека.

В предпочтительном варианте осуществления положительный по углеводу микроорганизм индуцирует эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, как минимум у одного животного или человека, предпочтительно включающий активацию CD4-положительных T-клеток Th1 типа и/или активацию CD8-положительных цитотоксических T-клеток.

Изобретение относится к соответствующему положительному по углеводу микроорганизму для использования в препарате по данному изобретению, выбранном из группы, включающей нутрицевтик и фармацевтическую композицию по изобретению, где положительный по углеводу микроорганизм связывается как минимум одной связывающей углевод молекулой, специфически узнающей углеводный эпитоп, присутствующий на молекуле из клетки человека или животного, при этом указанный микроорганизм индуцирует эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа, предпочтительно как минимум у одного животного или человека.

В другом предпочтительном варианте осуществления указанный иммунный ответ индуцируют in vitro.

Изобретение относится к положительному по углеводу микроорганизму, который индуцирует эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа, положительных по углеводному эпитопу опухолевых клеток или положительных по углеводному эпитопу заболеваний, предпочтительно как минимум у одного человека или животного и/или in vitro.

В предпочтительном варианте осуществления по изобретению предлагают или используют

(i) положительный по углеводу микроорганизм по изобретению, или

(ii) нутрицевтик или фармацевтический препарат, содержащий положительный по углеводу микроорганизм, который выбирают из группы, включающей

Escherichia coli, Streptococcus, Bacteroides, Rhuminococcus, Lactobacillus, Bifidobacterium, Peptostreptococcus, Fusobacterium, Johnsonella, Atopobium, Staphylococcus, Eubacterium, Finegoldia, Clostridium, Eggerthella, Butyribacterium, Citrobacter, Helicobacter, Propionibacterium и Corynebacterium;

и более предпочтительно, который выбирают из группы, включающей Escherichia coli, Bacteroides, такие как Bacteroides ovatus, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides acidophilus, Bacteroides caccae;

и даже более предпочтительно, который выбирают из группы, включающей новый штамм Bacteroides ovatus AG6 (DSM 18726), новый штамм Bacteroides ovatus MU1 (DSM 18728) и новый штамм Escherichia coli LH2 (DSM 18727), депонированные в «DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH» в г. Брауншвейг (Германия), компанией Glycotope GmbH, Robert-Rоssle-Str. 10, 13125 Berlin (Германия) 20 октября, 2006 г., и наиболее предпочтительно новые штаммы AG6 или MU1.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения положительный по углеводу микроорганизм из нутрицевтика или фармацевтического препарата представляет собой сочетание положительных по углеводу микроорганизмов различных штаммов.

В следующем предпочтительном варианте осуществления положительный по углеводу микроорганизм из препарата по изобретению представляет собой сочетание положительных по углеводу микроорганизмов различных штаммов, выбранных из штаммов AG6, MU1 и LH2.

В следующем предпочтительном варианте осуществления нутрицевтик или фармацевтическая композиция по изобретению содержат как минимум один положительный по углеводу микроорганизм в сочетании как минимум с одним другим полезным микроорганизмом, таким как, но не ограничиваясь ими, молочнокислые бактерии и/или бифидобактерии, даже более предпочтительным является сочетание положительных по углеводу микроорганизмов различных штаммов в сочетании с другими полезными микроорганизмами.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения положительный по углеводу микроорганизм представляет собой непатогенный микроорганизм.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения положительный по углеводу микроорганизм выделяют из здорового донора.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения положительный по углеводу микроорганизм может быть выделен из здорового донора.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения положительный по углеводу микроорганизм используют в нутрицевтике или фармацевтической композиции в виде живого организма.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения положительный по углеводу микроорганизм используют в виде живого организма и вводят перорально.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения положительный по углеводу микроорганизм, используемый в нутрицевтике или фармацевтической композиции, чувствителен как минимум к одному антибиотику.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения положительный по углеводу микроорганизм, используемый в нутрицевтике, может колонизировать кишечник.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения положительный по углеводу микроорганизм, используемый в нутрицевтике или фармацевтической композиции, является убитым.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения положительный по углеводу микроорганизм, используемый в нутрицевтике или фармацевтической композиции, является пастеризованным.

В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения положительный по углеводу микроорганизм используют в нутрицевтике или фармацевтической композиции в виде живого микроорганизма и выделяют из здорового донора-человека, и он может колонизировать кишечник человека и является чувствительным к антибиотику.

В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения положительный по углеводу микроорганизм используют в нутрицевтике в пастеризованной форме и выделяют из кишечника здорового донора-человека, и он является чувствительным к антибиотику.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения положительный по углеводу микроорганизм, используемый в фармацевтической композиции, является убитым или лизированным.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения положительный по углеводу микроорганизм, используемый в нутрицевтике или фармацевтической композиции, является лиофилизированным.

Изобретение дополнительно относится к способу тестирования способности положительного по углеводу микроорганизма или его фракции индуцировать гуморальный иммунный ответ против углеводного эпитопа, включающему

a) введение соответствующего количества положительного по углеводу микроорганизма или его фракции как минимум одному человеку или животному;

b) проверку иммунного ответа как минимум в одном тесте из тестов 1-6 на гуморальный иммунный ответ против углеводного эпитопа.

Изобретение дополнительно относится к способу тестирования способности положительного по углеводу микроорганизма или его фракции индуцировать эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ против углеводного эпитопа, включающему

a) введение соответствующего количества положительного по углеводу микроорганизма или его фракции как минимум одному человеку или животному и

b) проверку иммунного ответа как минимум в одном тесте на клеточный иммунный ответ против углеводного эпитопа.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу тестирования способности любого из нутрицевтиков, фармацевтических композиций, положительных по углеводу микроорганизмов или их фракций, либо содержащих их препаратов, индуцировать иммунный ответ и определения, какой иммунный ответ индуцирован.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу определения дозы, режима дозирования, пути введения, препарата, носителей и других компонентов, используемых в, или совместно с нутрицевтиками, фармацевтическими композициями, положительными по углеводу микроорганизмами или их фракциями, либо содержащими их препаратами.

Изобретение дополнительно относится к способу тестирования способности положительного по углеводу микроорганизма индуцировать гуморальный иммунный ответ, включающему как минимум один из тестов 1-6 на гуморальный иммунный ответ, предпочтительно как минимум два, более предпочтительно три, более предпочтительно 4, более предпочтительно 5 и наиболее предпочтительно все 6 тестов на гуморальный иммунный ответ, при этом как минимум одному животному или человеку дают соответствующие количества тестируемого микроорганизма, или перорально или системно (с дополнительными адъювантами или без них), и проверяют антитела в сыворотке или антитела, извлеченные из сыворотки, плазмы или фекалий, предпочтительно в сравнении с антителами в сыворотке или антителами, извлеченными из сыворотки, плазмы или фекалий, до введения микроорганизма. Специалисты в данной области способны определять соответствующие количества микроорганизма и способы извлечения антител из крови, а также соответствующие контроли. Тесты описаны подробно в данном разделе и/или в примере 11.

Изобретение дополнительно относится к способу тестирования способности положительного по углеводу микроорганизма индуцировать клеточный иммунный ответ, включающему как минимум один из тестов 1-5 на клеточный иммунный ответ, предпочтительно как минимум два, более предпочтительно три и наиболее предпочтительно все 5 тестов на клеточный иммунный ответ.

Изобретение дополнительно относится к способу тестирования способности положительного по углеводу микроорганизма индуцировать цитотоксический клеточный иммунный ответ, включающему как минимум тест 2 на клеточный иммунный ответ, предпочтительно 2 и 1, более предпочтительно 2, 3 и наиболее предпочтительно все 5 тестов на клеточный иммунный ответ.

В обоих вариантах осуществления изобретения тесты либо проводят, как описано выше, in vitro, либо тесты 1-3 и 5 на клеточный иммунный ответ проводят, давая как минимум одному животному или человеку соответствующие количества тестируемого микроорганизма, или перорально или системно (с дополнительными адъювантами или без них), и иммунные клетки извлекают из крови и (i) проверяют в клеточных тестах 1-3 или 5, как описано выше, или (ii) проверяют в клеточных тестах 1-3 или 5, как описано выше, с той разницей, что иммунные клетки не приводят в контакт с дендритными клетками, нагруженными положительным по углеводу микроорганизмом, и только дендритные клетки, нагруженные несущей углеводный эпитоп молекулой, добавляют для повторной стимуляции. Вариант (i) предпочтительно используют для усиления эффекта in vivo и для улучшения считывания данных при слабых ответах, и вариант (ii) предпочтительно используют при сильных ответах. Специалисты в данной области способны определять соответствующие количества микроорганизма и соответствующие контроли. Тесты описаны подробно в примере 12.

Изобретение дополнительно относится в предпочтительном варианте осуществления к способу тестирования способности положительного по углеводу микроорганизма индуцировать гуморальный и клеточный иммунный ответ, который представляет собой сочетание описанных выше способов, включая как минимум один из тестов 1-6 на гуморальный иммунный ответ и как минимум один из тестов 1-5 на клеточный иммунный ответ, предпочтительно как минимум два из тестов 1-6 на гуморальный иммунный ответ и как минимум один, более предпочтительно как минимум два из тестов 1-5 на клеточный иммунный ответ, более предпочтительно как минимум три из тестов 1-6 на гуморальный иммунный ответ, более предпочтительно как минимум 4 из тестов 1-6 на гуморальный иммунный ответ и все из тестов 1-5 на клеточный иммунный ответ, более предпочтительно как минимум 5 из тестов 1-6 на гуморальный иммунный ответ и все из тестов 1-5 на клеточный иммунный ответ, и наиболее предпочтительно все 6 из тестов 1-6 на гуморальный иммунный ответ и все 5 из тестов 1-5 на клеточный иммунный ответ.

Изобретение также относится к способам идентификации положительного по углеводу микроорганизма, по смыслу изобретения, и способам выделения положительного по углеводу микроорганизма из смеси положительных и отрицательных по углеводному эпитопу микроорганизмов.

Изобретение дополнительно относится к способу выделения положительного по углеводу микроорганизма, несущего интересующую углеводную структуру, из смеси микроорганизмов, включающему

(a) приведение связывающей углевод молекулы, специфичной к интересующей углеводной структуре, в контакт со смесью микроорганизмов, и

(b) выделение как минимум одного микроорганизма, связанного с указанной связывающей углевод молекулой, из указанной смеси,

(c) проверку того, что выделенный микроорганизм является положительным по углеводу микроорганизмом и несет интересующую углеводную структуру.

Подробности соответствующего способа также описаны выше.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение дополнительно относится к способу выделения положительного по углеводу микроорганизма из смеси микроорганизмов, где на этапе (b) используют магнитные частицы для разделения/обогащения микроорганизмов, связанных с указанной связывающей углевод молекулой.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу выделения микроорганизма, как описано где-либо еще в данном документе, включающему:

(a) приведение указанной связывающей углевод молекулы в контакт со смесью микроорганизмов, и

(b) выделение как минимум одного микроорганизма, связанного с указанной связывающей углевод молекулой, и

(d) тестирование индукции эффективного специфичного к углеводу клеточного иммунного ответа и/или гуморального иммунного ответа против указанного углеводного эпитопа.

Указанный углеводный эпитоп может, например, являться частью углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащих указанный углеводный эпитоп. Предпочтительно соответствующий гуморальный или клеточный ответ инициируется как минимум у одного животного или человека указанным микроорганизмом и/или его фракцией и/или лизатом.

(a) приведение указанной связывающей углевод молекулы в контакт со смесью микроорганизмов, и

(b) выделение как минимум одного микроорганизма, связанного с указанной связывающей углевод молекулой, и

(d) тестирование индукции эффективного специфичного к углеводу клеточного иммунного ответа против указанного углеводного эпитопа, и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащих указанный углеводный эпитоп, указанным микроорганизмом и/или его фракцией и/или лизатом, предпочтительно для активации CD4-положительных Т-клеток Th1 типа и/или для активации цитотоксических CD8-положительных Т-клеток, предпочтительно как минимум у одного животного или человека и/или in vitro.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение дополнительно относится к способу выделения положительного по углеводу микроорганизма из смеси микроорганизмов, где указанная смесь микроорганизмов представляет собой смесь как минимум двух микроорганизмов, выбираемых из группы, включающей микроорганизмы из здорового человека и/или пациента, животного, почвы, продуктов питания и/или растений.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение дополнительно относится к способу выделения положительного по углеводу микроорганизма из смеси микроорганизмов, где указанная смесь микроорганизмов представляет собой смесь, содержащую микроорганизмы из желудочно-кишечного тракта человека, экскрементов человека, крови человека, ткани человека или жидкостей организма человека от здоровых индивидуумов или пациентов.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение дополнительно относится к способу выделения положительного по углеводу микроорганизма из смеси микроорганизмов, которое проводят в анаэробных условиях, что позволяет выделять анаэробные положительные по углеводу микроорганизмы.

Указанная смесь микроорганизмов может представлять собой любую смесь как минимум из двух различных микроорганизмов, таких как, но не ограничиваясь ими, природные, такие как, но не ограничиваясь ими, существующие в почве, продуктах питания, растениях, животных, желудочно-кишечном тракте человека, крови человека, ткани человека, жидкостях организма человека от здоровых индивидуумов или пациентов, наиболее предпочтительной является смесь микроорганизмов от здорового индивидуума. Микроорганизмы предпочтительно переводят в соответствующий раствор перед приведением смеси в контакт со связывающей углевод молекулой. Связывающая углевод молекула предпочтительно связана с носителем, таким как магнитные частицы, что позволяет отделять микроорганизм, связанный с указанным носителем. И после сведения вместе связывающей углевод молекулы и смеси микроорганизмов, данные микроорганизмы, связанные со связывающей углевод молекулой, отделяют от тех, которые не связались с антителом. В альтернативном варианте осуществления связывающая углевод молекула не связана с носителем, и положительный по углеводу микроорганизм выделяют вместе со связывающей углевод молекулой, используя способы специфического выделения антитела, такие как белок A, белок G, белок L или анти-IgM антитела или анти-IgG антитела, которые сами связаны с носителем, таким как материал магнитных гранул хроматографического слоя. В предпочтительном варианте осуществления изобретения положительный по углеводу микроорганизм, связанный со связывающей углевод молекулой, тщательно промывают соответствующим буферным раствором (таким как PBS-a) и высевают на селективные и неселективные среды, такие как, но не ограничиваясь ими, MRS, BSM, KF, N, S, WC, BHI, CBA и ST (для подробностей см. таблицу 3). Полученные в результате колонии соскребают с планшетов и подвергают дополнительным циклам аффинного обогащения с помощью специфичных к углеводу молекул. Колонии отбирают, повторно высевают штрихом и анализируют на экспрессию углевода методом ELISA и иммунофлуоресценции (более подробно описано в примерах 1-9). Исходя из данных описаний и из примеров специалист в данной области сможет адаптировать или оптимизировать способы для различных бактерий из различных источников.

В предпочтительном специальном варианте осуществления способ осуществляют в анаэробных условиях, что позволяет выделять анаэробный положительный по углеводу микроорганизм, это условие, например, является важным для большинства микроорганизмов из кишечника человека.

Способ подробно описан в примерах 1-9.

В другом предпочтительном варианте осуществления микроорганизмы выделяют из продуктов питания. В еще более предпочтительном варианте осуществления микроорганизмы выделяют из пищеварительной системы, и даже более предпочтительно из человеческих фекалий.

Способ подробно описан в примерах 1-9.

Изобретение дополнительно относится к способу идентификации соответствующего положительного по углеводу микроорганизма для использования в качестве компонента для нутрицевтиков и фармацевтических композиций по изобретению, включающему

a) тестирование микроорганизма на его связывание как минимум одной связывающей углевод молекулой и

b) идентификацию данного положительного по углеводу микроорганизма, который связывается как минимум одной связывающей углевод молекулой, как описано в данном документе.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения тестирование микроорганизма на его связывание как минимум с одной связывающей углевод молекулой проводят методом ELISA, при этом положительный по углеводу микроорганизм дает в ELISA сигнал как минимум с одной связывающей углевод молекулой, который как минимум в 3 раза, более предпочтительно в 5 раз, и даже более предпочтительно как минимум в 10 раз превышает фоновый сигнал.

Предпочтительными являются положительные по углеводу микроорганизмы, для которых характерно уменьшение связывания связывающей углевод молекулой после обработки положительного по углеводу микроорганизма ферментами или химическими веществами, разрушающими углеводный эпитоп, как описано где-либо еще в данном документе.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу идентификации положительного по углеводу микроорганизма, как описано где-либо еще в данном документе, включающему:

a) приведение указанной связывающей углевод молекулы в контакт с микроорганизмом или смесью микроорганизмов, и

b) идентификацию микроорганизма, который специфически связывается указанной связывающей углевод молекулой, и

c) тестирование индукции клеточного и/или гуморального иммунного ответа указанным микроорганизмом и/или его фракциями или лизатами,

при этом указанный микроорганизм индуцирует эффективный специфичный к углеводу клеточный и/или гуморальный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, предпочтительно как минимум у одного животного или человека, или in vitro.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу выявления микроорганизма, как описано где-либо еще в данном документе, включающему:

c) тестирование индукции эффективного специфичного к углеводу клеточного иммунного ответа указанным микроорганизмом и/или его фракциями или лизатами,

при этом указанный микроорганизм индуцирует эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, предпочтительно как минимум у одного животного или человека, или in vitro.

Индукцию указанного эффективного специфичного к углеводу клеточного иммунного ответа против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, можно измерять в тестах на клеточный иммунный ответ, как раскрыто в данном документе, или способами, известными специалистам в данной области.

a) тестирование положительного по углеводу микроорганизма на его связывание как минимум одной связывающей углевод молекулой и

b) тестирование его способности индуцировать иммунный ответ у людей или животных, узнающий углеводный эпитоп и/или положительную по углеводному эпитопу клетку или опухолевую клетку, и

c) идентификацию данного микроорганизма, который связывается как минимум одной связывающей углевод молекулой, как описано в данном документе, и индуцирует иммунный ответ у людей или животных, узнающий углеводный эпитоп и/или положительную по углеводному эпитопу клетку или опухолевую клетку, являясь положительным как минимум в одном тесте на гуморальный иммунный ответ из тестов 1-6 или как минимум в одном тесте на клеточный иммунный ответ из тестов 1-5, как описано в данном документе.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу идентификации соответствующего положительного по углеводу микроорганизма для использования в качестве компонента для нутрицевтиков или фармацевтических композиций по изобретению, где индуцированный иммунный ответ после введения препарата по настоящему изобретению у человека или животного представляет собой иммунный ответ, положительный как минимум в одном тесте на гуморальный иммунный ответ против углеводного эпитопа и как минимум в одном тесте на клеточный иммунный ответ против углеводного эпитопа, как описано где-либо еще в данном документе.

Способы идентификации соответствующего положительного по углеводу микроорганизма для использования в качестве компонента для нутрицевтиков или фармацевтических композиций по изобретению можно использовать для идентификации соответствующих микроорганизмов из существующих штаммов, таких как имеющихся в DSMZ или других коллекциях микроорганизмов, либо из положительных по углеводу микроорганизмов, выделенных способом по изобретению для выделения положительного по углеводу микроорганизма из смеси микроорганизмов.

Изобретение также относится к способу выделения и идентификации положительной по углеводу бактерии, включающему

a) выделение целых бактерий из образцов фекалий,

b) проведение аффинных обогащений положительных по углеводному эпитопу бактерий с использованием одной или большего количества связывающих углевод молекул в аэробных или анаэробных условиях,

c) высевание обогащенных бактерий на различные селективные среды и проведение скрининга бактерий на связывание со связывающими углевод молекулами.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу выделения и идентификации положительных по углеводу бактерий, включающему

a) выделение смеси микроорганизмов, содержащей целые бактерии, из образцов фекалий;

b) приведение связывающей углевод молекулы в контакт со смесью микроорганизмов;

c) выделение микроорганизма, который связывает связывающую углевод молекулу в аэробных или анаэробных условиях с использованием разделения на магнитных частицах;

d) высевание обогащенных бактерий как минимум на одну селективную среду;

e) идентификацию микроорганизма, который связывается как минимум одной связывающей углевод молекулой.

a) создание чистого штамма бактерий, которые связываются как минимум одной связывающей углевод молекулой, и/или

b) тестирование способности указанного чистого бактериального штамма индуцировать или усиливать иммунный ответ против углеводного эпитопа как минимум у одного человека или животного.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу тестирования способности положительного по углеводу микроорганизма индуцировать специфичный к углеводному эпитопу иммунный ответ, включающему следующие этапы:

1) идентификацию положительных по углеводу микроорганизмов и производство их в чистой культуре,

2) идентификацию иммунологически эффективных бактериальных штаммов из кишечника,

3) создание эффективного иммунологически и токсикологически проверенного положительного по углеводу препарата в виде пищевой добавки, подготовленной для тестирования на людях,

4) индукцию или усиление специфичных к углеводу иммунных ответов у людей, и при необходимости

5) выделение, идентификацию и тестирование иммунологически эффективных определенных положительных по углеводному эпитопу фракции или компонента указанного микроорганизма.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения связывающую углевод молекулу из вышеописанных способов выбирают из группы, включающей моноклональные антитела, поликлональные антитела, лектины и/или селектины и/или производные от них молекулы.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения углеводный эпитоп из вышеописанных способов выбирают из группы, включающей TF, Core-1, Tn, сиалил-Tn, сиалил-TF, Globo-H, Lewis-Y, сиалил-Lewis-A, сиалил-Lewis-X, полисиаловую кислоту, Lewis-X, GM2, GD2, GD3, 9-O-ацетил GD3, 9-O-ацетил GD2, GD3L, фукозил GM1, фукозил GM1, Lewis-A, Lewis-B, sLac, сиалилированную цепь типа 1, антиген CA 19-9, антиген CA 72-4 и/или антиген CA-50.

Способ описан подробно в примерах 1-10.

Изобретение относится также к способу создания положительных по углеводу микроорганизмов, включающему

a) приведение микроорганизма в контакт со средствами для индукции мутаций с помощью химических и/или физических мутагенов, таких как, но не ограничиваясь ими, физические мутагены, такие как, но не ограничиваясь ими, EMS, УФ, метотрексат, ультракороткие волны, канцерогенные вещества, канцероген, мутаген или радиация в условиях, убивающих большинство микроорганизмов, и

b) культивирование выживших микроорганизмов в соответствующих условиях,

c) обогащение, выделение и/или идентификацию положительных по углеводу микроорганизмов, как описано где-либо еще в данном документе,

d) тестирование способности указанного микроорганизма индуцировать или усиливать иммунный ответ против углеводного эпитопа как минимум у одного человека или животного.

Изобретение также относится к способу создания положительных по углеводу микроорганизмов методами генетической инженерии, включающему

a) интродукцию, нокаут и/или сайленсинг генов, части генов, ДНК, РНК, антисмысловой РНК, олигонуклеотидов, олигопептидов или белков в микроорганизме, тем самым влияя на биосинтез углеводного эпитопа, деградацию углеводного эпитопа или биосинтез или деградацию фланкирующих углеводов; и

b) обогащение, выделение, идентификацию и/или тестирование положительных по углеводу микроорганизмов, как описано где-либо еще в данном документе.

В предпочтительном варианте осуществления указанный микроорганизм представляет собой отрицательный по углеводному эпитопу микроорганизм.

В следующем предпочтительном варианте осуществления указанный микроорганизм представляет собой полезный для пищеварительного тракта микроорганизм, такой как, но не ограничиваясь ими, Lactobacillus или Bifidobacterium .

В следующем предпочтительном варианте осуществления указанный микроорганизм представляет собой микроорганизм, используемый в производстве обычных продуктов питания, такой как, но не ограничиваясь ими, Lactobacillus или Bifidobacterium.

В другом варианте осуществления указанный микроорганизм уже является положительным по углеводному эпитопу, и способ используют для увеличения количества углеводного эпитопа, экспрессированного на клеточной поверхности.

В предпочтительном варианте осуществления положительный по углеводу микроорганизм, выделенный или идентифицированный любым из вышеуказанных способов, либо его фракцию или лизат, используют для производства лекарственного средства или нутрицевтика для профилактики и/или терапии заболевания, связанного с указанным углеводным эпитопом, при этом указанный микроорганизм и/или фракция и/или лизат индуцирует эффективный специфичный к углеводу клеточный и/или гуморальный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, как минимум у одного животного или человека.

В другом предпочтительном варианте осуществления положительный по углеводу микроорганизм, выделенный или идентифицированный любым из вышеуказанных способов, либо его фракцию или лизат, используют для производства лекарственного средства или нутрицевтика для профилактики и/или терапии заболевания, связанного с указанным углеводным эпитопом, при этом указанный микроорганизм и/или фракция и/или лизат индуцирует эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, как минимум у одного животного или человека, предпочтительно иммунный ответ включает активацию CD4-положительных Т-клеток Th1 типа и/или активацию CD8-положительных цитотоксических T-клеток.

Соответствующие методы производства и условия известны специалистам в данной области, или могут быть адаптированы специалистами в данной области.

C) Получение фракций положительного по углеводу микроорганизма

Изобретение относится к фракции положительного по углеводу микроорганизма по изобретению, при этом эпитоп положительного по углеводу микроорганизма присутствует на молекуле из клетки человека или животного, при этом указанная фракция положительного по углеводу микроорганизма индуцирует эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа как минимум у одного животного или человека и связывается как минимум одной связывающей углевод молекулой, специфически узнающей углевод.

По изобретению предлагают соответствующую фракцию положительного по углеводу микроорганизма по изобретению для использования в препарате по изобретению, выбираемом из группы, включающей нутрицевтик или фармацевтическую композицию.

Изобретение относится к фракции положительного по углеводу микроорганизма по изобретению, которая индуцирует специфичный к углеводу иммунный ответ против углеводного эпитопа или положительных по углеводному эпитопу клеток или опухолевых клеток у людей или животных.

Указанная фракция положительного по углеводу микроорганизма означает препараты или очищенные фракции более мелких частей указанных микроорганизмов, такие как препарат клеточной стенки, препарат оболочки, лизаты, препарат липополисахаридов, препарат капсул или препарат полисахаридов капсулы, которые описаны в примерах (пример 10), либо специалист в данной области способен оптимизировать и выбрать один подходящий способ или сочетание соответствующих способов. Они предпочтительно включают как минимум один положительный по углеводу компонент указанного положительного по углеводу микроорганизма. Их можно получать методами препарирования и очистки как минимум из одного положительного по углеводу микроорганизма. Указанные препараты или очищенные фракции можно получать способами, известными специалистам в данной области, такими как те, которые описаны выше, или при помощи однократного или последовательного фракционирования клеток, фенольно-водной экстракции, эфирной экстракции, расщепления лизоцимом или хроматографических методов. Положительный по углеводу компонент или фракцию, содержащую положительный по углеводу компонент, выявляют путем связывания фракции как минимум с одной связывающей углевод молекулой в системах тестирования, таких как, но не ограничиваясь ими, ELISA или дот-блот анализ, которые известны специалистам в данной области. В предпочтительном варианте осуществления изобретения фракцию, содержащую положительный по углеводу компонент, получают аффинной хроматографией с использованием как минимум одной связывающей углевод молекулы.

В предпочтительном варианте осуществления используют один этап препарирования или очистки. В другом предпочтительном варианте осуществления используют сочетания как минимум этапов препарирования и очистки.

В следующем предпочтительном варианте осуществления положительный по углеводу компонент в указанной фракции является обогащенным по сравнению с целым микроорганизмом, что можно определять по усиленному связыванию как минимум одной связывающей углевод молекулы с фракцией, по сравнению с микроорганизмом, например, методом ELISA, и предпочтительно тогда, когда масса содержащегося биологического материала в одинаковых объемах одна и та же.

Указанный положительный по углеводу компонент означает любой компонент положительного по углеводу микроорганизма, который связывается как минимум одной связывающей углевод молекулой. Указанный положительный по углеводу компонент включает как минимум одну углеводную структуру или имитирующую углевод структуру, которая может быть доступна в форме ее природной молекулы, где она является частью микроорганизма, такой как пептид, олигопептид, полипептид, липид, церамид, углевод, липопротеин, полисахарид, олигосахарид, полисахарид, протеогликан, липополисахарид или гликопротеин, либо как часть указанной природной молекулы, либо отдельно. Положительный по углеводу компонент можно использовать, по смыслу изобретения, в качестве фракции положительного по углеводу микроорганизма как таковой, или связанным с другими неприродными структурами-носителями, такими как белки, липиды, химические молекулы, такие как полиакриламид. Предпочтительно его используют в его природной форме. Положительный по углеводу компонент может содержать одну структуру углеводного эпитопа или имитирующую углевод структуру, либо повторяющиеся блоки указанных структур, и может содержать дополнительные углеводные структуры или блоки, или другие структуры биологических молекул. Указанная имитирующая углевод структура представляет собой структуру, которая связывается как минимум одной связывающей углевод молекулой и индуцирует иммунный ответ против углеводного эпитопа, предпочтительно эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ или гуморальный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа, и более предпочтительно эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ и гуморальный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа и/или клеток, связанных с указанным углеводным эпитопом.

Положительный по углеводу микроорганизм, из которого получают положительную по углеводу фракцию, описан в другом месте данного изобретения.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения фракция положительного по углеводу микроорганизма (активный компонент) нутрицевтика или фармацевтического препарата включает сочетание фракций из одного положительного по углеводу микроорганизма или предпочтительно из разных положительных по углеводу микроорганизмов различных штаммов. Фракции могут быть одного или разных типов препарирования или очистки, предпочтительно представляют собой сочетание положительных по углеводу компонентов, которые имеют разные молекулярные носители или имитирующие структуры, такие как, но не ограничиваясь ими, пептид, олигопептид, полипептид, липид, церамид, углевод, липопротеин, полисахарид, олигосахарид, полисахарид, протеогликан или гликопротеин, либо как часть другой природной или синтетической молекулы.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения положительный по углеводу компонент не является частью бактериального липополисахарида.

В следующем предпочтительном варианте осуществления указанная фракция положительного по углеводу микроорганизма содержит сочетание положительных по углеводу компонентов положительных по углеводу микроорганизмов как минимум двух различных штаммов.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанную углеводную структуру или ее указанные повторяющиеся блоки получают обогащением и/или очисткой и/или выделением из положительного по углеводу микроорганизма.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения указанную углеводную структуру или ее указанные повторяющиеся блоки получают химическим синтезом, методами, известными специалистам в данной области.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения указанную углеводную структуру или ее указанные повторяющиеся блоки получают обогащением и/или очисткой и/или выделением из штамма AG6.

Подробности приведены в примере 10.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения указанную углеводную структуру или ее указанные повторяющиеся блоки получают химическим синтезом.

Специалисты в данной области способны определять соответствующие условия и способы для химического синтеза углеводной структуры фигуры 8 или ее повторяющихся блоков.

D) Способы получения иммунных клеток, направленных против углеводного эпитопа

Изобретение относится к способу получения функциональной дендритной клетки против указанного углеводного эпитопа, включающему создание контакта между соответствующим количеством дендритной клетки или смеси дендритных клеток, или смеси клеток, содержащей как минимум одну дендритную клетку, и соответствующим количеством препарата, как описано где-либо еще в данном документе, в течение соответствующего времени при соответствующих условиях для получения как минимум одной функциональной дендритной клетки против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп. Как изложено выше, указанный углеводный эпитоп предпочтительно является человеческим эпитопом и предпочтительно незаряженным. Предпочтительно указанные дендритные клетки не нагружены пептидами, несущими интересующий углеводный эпитоп.

Изобретение относится к способу получения функциональной дендритной клетки против указанного углеводного эпитопа, включающему создание контакта между соответствующим количеством дендритной клетки или смеси дендритных клеток, или смеси клеток, содержащей как минимум одну дендритную клетку, и соответствующим количеством как минимум одной несущей углеводный эпитоп молекулы или как минимум одной болезнетворной клетки, связанной с углеводным эпитопом, или как минимум одной положительной по углеводному эпитопу опухолевой клетки, либо ее лизата или фракции, как описано где-либо еще в данном документе, в течение соответствующего времени при соответствующих условиях для получения как минимум одной функциональной дендритной клетки, нагруженной углеводным эпитопом.

Указанная дендритная клетка против углеводного эпитопа представляет собой дендритную клетку, или смесь дендритных клеток, которая активирует как минимум одну T-клетку против углеводного эпитопа, что предпочтительно можно проверять тестом на клеточный иммунный ответ по изобретению, и является положительной в отношении углеводного эпитопа как минимум в одном из тестов на клеточный иммунный ответ, описанных где-либо еще в данном документе. В предпочтительном варианте осуществления функциональная дендритная клетка презентирует углеводный эпитоп на своей поверхности и может быть выявлена специфичным к углеводному эпитопу антителом или связывающей углевод молекулой, как описано для примера в тесте 4 на клеточный иммунный ответ. В предпочтительном варианте осуществления изобретения функциональную дендритную клетку против углеводного эпитопа получают, создавая контакт между незрелой дендритной клеткой или смесью незрелых дендритных клеток, или смесью дендритных клеток, содержащей как минимум одну незрелую дендритную клетку, и соответствующим количеством как минимум одного положительного по углеводу микроорганизма, его лизата или фракции, как описано где-либо еще в данном документе, в течение соответствующего времени при соответствующих условиях для созревания указанной дендритной клетки с использованием соответствующих условий, как описано где-либо еще в данном документе и известно специалистам в данной области, включающих, например, молекулы TNFальфа (фактор некроза опухолей альфа), LPS (липополисахарид) или BCG (бацилла Кальметта-Герена), INFгамма (интерферон гамма), дексаметазон и/или TGFбета (трансформирующий фактор роста бета), в функциональную дендритную клетку, нагруженную углеводным эпитопом. В предпочтительном варианте осуществления изобретения дендритная клетка происходит от MUTZ-3 или NemodDC (поставщик Glycotope GmbH Berlin, Germamy; www. glycotope. com), и более предпочтительные незрелые дендритные клетки получают из клеток MUTZ-3 или NemodDC при соответствующих условиях, включающих использование IL-4 и GM-CSF, как правило, в течение одной недели, полученные незрелые дендритные клетки или iNMDC приводят в контакт с указанным соответствующим количеством как минимум одного положительного по углеводу микроорганизма, его лизата или фракции, клетки созревают при использовании соответствующих условий, включающих, например, TNFальфа, LPS, BCG, INFгамма, дексаметазон или TGFбета, предпочтительно TNFальфа, как правило, в течение примерно одного-двух дней, превращаясь в зрелые дендритные клетки, нагруженные углеводным эпитопом, что соответствует указанной функциональной дендритной клетке против углеводного эпитопа.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к функциональной дендритной клетке, полученной описанными выше способами, где функциональная дендритная клетка направлена против углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к функциональной дендритной клетке, полученной описанными выше способами, где функциональная дендритная клетка направлена против указанного углеводного антигена или клетки млекопитающего, содержащей указанное, и индуцирует эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ и/или гуморальный иммунный ответ против клеток и/или заболеваний, где экспрессируется указанный углеводный эпитоп.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу получения активированной Т-клетки, T-клеток, T-клеточного клона или T-клеточной линии против углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, включающему

(a) создание контакта между соответствующим количеством как минимум одной функциональной дендритной клетки, как описано выше, и соответствующим количеством как минимум одной T-клетки или смеси T-клеток, или смеси клеток, содержащей как минимум одну T-клетку, культивирование указанной T-клетки или смеси T-клеток вместе с указанными нагруженными функциональными дендритными клетками в течение соответствующего времени и при соответствующих условиях для активации или примирования T-клетки или T-клеток против указанного углеводного эпитопа, и

(b) повторную стимуляцию указанных T-клеток соответствующим количеством как минимум одной функциональной дендритной клетки, нагруженной клеткой человека или животного, или молекулой, несущей указанный углеводный эпитоп.

Изобретение относится к способу получения активированной Т-клетки или T-клеток против углеводного эпитопа, включающему

(a) создание контакта между соответствующим количеством как минимум одной функциональной дендритной клетки или смеси клеток, содержащей как минимум одну функциональную дендритную клетку, нагруженную соответствующими количествами положительного по углеводу микроорганизма, его лизата или фракции, и как минимум одной T-клеткой или T-клетками,

(b) культивирование указанной T-клетки или T-клеток вместе с указанными нагруженными функциональными дендритными клетками в течение соответствующего времени и при соответствующих условиях для активации или примирования T-клетки или T-клеток против углеводного эпитопа.

(a) создание контакта между соответствующим количеством функциональных дендритных клеток или смеси клеток, содержащей как минимум одну функциональную дендритную клетку, нагруженную соответствующими количествами несущей углеводный эпитоп молекулы, положительной по углеводному эпитопу опухолевой клетки или клетки, содержащей углеводный эпитоп, либо ее лизата или фракции, и T-клеткой или T-клетками, или смесью клеток, содержащей как минимум одну T-клетку,

(b) культивирование указанной T-клетки или T-клеток, или смеси клеток, содержащей как минимум одну T-клетку, вместе с указанными нагруженными функциональными дендритными клетками в течение соответствующего времени и при соответствующих условиях для активации или примирования T-клетки или T-клеток против углеводного эпитопа.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу получения активированной Т-клетки или T-клеток против углеводного эпитопа, включающему

(a) создание контакта между соответствующими количествами функциональных дендритных клеток, нагруженных соответствующими количествами положительного по углеводу микроорганизма, или его лизата или фракции, и T-клеткой или T-клетками,

(c) добавление функциональных дендритных клеток, нагруженных несущей углеводный эпитоп молекулой, положительной по углеводному эпитопу опухолевой клеткой или клеткой, содержащей углеводный эпитоп, либо ее лизатом или фракцией, для повторной стимуляции,

(d) культивирование в течение соответствующего времени и при соответствующих условиях.

(a) создание контакта между соответствующим количеством как минимум одной функциональной дендритной клетки, нагруженной соответствующим количеством как минимум одного положительного по углеводу микроорганизма, либо его лизата или фракции, и соответствующим количеством как минимум одной T-клетки или смеси T-клеток, или смеси клеток, содержащей как минимум одну T-клетку,

b) культивирование указанной T-клетки или смеси T-клеток, или смеси клеток, содержащей как минимум одну T-клетку, с указанными нагруженными функциональными дендритными клетками в течение соответствующего времени и при соответствующих условиях для активации или примирования T-клетки или T-клеток против углеводного эпитопа.

(a) создание контакта между соответствующим количеством как минимум одной функциональной дендритной клетки, нагруженной соответствующим количеством как минимум одной несущей углеводный эпитоп молекулы или положительной по углеводному эпитопу опухолевой клетки или клетки, содержащей углеводный эпитоп, либо ее лизата или фракции, и соответствующим количеством как минимум одной T-клетки или смеси T-клеток, или смеси клеток, содержащей как минимум одну T-клетку,

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу получения активированной Т-клетки или T-клеток против углеводного эпитопа, включающему этапы (a) и (b) предшествующих способов и далее включающему

(c) добавление соответствующего количества как минимум одной функциональной дендритной клетки, нагруженной соответствующим количеством как минимум одной несущей углеводный эпитоп молекулы или положительной по углеводному эпитопу опухолевой клетки, или клетки, содержащей углеводный эпитоп, либо ее лизата или фракции, для повторной стимуляции,

или добавление соответствующего количества как минимум одной функциональной дендритной клетки, нагруженной соответствующим количеством как минимум одного положительного по углеводу микроорганизма, его лизата или фракции, для повторной стимуляции, и

(d) культивирование в течение соответствующего времени и при соответствующих условиях.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу получения T-клеточной линии против углеводного эпитопа, включающему этапы (a), (b), (c) и (d) предшествующего способа и далее, включающему как минимум один дополнительный цикл повторной стимуляции, где один цикл стимуляции включает либо этапы (e) и (f), либо этапы (g) и (h), где

(e) добавление соответствующего количества как минимум одной функциональной дендритной клетки, нагруженной соответствующим количеством как минимум одной несущей углеводный эпитоп молекулы или положительной по углеводному эпитопу опухолевой клетки, или клетки, содержащей углеводный эпитоп, либо ее лизата или фракции, для повторной стимуляции,

(f) культивирование в течение соответствующего времени и при соответствующих условиях,

(g) добавление соответствующего количества как минимум одной функциональной дендритной клетки, нагруженной соответствующим количеством как минимум одного положительного по углеводу микроорганизма, или его лизата или фракции, для повторной стимуляции,

(h) культивирование в течение соответствующего времени и при соответствующих условиях.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу получения T-клеточной линии против углеводного эпитопа, дополнительно включающему два дополнительных цикла указанного цикла повторной стимуляции.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу получения T-клеточной линии против углеводного эпитопа, включающему три дополнительных цикла указанного цикла повторной стимуляции.

В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу получения T-клеточной линии против углеводного эпитопа, включающему пять дополнительных циклов указанного цикла повторной стимуляции.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу получения T-клеточного клона против углеводного эпитопа, где как минимум один раз проводят дополнительный этап клонирования клеток перед одним циклом указанных циклов повторной стимуляции.

В предпочтительном варианте осуществления активированная T-клетка или T-клетки представляют собой T-клеточную линию против углеводного эпитопа, при этом предпочтительно (c) и (d), которые соответствуют одному циклу повторной стимуляции, выполняют два раза, более предпочтительно три раза, более предпочтительно 4 раза, и наиболее предпочтительной является T-клеточная линия, для которой выполняют более 4 циклов повторной стимуляции.

В предпочтительном варианте осуществления активированная T-клетка или T-клетки представляют собой T-клеточный клон против углеводного эпитопа, при этом предпочтительно (c) и (d), которые соответствуют одному циклу повторной стимуляции, выполняют два раза, более предпочтительно три раза, более предпочтительно 4 раза, и наиболее предпочтительной является T-клеточная линия, для которой выполняют более 4 циклов повторной стимуляции, и перед повторной стимуляцией клетки клонируют как минимум один раз, например, методом серийных разведений.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу получения T-клеточного клона против углеводного эпитопа, где указанная функциональная дендритная клетка представляет собой зрелую дендритную клетку.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу получения T-клеточного клона против углеводного эпитопа, где указанная функциональная дендритная клетка и T-клетка или T-клетки представляют собой клетки человека.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу получения активированной T-клетки, T-клеточного клона или T-клеточной линии против углеводного эпитопа, где указанная функциональная дендритная клетка происходит от MUTZ-3 [патентные заявки 10139428.4 (DE), PCT/EP02/09260, 02758474.7 (EP), US10/486966, CA2457287, DE10139428A1, WO2003/023023A1, EP01419240, US20040265998, CA2457287], такой как, но не ограничиваясь ею, Nemod-DC (поставщик Glycotope GmbH Berlin, Germany, www.glycotope.com).

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу получения активированной T-клетки, T-клеточного клона или T-клеточной линии против углеводного эпитопа, где указанная функциональная дендритная клетка и T-клетка или T-клетки совместимы по молекуле как минимум одного класса MHC.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к активированной T-клетке, T-клеткам, T-клеточному клону или T-клеточной линии, полученным любым из описанных выше способов, где активированная T-клетка, T-клетки, T-клеточный клон или T-клеточная линия направлены против углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к активированной T-клетке, T-клеткам, T-клеточному клону или T-клеточной линии, полученным любым из описанных выше способов, где активированная T-клетка, T-клетки, T-клеточный клон или T-клеточная линия направлены против углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, и индуцируют эффективный специфичный к углеводному эпитопу клеточный иммунный ответ против углеводного эпитопа и/или клеток и/или заболеваний, связанных с указанным углеводным эпитопом.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к активированной T-клетке или T-клеткам против углеводного эпитопа, при этом клеточная композиция включает как минимум одну T-клетку против углеводного эпитопа, T-клеточную линию против углеводного эпитопа или T-клеточный клон против углеводного эпитопа, как описано выше, которые убивают как минимум одну положительную в отношении углеводного эпитопа опухолевую клетку или болезнетворную клетку, связанную с углеводным эпитопом, или секретируют молекулы, которые являются посредниками гибели как минимум одной опухолевой клетки.

Активированная T-клетка или T-клетки против углеводного эпитопа, клеточная композиция, содержащая T-клетки против углеводного эпитопа, T-клеточную линию против углеводного эпитопа или T-клеточный клон против углеводного эпитопа по изобретению, которые убивают как минимум одну положительную по углеводному эпитопу опухолевую клетку или болезнетворную клетку или секретируют молекулы, которые являются посредниками гибели как минимум одной опухолевой клетки или болезнетворной клетки, означает, что указанная цитотоксическая T-клетка или клетки против углеводного эпитопа убивают положительную по углеводному эпитопу опухолевую клетку или болезнетворную клетку, что можно определять либо при помощи теста на клеточный иммунный ответ, описанного где-либо еще в данном документе, измеряя секрецию INFгамма или TNFальфа, либо при помощи теста на цитотоксичность (такого как тест 5 на клеточный иммунный ответ), где как минимум одна меченая положительная по углеводному эпитопу опухолевая клетка или болезнетворная клетка лизируется указанными T-клетками, как в принципе известно специалистам в данной области, при использовании T-клеток по изобретению, например, CTL или Th1-клеток, либо путем индуцирования специфического CD4 T-хелперного ответа, который опосредует активацию соответствующего гуморального или клеточного иммунных ответов, что приводит к гибели как минимум одной положительной по углеводному эпитопу опухолевой клетки.

Специалисты в данной области способны выполнять описанную задачу, используя раскрытые в данном документе способы и материал. Они способны определять наилучшие условия для получения данных функциональных дендритных клеток или T-клеток, наилучшие пути введения и/или соответствующие композиции, содержащие их, и/или условия для получения и использования дополнительно описаны в предпочтительных вариантах осуществления в патентных заявках DE10139428A1, WO2003/023023A1, EP01419240, US20040265998, CA2457287.

Указанные активированные T-клетки или T-клетки против углеводного эпитопа означают, что полученная T-клетка, T-клетки или клеточная композиция, содержащая T-клетки, являются положительными как минимум по одному из тестов на клеточный иммунный ответ по изобретению, предпочтительно по двум, более предпочтительно по трем и наиболее предпочтительно по всем 4. Предпочтительно они содержат как минимум одну CD4+ хелперную клетку, и даже более предпочтительно как минимум одну цитотоксическую T-клетку, способную убивать как минимум одну положительную по углеводному эпитопу опухолевую клетку.

Указанная T-клетка или T-клетки, используемые для создания контакта, представляют собой либо как минимум одну CD4+ и/или CD8+ T-клетку, которые были выделены или обогащены ранее стандартными способами, известными специалистам в данной области, либо представляют собой клеточную композицию, которая содержит как минимум одну CD4+ и/или CD8+ T-клетки.

Указанный лизат может представлять собой любой лизат из положительного по углеводному эпитопу микроорганизма или из положительной по углеводному эпитопу опухолевой клетки, соответственно, такой как, но не ограничиваясь ими, лизат, полученный при повторном замораживании-оттаивании, при разрушении ультразвуком, при механическом воздействии или при температурном воздействии.

Для подробностей относительно получения специфичных к углеводному эпитопу Т-клеток см. пример 12.

Функциональная дендритная клетка представляет собой клетку, которая способна активировать T-клетку.

Активация T-клетки означает стимуляцию пролиферации и/или превращение из наивной в активную T-клетку. Активная T-клетка секретирует молекулы, которые индуцируют или способствуют иммунному ответу против целевого углеводного эпитопа или опухолевых клеток, либо болезнетворных клеток, несущих углеводный эпитоп, предпочтительно такие цитотоксические T-клетки, которые являются посредниками гибели положительной по углеводному эпитопу опухолевой клетки или болезнетворной клетки.

В предпочтительном варианте осуществления указанная функциональная дендритная клетка представляет собой зрелую дендритную клетку. Более предпочтительный предшественник дендритной клетки, из которого происходит зрелая клетка, получают от человека, более предпочтительно от человека, от которого также получены Т-клетка или T-клетки, или которые совместимы как минимум по одной молекуле класса MHC. В более предпочтительном варианте осуществления функциональную дендритную клетку получают из MUTZ-3, и даже более предпочтительно клетки MUTZ-3 или клетки, производные от них, дифференцируют при помощи Il-4 и GM-CSF, нагружают соответствующими количествами положительного по углеводу микроорганизма, его лизата или фракции, либо несущей углеводный эпитоп молекулы, либо положительной по углеводному эпитопу опухолевой клетки, ее лизата или фракции, и далее подвергают созреванию, используя для созревания дендритных клеток, например, соответствующие количества TNF-альфа, и она соответствует функциональной дендритной клетке по изобретению. В еще более предпочтительном варианте осуществления нагруженные функциональные дендритные клетки используют совместно с PBMC (мононуклеары периферической крови), совместимыми как минимум по MHC классу I (HLA-A2) и (HLA-B44).

Специалисты в данной области способны определять соответствующие условия для получения функциональных дендритных клеток, нагруженных положительным по углеводу микроорганизмом, его лизатом или фракцией, либо несущей углеводный эпитоп молекулой, либо положительной по углеводному эпитопу опухолевой клеткой или болезнетворной клеткой, либо ее лизатом или фракцией, а также соответствующие количества и методы обогащения или очистки T-клетки или T-клеток, и соответствующие условия для совместного культивирования обеих клеток, такие как, включительно, время, среды, условия культивирования и необходимые дополнительные факторы. Как правило, функциональные дендритные клетки дифференцируют из клеток-предшественников в течение 6-10 дней и нагружают и проводят созревание в течение следующих 1-2 дней. Культивирование указанной T-клетки или T-клеток совместно с указанными нагруженными функциональными дендритными клетками, как правило, проводят в течение 7-10 дней, и добавление и культивирование нагруженных функциональных дендритных клеток для повторной стимуляции, как правило, в течение 7-9 дней для каждого цикла повторной стимуляции. Дополнительные подробности представлены в примере 12.

В другом предпочтительном варианте осуществления различные дендритные клетки или функциональные дендритные клетки из различных источников, такие как происходящие из MUTZ-3 и донорские дендритные клетки человека, используют для различных этапов примирования и повторной стимуляции. Специалисты в данной области способны выбирать наилучшие варианты сочетания.

Успешное получение T-клетки, T-клеток или клеточных композиций, содержащих T-клетку, T-клетки, CD4+ и/или CD8+ T-клетки против углеводного эпитопа можно проверять, используя как минимум один тест на клеточный иммунный ответ по изобретению. Дополнительные детали описаны где-либо еще в данном документе. Предпочтительно как минимум два теста на клеточный иммунный ответ являются положительными, более предпочтительно три, более предпочтительно четыре и наиболее предпочтительно все пять.

Приведенное здесь описание для дендритных клеток, их использования, а также соответствующих условий и молекул для их применения также имеет силу для тестов на клеточный иммунный ответ, описанных где-либо еще в данном документе, и наоборот, и будет иметь силу для всех других частей изобретения.

В другом варианте осуществления изобретение относится к активированной T-клетке против углеводного эпитопа.

В другом варианте осуществления изобретение относится к T-клеткам, содержащим как минимум одну активированную T-клетку против углеводного эпитопа.

В другом варианте осуществления изобретение относится к T-клеточной линии против углеводного эпитопа.

В другом варианте осуществления изобретение относится к T-клеточному клону против углеводного эпитопа.

В предпочтительном варианте осуществления T-клеточную линию или T-клеточный клон получали с использованием производных от MUTZ-3 функциональных дендритных клеток (таких как Nemod-DC), нагруженных положительным по углеводу микроорганизмом, его лизатом или фракцией, в сочетании как минимум с одним циклом повторной стимуляции производными от MUTZ-3 функциональными дендритными клетками, нагруженными как минимум одной несущей углеводный эпитоп молекулой или положительной по углеводному эпитопу опухолевой клеткой, или болезнетворной клеткой, либо их лизатом или фракцией от здорового донора, и даже более предпочтительно от пациента, и даже более предпочтительно от пациента, чье заболевание или опухоль являются положительными в отношении связывания со связывающей углевод молекулой, предпочтительно со специфичным к углеводному эпитопу антителом.

Изобретение дополнительно относится к способу получения как минимум одной активированной T-клетки для применения в качестве терапии опухолей, включающей введение активированных T-клеток против положительных по углеводному эпитопу опухолевых клеток пациенту.

E) Способы индукции иммунной защиты против заболеваний, связанных с углеводным эпитопом, и способы предотвращения и/или лечения заболеваний, связанных с углеводным эпитопом

Изобретение относится к способу индукции или усиления эффективного специфичного к углеводу клеточного иммунного ответа и/или специфичного гуморального иммунного ответа против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, как минимум у одного животного или человека, включающему введение человеку или животному эффективного количества препарата, как описано где-либо еще в данном документе.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу индукции или усиления эффективного специфичного к углеводу клеточного иммунного ответа против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, как минимум у одного животного или человека, включающему введение человеку или животному эффективного количества препарата, как описано где-либо еще в данном документе, предпочтительно указанный эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ включает активацию CD4-положительных T-клеток Th1-типа и/или CD8-положительных цитотоксических T-клеток, более предпочтительно указанный эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ включает активацию CD4-положительных T-клеток Th1-типа и активацию CD8-положительных цитотоксических T-клеток.

Индукцию указанного эффективного специфичного к углеводу клеточного иммунного ответа предпочтительно измеряют при помощи тестов на клеточный иммунный ответ, как описано где-либо еще в данном документе.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения пациента с раком или пациента, страдающего от заболевания, связанного с углеводным эпитопом, включающему введение любого из активированной T-клетки или T-клеток против углеводного эпитопа, клеточной композиции, содержащей как минимум одну T-клетку против углеводного эпитопа, T-клеточной линии против углеводного эпитопа или T-клеточного клона против углеводного эпитопа, как описано выше, либо композиции, содержащей их.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения пациента с раком или пациента, страдающего от заболевания, связанного с углеводным эпитопом, включающему введение соответствующего количества как минимум одной из функциональных дендритных клеток против углеводного эпитопа, как описано выше, либо композиции, содержащей их.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения пациента с раком, где пациент имеет или имел раковую клетку, положительную по углеводному эпитопу.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения пациента с раком или пациента, страдающего от заболевания, связанного с углеводным эпитопом, где функциональная дендритная клетка является аутологической.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения пациента с раком или пациента, страдающего от заболевания, связанного с углеводным эпитопом, где функциональная дендритная клетка является аллогенной, взятой от донора.

Изобретение дополнительно относится к способу лечения пациента с раком или пациента, страдающего от заболевания, связанного с углеводным эпитопом, включающему введение любого из активированной T-клетки или T-клеток против углеводного эпитопа, клеточной композиции, содержащей как минимум одну T-клетку против углеводного эпитопа, T-клеточной линии против углеводного эпитопа или T-клеточного клона против углеводного эпитопа, как описано где-либо еще в данном документе, либо композиции, содержащей как минимум одно из них.

Изобретение дополнительно относится к способу лечения пациента с раком или пациента, страдающего от заболевания, связанного с углеводным эпитопом, включающему введение соответствующего количества как минимум одной из функциональных дендритных клеток против углеводного эпитопа, как описано где-либо еще в данном документе, либо композиции, содержащей их.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения как минимум один из указанных способов применяют к пациенту, который имеет или имел раковую клетку, положительную по углеводному эпитопу, что можно выявлять при помощи как минимум одной связывающей углевод молекулы или специфичного к углеводному эпитопу антитела, и в его предпочтительном варианте осуществления, описанном где-либо еще в данном документе.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения как минимум один из указанных способов применяют к пациенту, который имеет или имел заболевание, связанное с углеводным эпитопом, что можно выявлять при помощи как минимум одной связывающей углевод молекулы или специфичного к углеводному эпитопу антитела, как описано где-либо еще в данном документе.

Кроме того, предпочтительными являются указанные способы, где функциональная дендритная клетка является аутологической, более предпочтительно, если функциональная дендритная клетка является аллогенной, более предпочтительно, если функциональная дендритная клетка происходит от донора, даже более предпочтительно, если функциональная дендритная клетка происходит от MUTZ-3, даже более предпочтительно, если любая из описанных функциональных дендритных клеток разделяет как минимум одну молекулу класса MHC с индивидуумом, которому ее вводят.

Изобретение относится к способу индукции или усиления специфического гуморального и/или клеточного иммунного ответа против углеводного эпитопа, несущей углеводный эпитоп молекулы или положительных по углеводному эпитопу опухолевых клеток, или положительных по углеводному эпитопу болезнетворных клеток, включающему введение человеку или животному эффективного количества нутрицевтика или фармацевтической композиции, или положительного по углеводному эпитопу микроорганизма, либо его фракции, как описано где-либо еще в данном документе, или препаратов, содержащих их.

Изобретение относится к способу индукции эффективного специфичного к углеводу клеточного иммунного ответа против указанного углеводного эпитопа, несущей углеводный эпитоп молекулы или положительных по углеводному эпитопу опухолевых клеток, или положительных по углеводному эпитопу болезнетворных клеток, включающему введение человеку или животному эффективного количества нутрицевтика или фармацевтической композиции, или положительного по углеводному эпитопу микроорганизма, либо его фракции, как описано где-либо еще в данном документе, или препаратов, содержащих их.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу индукции эффективного специфичного к углеводу клеточного иммунного ответа против углеводного эпитопа как минимум у одного индивидуума, включающему активацию CD4-положительных хелперных T-клеток Th1-типа и/или цитотоксических CD8-положительных T-клеток против углеводного эпитопа, что можно выявлять при помощи как минимум одного из тестов на иммунный ответ, описанных где-либо еще в данном документе.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу индукции эффективного специфичного к углеводу клеточного иммунного ответа против углеводного эпитопа как минимум у одного индивидуума, включающему активацию CD4-положительных хелперных T-клеток Th1-типа и цитотоксических CD8-положительных T-клеток против углеводного эпитопа, что можно выявлять при помощи как минимум одного из тестов на иммунный ответ, описанных где-либо еще в данном документе.

Изобретение относится к способу индукции или усиления специфического гуморального и клеточного иммунного ответа против углеводного эпитопа, несущей углеводный эпитоп молекулы или положительных по углеводному эпитопу опухолевых клеток, или положительных по углеводному эпитопу болезнетворных клеток, включающему введение человеку или животному эффективного количества нутрицевтика или фармацевтической композиции, или положительного по углеводному эпитопу микроорганизма, либо его фракции, как описано где-либо еще в данном документе, или препаратов, содержащих их.

Изобретение относится к способу индукции или усиления специфичного к углеводному эпитопу иммунного ответа, который действует как защита против положительных по углеводному эпитопу раковых или болезнетворных клеток, обладая способностью разрушать как минимум одну положительную по углеводному эпитопу раковую или болезнетворную клетку.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу индукции специфичного к углеводному эпитопу иммунного ответа, который действует как защита против положительных по углеводному эпитопу раковых клеток, обладая способностью разрушать такие клетки, как продемонстрировано в данном документе, например, путем индукции специфичных к углеводному эпитопу антител, путем индукции специфичной к углеводному эпитопу комплементзависимой цитотоксичности специфичных к углеводному эпитопу антител против положительных по углеводному эпитопу раковых клеток или болезнетворных клеток, эффективно их убивая, и/или путем секреции TNFальфа и/или INFгамма при специфичных к углеводному эпитопу T-клеточных ответах, каковые являются научно признанными специалистами в данной области суррогатными маркерами специфического опосредованного цитотоксическими Т-клетками лизиса данных опухолевых клеток или болезнетворных клеток, несущих углеводный эпитоп, как показано в примерах и описано в данном документе, включающему введение человеку или животному эффективного количества нутрицевтика или фармацевтической композиции, или положительного по углеводному эпитопу микроорганизма, либо его фракции, как описано где-либо еще в данном документе, или препаратов, содержащих их.

Изобретение дополнительно относится к способу уменьшения, или даже более предпочтительно предотвращения появления опухоли, предпочтительно положительной по углеводному эпитопу опухоли, включающему введение человеку или животному эффективного количества нутрицевтика или фармацевтической композиции, или положительного по углеводному эпитопу микроорганизма, либо его фракции, как описано где-либо еще в данном документе, или препаратов, содержащих их, предпочтительно здоровому индивидууму.

Изобретение дополнительно относится к способу уменьшения, или даже более предпочтительно предотвращения возникновения заболевания, предпочтительно положительного по углеводному эпитопу заболевания, включающему введение человеку или животному эффективного количества нутрицевтика или фармацевтической композиции, или положительного по углеводному эпитопу микроорганизма, либо его фракции, как описано где-либо еще в данном документе, или препаратов, содержащих их, предпочтительно здоровому индивидууму.

Изобретение дополнительно относится к способу уменьшения, или даже более предпочтительно предотвращения распространения или метастаза опухоли, предпочтительно положительной по углеводному эпитопу опухоли, включающему введение человеку или животному эффективного количества нутрицевтика или фармацевтической композиции, или положительного по углеводному эпитопу микроорганизма, либо его фракции, как описано где-либо еще в данном документе, или препаратов, содержащих их.

Изобретение относится к способу лечения опухоли, предпочтительно положительной по углеводному эпитопу опухоли, включающему введение человеку или животному эффективного количества нутрицевтика или фармацевтической композиции, или положительного по углеводному эпитопу микроорганизма, либо его фракции, как описано где-либо еще в данном документе, или препаратов, содержащих их.

Изобретение относится к способу лечения заболевания, предпочтительно заболевания, связанного с углеводным эпитопом, включающему введение человеку или животному эффективного количества нутрицевтика или фармацевтической композиции, или положительного по углеводному эпитопу микроорганизма, либо его фракции, как описано где-либо еще в данном документе, или препаратов, содержащих их.

Изобретение относится к способу уменьшения, или даже более предпочтительно предотвращения возникновения положительного по углеводному эпитопу заболевания или опухоли, включающему введение человеку или животному эффективного количества нутрицевтика или фармацевтической композиции, или положительного по углеводному эпитопу микроорганизма, либо его фракции, как описано где-либо еще в данном документе, или препаратов, содержащих их, предпочтительно здоровому индивидууму.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу иммунизации или вакцинации человека или животного против углеводного эпитопа, присутствующего на молекуле из клетки человека или животного, включающему

(i) введение человеку или животному эффективного количества иммунных клеток или смеси клеток, содержащей как минимум одну иммунную клетку, направленную против углеводного эпитопа, как описано где-либо еще в данном документе, и индукцию иммунного ответа указанной иммунной клеткой у человека или животного (примирование); и

ii) активацию иммунного ответа путем введения эффективного количества препаратов, описанных где-либо еще в данном документе.

(i) введение человеку или животному эффективного количества иммунных клеток или смеси клеток, содержащей как минимум одну иммунную клетку, направленную против углеводного эпитопа, как минимум один раз, и индукцию иммунного ответа указанной иммунной клеткой у человека или животного (примирование); и

ii) активацию иммунного ответа путем введения эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей положительный по углеводу микроорганизм и/или его фракцию.

Указанную иммунную клетку, направленную против углеводного эпитопа, можно выбирать из группы, включающей дендритную клетку или клетки, дендритную клеточную линию, T-клетку или клетки, T-клеточную линию и/или T-клеточный клон, либо содержащие их смеси, при этом указанная иммунная клетка направлена против углеводного эпитопа. Получение указанных иммунных клеток описано где-либо еще в данном документе.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения введение указанных иммунных клеток и примирование проводят один раз.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения введение указанных иммунных клеток и примирование проводят дважды.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения введение указанных иммунных клеток и примирование проводят как минимум от трех до пяти раз.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения активацию иммунного ответа путем введения эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей положительный по углеводу микроорганизм и/или его фракцию, проводят один раз.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения активацию проводят 2-10 раз, более предпочтительно более чем 10 раз, более предпочтительно вплоть до 20 раз, наиболее предпочтительно активацию проводят постоянно через равномерные временные интервалы на протяжении периода от нескольких месяцев до нескольких лет.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения активацию иммунного ответа проводят 1-5 раз близко по времени к примированию, а затем с интервалами от 3 месяцев до 1 года или от 1 года до 10 лет.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу индукции эффективного специфичного к углеводу клеточного и/или гуморального иммунного ответа, предпочтительно цитотоксического T-клеточного ответа, против углеводного эпитопа, присутствующего на молекуле из клетки человека или животного, включающему

i) пероральное введение нутрицевтика, содержащего положительный по углеводу микроорганизм, либо его лизат или фракцию, человеку или животному,

ii) повторение перорального введения для индукции иммунной защиты против возникновения заболевания, характеризующегося наличием углеводного эпитопа.

Нутрицевтик по настоящему изобретению может представлять собой любой пищевой продукт или пищевую добавку, или диетическую добавку, или терапевтический пищевой продукт, или пищевой продукт для определенного оздоровительного применения, или пищевой продукт для специального диетического применения, или функциональный пищевой продукт, и может применяться в различных формах, как описано где-либо еще в данном документе. В предпочтительном варианте осуществления изобретения нутрицевтик вводят через неравные интервалы.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения нутрицевтик вводят с интервалами, исчисляющимися от дней до недель, более предпочтительным является первоначальное регулярное применение как минимум с недельными интервалами в течение периода 1-6 месяцев с последующим повторным применением через неравномерные интервалы.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения нутрицевтик применяют как клинический пищевой продукт. В даже более предпочтительном варианте осуществления нутрицевтик применяют до и/или после биопсии, предпочтительно потенциальной опухоли. И даже более предпочтительно нутрицевтик применяют до и/или после хирургического удаления опухоли, предпочтительно, опухоли, положительной по углеводному эпитопу. И даже более предпочтительно нутрицевтик применяют в сочетании с другими видами лечения.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу вакцинации или иммунизации человека или животного против углеводного эпитопа и/или положительных по углеводному эпитопу заболеваний или опухолей, включающему

ii) введение человеку или животному эффективного количества функциональных дендритных клеток или смеси клеток, содержащей как минимум одну функциональную дендритную клетку, направленных против углеводного эпитопа, как минимум один раз и индукцию иммунного ответа с помощью указанных функциональных дендритных клеток у человека или животного, и

iii) активацию иммунного ответа путем введения эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей как минимум один положительный по углеводу микроорганизм и/или его фракцию и/или лизат, как минимум один раз.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу вакцинации человека или животного против углеводного эпитопа, присутствующего на молекуле из клетки человека или животного, и/или положительных по углеводному эпитопу заболеваний или опухолей, включающему

i) введение человеку или животному эффективного количества активированных T-клеток, T-клеточного клона, T-клеточной линии или смеси клеток, содержащей как минимум одну активированную T-клетку, направленных против углеводного эпитопа, как минимум один раз и индукцию иммунного ответа с помощью указанных активированных T-клеток у человека или животного, и

Получение функциональных дендритных клеток, активированных T-клеток, T-клеточных линий и T-клеточных клонов описано где-либо еще в данном документе.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения введение согласно предыдущим способам по п. (i) проводят один раз.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения введение согласно предыдущим способам по п. (i) проводят дважды.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения введение согласно предыдущим способам по п. (i) проводят как минимум от трех до пяти раз.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения активацию иммунного ответа путем введения эффективного количества фармацевтической композиции по п. (ii) предыдущих способов проводят один раз, в другом предпочтительном варианте осуществления изобретения активацию проводят 2-10 раз, более предпочтительно более 10 раз, более предпочтительно вплоть до 20 раз, наиболее предпочтительно активацию проводят постоянно через равномерные временные интервалы на протяжении периода от нескольких месяцев до нескольких лет.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или лечения положительной по углеводному эпитопу опухоли и/или заболевания, включающему введение соответствующего количества препарата, положительного по углеводу микроорганизма или его фракции, функциональной дендритной клетки или активированной T-клетки, T-клеточной линии или T-клеточного клона против углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, как описано где-либо еще в данном документе, человеку или животному.

Изобретение относится к способу уменьшения или даже более предпочтительно предотвращения распространения положительного по углеводному эпитопу заболевания, включающему введение человеку или животному эффективного количества нутрицевтика или фармацевтического препарата, или положительного по углеводному эпитопу микроорганизма, либо его фракции, как описано где-либо еще в данном документе, или препаратов, содержащих их.

Изобретение относится к способу лечения положительного по углеводному эпитопу заболевания, включающему введение человеку или животному эффективного количества нутрицевтика или фармацевтического препарата, или положительного по углеводу микроорганизма, либо его фракции, как описано где-либо еще в данном документе, или препаратов, содержащих их.

Изобретение относится к способу укрепления иммунной системы или усиления иммунного ответа, включающему введение человеку или животному эффективного количества нутрицевтика или фармацевтической композиции, или положительного по углеводу микроорганизма, либо его фракции, которые описаны где-либо еще в данном документе, или препаратов, содержащих их. Это может представлять собой, например, но не ограничиваясь ими, общее улучшение состояния иммунной системы, например, против инфекционных заболеваний или опухолей, усиление активности других иммуностимулирующих средств или пробиотиков, или пребиотиков, либо адъювантное действие.

В предпочтительном варианте осуществления нутрицевтик или фармацевтический препарат, или положительный по углеводу микроорганизм, либо его фракция, которые описаны где-либо еще в данном документе, или препараты, содержащие их, из вышеописанных способов включают как минимум один микроорганизм, лизат или фракцию, выбранные из группы, включающей штамм Bacteroides ovatus штамм AG6 (DSM 18726), штамм Bacteroides ovatus MU1 (DSM 18728) и/или штамм Echerichia coli LH2 (DSM 18727), более предпочтительно из штамма AG6 и/или MU1, депонированных в «DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH» в г. Брауншвейг (Германия), компанией Glycotope GmbH, Robert-Rоssle-Str. 10, 13125 Berlin (Германия) 20 октября, 2006 г.

Термин «препарат» означает любое вещество или композицию веществ в соответствующей форме для введения, включающие как минимум что-то одно из нутрицевтика, фармацевтической композиции, положительного по углеводу микроорганизма или его фракции, которые могут содержать фармацевтически приемлемый носитель или носитель, приемлемый для пищевых добавок и/или нутрицевтика, либо только нутрицевтик, фармацевтическую композицию, положительный по углеводу микроорганизм или его фракцию.

Термин «предотвращение возникновения» означает применение нутрицевтика, фармацевтической композиции, положительного по углеводу микроорганизма или его фракции, либо содержащих их препаратов, к субъекту с целью снизить риск или скорость или вероятность развития положительного по углеводному эпитопу вида рака или положительного по углеводному эпитопу заболевания.

Термин «уменьшение или предотвращение распространения опухоли или положительного по углеводному эпитопу заболевания, или метастаза опухоли» означает применение нутрицевтика, фармацевтической композиции, положительного по углеводу микроорганизма или его фракции, либо содержащих их препаратов, к субъекту с целью снизить риск или скорость или вероятность метастаза или распространения заболевания на другие органы или другие участки тела, либо на других индивидуумов.

Термин «лечение» означает применение нутрицевтика, фармацевтической композиции, положительного по углеводу микроорганизма или его фракции, либо содержащих их препаратов, к индивидууму или субъекту с целью излечения, заживления, облегчения, ослабления, изменения, лечения, снижения тяжести, улучшения состояния, либо оказания воздействия на рак, симптомы рака, предрасположенность к раку, время дожития, либо время до прогрессирования.

Указанное положительное по углеводному эпитопу заболевание или заболевание, связанное с указанным углеводным эпитопом, либо заболевание, характеризующееся наличием указанного углеводного эпитопа, представляет собой любое заболевание, которое ассоциировано с прионом, вирусом, микроорганизмом, бактерией или другим биологическим материалом, который может быть связан как минимум одной из связывающих углевод молекул, предпочтительно как минимум одним из специфичных к углеводному эпитопу антител, либо которое ассоциировано с компонентом организма или имеет место в организме человека или животного, например, но не ограничиваясь ими, клетка, микроорганизм, вирус или частица, которые связываются как минимум одной из связывающих углевод молекул, предпочтительно связываются как минимум одним из специфичных к углеводному эпитопу антител.

«Эффективное количество» любого из нутрицевтика, фармацевтической композиции, положительного по углеводу микроорганизма или его фракции, либо содержащих их препаратов, включает живые или убитые микроорганизмы, либо лизаты или фракции данных микроорганизмов, которые соответствуют или получаются примерно из 1×10⁶-1×10¹⁴ КОЕ на человека в сутки (КОЕ/человека/сутки), при этом КОЕ представляет собой колониеобразующую единицу как показатель для одного микроорганизма, как это известно и может быть определено специалистами в данной области.

В другом варианте осуществления изобретения эффективное количество представляет собой количество нутрицевтика, фармацевтической композиции, положительного по углеводу микроорганизма или его фракции, либо содержащих их препаратов, которое индуцирует гуморальный или клеточный иммунный ответ против углеводного эпитопа как минимум у одного индивидуума, предпочтительно гуморальный и клеточный иммунный ответ против углеводного эпитопа, определяемый как минимум одним из тестов на иммунный ответ против углеводного эпитопа, описанных где-либо еще в данном документе. В другом варианте осуществления изобретения эффективное количество представляет собой количество нутрицевтика, фармацевтической композиции, положительного по углеводу микроорганизма или его фракции, либо содержащих их препаратов, которое индуцирует эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ против углеводного эпитопа как минимум у одного индивидуума, предпочтительно включающий активацию CD4-положительных хелперных Т-клеток Th1 типа и/или CD8-положительных цитотоксических T-клеток против углеводного эпитопа, определяемый как минимум одним из тестов на иммунный ответ, описанных где-либо еще в данном документе.

Эффективное количество для индивидуума или группы индивидуумов могут определять и/или оптимизировать специалисты в данной области, предпочтительно используя как минимум один тест на иммунный ответ против углеводного эпитопа, описанный где-либо еще в данном документе, и предпочтительно такие сочетания тестов на иммунный ответ против углеводного эпитопа, которые описаны где-либо еще в данном документе как предпочтительные варианты осуществления и/или тесты на клинический ответ, известные специалистам в данной области или описанные где-либо еще в данном документе.

Данные эффективные количества могут отличаться от описанных выше количеств или доз, или предпочтительных количеств или доз, описанных где-либо еще в данном документе, для человека в зависимости, например, от субъекта, от количественного и временного расписания дозирования, от формата препарата нутрицевтика, фармацевтической композиции, положительного по углеводу микроорганизма или его фракции, от пути введения и временной схемы введения, от цели его использования, такой как профилактика или лечение, от состояния положительного по углеводному эпитопу заболевания или рака, и они могут варьировать в зависимости от видов, рас, а также для отдельного животного или отдельного человека, получающего нутрицевтик, фармацевтическую композицию, положительный по углеводу микроорганизм или его фракцию, либо содержащие их препараты. Специалисты в данной области способны определять соответствующие и/или оптимальные дозы, путь введения и временную схему для индивидуума или группы индивидуумов, предпочтительно с использованием описания и варианта осуществления изобретения, описанного в данном документе.

Предпочтительными являются такие эффективные количества и дозы нутрицевтика, фармацевтической композиции, положительного по углеводу микроорганизма или его фракции, либо содержащих их препаратов, которые индуцируют или усиливают иммунный ответ против углеводного эпитопа более чем у одного индивидуума, более предпочтительно у значительного количества индивидуумов, более предпочтительно как минимум у 10%, более предпочтительно как минимум у 20%, более предпочтительно как минимум у 30%, более предпочтительно как минимум у 40%, более предпочтительно как минимум у 50% и наиболее предпочтительно у большинства индивидуумов.

В предпочтительном варианте осуществления указанный индуцированный или усиленный иммунный ответ является гуморальным и клеточным иммунным ответом против углеводного эпитопа, выявляемым как минимум одним из тестов 1-6 на гуморальный иммунный ответ и одним из тестов 1-5 на клеточный иммунный ответ.

В предпочтительном варианте осуществления эффективное количество представляет собой количество указанного нутрицевтика, указанной фармацевтической композиции, указанного положительного по углеводу микроорганизма или его указанной фракции, либо указанных содержащих их препаратов, которое требуется для создания иммунной защиты против положительных по углеводному эпитопу опухолевых клеток, для оказания профилактического эффекта против рака или для оказания терапевтического эффекта против рака, или для оказания профилактического или терапевтического эффекта против другого положительного по углеводному эпитопу заболевания, как минимум у одного индивидуума. В другом предпочтительном варианте осуществления эффективное количество представляет собой количество указанного нутрицевтика, указанной фармацевтической композиции, указанного положительного по углеводу микроорганизма или его указанной фракции, либо указанных содержащих их препаратов, которое индуцирует максимальный или близкий к максимальному иммунный ответ против углеводного эпитопа как минимум у одного индивидуума.

В еще более предпочтительном варианте осуществления предпочтительное эффективное количество представляет собой количество нутрицевтика, фармацевтической композиции, положительного по углеводу микроорганизма или его фракции, либо содержащих их препаратов, которое индуцирует максимальные или близкие к максимальным иммунные ответы против углеводного эпитопа, что определяют в тестах на иммунный ответ против углеводного эпитопа специалисты в данной области, при этом данный максимальный иммунный ответ не обязательно должен быть таким, который является положительным во всех тестах на иммунный ответ, но предпочтительно таким, который дает максимальные ответы по антителам или титры антител против углеводного эпитопа и/или наиболее сильный T-клеточный ответ против углеводного эпитопа, и более предпочтительно против положительных по углеводному эпитопу раковых клеток, более предпочтительно оба из них, и наиболее предпочтительно те, которые демонстрируют как минимум в тестах 1 и 3 на гуморальный иммунный ответ против углеводного эпитопа наивысшие титры антител и/или как минимум в тестах 1 или 2 или 3 на клеточный иммунный ответ - наивысшие T-клеточные ответы против углеводного эпитопа.

В предпочтительном варианте осуществления эффективное количество указанного нутрицевтика, указанной фармацевтической композиции, указанного положительного по углеводу микроорганизма или его указанной фракции, либо указанных препаратов, содержащих живые или убитые микроорганизмы, либо лизаты или фракции данных микроорганизмов, соответствуют или получается примерно из 1×10⁶-1×10¹⁴ КОЕ на дозу для индивидуума.

В более предпочтительном варианте осуществления эффективное количество нутрицевтика, фармацевтической композиции, положительного по углеводу микроорганизма или его фракции, либо содержащих их препаратов, содержит живые или убитые микроорганизмы, либо лизаты или фракции данных микроорганизмов, которые соответствуют или получаются из 1×10⁷ -1×10¹³ КОЕ/человека/сутки, более предпочтительно 2×10⁸-1×10¹² и более предпочтительно 1×10⁹-1×10¹¹ КОЕ/человека/сутки.

Эффективные количества или эффективные дозы могут также варьировать, как признают специалисты в данной области, в зависимости от пути введения, использования эксципиентов и возможности совместного использования с другими средствами, такими как средства для усиления иммунитета, для индукции иммунного ответа или создания иммунной защиты, либо для предотвращения или лечения рака.

Эффективные количества или эффективные дозы могут также варьировать, как признают специалисты в данной области, в зависимости от формата использования, например, использования в качестве нутрицевтика, в качестве фармацевтической композиции, в качестве положительного по углеводу микроорганизма или его фракции, либо в качестве содержащих их препаратов, а также в зависимости от того, содержат ли они живые или убитые микроорганизмы, их лизаты или фракции, а также от количества доз, а также от временных интервалов между дозами. Эти параметры могут определять и оптимизировать специалисты в данной области, предпочтительно используя предлагаемое изобретение, тесты и способы по изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления нутрицевтик вводят перорально, от более одной дозы ежедневно до одной дозы ежедневно, еженедельно или ежемесячно, от короткого временного интервала до применения в течение года, предпочтительно ежедневное или еженедельное применение на протяжении от 4 недель до 2 лет.

В другом предпочтительном варианте осуществления индивидууму вводят одну дозу.

В другом предпочтительном варианте осуществления индивидууму вводят множество доз.

В другом предпочтительном варианте осуществления эффективное количество соответствует одной дозе.

В другом предпочтительном варианте осуществления эффективное количество соответствует множеству доз.

В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическую композицию можно вводить системно, от всего лишь одной дозы до множества доз, предпочтительно от одного раза в неделю до одного раза в месяц, одного раза в 3 месяца или одного раза в 6 месяцев, либо сочетая режимы вперемежку, и возможно сочетание с подкреплением иммунизации от одного раза в 6 месяцев до одного раза в год, до одного раза в 5 лет, до одного раза в десять лет.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения эффективная доза препарата нутрицевтика, содержащего как минимум один положительный по углеводу микроорганизм, либо его лизат или фракцию, для людей составляет 0,1 мг/м²-10 г/м², более предпочтительно 10 мг/м²-10 г/м², даже более предпочтительно 0,1 г/м²-10 г/м².

В другом предпочтительном варианте осуществления препарат вводят сначала системно с последующими пероральными подкреплениями иммунизации.

Термин «введение» означает создание контакта между человекам или животным и эффективным количеством нутрицевтика, фармацевтической композиции, положительного по углеводу микроорганизма или его фракции, либо содержащих их препаратов, для которых могут быть использованы дополнительные носители. Пути введения включают любой путь для создания контакта между человеком или животным и нутрицевтиком, фармацевтической композицией, положительным по углеводу микроорганизмом или его фракцией, либо содержащими их препаратами. Предпочтительными являются такие пути введения, как например, но не ограничиваясь ими, пероральное введение, системное введение, введение путем ингаляции или путем создания контакта с кожей или другим эпидермисом, которые приводят к иммунному ответу против углеводного эпитопа, к иммунной защите против углеводного эпитопа или положительных по углеводному эпитопу опухолевых клеток, к профилактическому эффекту против рака или терапевтическому эффекту против рака, предпочтительные формы которых можно определять, как описано выше или где-либо еще в данном документе. Специалисты в данной области могут выбирать наиболее подходящий путь введения.

Примеры предпочтительных путей введения и препаратов описаны далее:

Нутрицевтики предпочтительно вводят перорально, например, либо в виде капсул, таблеток, эмульсий, порошков, жидкостей, в форме любого пищевого продукта или напитка, либо в качестве компонента пищевого продукта или напитка, например, пищевой добавки. Нутрицевтик можно принимать отдельно или в смеси как минимум с одним другим ингредиентом. Сам по себе нутрицевтик или его смесь как минимум с одним другим ингредиентом можно принимать отдельно или смешивая с пищевыми продуктами или напитками.

Препарат для перорального введения нутрицевтика, а также фармацевтической композиции, положительного по углеводу микроорганизма или его фракции, либо содержащих их препаратов, может представлять собой любую перорально приемлемую лекарственную форму или эффективное количество нутрицевтика, фармацевтической композиции, положительного по углеводу микроорганизма или его фракции, либо содержащих их препаратов, включая, но не ограничиваясь ими, таблетки, капсулы, наночастицы, эмульсии или водные суспензии, коллоидные растворы и растворы. Обычно используемые носители для таблеток включают лактозу и кукурузный крахмал. Смазывающие вещества, такие как стеарат магния, также обычно добавляют к таблеткам. Для перорального введения в виде капсул применимые растворители включают лактозу и обезвоженный кукурузный крахмал. При пероральном введении водных суспензий или эмульсий активный ингредиент можно суспендировать или растворять в масляной фазе в сочетании с эмульгирующими или суспендирующими средствами. При желании, можно добавлять определенные подсластители, ароматизаторы или красящие вещества.

Препарат для перорального введения может представлять собой любую приемлемую перорально лекарственную форму или эффективное количество нутрицевтика, фармацевтической композиции, положительного по углеводу микроорганизма или его фракции, либо содержащих их препаратов, включая, но не ограничиваясь ими, таблетки, капсулы, наночастицы, эмульсии или водные суспензии, коллоидные растворы и растворы. Обычно используемые носители для таблеток включают лактозу и кукурузный крахмал. Смазывающие вещества, такие как стеарат магния, также обычно добавляют к таблеткам. Для перорального введения в виде капсул применимые растворители включают лактозу и обезвоженный кукурузный крахмал. При пероральном введении водных суспензий или эмульсий активный ингредиент можно суспендировать или растворять в масляной фазе в сочетании с эмульгирующими или суспендирующими средствами. При желании, можно добавлять определенные подсластители, ароматизаторы или красящие вещества.

Препарат по настоящему изобретению можно вводить перорально или парентерально. Парентеральное введение включает инъекции, такие как капельное вливание, подкожные, внутривенные или внутримышечные инъекции, трансдермальное нанесение с мазью или трансдермальным лекарственным средством, а также ректальное применение с суппозиторием. Если композицию вводят перорально, ее можно изготавливать в форме твердой капсулы, мягкой капсулы, гранулы, порошка, мелких гранул, пилюли, пастилки, системы для постепенной доставки активного ингредиента, жидкости и суспензии. Препарат может быть легко выполнен общепринятыми в фармацевтической области способами.

Способ введения и лекарственные формы, безусловно, будут влиять на терапевтические количества соединений или композиций, которые являются желательными и эффективными для данного лекарственного применения. Если препарат по настоящему изобретению получают в форме для перорального введения, композицию можно получать с использованием общепринятых в обычной медицине фармацевтических ингредиентов, таких как наполнитель, разбавитель, связывающее вещество, дезинтегратор, сурфактант, разбавители, такие как смазывающее вещество и эксципиент. Конкретные примеры общепринятых ингредиентов включают реципиенты, такие как молочный сахар, белый сахар, хлорид натрия, глюкоза, мочевина, крахмал, карбонат кальция, каолин, кристаллическая целлюлоза и кремниевая кислота; связывающие вещества, такие как вода, этанол, сироп лекарственных растений, виноградный сахар, крахмальная жидкость, раствор желатина, карбоксиметилцеллюлоза, шеллак, метилцеллюлоза, фосфат калия и поливинилпирролидон; дезинтеграторы, такие как обезвоженный крахмал, альгинат натрия, порошок агара, порошок ламинарии, бикарбонат натрия, карбонат кальция, полиоксиэтиленовый эфир сорбита и жирной кислоты, лаурилсульфат натрия, моноглицерид стеариновой кислоты, крахмал и молочный сахар; ингибиторы разложения, такие как белый сахар, стеариновая кислота, масло какао и гидрогенизированное масло; способствующие абсорбции вещества, такие как четвертичная аммониевая соль и лаурилсульфат натрия; увлажняющие средства, такие как глицерин и крахмал; абсорбенты, такие как крахмал, молочный сахар, каолин, бентонит и коллоидная кремниевая кислота; а также смазывающие вещества, такие как очищенный тальк и стеарат. При необходимости препарат дополнительно включает краситель, консервант, ароматизирующее вкусовое вещество и подсластитель. Подходящие фармацевтически приемлемые соли хорошо известны специалистам в данной области и включают основные соли неорганических и органических кислот, таких как соляная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, уксусная кислота, яблочная кислота, винная кислота, лимонная кислота, молочная кислота, щавелевая кислота, янтарная кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, бензойная кислота, салициловая кислота, фенилуксусная кислота и миндальная кислота. Кроме того, фармацевтически приемлемые соли соединений по настоящему изобретению могут также быть образованы с фармацевтически приемлемым катионом, например, если замещающая группа содержит карбоксильный фрагмент. Подходящие фармацевтически приемлемые катионы хорошо известны специалистам в данной области и включают катионы щелочные, щелочноземельные, аммония и четвертичного аммония.

В предпочтительном варианте осуществления путь введения фармацевтической композиции выбирают из группы, состоящей из внутривенной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, внутримышечной инъекции, внутричерепной инъекции, внутриопухолевой инъекции, внутриэпителиальной инъекции, чрескожной доставки, введения через пищевод, внутрибрюшного введения, внутриаппендикулярного введения, внутриартериального введения, внутрисуставного введения, внутрибронхиального введения, внутриротового введения, внутрикапсулярного введения, внутрисердечного введения, внутрихрящевого введения, внутриполостного введения, внутриголовного введения, введения в толстый кишечник, внутрикожного введения, внутрикистозного введения, интрадермального введения, внутрипротокового введения, интрадуоденального введения, внутрипучкового введения, введения в жировую клетчатку, введения в межпетлевое пространство, внутрищелевого введения, внутрижелудочного введения, внутригландулярного введения, внутрипеченочного введения, внутрикишечного введения, внутрипластинчатого введения, введения в пораженные ткани, внутрисвязочного введения, внутриязычного введения, введения в молочную железу, интрамедуллярного введения, интраменингеального введения, интрамиокардиального введения, интраназального введения, внутриглазного введения, интраоперационного введения, внутриротового введения, внутрикостного введения, внутриовариального введения, интрапанкреатического введения, внутритеменного введения, внутритазового введения, интраперикардиального введения, внутрипахового введения, внутрибрюшинного введения, внутриплацентарного введения, внутриплеврального введения, введения в варолиев мост, введения в предстательную железу, внутрилегочного введения, внутрипозвоночного введения, интраректального введения, внутрипочечного введения, интрасклерального введения, внутримошоночного введения, внутрисегментального введения, введения в область турецкого седла, интраспинального введения, внутриселезеночного введения, надчревного введения, интрастромального введения, внутрисуставного введения, внутриплюсневого введения, внутрисеменникового введения, внутригрудного введения, интратонзиллярного введения, внутритрахеального введения, внутритрубного введения, введения в барабанную полость, внутримочеточникого введения, внутриуретрального введения, внутриматочного введения, внутривлагалищного введения, внутрисосудистого введения, интравентрикулярного введения, внутрипозвоночного введения, внутрипузырного введения и введения в стекловидное тело.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения примеры путей введения (= создание контакта) включают парентеральное, например, внутривенное, внутрикожное, подкожное, пероральное, трансдермальное (местное), трансмукозальное, внутрибрюшинное, интраназальное, ректальное, внутрикишечное и пероральное введение.

Препарат по настоящему изобретению может включать фармацевтически приемлемые соли содержащихся в нем компонентов. Фармацевтически приемлемые соли включают кислотно-аддитивные соли, которые образованы с неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, винная, миндальная и тому подобные. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, могут также быть получены из неорганических оснований, таких как, например, натрий, калий, аммоний, кальций или гидроокись железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламино-, 2-этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и тому подобные. Физиологически приемлемые носители хорошо известны специалистам в данной области. Примерами жидких носителей являются стерильные водные растворы, которые не содержат других материалов кроме активных ингредиентов и воды или содержат буфер, такой как фосфат натрия при физиологическом значении pH, физиологический раствор, или оба вместе, например фосфатно-солевой буферный раствор. Кроме того, водные носители могут содержать более одной буферной соли, а также соли, такие как хлориды натрия и калия, декстрозу, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и другие растворенные вещества. Жидкие композиции могут также содержать жидкие фазы помимо, и за исключением, воды. Примерами таких дополнительных жидких фаз являются глицерин, растительные масла, такие как хлопковое масло, органические сложные эфиры, такие как этилолеат, и водно-масляные эмульсии. Препарат содержит положительный по углеводу микроорганизм, его лизат или фракцию по настоящему изобретению, как правило, в количестве как минимум 0,1 весовой процент положительного по углеводу микроорганизма, его лизата или фракции, от общего веса композиции. Весовой процент представляет собой отношение по весу положительного по углеводу микроорганизма, его лизата или фракции, ко всей композиции. Таким образом, например, 0,1 весовой процент составляет 0,1 грамм положительного по углеводу микроорганизма, его лизата или фракции, на 100 граммов всей композиции.

Термин «фармацевтически приемлемая соль» означает такие соли соединений, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства свободных оснований и которые получают реакцией с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, салициловая кислота и тому подобные. Фармацевтически приемлемые соли включают, например, соли щелочных металлов, таких как натрий и калий, соли щелочноземельных металлов и соли аммония.

Препарат, содержащий в качестве активного ингредиента положительный по углеводу микроорганизм, его лизат или фракцию, может находиться в форме для перорального использования, например в форме таблеток, пастилок, таблеток для рассасывания, водных или масляных суспензий, дисперсных порошков или гранул, эмульсий, твердых или мягких капсул, либо сиропов или эликсиров. Композиции, предназначенные для перорального применения, можно получать любым способом, известным в данной области, для производства фармацевтических композиций, и такие композиции могут содержать одно или более средств, выбираемых из группы, состоящей из подсластителей, ароматизаторов, красящих веществ и консервантов, для получения фармацевтически отточенных и приятных на вкус препаратов. Таблетки содержат активный ингредиент с добавлением нетоксичных фармацевтически приемлемых эксципиентов, которые подходят для производства таблеток. Данные эксципиенты могут представлять собой, например, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза, фосфат кальция или фосфат натрия; гранулирующие и дезинтегрирующие средства, например кукурузный крахмал или альгиновая кислота; связывающие вещества, например крахмал, желатин или камедь, и смазывающие вещества, например, стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Таблетки могут быть без покрытия или с покрытием, нанесенным известными способами, для замедления дезинтеграции и абсорбции в желудочно-кишечном тракте и тем самым обеспечения длительного действия на протяжении большего периода времени. Например, можно использовать продлевающий время действия материал, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат. Покрытие можно также наносить методами, описанными в патентах США № № 4256108, 4166452 и 4265874, для получения осмотических терапевтических таблеток для контролируемого высвобождения. Препарат по настоящему изобретению может также, или альтернативно, содержать одно или более лекарственных средств, которые могут быть связаны с модулирующим средством, либо могут находиться в составе композиции в свободном состоянии. Практически любое лекарственное средство можно вводить в сочетании с модулирующим средством, как описано в данном документе, для различных целей, как описано ниже. Примеры типов лекарственных средств, которые можно вводить с модулирующим средством, включают анальгетики, анестетики, антиангинальные препараты, противогрибковые средства, антибиотики, противораковые средства (например, таксол или митомицин C), противовоспалительные средства (например, ибупрофен и индометацин), противоглистные препараты, антидепрессанты, антидоты, противорвотные средства, антигистаминные препараты, антигипертензивные средства, противомалярийные средства, средства против микротрубочек (например, колхицин или алкалоид барвинка), средства против мигрени, противомикробные препараты, нейролептики, антипиретики, антисептики, противосигнальные средства (например, ингибиторы протеинкиназы C или ингибиторы межклеточной мобилизации кальция), противоартритные препараты, антитромбиновые средства, противотуберкулезные препараты, средства против кашля, антивирусные препараты, подавляющие аппетит средства, кардиоактивные лекарственные средства, лекарственные средства против химической зависимости, слабительные средства, химиотерапевтические средства, коронарные, церебральные или периферические вазодилятаторы, контрацептивные средства, депрессанты, диуретики, отхаркивающие средства, ростовые факторы, гормональные средства, снотворные средства, иммуносуппрессорные средства, антагонисты наркотических аналгетиков, парасимпатомиметики, седативные препараты, стимуляторы, симпатомиметики, токсины (например, холерный токсин), транквилизаторы и средства против инфекции мочевых путей.

Препараты для перорального применения можно также предлагать в виде твердых желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем, например карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, либо в виде мягких желатиновых капсул, где активный ингредиент смешан с водой или масляной средой, например арахисовым маслом, жидким парафином или оливковым маслом. Водные суспензии содержат активные материалы в смеси с эксципиентами, подходящими для производства водных суспензий. Такие эксципиенты представляют собой суспендирующие средства, например натрий-карбоксиметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, альгинат натрия, поливинилпирролидон, тракагантовую камедь и гуммиарабик; диспергирующие или смачивающие средства могут представлять собой природные фосфатиды, например лецитин, или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например полиоксиэтиленстеарат, или продукты конденсации этиленоксида с высокомолекулярными алифатическими спиртами, например гептадекаэтиленоксицетанол, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, полученными из жирных кислот и гексита, такого как полиоксиэтилен, с неполными эфирами, полученными из жирных кислот и ангидридов гексита, например полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат. Водные суспензии могут также содержать один или более консервантов, например этил или н-пропил, п-гидроксибензоат, один или более красящих средств, один или более ароматизаторов и один или более подсластителей, таких как сахароза или сахарин.

Масляные суспензии можно получать суспендированием активного ингредиента в растительном масле, например, в арахисовом масле, оливковом масле, сезамовом масле или кокосовом масле, либо в минеральном масле, таком как жидкий парафин. Масляные суспензии могут содержать загуститель, например, пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. Подсластители, такие как те, что указаны выше, и ароматизаторы можно добавлять для получения приятного на вкус перорального препарата. Данные композиции можно сохранять от порчи путем добавления антиоксиданта, такого как аскорбиновая кислота.

Диспергируемые порошки и гранулы, подходящие для получения водной суспензии путем добавления воды, содержат активный ингредиент в смеси с диспергирующим или смачивающим средством, суспендирующим средством и одним или большим количеством консервантов. Подходящие диспергирующие или смачивающие средства и суспендирующие средства приведены в качестве примеров, например, могут присутствовать также подсластители, ароматизаторы и красящие вещества.

Препарат по изобретению может также находиться в форме эмульсий типа «масло в воде». Масляная фаза может представлять собой растительное масло, например, оливковое масло или арахисовое масло, либо минеральное масло, например жидкий парафин, или их смеси. Подходящие эмульгирующие средства могут представлять собой природные камеди, например гуммиарабик или трагакантовую камедь, природные фосфатиды, например, соевый лецитин, и сложные эфиры или неполные эфиры, полученные из жирных кислот и ангидридов гексита, например сорбитанмоноолеат, и продукты конденсации указанных неполных эфиров с этиленоксидом, например полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат. Эмульсии могут также содержать подсластители и ароматизаторы.

Сиропы и эликсиры могут содержать в составе подсластители, например, глицерин, пропиленгликоль, сорбит или сахарозу. Такие препараты могут также содержать уменьшающее раздражение средство, консервант, а также ароматизаторы и красящие вещества. Фармацевтические композиции могут находиться в форме стерильной инъецируемой водной или масляной суспензии. Такая суспензия может быть составлена известными в данной области способами с применением тех подходящих диспергирующих или смачивающих средств и суспендирующих средств, которые перечислены выше. Стерильный инъецируемый препарат может также находиться в стерильном инъецируемом растворе или суспензии в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, в виде раствора в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых основ и растворителей, которые можно использовать, находятся вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные нелетучие масла обычно используют в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели можно использовать любое легкое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, находят применение для получения инъекционных препаратов. Уровни доз порядка от 0,01 мг до примерно 140 мг на килограмм массы тела в сутки применяют для лечения вышеуказанных состояний (от примерно 2,5 мг до примерно 7 г на пациента в сутки). Например, положительную по углеводному эпитопу опухоль можно эффективно лечить введением от примерно 0,01 до 50 мг соединения на килограмм массы тела в сутки (от примерно 0,5 мг до примерно 3,5 г на пациента в сутки). Количество активного ингредиента, которое можно объединять с материалами носителя для получения единичной лекарственной формы, будет варьировать в зависимости от подвергающегося лечению хозяина и конкретного способа введения. Например, препарат, предназначенный для перорального введения людям, может варьировать от примерно 5 до примерно 95% от всей композиции. Стандартные лекарственные формы, как правило, содержат от примерно 1 мг до примерно 10 г активного ингредиента. Однако следует понимать, что определенный уровень доз для любого конкретного пациента будет зависеть от множества факторов, включая активность определенного используемого компонента, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола, времени введения в пищевом режиме, пути введения, скорости выведения, сочетания лекарственных средств и тяжести конкретного излечиваемого заболевания. Эффективное количество соединений в дозе по изобретению будет варьировать в зависимости от факторов, включая конкретное соединение, токсичность и ингибиторную активность, излечиваемое состояние, а также от того, вводят ли соединение отдельно или совместно с другими видами терапии. Как правило, эффективное количество в дозе находится в диапазоне от примерно 0,0001 мг/кг до 1500 мг/кг, более предпочтительно 1-1000 мг/кг, более предпочтительно от примерно 1 до 150 мг/кг массы тела и наиболее предпочтительно примерно 50-100 мг/кг массы тела.

Изобретение также относится к способу или методу лечения вышеупомянутых патологических состояний. Соединения по настоящему изобретению можно вводить профилактически или терапевтически, предпочтительно в количестве, которое является эффективным против упомянутых заболеваний, теплокровному животному, например человеку, нуждающемуся в таком лечении, при этом соединения используют в форме фармацевтических композиций или нутрицевтиков.

Состав фармацевтически приемлемых эксципиентов и растворов носителей хорошо известен специалистам в данной области, как и разработка подходящих режимов дозирования и лечения для использования конкретных композиций, описанных в данном документе, во множестве режимов лечения, включая, например, пероральное, парентеральное, внутривенное, интраназальное и внутримышечное введение, а также препарат.

A. Пероральная доставка

В определенных приложениях препараты, раскрытые в данном документе, можно доставлять путем перорального введения человеку или животному. В связи с этим такие композиции могут иметь в составе инертный разбавитель или усвояемый съедобный наполнитель, либо их можно заключать в твердые и мягкие желатиновые капсулы, либо их можно прессовать в таблетки, либо их можно непосредственно включать в пищевые продукты диетического рациона.

Активные соединения можно даже соединять с эксципиентами и применять в форме проглатываемых таблеток, таблеток для рассасывания, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и тому подобного. Таблетки, пастилки, пилюли, капсулы и тому подобные могут также содержать следующее: связывающее вещество, такое как трагакантовая камедь, гуммиарабик, кукурузный крахмал или желатин; эксципиенты, такие как дикальцийфосфат; дезинтегрирующее средство, такое как кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота и тому подобное; смазывающее вещество, такое как стеарат магния; и можно добавлять подсластитель, такой как сахароза, лактоза, или сахарин, либо ароматизатор, такой как перечная мята, винтергреневое масло, или вишневая отдушка. Когда стандартной лекарственной формой является капсула, она может содержать в дополнение к материалам вышеперечисленных типов жидкий наполнитель. Различные другие вещества могут присутствовать в качестве покрытий или для того, чтобы каким-либо образом модифицировать физическое состояние лекарственной формы. Например, таблетки, пилюли или капсулы могут быть покрыты шеллаком, сахаром, либо и тем, и другим. Сироп эликсира может содержать активное соединение сахарозу в качестве подсластителя, метил- и пропилпарабены в качестве консервантов, краситель и ароматизатор, такой как вишневый или апельсиновый ароматизатор. Разумеется, любой материал, используемый при изготовлении любой стандартной лекарственной формы, должен быть фармацевтически чистым и в основном нетоксичным в используемых количествах. Кроме того, активные соединения можно вводить в препараты и составы с замедленным высвобождением.

Как правило, такие препараты могут содержать как минимум примерно 0,1% активного соединения или более, хотя процентное содержание активного ингредиента(ов), несомненно, может варьировать и целесообразным образом составлять от примерно 1 или 2% до примерно 60 или 70%, или более от веса или объема всего препарата. Естественно, количество активного соединения(ний) в каждой терапевтически пригодной композиции можно подбирать таким образом, что соответствующая доза будет получена в любой единичной дозе данного соединения. Такие факторы, как растворимость, биодоступность, биологическое время полужизни, путь введения, срок хранения продукта, наряду с другими фармакологическими факторами, будут предусмотрены специалистом в области изготовления таких фармацевтических препаратов, и по этой причине, могут оказаться желательными самые различные дозировки и схемы лечения.

Для перорального введения композиции по настоящему изобретению можно соединять альтернативно с одним или большим количеством эксципиентов в форме ополаскивателя полости рта, средства для ухода за зубами, таблеток для рассасывания, спрея для ротовой полости или подъязычного перорального препарата. Например, ополаскиватель полости рта можно получать, вводя активный ингредиент в необходимом количестве в подходящий растворитель, такой как раствор бората натрия (раствор Добелла). Альтернативно активный ингредиент можно вводить в раствор для полости рта, такой как содержащий борат натрия, глицерин и бикарбонат калия, либо диспергировать в средстве для ухода за зубами, либо в терапевтически эффективном количестве/эффективной дозе добавлять к композиции, которая может включать воду, связывающие вещества, абразивные материалы, ароматизаторы, пенообразующие средства и увлажнители. Альтернативно композиции можно придать форму таблетки или раствора, которые можно поместить под язык или каким-либо иным способом растворять во рту.

B. Инъекционная доставка

В определенных обстоятельствах желательно доставлять препараты, раскрытые в данном документе, парентеральным, внутривенным, внутримышечным или даже внутрибрюшинным путем. Растворы активных соединений в виде свободного основания или фармакологически приемлемых солей можно готовить в воде, подходящим образом смешанной с сурфактантом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Коллоидные растворы также можно готовить в глицерине, жидких полиэтиленгликолях, а также в их смесях и маслах. При обычных условиях хранения и применения эти препараты содержат консервант для предотвращения роста микроорганизмов.

Фармацевтические формы, подходящие для применения в виде инъекций, включают стерильные водные растворы или коллоидные растворы и стерильные порошки для изготовления по индивидуальному рецепту стерильных растворов и коллоидных растворов для инъекций. Во всех случаях данная форма должна быть стерильной и быть жидкой до такой степени, чтобы существовала возможность легкого применения с помощью шприца. Она должна быть стабильной в условиях производства и хранения и должна быть защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Носитель может являться растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль, а также жидкий полиэтиленгликоль, и тому подобное), их подходящими смесями и/или растительными маслами. Необходимую текучесть можно обеспечивать, например, применяя покрытие, такое как лецитин, сохраняя необходимый размер частиц в случае коллоидного раствора и применяя сурфактанты. Предохранению от действия микроорганизмов могут способствовать различные бактерицидные и противогрибковые средства, например парабены, хлорбутанол, фенол, сорбиновая кислота, тимеросал и тому подобные. Во многих случаях предпочтительно будет включать изотонические средства, например сахара или хлорид натрия. Более длительная абсорбция инъекционных композиций может быть вызвана применением в составе композиций средств, замедляющих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.

Для парентерального введения, например, в водном растворе данный раствор, если необходимо, должен быть соответствующим образом забуферен, а жидкий разбавитель следует сначала сделать изотоническим с помощью подходящей соли или глюкозы. Данные конкретные водные растворы особенно подходят для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшного введения. В связи с этим стерильная водная среда, которую можно использовать, известна специалистам в данной области, в свете настоящего описания. Например, одну дозу можно растворять в 1 мл изотонического раствора NaCl и либо добавлять к 1000 мл жидкости для введения в подкожную клетчатку, либо инъецировать в место предполагаемой инфузии. В зависимости от состояния подвергающегося лечению субъекта, в дозировку обязательно вносят необходимые изменения. В любом случае соответствующую дозу для конкретного субъекта определяет человек, ответственный за введение лекарственного средства. Кроме того, для введения человеку препараты должны отвечать стандартам стерильности, пирогенности и общим требованиям по безопасности и чистоте, согласно требованиям национальных или региональных бюро стандартов для биопрепаратов.

Стерильные растворы для инъекций получают, вводя активные соединения в необходимом количестве в подходящий растворитель с целым рядом других ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости с последующей стерилизацией фильтрованием. Как правило, коллоидные растворы получают, вводя различные стерилизованные активные ингредиенты в стерильную основу, содержащую основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из тех, что перечислены выше. В случае стерильных порошков для изготовления стерильных растворов для инъекций, предпочтительными способами изготовления являются высушивание в вакууме и лиофилизация, в результате чего получают порошок активного ингредиента, плюс любой дополнительный желательный ингредиент из его раствора, заранее профильтрованного стерильно.

Раскрытые в данном документе композиции можно составлять в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемые соли включают кислотно-аддитивные соли (образованные свободными аминогруппами белка) и те, которые образуются с неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислоты, либо с такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и тому подобные. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, можно также получать из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и тому подобные. После получения препарата растворы вводят способом, совместимым с дозированным препаратом, и в том количестве, которое терапевтически эффективно. Препараты легко вводить в виде целого ряда лекарственных форм, таких как растворы для инъекций, высвобождающие лекарственное средство капсулы и тому подобные.

Используемый в данном документе термин «носитель» включает любой и все растворители, дисперсионные среды, основы, покрытия, разбавители, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и замедляющие абсорбцию средства, буферные растворы, растворы-носители, суспензии, коллоидные растворы и тому подобное. Использование таких сред и средств для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. За исключением случаев, когда любая традиционная среда или средство несовместимы с активным ингредиентом, их использование в терапевтических композициях предусмотрено. Дополнительные активные ингредиенты также можно вводить в композиции.

Словосочетание «фармацевтически приемлемые» относится к молекулярным субстанциям и композициям, которые не вызывают аллергических или аналогичных нежелательных реакций, когда их вводят человеку. Получение водной композиции, содержащей белок в качестве активного ингредиента, хорошо изучено в данной области. Как правило, такие композиции получают в виде инъекционных препаратов, либо в виде жидких растворов, либо суспензий; можно также получать твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Препарат также можно эмульгировать.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу индукции или усиления специфичного к углеводному эпитопу иммунного ответа, и/или способу профилактики или лечения положительного по углеводному эпитопу заболевания, при этом указанный нутрицевтик, указанную фармацевтическую композицию, указанный положительный по углеводу микроорганизм или указанную его фракцию, либо указанные содержащие их препараты вводят здоровому индивидууму.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу индукции или усиления специфичного к углеводному эпитопу иммунного ответа, и/или способу профилактики или лечения положительного по углеводному эпитопу заболевания, при этом указанный нутрицевтик, указанную фармацевтическую композицию, указанный положительный по углеводу микроорганизм или указанную его фракцию, либо содержащие их препараты вводят индивидууму, страдающему заболеванием, связанным с углеводным эпитопом, раком, опухолью, носителю как минимум одной опухолевой или раковой клетки, либо как минимум одного метастаза.

В частности, нутрицевтик, фармацевтическую композицию, положительный по углеводу микроорганизм или его фракцию, либо содержащие их препараты можно использовать, чтобы индуцировать иммунный ответ против рака, опухоли, раковой клетки или раковых клеток, либо метастаза, производного от них, индуцировать иммунный ответ, который служит иммунной защитой против опухолевых клеток, рака, опухоли, раковой клетки или раковых клеток, либо метастаза, производного от них, лечить опухоль или рак, метастазы и/или метастазирование, и/или уменьшать или предотвращать возникновение, распространение или метастазирование рака, опухоли, раковой клетки или раковых клеток, либо метастаза, производного от них, у здоровых индивидуумов или пациентов, соответственно, каждый из которых предпочтительно является носителем как минимум одной положительной по углеводному эпитопу опухолевой клетки, выбранной из форм рака, опухолей, либо раковых или опухолевых заболеваний, как описано ниже или где-либо еще в данном документе. Например, лечение направлено против первичных опухолей или форм рака, минимальных остаточных опухолевых или раковых заболеваний, рецидивов и/или метастазов, либо их составляющих. Лечение опухолей или форм рака также можно осуществлять в виде адъювантной терапии. Нутрицевтик, фармацевтическую композицию, положительный по углеводу микроорганизм или его фракцию, либо содержащие их препараты можно также использовать для профилактики положительных по углеводу опухолевых заболеваний, опухолей или опухолевых клеток. Например, профилактическое применение направлено на профилактику опухолей и метастазов. Эти противоопухолевые средства вводят в соответствующей форме согласно широко известным способам, или так, как описано где-либо еще в данном документе. Предпочтительным вариантом является инъекция или введение этих противоопухолевых средств или лекарств перорально, внутривенно, местно в полости тела, например, внутрибрюшинно, интраректально, в желудочно-кишечный тракт, местно, например, непосредственно в опухоль, в органы или лимфатическиие сосуды (интранодально), но также подкожно, внутрикожно или наружно на кожу, и внутримышечно. В предпочтительном способе типы введения можно также комбинировать, и в этом случае введение можно осуществлять в разные дни курса лечения, либо в один день лечения, как подробно описано где-либо еще в данном документе. По данному изобретению также можно сочетать два или более патентоспособных нутрицевтиков, фармацевтических композиций, положительных по углеводу микроорганизмов или их фракций, либо содержащих их препаратов, а также комбинировать что-либо одно из них или их сочетание, с одним или большим количеством лекарственных средств или способов лечения опухолей, таких как терапия антителами, химиотерапия или лучевая терапия, с соответствующим введением или применением, одновременно, либо в разное время.

Рак, опухоль, опухолевые клетки, раковые клетки или метастазы, производные от них, выбирают из группы раковых заболеваний или опухолевых заболеваний зоны уха-горла-носа, легких, средостения, желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы, гинекологической системы, молочной железы, эндокринной системы; сарком кожи, костей и мягких тканей; мезотелиом; меланом; новообразований центральной нервной системы; раковых заболеваний или опухолевых заболеваний детей младшего возраста; лимфом; лейкозов; паранеопластических синдромов; метастазов с неизвестной первичной опухолью (CUP синдром); карциноматозов брюшины; связанных с иммуносупрессией злокачественных новообразований и/или опухолевых метастазов.

Более конкретно, рак, опухоль, опухолевые клетки, раковые клетки или метастазы, производные от них, могут включать следующие типы рака: аденокарциному молочной железы, простаты и толстой кишки; все формы рака легких, начиная с бронхов; рак костного мозга, меланому, гепатому, нейробластому; папиллому; апудому, хористому, бранхиогенный рак; злокачественный карциноидный синдром; карциноидное заболевание сердца, карциному (например, карциносаркому Уолкера, базалиому, плоскоклеточную карциному, карциному Брауна-Пирс, протоковую карциному, опухоль Эрлиха, преинвазивный рак, карциному при раке-2, карциному из клеток Меркеля, рак слизистой оболочки, немелкоклеточную бронхиальную карциному, овсяно-клеточный рак, папиллярную карциному, фиброзную карциному, бронхо-альвеолярную карциному, бронхиальную карциному, плоскоклеточную карциному и переходно-клеточную карциному); гистиоцитарное функциональное расстройство; лейкоз (например, применительно к B-клеточному лейкозу, смешанно-клеточному лейкозу, нуль-клеточному лейкозу, Т-клеточному лейкозу, хроническому Т-клеточному лейкозу, HTLV-II-связанному лейкозу, острому лимфоцитарному лейкозу, хроническому лимфоцитарному лейкозу, базофильному лейкозу и миелолейкозу); злокачественный гистиоцитоз, лимфогранулематоз, неходжкинскую лимфому, одиночную плазмоцитому; ретикулоэндотелиоз, хондробластому; хондрому, хондросаркому; фиброму; фибросаркому; гигантоклеточную опухоль; гистиоцитому; липому; липосаркому; лейкосаркому; мезотелиому; миксому; миксосаркому; остеому; остеосаркому; саркому Юинга; синовиому; аденофиброму; аденолимфому; карциносаркому, хордому, краниофарингиому, дисгерминому, гамартому; мезенхимому; мезонефрому, миосаркому, амелобластому, цементому; одонтому; тератому; тимому, хориобластому; аденокарциному, аденому; холангиому; холестеатому; цилиндрому; цистаденокарциному, кистозную аденому; фолликулоидный рак яичника; гинандробластому; гидраденому; аденому островковой ткани; опухоль из лейдиговских клеток; папиллому; опухоль из клеток Сертоли, текаклеточную опухоль, лейомиому; лейомиосаркому; миобластому; миому; миосаркому; рабдомиому; рабдомиосаркому; эпендимому; ганглионеврому, глиому; медуллобластому, менингиому; неврилеммому; нейробластому; нейроэпителиому, нейрофиброму, неврому, параганглиому, нехромаффинную параганглиому, ангиокератому, ангиолимфоидную гиперплазию с эозинофилией; склеротизирующую ангиому; ангиоматоз; гломангиому; гемангиоэндотелиому; гемангиому; гемангиоперицитому, гемангиосаркому; лимфангиому, лимфангиомиому, лимфангиосаркому; пинеалому; филлоидную саркому; гемангиосаркому; лимфангиосаркому; миксосаркому, карциному яичника; саркому (например, экспериментальную саркому Юинга, саркому Капоши и тучноклеточную саркому); новообразования (например, новообразования кости, новообразования молочной железы, новообразования пищеварительной системы, колоректальные новообразования, новообразования печени, новообразования поджелудочной железы, новообразования гипофиза, новообразования семенника, новообразования глазницы, новообразования головы и шеи, новообразования центральной нервной системы, новообразования органа слуха, почечной лоханки, дыхательного тракта и мочеполового тракта); нейрофиброматоз и цервикальную плоскоклеточную дисплазию и/или метастазы, производные от любого из них.

В предпочтительном варианте осуществления рак, опухоль, опухолевые клетки, раковые клетки или метастазы, производные от них, выбирают из группы раковых заболеваний или опухолевых заболеваний, включающих как минимум одну клетку или предпочтительно значительное число клеток, или более предпочтительно большинство опухолевых клеток, положительных по углеводному эпитопу, по определению согласно данному изобретению, выбранных из группы: опухолей зоны уха-горла-носа, включая опухоли внутренней части носа, придаточной полости носа, носоглотки, губ, ротовой полости, ротовой части глотки, гортани, гортанной части глотки, уха, слюнных желез и параганглиомы, опухолей легких, включая немелкоклеточные бронхиальные карциномы, мелкоклеточные бронхиальные карциномы, опухолей средостения, опухолей желудочно-кишечного тракта, включая опухоли пищевода, желудка, поджелудочной железы, печени, желчного пузыря и желчных протоков, карциномы тонкого кишечника, толстого кишечника и прямой кишки, а также анальные карциномы, опухолей мочеполовой системы, включая опухоли почек, мочеточника, мочевого пузыря, предстательной железы, уретры, пениса и семенников, гинекологических опухолей, включая опухоли шейки матки, влагалища, вульвы, рак матки, злокачественное заболевание трофобластов, карциному яичника, опухоли маточных труб (фаллопиевых труб), опухолей брюшной полости, карцином молочной железы, опухолей эндокринных органов, включая опухоли щитовидной железы, парашитовидной железы, коры надпочечников, опухолей эндокринной поджелудочной железы, карциноидных опухолей и карциноидного синдрома, множественных эндокринных новообразований, сарком костей и мягких тканей, мезотелиом, опухолей кожи, меланом, включая кожную и внутриглазную меланомы, опухолей центральной нервной системы, опухолей детей младшего возраста, включая ретинобластому, опухоли Вильмса, нейрофиброматоза, нейробластомы, семейства опухолей саркомы Юинга, рабдомиосаркомы, лимфом, включая неходжкинскую лимфому, кожную Т-клеточную лимфому, первичные лимфомы центральной нервной системы, лимфогранулематоз, лейкозов, включая острые лейкозы, хронические миелолейкозы и лимфолейкозы, плазмоклеточные новообразования, миелодиспластических синдромов, паранеопластических синдромов, метастазов с неизвестной первичной опухолью (CUP синдром), карциноматоза брюшины, связанных с иммуносупрессией злокачественных новообразований, включая такие относящиеся к СПИДу злокачественные новообразования, как саркома Капоши, связанные со СПИДом лимфомы, связанные со СПИДом лимфомы центральной нервной системы, связанный со СПИДом лимфогранулематоз и связанные со СПИДом аногенитальные опухоли, связанных с трансплантацией злокачественных новообразований, метастазирующих опухолей, включая метастазы мозга, метастазы легких, рак печени, метастазы печени, метастазы кости, плевральные и перикардиальные метастазы и злокачественных асцитов, и/или метастазов, производных от любого из них.

В другом предпочтительном варианте осуществления рак, опухоль, опухолевые клетки, раковые клетки или метастазы, производные от них, выбирают из группы, включающей раковые заболевания или опухолевые заболевания, такие как карциномы молочной железы, желудочно-кишечные опухоли, включая карциномы толстого кишечника, карциномы желудка, карциномы поджелудочной железы, рак толстого кишечника, ранний рак желудка, рак тонкого кишечника, карциномы яичника, карциномы шейки матки, рак легких, рак предстательной железы, светлоклеточный рак, злокачественную меланому и/или рак печени, и/или метастазы, производные от любого из них.

В следующем предпочтительном варианте осуществления рак, опухоль, опухолевые клетки, раковые клетки или метастазы, производные от них, выбирают из группы раковых заболеваний или опухолевых заболеваний, включающих как минимум одну клетку, предпочтительно значительное число клеток или более предпочтительно большинство опухолевых клеток, положительных по углеводному эпитопу, по определению согласно данному изобретению, выбранных из группы карцином молочной железы, желудочно-кишечных опухолей, включая карциномы толстого кишечника, карциномы желудка, карциномы поджелудочной железы, рак толстого кишечника, ранний рак желудка, рак тонкого кишечника, карцином яичника, карцином шейки матки, рака легких, рака предстательной железы, светлоклеточного рака, злокачественной меланомы и/или рака печени, и/или метастазов, производных от любого из них.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу индукции или усиления специфичного к углеводному эпитопу иммунного ответа и/или способу профилактики или лечения положительного по углеводному эпитопу заболевания, рака, опухоли, как минимум одной опухолевой или раковой клетки или как минимум одного метастаза, включающего как минимум одну клетку, положительную по углеводному эпитопу.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу индукции или усиления специфичного к углеводному эпитопу иммунного ответа и/или способу профилактики или лечения положительного по углеводному эпитопу заболевания, где у индивидуума имеется рак, опухоль, как минимум одна опухолевая или раковая клетка или как минимум один метастаз, выбранные из группы раковых заболеваний или опухолевых заболеваний, включающей карциномы молочной железы, желудочно-кишечные опухоли, включая карциномы толстого кишечника, карциномы желудка, карциномы поджелудочной железы, рак толстого кишечника, ранний рак желудка, рак тонкого кишечника, карциномы яичника, карциномы шейки матки, рак легких, рак предстательной железы, светлоклеточный рак, злокачественную меланому и/или рак печени, и/или метастазы, производные от любого из них.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения заболевание, связанное с углеводным эпитопом, или заболевание, положительное по углеводному эпитопу, выбирают из группы, включающей желудочно-кишечные патологии, болезнь Уиппла, артрит, саркоидоз, сепсис или остеорадионекроз.

Желудочно-кишечные патологии предпочтительно выбирают из группы, включающей функциональные расстройства пищеварения и воспалительные заболевания пищеварительного тракта; при этом воспалительные заболевания пищеварительного тракта выбирают из группы, включающей болезнь Крона, илеит и/или язвенный колит, а функциональные расстройства пищеварения выбирают из группы, включающей гастроэзофагеальный рефлюкс, диспепсию, спастический колит и/или функциональную абдоминальную боль. Желудочно-кишечный тракт в контексте данного изобретения состоит из следующих компонентов: рта (полость рта; включает слюнные железы, слизистую оболочку, зубы и язык), глотки, пищевода и кардиального отдела желудка, желудка, который включает антральный отдел желудка и привратник желудка, пищеварительного тракта или кишечника: тонкого кишечника, который имеет три части: двенадцатиперстную кишку, тощую кишку, подвздошную кишку; толстого кишечника, который имеет три части: слепую кишку (червеобразный отросток соединен со слепой кишкой), толстую кишку (восходящую ободочную кишку, поперечную ободочную кишку, нисходящую ободочную кишку и сигмовидный изгиб), прямую кишку, и/или заднего прохода.

Заболевания, связанные с углеводным эпитопом, по смыслу данного изобретения также являются заболеваниями, полностью или частично обусловленными образованием аутоантител и их разрушительным действием на организм в целом или системы органов, т.е. обусловленными аутоагрессией. Можно систематизировать их на группы органоспецифических, промежуточных и/или системных аутоиммунных заболеваний. Предпочтительными органоспецифическими аутоиммунными заболеваниями являются тиреоидит Хашимото, первичная микседема, тиреотоксикоз (базедова болезнь), пернициозная анемия, болезнь Аддисона, злокачественная миастения и/или юношеский диабет. Предпочтительными промежуточными аутоиммунными заболеваниями являются синдром Гудпасчера, аутоиммунная гемолитическая анемия, аутоиммунная лейкопения, идиопатическая тромбоцитопения, обыкновенная пузырчатка, симпатическая офтальмия, первичный цирроз желчных протоков, аутоиммунный гепатит, язвенный колит и/или синдром Шегрена. Предпочтительными системными аутоиммунными заболеваниями являются ревматоидный артрит, ревматическая лихорадка, системная эритематозная волчанка, дерматомиозит/полимиозит, прогрессирующий системный склероз, гранулематоз Вегенера, нодозный панартериит и/или аллергический васкулит. Типичными аутоиммунными заболеваниями являются тиреотоксикоз, гипотиреоидный отек, тиреоидит Хашимото, общая эндокринопатия, пернициозная анемия, хронический гастрит типа A, заболевания одного из или всех кровяных телец (например, аутоиммунная гемолитическая анемия, идиопатическая тромбоцитопения или тромбоцитопатия; идиопатическая лейкопения или агранулоцитоз), обыкновенная пузырчатка и пемфигоид, симпатическая офтальмия и множественные формы увеита, первичный цирроз желчных протоков и печени, а также хронический агрессивный аутоиммунный гепатит, сахарный диабет типа I, болезнь Крона и язвенный колит, синдром Шегрена, болезнь Аддисона, рассеянная красная волчанка и дискоидная форма указанного заболевания, такая как дерматомиозит и склеродерма, ревматоидный артрит (= первичный хронический полиартрит), нефрит клубочковой базальной мембраны. В основе лежит агрессивная иммунная реакция вследствие нарушения механизма иммунной толерантности к собственным детерминантам и снижения активности T-супрессоров (с лимфоцитарным маркером T8), либо избытка T-хелперов (с лимфоцитарным маркером T4) по сравнению с супрессорами; кроме того, образование аутоантигенов возможно, например, из-за того, что белки хозяина связываются с гаптенами (например, лекарственными средствами), из-за того, что онтогенетическая ткань не развивается до того как развивается аутотолерантность, из-за того, что белковые компоненты демаскированы в результате конформационных изменений белков в связи, например, с вирусной или бактериальной инфекцией; а также из-за того, что новые белки образуются в связи с неоплазией.

Септические заболевания по смыслу данного изобретения являются заболеваниями, возникающими вследствие непрерывного или периодического заражения патогенными бактериями и/или их токсинами из очага заболевания и их распространения в лимфатической и кровяной системе, что приводит к общей или местной инфекции.

Сепсис, по смыслу данного изобретения, предпочтительно является раневым сепсисом (флегмона, тромбофлебит, лимфангит), послеродовым сепсисом (в случае послеродовой горячки), отогенным сепсисом (в случае среднего отита), тонзиллогенным сепсисом (в случае ангины, перитонзиллита), холангитическим сепсисом (в случае гнойного холецистита, холангита), пилефлебитным сепсисом (в случае пилефлебита), пупочным сепсисом (в случае омфалита и так далее), сепсисом мочевыводящих путей, а также зубной гранулемой. Сепсис, по смыслу данного изобретения, может быть от острого до крайне острого (скоротечного), подострым (например, в форме затяжного септического эндокардита) или хроническим, и, безусловно, также может быть сепсисом новорожденных.

Вследствие этого, сепсисами, по смыслу данного изобретения, являются все патогенные изменения у пациента, которые можно связать с перемежающейся лихорадкой и ознобом, опухолью селезенки, токсическими реакциями, либо повреждением костного мозга или крови (многоядерный лейкоцитоз, анемия, гемолиз, тромбоцитопения), либо с патогенными реакциями в сердце и вазомоторном нерве (тахикардия, централизация кровообращения, отеки, олигурия; возможно, шок), или в пищеварительном тракте (обезвоживание, обложенный язык, диарея), либо с септической пиемией (пиемия с образованием септического инфаркта и метастатического абсцесса).

По смыслу данного изобретения, предпочтительные заболевания включают: СПИД, акне, альбуминурию (протеинурию), абстинентный алкогольный синдром, аллергии, алопецию (потерю волос), ALS (боковой амиотрофический синдром), болезнь Альцгеймера, старческое перерождение пятна сетчатки, малокровие, талассемию, синдром тревожности, склероз аорты при сибирской язве, окклюзионное поражение артерии, артериосклероз, закупорку артерии, узелковый периартериит, артериовенозную фистулу, астму, дыхательную недостаточность, аутоиммунное заболевание, выпадение межпозвоночного диска, воспаление брюшины, рак поджелудочной железы, мышечную дистрофию Беккера, доброкачественную гиперплазию предстательной железы (BPH), карциному мочевого пузыря, гемофилию, бронхиальную карциному, рак молочной железы, губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (BSE), хламидиоз, хроническую боль, цирроз, сотрясение головного мозга (коммоцию), болезнь Крейцфельда-Якоба, кишечную карциному, кишечный туберкулез, депрессию, несахарный диабет, сахарный диабет, сахарный диабет молодых, диабетическую ретинопатию, мышечную дистрофию Дюшенна, карциному двенадцатиперстной кишки, прогрессирующую мышечную дистрофию, дистрофию, лихорадку Эбола, экзему, эректильную дисфункцию, ожирение, фиброз, рак шейки матки, рак матки, кровоизлияние в мозг, энцефалит, выпадение волос, односторонний паралич, гемолитическую анемию, гемофилию, недержание мочи, аллергию на домашних животных (аллергию на шерсть животных), рак кожи, опоясывающий лишай, сердечный инфаркт, сердечную недостаточность, воспаление клапанов сердца, церебральные метастазы, мозговой инсульт, опухоль мозга, рак семенника, ишемическую болезнь, болезнь Калера (плазмоцитому), детский паралич (полиомиелит), разрежение кости, карциному толстой кишки, контактную экзему, парез, цирроз печени, лейкоз, фиброз легких, рак легких, отек легких, рак лимфатических узлов, (болезнь Ходжкина), лимфогранулематоз, лимфому, бешенство, карциному желудка, менингит, муковисцидоз (кистозный фиброз), рассеянный склероз (MS), инфаркт миокарда, нейродермит, нейрофиброматоз, нейрональные опухоли, рак почки (карциному почечных клеток), остеопороз, карциному поджелудочной железы, пневмонию, полиартрит, полиневропатии, расстройства потенции, прогрессирующий системный склероз (PSS), рак предстательной железы, карциному прямой кишки, плеврит, черепно-мозговую травму, влагалищную карциному, синусит, рак пищевода, тремор, туберкулез, опухолевую боль, ожог/ошпаривание, интоксикации, вирусный менингит, менопаузу, саркому мягких тканей, опухоль мягких тканей, нарушения мозгового кровообращения, опухоли ЦНС.

Для тестирования необходимо проводить исследование со здоровыми добровольцами, при котором определяют титры сывороточных антител против Core-1, используя как минимум один из тестов 1-6 на гуморальный иммунный ответ, определяя существующую продукцию антител против Core-1 перед первым применением нутрицевтика, и предпочтительно для испытаний на людях выбирают добровольцев с низкими или неопределяемыми уровнями антител против Core-1. Таким добровольцам нутрицевтик, содержащий AG6 или MU1, либо плацебо, необходимо давать перорально в течение периода от 3 до 30 недель. Должно быть выполнено пероральное введение как минимум двух различных доз. Иммунные ответы отслеживают, определяя продукцию антител и/или T-клеточный ответ против Core-1 с использованием как минимум одного из тестов 1-6 на гуморальный ответ и/или тестов 1-5 на клеточный иммунный ответ, предварительно и через соответствующие интервалы после начала перорального введения нутрицевтика. Если препарат имеет желательные характеристики, то наблюдается значительное увеличение продукции антител против Core-1 и/или T-клеточного ответа против Core-1 у значительного числа добровольцев из группы добровольцев, принимающих нутрицевтик, по сравнению с титром до начала исследования, по результатам испытаний, которые признавали положительными, если положительный результат давал как минимум один из тестов 1-6 на гуморальный иммунный ответ и/или как минимум один из тестов 1-5 на клеточный иммунный ответ. В группе плацебо увеличение продукции антител или T-клеточного ответа против Core-1 должно наблюдаться менее часто, или в меньшей степени.

Это демонстрирует эффективность данного нутрицевтика для создания у людей иммунного ответа против Core-1, который служит защитой против раковых клеток, положительных по Core-1, для предотвращения, уменьшения распространения положительных по Core-1 опухолей или их метастаза, либо для их лечения.

Для проверки терапевтического потенциала следует проводить исследование на иммунокомпетентных людях-пациентах с раком, имеющих положительные по Core-1 опухоли, которые перенесли хирургическое удаление основной опухоли. Затем определяют титры сывороточных антител против Core-1, используя как минимум один из тестов 1-6 на гуморальный иммунный ответ, для определения существующей продукции антител против Core-1 перед первым применением фармацевтической композиции. Фармацевтическую композицию, содержащую AG6 или MU1, либо плацебо, вводят несколько раз перорально, внутрибрюшинно или внутривенно на протяжении периода от 3 до 70 недель. Вводят как минимум две различные подходящие дозы. Иммунные ответы отслеживают, определяя продукцию антител и/или T-клеточный ответ против Core-1 с использованием как минимум одного из тестов 1-6 на гуморальный ответ и/или тестов 1-5 на клеточный иммунный ответ, и/или отслеживают клинический ответ, определяя время до прогрессирования заболевания, безопухолевую выживаемость и/или объемы опухолей, и/или их локализации, в каждом случае предварительно и через соответствующие интервалы после начала введения фармацевтической композиции. Наблюдается значительное увеличение продукции антител против Core-1 и/или T-клеточного ответа против Core-1 у значительного числа добровольцев из группы, получающей препарат по изобретению, в сравнении с титром до начала исследования, по результатам испытаний, которые признавали положительными, если положительный результат давал как минимум один из тестов 1-6 на гуморальный иммунный ответ и/или как минимум один из тестов 1-5 на клеточный иммунный ответ, и/или в случае частичного или полного клинического ответа, либо продления времени до прогрессирования заболевания, либо времени выживания у значительного числа пациентов, получающих препарат. В группе плацебо увеличение продукции антител или T-клеточного ответа против Core-1 наблюдается менее часто, либо в меньшей степени, и/или не наблюдается вовсе, либо наблюдается значительно более слабый клинический ответ.

Это демонстрирует эффективность данной фармацевтической композиции для создания у людей иммунного ответа против Core-1, который служит защитой против раковых клеток, положительных по Core-1, для предотвращения, уменьшения распространения или возникновения положительных по Core-1 опухолей или их метастаза, либо для их лечения.

Контакт положительного по Core-1 микроорганизма или его фракции с организмом живого существа (человека/животного) может инициировать продукцию антител, связывающих Core-1, антиген Core-1 или положительные по Core-1 опухолевые клетки у значительного числа людей или животных.

Неожиданно оказалось, что антитела против Core-1 могут служить механизмом иммунного надзора за вновь появляющимися раковыми клетками. Еще более неожиданно, что специфичный к Core-1 клеточный иммунный ответ, включающий активацию CD4-положительных Т-клеток Th1-типа и/или активацию CD8-положительных цитотоксических T-клеток, направленных против Core-1 и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, можно вызвать у значительного числа людей или животных.

В исследовании со здоровыми добровольцами титры сывороточных антител против Tn или Lewis-, либо Lewis-Y, можно определять с использованием как минимум одного из тестов 1-6 на гуморальный иммунный ответ, определяя существующую продукцию антител против Tn или Lewis Y перед первым применением нутрицевтика, и для испытаний на людях предпочтительно выбирают добровольцев с неопределяемыми или низкими уровнями антител против Tn или Lewis Y. Таким добровольцам нутрицевтик, содержащий положительный по Tn микроорганизм или положительный по Lewis-Y микроорганизм, либо плацебо, дают перорально на протяжении периода от 3 до 30 недель. Выполняют пероральное введение как минимум двух различных доз. Иммунные ответы отслеживают, определяя продукцию антител и/или T-клеточный ответ против Tn или Lewis Y с использованием как минимум одного из тестов 1-6 на гуморальный ответ и тестов 1-5 на клеточный иммунный ответ, предварительно и через соответствующие интервалы после начала перорального введения нутрицевтика. Для подходящих препаратов должно наблюдаться значительное увеличение продукции антител против Tn или Lewis Y и/или T-клеточного ответа против Tn или Lewis Y, соответственно, у значительного числа добровольцев из группы добровольцев, принимающих нутрицевтик, по сравнению с титром до начала исследования, по результатам испытаний, которые признавали положительными, если положительный результат давал как минимум один из тестов 1-6 на гуморальный иммунный ответ и/или как минимум один из тестов 1-5 на клеточный иммунный ответ. В группе плацебо увеличение продукции антител или T-клеточного ответа против Tn или Lewis Y наблюдают менее часто, или в меньшей степени. Индукция клеточного иммунного ответа характеризуется активацией специфичных к Tn или Lewis Y T-клеток, таких как CD4-положительные Th1-клетки и/или CD8-положительные цитотоксические T-клетки, свидетельствуя об индукции эффективного специфичного к Tn или Lewis Y клеточного иммунного ответа, соответственно.

Это может демонстрировать эффективность данного нутрицевтика для создания у людей иммунного ответа против Tn или Lewis Y, который действует как защита против положительных по Tn или Lewis Y раковых клеток, для предотвращения или уменьшения распространения положительных по Tn или Lewis Y опухолей или их метастаза, либо для их лечения.

Перед первым применением фармацевтической композиции в исследовании на иммунокомпетентных людях-пациентах с раком, страдающих от положительных по Lewis-Y опухолей, определяют титры сывороточных антител против Lewis-Y, используя как минимум один из тестов 1-6 на гуморальный иммунный ответ для определения существующей продукции антител против Lewis-Y.

Пациентов подвергают адъювантному лечению после удаления основной опухоли. Фармацевтическую композицию, содержащую положительный по Lewis-Y бактериальный штамм, либо плацебо, вводят несколько раз перорально, внутрибрюшинно или внутривенно на протяжении периода от 3 до 70 недель. Вводят как минимум две различные подходящие дозы. Иммунные ответы отслеживают, определяя продукцию антител и/или T-клеточный ответ против Lewis-Y с использованием как минимум одного из тестов 1-6 на гуморальный ответ и/или тестов 1-5 на клеточный иммунный ответ. Клинический ответ отслеживают, определяя время до прогрессирования заболевания, безопухолевую выживаемость и/или объемы опухолей, и/или их локализации, в каждом случае предварительно и через соответствующие интервалы после начала введения фармацевтической композиции. Наблюдается значительное увеличение продукции антител против Lewis-Y и/или T-клеточного ответа против Lewis-Y у значительного числа добровольцев из группы, получающей препарат по изобретению, в сравнении с титром до начала исследования, по результатам испытаний, которые признавали положительными, если положительный результат давал как минимум один из тестов 1-6 на гуморальный иммунный ответ и/или как минимум один из тестов 1-5 на клеточный иммунный ответ, и/или в случае частичного или полного клинического ответа, либо продления времени до прогрессирования заболевания, либо времени выживания у значительного числа пациентов, получающих препарат.

Индуцированный T-клеточный ответ проявляет свойства эффективного специфичного к Lewis-Y клеточного иммунного ответа, включающего активацию CD4-положительных Т-клеток Th1-типа и/или CD8-положительных цитотоксических T-клеток. В группе плацебо увеличение продукции антител или T-клеточного ответа против Lewis-Y наблюдают менее часто, или в меньшей степени, и/или не наблюдают вовсе, либо наблюдают значительно более слабый клинический ответ.

Это демонстрирует эффективность данной фармацевтической композиции для создания у людей иммунного ответа против Lewis-Y, который действует как защита против положительных по Lewis-Y раковых клеток, для предотвращения, уменьшения распространения или возникновения положительных по Lewis-Y опухолей или их метастаза, либо их лечения.

Контакт положительного по Lewis-Y микроорганизма или его фракции с организмом живого существа (человека/животного) может инициировать продукцию антител, связывающих Lewis-Y, антиген Lewis-Y или положительные по Lewis-Y опухолевые клетки, у значительного числа людей или животных. Неожиданно оказалось, что антитела против Lewis-Y служат механизмом иммунного надзора за вновь появляющимися раковыми клетками. Индукция эффективного специфичного к Lewis-Y клеточного иммунного ответа может приводить к уничтожению оставшихся или вновь образуемых положительных по Lewis-Y опухолевых клеток у пациента.

F) НАБОРЫ

Данное изобретение также относится к набору для индукции специфического гуморального и/или клеточного иммунного ответа у человека или животного против углеводного эпитопа или положительных по углеводному эпитопу опухолевых клеток, как описано где-либо еще в данном документе, включающему нутрицевтик или фармацевтический препарат, или положительный по углеводу микроорганизм, либо его фракцию, или содержащие их препараты, которые описаны где-либо еще в данном документе, а также информацию об использовании данного набора.

Изобретение также относится к набору для индукции эффективного специфичного к углеводу клеточного иммунного ответа у человека или животного против углеводного эпитопа или положительных по углеводному эпитопу опухолевых клеток, или болезнетворных клеток, как описано где-либо еще в данном документе, включающему нутрицевтик или фармацевтический препарат, или положительный по углеводу микроорганизм, либо его фракцию, или содержащие их препараты, которые описаны где-либо еще в данном документе, а также информацию об использовании данного набора.

Изобретение также относится к набору для уменьшения или предотвращения возникновения положительной по углеводному эпитопу болезни или опухоли, предпочтительно положительной по углеводному эпитопу опухоли, включающему нутрицевтик или фармацевтический препарат, или положительный по углеводу микроорганизм, либо его фракцию, или препараты на их основе, которые описаны где-либо еще в данном документе, или содержащие их препараты, а также информацию об использовании данного набора.

Изобретение также относится к набору для уменьшения или предотвращения распространения положительного по углеводному эпитопу заболевания, либо метастаза опухоли, предпочтительно положительной по углеводному эпитопу опухоли, включающему нутрицевтик или фармацевтический препарат, или положительный по углеводу микроорганизм, либо его фракцию, или препараты на их основе, которые описаны где-либо еще в данном документе, или содержащие их препараты, а также информацию об использовании данного набора.

Изобретение также относится к набору для лечения положительного по углеводному эпитопу заболевания или опухоли, предпочтительно положительной по углеводному эпитопу опухоли, включающему нутрицевтик или фармацевтический препарат, или положительный по углеводу микроорганизм, либо его фракцию, или препараты на их основе, которые описаны где-либо еще в данном документе, или содержащие их препараты, а также информацию об использовании данного набора.

Изобретение также относится к набору для укрепления иммунной системы или усиления иммунного ответа, как описано где-либо еще в данном документе, включающему нутрицевтик или фармацевтический препарат, или положительный по углеводу микроорганизм, либо его фракцию, или препараты на их основе, которые описаны где-либо еще в данном документе, или содержащие их препараты, а также информацию об использовании данного набора.

Набор может включать информацию (буклет инструкций, адрес в интернете), объясняющий, как комбинировать компоненты набора. Указанная информация может также иметь отношение к терапевтической схеме.

Изобретение также относится к набору для определения иммунного ответа против углеводного эпитопа, включающему как минимум один из описанных в данном документе тестов на иммунный ответ против углеводного эпитопа, предпочтительно как минимум два и более предпочтительно как минимум один тест на гуморальный и один на клеточный иммунный ответ, содержащему как минимум один из материалов, описанных в тесте на соответствующий иммунный ответ, а также информацию об использовании данного набора. В предпочтительном варианте осуществления набор дополнительно содержит соответствующие контроли, и более предпочтительно как минимум что-либо одно из нутрицевтика, или фармацевтического препарата, или положительного по углеводу микроорганизма, либо его фракции, или препарата на их основе, которые описаны где-либо еще в данном документе, или содержащего их препарата.

Изобретение также относится к набору для получения как минимум одной функциональной дендритной клетки против углеводного эпитопа, включающему нутрицевтик или фармацевтический препарат, или положительный по углеводу микроорганизм, либо его фракцию, или содержащие их препараты, а также информацию об использовании данного набора.

В предпочтительном варианте осуществления набор для получения как минимум одной функциональной дендритной клетки против углеводного эпитопа дополнительно содержит незрелые дендритные клетки, происходящие из линии дендритных клеток, такой как, но не ограничиваясь ими, MUTZ-3 или Nemod-DC.

Изобретение также относится к набору для получения как минимум одной активированной T-клетки, T-клеток, T-клеточного клона или T-клеточной линии против углеводного эпитопа, включающему нутрицевтик или фармацевтический препарат, или положительный по углеводу микроорганизм, либо его фракцию, или препараты на их основе, или содержащие их препараты, а также информацию об использовании данного набора.

Изобретение также относится к набору для выделения положительного по углеводу микроорганизма, либо фракции микроорганизма, содержащего как минимум одну несущую углеводный эпитоп молекулу или структуру, включающему как минимум одно специфичное к углеводному эпитопу антитело или связывающую углевод молекулу, а также информацию об использовании данного набора.

Изобретение также относится к набору для идентификации положительного по углеводу микроорганизма, либо фракции микроорганизма, содержащего как минимум одну несущую углеводный эпитоп молекулу или структуру, включающему как минимум одно специфичное к углеводному эпитопу антитело или связывающую углевод молекулу, а также информацию об использовании данного набора.

Изобретение также относится к набору для идентификации или выделения положительного по углеводу микроорганизма, либо фракции микроорганизма, содержащего как минимум одну несущую углеводный эпитоп молекулу или структуру, или для идентификации соответствующего положительного по углеводу микроорганизма для использования в качестве компонента для нутрицевтиков и фармацевтических композиций по изобретению, включающему как минимум одно специфичное к углеводному эпитопу антитело или связывающую углевод молекулу, а также информацию об использовании данного набора.

В предпочтительном варианте осуществления набор включает как минимум один положительный по углеводу микроорганизм, его лизат или фракцию в качестве положительного контроля.

G) СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ

Изобретение также относится к способу получения антитела или композиции антител, или поликлональной сыворотки, узнающих интересующий углеводный эпитоп, включающему:

(a) создание контакта между нутрицевтиком, фармацевтической композицией, положительным по углеводу микроорганизмом или его фракцией человеком или животным;

(b) индукцию или усиление гуморального иммунного ответа, узнающего углеводный эпитоп и/или положительную по углеводному эпитопу опухолевую клетку;

По одному варианту осуществления на этапе (c) образуется как минимум одна клетка, продуцирующая указанное антитело или композицию антител против углеводного эпитопа. Указанный последний этап (c) можно выполнять различными способами, такими как:

(i) путем иммортализации как минимум одной клетки, продуцирующей антитело против углеводного эпитопа, предпочтительно путем слияния с бессмертной клеточной линией, как происходит в гибридомном методе, либо предпочтительно путем инфекции соответствующим вирусом, таким как вирус Эпштейна-Барра (EBV), либо путем рекомбинантной трансфекции как минимум одним геном, что приводит к иммортализации клеток, таких как E1 из EBV; или

(ii) путем анализа пептидной последовательности как минимум вариабельных областей антитела против углеводного эпитопа, либо как минимум связывающей области антитела против углеводного эпитопа, ответственной за специфичность антитела, и трансформации клеток ДНК, кодирующей данное антитело против углеводного эпитопа в виде полноразмерного антитела любого изотипа, либо его фрагмента, либо слитого белка с фрагментом данного антитела против углеводного эпитопа, либо полноразмерного антитела как минимум с одной другой аминокислотной или полипептидной последовательностью.

Предпочтительными являются клетки, способные стабильно продуцировать антитела, это означает, что клетки можно пассировать на протяжении соответствующего количества циклов для продукции антител, такие как, но не ограничиваясь ими, гибридомные клетки и иным способом иммортализованные клетки, либо рекомбинантные стабильно трансформированные клетки, такие как, но не ограничиваясь ими, CHO, NS0, SP2, Y0, PerC.6, Hec293. Однако временная экспрессия, такая как экспрессия в клетках COS, или Hec293, или в B-клетках, также является вариантом осуществления данного изобретения. Указанное моноклональное антитело против углеводного эпитопа можно выделять из культурального супернатанта. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанную клетку, продуцирующую моноклональное антитело против углеводного эпитопа, получают путем клонирования одиночных клеток.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к нуклеиновой кислоте, такой как ДНК, кодирующей антитело против углеводного эпитопа, моноклональное антитело или его фрагмент.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к антителу против углеводного эпитопа или композиции антител, или поликлональной сыворотке, или моноклональному антителу против углеводного эпитопа, или как минимум одному его фрагменту. В другом варианте осуществления изобретение относится к клетке, продуцирующей антитело против углеводного эпитопа или композицию антител, или как минимум один его фрагмент. В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к моноклональному антителу против углеводного эпитопа, либо его фрагменту, которое является гуманизированным антителом или антителом человека из трансгенной мыши.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к клетке, продуцирующей антитело против углеводного эпитопа или композицию антител, или моноклональное антитело против углеводного эпитопа, или как минимум один его фрагмент, как описано выше.

Указанным антителом против углеводного эпитопа, по смыслу данного изобретения, может являться любое индуцируемое антитело человека или животного, узнающее интересующий углеводный эпитоп, и/или опухолевую клетку, несущую интересующий углеводный эпитоп, предпочтительно такие антитела, которые являются специфичными к углеводному эпитопу антителами с критериями связывания или специфичности, описанными в разделе «Определения» или где-либо еще в данном документе.

Указанное антитело против углеводного эпитопа может иметь формат, такой как IgG, IgM, IgA, IgE, IgD или любой фрагмент, получаемый их них методами, известными специалистам в данной области, такой как, но не ограничиваясь ими, Fab, F(ab)2, одноцепочечные антитела, однодоменные антитела, мультитела, слитые белки с антителом, биспецифические антитела или антитело и гуманизированные или химеризованные антитела.

Любое животное или человека можно приводить в контакт с нутрицевтиком, фармацевтической композицией, положительным по углеводу микроорганизмом и/или его фракцией, предпочтительными являются люди и мыши, крысы, кролики, козы, верблюды, цыплята, хомячки, морские свинки или обезьяны, даже более предпочтительными являются животные, известные специалистам в данной области как особенно подходящие для продукции антител, такие как, но не ограничиваясь ими, кролики, козы, крысы, люди, шимпанзе и мыши - для сыворотки с поликлональными антителами, и те, которые известны специалистам в данной области как особенно подходящие для продукции моноклональных антител, такие как, но не ограничиваясь ими, мыши, крысы, человек, дополнительное предпочтение отдается трансгенным мышам, которые несут как минимум части генов антител человека, и людям.

Приведение в контакт означает любой способ или путь введения, описанный где-либо еще в данном документе, для введения нутрицевтика, фармацевтической композиции, положительного по углеводу микроорганизма и/или его фракции, способных индуцировать гуморальный ответ против интересующего углеводного эпитопа. Для увеличения иммуногенности можно использовать дополнительные адъюванты, которые известны специалистам в данной области. Предпочтительным является пероральное и системное введение, а из последнего - внутривенное, внутрикожное или подкожное, а даже более - внутрибрюшинное введение.

Индукцию гуморального иммунного ответа против интересующего углеводного эпитопа можно проверять в тестах на гуморальный иммунный ответ по данному изобретению, и как минимум один из тестов 1-6 на гуморальный иммунный ответ должен быть положительным, как описано где-либо еще в данном документе, при этом в предпочтительном варианте осуществления указанные антитела, извлеченные из сыворотки, плазмы или фекалий, также включают те, которые извлекают из клеток, продуцирующих антитела против интересующего углеводного эпитопа, таких как B-клетки или иммортализованные B-клетки, либо клетки, рекомбинантно экспрессирующие антитела против углеводного эпитопа. Данные антитела можно извлекать различными способами, известными специалистам в данной области, в предпочтительном варианте осуществления сыворотки крови, либо фракции сывороток, либо сыворотка или фракция сыворотки, предварительно истощенные против соответствующих антигенов, таких как микробные антигены, отрицательные по интересующему углеводному эпитопу, предпочтительно микроорганизм, отрицательный по интересующему углеводному эпитопу, либо антитела из продуцирующей антитела клетки, такой как те, что описаны выше, в форме цельных или разделенных на фракции клеточных супенатантов, либо очищенные антитела используют в качестве указанных антител, извлеченных из сыворотки, плазмы или фекалий, как минимум в одном из тестов 1-6 на гуморальный иммунитет.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Нутрицевтик

Согласно настоящему изобретению термин «нутрицевтик» означает любой пищевой продукт, композицию пищевых продуктов или препарат, которые можно принимать перорально человеку или животному, как, например, но не ограничиваясь ими, пищевые продукты, кормовые добавки, пищевые добавки, диетические добавки, лечебные продукты питания или корма, медицинские продукты питания или корма, зондовые продукты питания, зондовые клинические корма, корма или пищевые продукты для оздоровительного применения, пищевые продукты для специального диетического применения, специальные продукты здорового питания или функциональные пищевые продукты, которые можно употреблять перорально в различных формах, таких как, но не ограничиваясь ими, капсулы, таблетки, эмульсии, порошки, жидкости, а также в форме любой пищи или напитков, либо их составляющих. В особых случаях нутрицевтик можно принимать парентерально (парентеральное питание). Нутрицевтик можно давать отдельно либо в смеси как минимум с одним иным ингредиентом. Нутрицевтик в отдельности либо в смеси как минимум с одним иным ингредиентом можно давать либо отдельно, либо смешивая с едой или напитком. Термин нутрицевтик также означает любой пищевой продукт, напиток, капсулу, таблетку, эмульсию, порошок или жидкость.

Фармацевтическая композиция

Согласно настоящему изобретению термин «фармацевтическая композиция» означает любую композицию, которую можно использовать в качестве лекарственного средства или фармацевтического препарата, или биопрепарата, либо компонента лекарственного средства или фармацевтического препарата, или биопрепарата.

Положительный по углеводу микроорганизм

Согласно настоящему изобретению термин «положительный по углеводу микроорганизм» означает любой микроорганизм, который узнается и вследствие этого связывается при контакте как минимум с одной связывающей углевод молекулой, специфически узнающей углеводный эпитоп (как определено где-либо еще в данном документе), обычно присутствующий на молекуле из клетки человека или животного. Предпочтительно такое связывание может быть ингибировано мягкой периодатной обработкой и/или посредством частичного или полного химического или ферментативного удаления или изменения углеводного эпитопа или углеводной структуры, включающей углеводный эпитоп, и/или посредством ингибирования связывания связывающей углевод молекулы соответствующими количествами другой связывающей углевод молекулы, узнающей указанный углеводный эпитоп, и/или посредством ингибирования связывания связывающей углевод молекулы соответствующими количествами углеводного эпитопа или молекулы, смеси молекул, или клетки, содержащих указанный углеводный эпитоп, при инкубации с микроорганизмом в процессе исследований по связыванию со связывающей углевод молекулой. Также термин «положительный по углеводу микроорганизм» охватывает микроорганизмы, у которых интересующий углеводный эпитоп экспонируется только после химической или ферментативной обработки, такой как, например, периодатная обработка. Вследствие этого, указанный микроорганизм узнается, а потому связывается при контакте как минимум с соответствующей связывающей углевод молекулой после указанной обработки.

Положительный по углеводу микроорганизм может являться любым микроорганизмом, таким как, но не ограничиваясь ими, бактерии, цианобактерии, эубактерии, водоросли, грибы (высшие грибы, дрожжи, головня, плесневые грибы и так далее), вирусы и простейшие, предпочтительными являются бактериальные микроорганизмы, такие как, но не ограничиваясь ими, микроорганизмы, выделенные из почвы, из растений, животных, людей или иных высших живых организмов, таких как кошки, собаки, свиньи, коровы, козы, кролики, мыши, шимпанзе. В предпочтительном варианте осуществления положительный по углеводу микроорганизм является микроорганизмом, происходящим из желудочно-кишечного тракта человека.

Связывающая углевод молекула

Согласно настоящему изобретению термин «связывающая углевод молекула» означает молекулу, которая узнает определенную углеводную структуру или которая связывает свой эпитоп в зависимости от определенного углевода, такую как, но не ограничиваясь ими, специфичные к углеводу моноклональные и поликлональные антитела, лектины и селектины и/или молекулы, производные от них. Предпочтительно указанная связывающая углевод молекула специфически узнает углеводный эпитоп, присутствующий на клетке человека или животного, такой как, например, опухолевый маркер. С помощью соответствующих связывающих углевод молекул, которые являются специфическими для «человеческого» углеводного эпитопа, можно выделять положительный по углеводу микроорганизм, несущий структуру, которая идентична или имитирует интересующий углеводный эпитоп, как можно определять по связыванию указанной связывающей углевод молекулы, которая предпочтительно является антителом. Примеры подходящих связывающих углевод молекул описаны, например, в таблице 2.

Указанное специфичное к углеводу антитело может являться полноразмерным антителом любого животного или человека, таким как антитело мыши, крысы, человека, верблюда, гуманизированное или химерное IgM, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgD, либо любым фрагментом антитела, при условии, что он обладает специфичностью связывания или зависимостью от углевода, таким как Fab, F(ab)₂, одноцепочечное Fv, либо однодоменные антитела. Такие антитела могут также содержать как минимум одну дополнительную аминокислоту или мутации, или полипептидные последовательности, такие как таг-метки, линкеры или домены мультимеризации, и они также могут происходить из иных, чем животные, источников, таких как растения и таких как выборки из библиотек синтетических антител с использованием, например, фагового дисплея или рибосомного дисплея, или путем рекомбинантного конструирования.

Углеводный эпитоп

Согласно настоящему изобретению термин «углеводный эпитоп» означает структуру, которая связывается при контакте связывающей углевод молекулой.

Вследствие этого, указанный углеводный эпитоп может соответствовать углеводной части, связываемой указанной связывающей углевод молекулой, либо углеводный эпитоп может включать углеводную часть, связываемую связывающей углевод молекулой. Для дополнительного разъяснения, например, но не ограничиваясь ими, (i) указанный углеводный эпитоп может соответствовать тетрасахариду Lewis Y, все четыре углеводные единицы которого необходимы для связывания связывающей углевод молекулой моноклонального антитела A70-C/C8, или указанный углеводный эпитоп также является Lewis Y, содержащим трисахарид H-типа 2, что является минимальным требованием для специфичности связывания связывающей углевод молекулой моноклонального антитела A46-B/B10, и которое также связывает тетрасахарид Lewis Y, и/или (ii) указанный углеводный эпитоп соответствует углеводной части, связываемой связывающей углевод молекулой, но присоединяется иначе, например, помимо прочего, бета-связь вместо альфа-связи, или наоборот, или связь через другой углеводный атом.

Термин углеводный эпитоп может также означать углеводный антиген, который может являться таким же, как углеводный эпитоп, или быть любой структурой, включающей углеводный эпитоп, описанный где-либо еще в данном документе, в дополнение, например, к пептидной части/фрагменту.

Углеводный эпитоп может состоять из углеводных структур или структур, имитирующих углеводы, таких как полипептиды, пептиды, липиды, или углеводы, или их сочетания, с химической структурой, отличной от углевода, но имеющей конформационную структуру, которую могут узнавать связывающие углевод молекулы по данному изобретению и вследствие этого имеющие иммунохимически сходные или идентичные свойства.

Углеводный эпитоп может быть присоединен к другим биологическим молекулам или являться их частью, например, но не ограничиваясь ими, полисахариды, пептидогликаны, гликопротеины, гликопептиды, гликолипиды, липополисахариды, гликозаминогликаны, капсулярные полисахариды или O-антигены.

Углеводный эпитоп может быть также присоединен через различные линкеры и различные связующие звенья к природным или синтетическим носителям, таким как полиакриламид (в данном документе также называемый PAA), или другим молекулам, таким как материалы хроматографического слоя (например, сефароза), биотин или белки, такие как бычий сывороточный альбумин (BSA), овальбумин (Ova), гемоцианин лимфы улитки (KLH), токсины, анатоксины, T-хелперные эпитопы.

Углеводный эпитоп происходит из, или представляет собой (например, имитирует) углеводный эпитоп из клетки человека или животного и может находиться на клеточной поверхности или внутри клетки, или может секретироваться клеткой человека или животного. Предпочтительно указанный углеводный эпитоп является маркером заболевания, например опухолевым маркером.

Эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ (ECSCIR)

Согласно настоящему изобретению термин «эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ» означает клеточный иммунный ответ, индуцируемый введением иммуногена, содержащего углеводный эпитоп, который предпочтительно обладает следующими особенностями:

(i) иммунный ответ направлен против углеводного эпитопа, это означает, что иммунный ответ является специфичным к углеводу, или зависящим от углевода, или от доступности углевода, при этом данный иммунный ответ против углеводного эпитопа также может представлять собой или включать иммунный ответ против как минимум одной углеводной структуры, углеводного конъюгата и/или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп;

(ii) иммунный ответ является зависимым от MHC;

(iii) иммунный ответ включает иммунный ответ Th1-типа, включающий активацию CD4-положительных T-клеток Th1-типа; и/или

(iv) индукцию CD8-положительных цитотоксических T-клеток,

предпочтительно активацию CD4-положительных T-клеток Th1-типа и индукцию CD8-положительных цитотоксических T-клеток.

Иммунитет Th1-типа характеризуется пролиферацией T-клеток и секрецией цитокинов IFNгамма и/или TNFальфа, а также GM-CSF, которую можно измерять тестами на клеточный иммунный ответ, как раскрыто в данном документе, либо методами, известными специалистам в данной области, такими как, но не ограничиваясь ими, анализы пролиферации, ELISA, ELISpot или проточная цитометрия.

Индукцию CD8-положительных цитотоксических T-клеток можно измерять тестами на клеточный иммунный ответ, как раскрыто в данном документе, либо методами, известными специалистам в данной области.

Специфичность к углеводу клеточного иммунного ответа можно определять путем повторной стимуляции активированных T-клеток углеводным эпитопом, предпочтительно углеводным эпитопом на носителе, отличном от носителя, использованного для примирования T-клеточного ответа, таком как, но не ограничиваясь ими, лизаты или фракции клеток, экспрессирующих углеводный эпитоп, или белки или пептиды, несущие углеводный эпитоп (в случае примирования углеводным эпитопом на микроорганизмах), и/или путем блокирования пролиферации, и/или секреции цитокинов связывающими углевод молекулами, и/или специфическим для класса MHC антителом; предпочтительно специфичность к углеводу клеточного иммунного ответа определяют путем повторной стимуляции активированных T-клеток углеводным эпитопом на носителе, отличном от носителя, использованного для примирования T-клеточного ответа, а также путем блокирования пролиферации или секреции цитокинов связывающими углевод молекулами.

Фракция положительного по углеводу микроорганизма

Согласно настоящему изобретению термин «фракция положительного по углеводу микроорганизма» означает получение или очистку части или частей указанного микроорганизма, таких как, но не ограничиваясь ими, препарат клеточной стенки, препарат оболочки, лизат, липополисахаридный препарат, препарат капсул или препарат капсулярных полисахаридов. Они содержат как минимум один положительный по углеводу компонент указанного положительного по углеводу микроорганизма, который связывается как минимум одной из указанных связывающих углевод молекул, узнающих выбранный углеводный эпитоп и/или антиген. Их можно получать путем предварительной обработки, очистки и/или этапов предварительной обработки и очистки, как минимум, из одного положительного по углеводу микроорганизма. Указанные препараты и/или очищенные препараты можно получать способами, известными специалистам в данной области, такими как те, что описаны выше, или такими как, но не ограничиваясь ими, одноэтапное или последовательное фракционирование клеток, фенол-водные экстракции, экстракции эфиром, расщепление лизоцимом или хроматографические способы, или их сочетания. Кроме того, термин «фракция положительного по углеводу микроорганизма» также охватывает искусственно полученные положительные по углеводу компоненты, которые также обнаружены на положительных по углеводу микроорганизмах по настоящему изобретению. Например, на фигуре 19 представлены некоторые положительные по Core-1 компоненты и, следовательно, фракции положительного по Core-1 микроорганизма (здесь: AG6). Эти положительные по Core-1 компоненты/фракции положительного по Core-1 микроорганизма AG6 также можно получать химическим путем. Положительный по углеводу компонент или фракцию, содержащую положительный по углеводу компонент, определяют путем связывания данной фракции как минимум с одной связывающей углевод молекулой в системах тестирования, таких как, но не ограничиваясь ими, ELISA, проточная цитометрия, иммунофлуоресценция или дот-блоты, которые известны специалистам в данной области. В предпочтительном варианте осуществления изобретения фракцию, содержащую положительный по углеводу компонент, получают аффинной хроматографией с помощью как минимум одного специфичного к углеводу антитела. В предпочтительном варианте осуществления используют один этап предварительной обработки или очистки. В другом предпочтительном варианте осуществления используют сочетание как минимум двух этапов предварительной обработки и/или очистки.

Положительный по углеводу компонент

Согласно настоящему изобретению термин «положительный по углеводу компонент» означает любой компонент положительного по углеводу микроорганизма, который связывается при контакте как минимум одним специфичным к углеводу антителом или связывающей углевод молекулой. Указанный положительный по углеводу компонент включает как минимум одну углеводную структуру, содержащую углеводный эпитоп, как определено или описано где-либо еще в данном документе, который может быть доступен в форме своей природной молекулы, где она является частью микроорганизма, такой как пептид, олигопептид, полипептид, липид, церамид, углевод, липопротеин, полисахарид, олигосахарид, полисахарид, протеогликан или гликопротеин, либо как часть указанной природной молекулы, либо отдельно. Положительный по углеводу компонент можно использовать, по смыслу данного изобретения, в качестве фракции положительного по углеводу микроорганизма как есть, или присоединенным к другим неприродным структурам-носителям, таким как, но не ограничиваясь ими, белки, липиды, химические молекулы, такие как полиакриламид. Предпочтительно его используют в природной форме или в виде части указанной природной молекулы. Положительный по углеводу компонент может содержать один или разные типы углеводных цепей с единственным углеводным эпитопом или множественными углеводными эпитопами, либо повторяющиеся блоки указанных структур, и может содержать дополнительные углеводные структуры, либо блоки, либо другие биомолекулярные структуры. Как описано где-либо еще в данном документе, углеводный эпитоп также может представлять собой или содержать структуру, имитирующую углевод, которая является структурой, способной связываться как минимум одним специфичным к углеводу антителом, или связывающей молекулой, и/или может индуцировать иммунный ответ против углевода, предпочтительно гуморальный иммунный ответ против углевода, и более предпочтительно эффективный клеточный иммунный ответ против указанного углевода, и даже более предпочтительно гуморальный иммунный ответ против углевода и эффективный клеточный иммунный ответ против углевода.

Природная молекула

Согласно настоящему изобретению термин «природная молекула» означает любую биологическую молекулу или ее части, которые имеются как минимум у одного живого или мертвого организма (такого как, но не ограничиваясь ими, прион, вирус, микроорганизм, простейшее, бактерия, водоросль, грибок, растение, животное, человек), или продуцируются данным организмом.

Природные молекулы можно использовать в виде целых организмов (таких как микроорганизмы или вирусы), либо можно выделять из природных источников или можно синтезировать в виде точно такой же структуры, как она встречается в природе.

Предпочтительно природные молекулы не являются комбинацией биологических молекул или их частей, которые не встречаются в каком-либо организме в таком сочетании и не присоединены или конъюгированы к природным или синтетическим носителям, таким как белки, пептиды, KLH, OVA, BSA, токсин, анатоксин, T-хелперный эпитоп, биотин, PAA, гранулы, наночастицы или материалы хроматографического слоя.

Без намерения устанавливать ограничения, данное изобретение будет объяснено более детально со ссылкой на следующие примеры.

ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1

Некорневое древо, основанное на однозначно выровненных последовательностях (1248 пар оснований) изолятов AG6, MU1, их ближайших родственных форм и типового штамма E. coli, полученное по методу объединения соседних пар (7).

Фигура 2

2a: Продукты ПЦР штамма LH E. coli, полученные после амплификации с праймером OPL07 - дорожка 1- набор стандартов 1 кб; дорожки 2-11- штаммы LH 2-5, 8, 13-16, 18; дорожка 12 - штамм 32 E. coli DSMZ 8697.

2b: Штаммы MU и AG6, полученные после амплификации с праймером OPA18 - дорожка 1 - набор стандартов 1 кб; дорожки 2-5 - штаммы MU 1, 3-5; дорожка 6 - AB12; дорожка 7 - B. thetaiotaomicron DSMZ 2079; дорожка 8 - B. ovatus DSMZ 1896; дорожка 9 - B. vulgatus DSMZ 1447; дорожка 10 - B. acidifaciens DSMZ 15896; дорожки 11-13 - AG6.

Фигура 3

ELISA с нанесенными бактериальными штаммами AG6, LH2 и MU1 (5×10⁶ бактерий/мл) и специфичными к Core-1 моноклональными антителами Nemod-TF1, Nemod-TF2, а также менее специфичными A68-B/A11 и контрольным антителом A63-B/C2.

Фигура 3a

ELISA с нанесенными бактериальными штаммами Helicobacter pylori NCTC 11637, штаммом E. coli DSMZ 8697 (штамм 32) и штаммом Bacteroides ovatus MU1 (каждый при плотности, соответствующей 10×OD_650нм 0,1) и моноклональными антителами Nemod-TF1 Nemod-TF2 и A68-BA11 (OD_450/630нм минус OD_450/630нм контрольного антитела A63-B/C2).

Фигура 4

SDS-PAGE и вестерн-блоттинг анализы капсулярного препарата штамма AG6

A) Окрашивание альциановым синим SDS-полиакриламидного геля

B) Окрашивание DIG-гликаном вестерн-блота

C) Окрашивание вестерн-блота с помощью Nemod-TF2.

Фигура 5

Обогащение положительных по Core-1 полисахаридов хроматографией с обращенной фазой.

Фигура 6

Последовательность повторяющихся блоков положительного по Core-1 капсулярного полисахарида B. ovatus штамма AG6.

Фигура 7

Структура повторяющихся блоков положительного по Core-1 капсулярного полисахарида B. ovatus AG6 (L-Fuc: L-фукоза, D-Gal: D-галактоза, HexNAc: N-ацетилгексозамин, D-Hex: D-гексоза, OMe: O-метильная группа).

Фигура 8

Структура повторяющихся блоков положительного по Core-1 капсулярного полисахарида B. ovatus AG6 ((L-Fuc: L-фукоза, D-Gal: D-галактоза, HexNAc: N-ацетилгексозамин, D-Hex: D-гексоза, OMe: O-метильная группа).

Фигура 9

Анализ сывороток мышей с помощью теста 1 на гуморальный иммунный ответ.

IgM антитела против AGP и AGP после обработки йодной кислотой определяли методом ELISA в сыворотках мышей, иммунизированных PBS (группа L), отрицательными по Core-1 бактериями (группа I) и положительными по Core-1 бактериями (группа K). Разведение сыворотки 1:200, день 21.

Фигура 10

Сигналы ELISA иммунных сывороток на конъюгаты углевод-PAA.

Среднее значение сигналов ELISA от 4 мышей C3H против PAA-конъюгата Galбета1-3GalNAc альфа1-PAA относительно сигнала ELISA против GlcNAc микроорганизмы и их фракции, индуцирующие специфичный к углеводу клеточный иммунитет, патент № 2460074 1-2Gal 1-3GalNAc альфа -PAA (разведение сывороток 1:100).

Фигура 11 a-e

FACS-анализ сывороток мышей, иммунизированных PBS (группа L), отрицательными по Core-1 бактериями (группа I) и положительными по Core-1 бактериями (AG6, группа K) на 21 день

А) средняя интенсивность флуоресценции FACS-анализа

В) наложение гистограмм (черный: группа L, синий: группа I, красный: группа K).

На Фигуре 11c представлены результаты теста 1 на гуморальный иммунный ответ с сыворотками мышей, иммунизированных бактериальными штаммами Bacteroides ovatus MU-1, E.coli LH2, E.coli AG3, E.coli 086 DSMZ 8697=32 (представлены средние значения для 4 мышей в группе).

На Фигуре 11d представлены результаты теста 2 на гуморальный иммунный ответ с сыворотками мышей, иммунизированных бактериальными штаммами Bacteroides ovatus MU-1, E.coli LH2, E.coli AG3, E.coli 086 DSMZ 8697=32 (представлены средние значения для 4 мышей в группе).

На Фигуре 11e представлены результаты теста 3 на гуморальный иммунный ответ с сыворотками мышей, иммунизированных бактериальными штаммами Bacteroides ovatus MU-1, E.coli LH2, E.coli AG3, E.coli 086 DSMZ 8697=32 (представлены средние значения для 4 мышей в группе).

Фигура 12

Тест 1 на гуморальный иммунный ответ сывороток безмикробных мышей (контрольная мышь и 3 разные мыши, иммунизированные бактериальным штаммом AG6).

Фигура 13

Тест 1 на гуморальный иммунный ответ сывороток мышей C3H, перорально иммунизированных A) 2×10¹¹ (группа A) или B) 2×10¹⁰ (группа B) пастеризованными бактериями штамма AG6 в дни от 0 до 28.

Представлены сигналы ELISA на 21 день против гликофорина (GP), асиалогликофорина (AGP) и обработанного периодатом AGP (AGP+PJ) отдельных мышей.

Фигура 14

Тест 3 на гуморальный иммунный ответ сывороток мышей C3H, перорально иммунизированных пастеризованными положительными по Core-1 бактериями (штамм AG6). Сыворотки на 0-й день и 28-й день разводили 1:300 и анализировали проточной цитометрией на связывание с клеточными линиями NM-wt и NM-D4.

Фигура 15

Продукция цитокинов T-клетками, вызванная лизатами положительных по Core-1 бактерий (AG6 и MU1), после повторной стимуляции DC, нагруженными положительными по Core-1 MN-D4 (DC/D4) или отрицательными по нему NMwt (DC/wt) клеточными лизатами из линий опухолевых клеток человека. Ингибирование продукции цитокинов посредством преинкубации нагруженных лизатами NM-DC со специфичным к Core-1 антителом (DC/D4+Ak).

A) Продукция GM-CSF T-клетками (CIRT 1).

B) Продукция TNF альфа T-клетками (CIRT 2).

Фигура 16

Тест 2 на клеточный иммунный ответ: Результаты анализа ELISpot продукции IFN-гамма иммунокомпетентными T-клетками после повторной стимуляции DC, нагруженными положительными по Core-1 (DC/D4) или отрицательными по нему (DC/wt) клеточными лизатами из линий опухолевых клеток человека, и ингибирование продукции цитокинов посредством преинкубации нагруженных лизатами NM-DC со специфичным к Core-1 антителом (DC/D4+Ak).

Фигура 17

Тест 3 на клеточный иммунный ответ: анализ T-клеточной пролиферации (WST) на иммунокомпетентных клетках (R) после повторной стимуляции DC, нагруженными положительными по Core-1 (DC/D4) или отрицательными по нему (DC/wt) клеточными лизатами из линий опухолевых клеток человека, и ингибирование пролиферации посредством преинкубации нагруженных лизатами NM-DC со специфичным к Core-1 антителом (DC/D4+Ak).

Фигура 18

Тест 4 на клеточный иммунный ответ: Иммунофлуоресцентный анализ mNM-DC, нагруженных отрицательными по Core-1 (AG3) или положительными по Core-1 (AG6) бактериями, либо отрицательными по Core-1 (NM-wt) или положительными по Core-1 (NM-D4) линиями клеток человека.

Фигура 19

Углеводные структуры положительных по Core-1 компонентов

L-Fuc: L-фукоза, D-GalNAc: N-ацетилгалактозамин, D-Gal: D-галактозамин, Hex: гексоза, HexNAc: N-ацетилгексозамин, OMe: O-метилирование. Такие структуры обнаружены, например, на AG6.

Фигура 20

Скрытый и экспонированный антиген Core-1.

Фигура 21

На Фигуре 21 представлены сигналы ELISA против PAA-конъюгата Gal микроорганизмы и их фракции, индуцирующие специфичный к углеводу клеточный иммунитет, патент № 2460074 1-3 GalNAc а-PAA и PAA-конъюгата Gal 1-3 GlcNAc а-PAA на 21 день. Сыворотки считались положительными, если сигнал на PAA 48 был как минимум на 30% выше, чем сигналы на PAA 43. Учитывая эти критерии, у 5 (A1, A2, A3, B1 и B5) из 6 мышей развился специфичный к Core-1 гуморальный иммунный ответ.

На Фигуре 22 представлена таблица, где выбранные положительные по Core-1 штаммы, а также штаммы, не являющиеся положительными по Core-1, охарактеризованы по их чувствительности в отношении различных антибиотиков.

Фигура 23

Общий анализ теста на клеточный ответ по настоящему изобретению.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Методы и среды анаэробного культивирования

Анаэробные методы, используемые при культивировании бактерий, основаны на описанных ранее способах, суммированных в работе Breznak и Costilow. Среды, приготовленные с цистеин-HCl в качестве восстанавливающего средства, распределяли по пробиркам для анаэробного культивирования (Ochs, Bovenden, Germany) или сывороточным стеклянным бутылям, оставляя приблизительно от половины до трети общего объема сосуда в качестве газового пространства над жидкостью, и закупоривали пробками из бутилкаучука. Растворы, приготовленные без восстанавливающих средств (например, PBS-a), кипятили перед розливом. Перед автоклавированием газовую фазу заменяли на N₂/CO₂ (80/20, объем/объем). Чтобы добиться этого, в бутыли через бутилкаучуковые пробки втыкали иглы и из бутылей откачивали воздух вакуумным насосом (Vacuubrand, Wertheim, Germany). После откачивания воздуха бутыли, которые постоянно встряхивали на протяжении всего процесса, заполняли газовой смесью N₂/CO₂ (80/20, объем/объем). Эту процедуру откачивания и заполнения газом повторяли в общей сложности трижды. Перед введением в сосуды газовую смесь пропускали над горячим палладиевым катализатором для удаления остаточных следов кислорода, присутствующего в газовой смеси. В качестве окислительно-восстановительного индикатора использовали резаурин (1 мг/л).

Среды для посева заливали в ламинарном шкафу и хранили в бескислородных условиях в течение как минимум 24 ч до использования. Это осуществляли либо в находящихся под давлением (1,5×10⁵ Па) анаэростатах с 3,5 л анаэрогена (AnaeroGen) (Oxoid, Basingstoke, England), либо с постоянной продувкой смесью N₂/CO₂/H₂ (80/10/10, объем/объем/объем) воздушного шлюза анаэробной камеры (Don Whitley Scientific, Shipley, England). Манипуляции с образцами проводили в анаэробной камере (MACS variable atmosphere workstation, Don Whitley Scientific, Shipley, England, или Coy Laboratory Products, Grass Lake, USA).

Нестерильные растворы и материалы стерилизовали автоклавированием (121°C, 1,2×10⁵ Па, 15 мин). Термолабильные соединения готовили в виде концентрированных маточных растворов на милли-Q воде, стерильно фильтровали (0,22 мкм, смешанный эфир целлюлозы, Roth, Karlsruhe, Germany) и добавляли к средам в необходимых концентрациях.

Пример 2. Аффинное обогащение положительных по Core-1 микроорганизмов

2.1. Получение Dynabeads^®, покрытых TF1 и TF2

По 100 мкл Dynabeads^® (M-450 крысы против IgM мыши, Dynal Biotech ASA, Oslo, Norway) помещали в каждую надежно закрывающуюся пробирку Эппендорфа на 2 мл (Safe-Lock Eppendorf tubes) (Eppendorf, Hamburg, Germany), дважды промывали 2 мл фосфатно-буферного солевого раствора a (PBS-a: 8,1 г/л NaCl, 0,16 г/л NaH₂PO₄·H₂O, 0,98 г/л Na₂HPO₄·2H₂O, 1 г/л BSA, pH 7,4) с помощью магнитного концентратора частиц Dynal Magnetic Particle Concentrator^®-S (MPC^® -S, Dynal Biotech, Oslo, Norway) и суспендировали в 25 мкл PBS-a. Лиофилизированные супернатанты культуры клеток TF1 или TF2 растворяли в 1 мл воды милли-Q для синтеза (Millipore, Billerica, MA, USA). Растворенные супернатанты культуры клеток TF1 или TF2 (1 мл) добавляли в пробирки с Dynabeads^® и инкубировали в течение 30 мин при 4°C в ротаторе для пробирок (модель 34528, Snijders Scientific, Netherlands). Пробирки помещали в MPC^®-S и оставляли на 3 мин перед удалением жидкости пипеткой. Dynabeads^® ресуспендировали в 2 мл PBS-a, помещали в MPC^®-S и жидкость удаляли пипетированием. Такой этап промывки проводили три раза. Промытые Dynabeads^® суспендировали в их исходном объеме - в 100 мкл PBS-a. Dynabeads^®, полученные таким образом, использовали либо сразу, либо в пределах двух недель со дня получения после трехкратного повторения этапа промывки 2 мл PBS-a.

2.2. Сбор и переработка фекальных образцов для обогащения с помощью Dynabeads^®

Фекальные образцы восьми добровольцев (таблица 3) собирали в перфорированные пластиковые пробирки, сохраняли в бескислородных условиях с помощью AnaeroGen Compact (Oxoid, Basingstoke, England) и хранили при 4°C в течение максимум 4 ч до переработки. Добровольцами являлись здоровые взрослые, не принимавшие антибиотики в течение как минимум 3 месяцев до даты сдачи анализа, и питающиеся как обычно.

Таблица 3 Индивидуальные параметры в момент сбора фекальных образцов
Номер испытуемого	Возраст	Пол
1 - GH	24	жен
2 - RM	26	жен
3 - TC	25	муж
4 - AG	27	жен
5 - AB	37	жен
6 - MU	36	жен
7 - LH	24	жен
8 - CA	50	муж

Фекальные образцы десятикратно (вес/объем) разводили в PBS-b (PBS-b: 8,5 г/л NaCl, 0,3 г/л KH₂PO₄, 0,6 г/л Na₂HPO₄, pH 7,0, содержащий 0,1 г/л пептон и 0,25 г/л цистеин-HCl). Добавляли шесть стерильных стеклянных гранул диаметром 3 мм, и разбавленные образцы гомогенизировали встряхиванием на вортексе с низкими оборотами. Гомогенизированный образец центрифугировали (300×g, 1 мин, 21°C) для осаждения дебриса. Порцию в 200 мкл полученного супернатанта добавляли к 1,8 мл PBS-b, что приводило приблизительно к 100-кратному разведению исходного фекального образца. Данные разведенные образцы промывали один раз 2 мл PBS-b (8000×g, 5 мин, 21°C), и осадки суспендировали в 2 мл PBS-b.

2.3. Способ обогащения с помощью Dynabeads^®

20 мкл из 100-кратно разведенного образца добавляли в пробирку объемом 2 мл, содержащую 180 мкл PBS-a и 5 мкл Dynabeads^®, покрытых антителом либо к TF1, либо к TF2. Пробирки инкубировали в течение 30 мин при 4°C в ротаторе для пробирок. Пробирки помещали в MPC^®-S и оставляли на 3 мин перед удалением максимально возможного количества супернатанта аспирацией с помощью шприца и иглы. Образцы промывали три раза 2 мл PBS-a, вновь удаляя максимально возможное количество супернатанта.

2.4. Посев на селективные и неселективные среды

Промытые образцы суспендировали в 1 мл PBS-b, и аликвоты по 100 мкл рассевали мазком на различные селективные и неселективные среды (таблица 4) и инкубировали в течение 48 ч при 37°C в анаэробной камере.

Таблица 4 Среды, применяемые для посева мазком
Среды	Производитель	Селективные для	Сокращение
Среда де Мана-Рогозы-Шарпа	Merck, Darmstadt, Germany	лактобацилл, молочно-кислых бактерий	MRS
Bifidus-селективная среда	Fluka, St. Gallen Switzerland	бифидобактерий	BSM
Агар K-F Streptococcus	Oxoid	стрептококков	KF
Питательный агар	Oxoid	неселективная	N
Анаэробный агар Шадлера	Oxoid	неселективная	S
Анаэробный агар Вилкинса-Чалгрена	Oxoid	неселективная	WC
Агар с сердечно-мозговым экстрактом	Biomérieux, Marcy l'Etoile, France	неселективная	BHI
Колумбийский агар с 5% крови овцы	Biomérieux	неселективная	CBA
Штамм-агар		неселективная	ST

Плотные среды готовили согласно инструкциям производителя. Состав ST-агара был следующим: 1 г/л протеозопептона, 9 г/л мясного пептона, 3 г/л NaCl, 2 г/л Na₂HPO₄·2H₂0, 3 г/л мясного экстракта, 4 г/л дрожжевого экстракта, 6 г/л D(+)-глюкозы, 0,5 мл/л Tween-80, 0,25 г/л цистеин-HCl, 1 мг/л резазурин, 0,1 г/л MgSO₄ ·7H₂O, 5 мг/л FeSO₄·7H₂ O, 0,5 г/л, 3,4 мг/л MnSO₄·2H₂O, 1,5 г/л бактериологического агара, pH 7,0.

Для субъектов 1-4 колонии от одной процедуры обогащения выбирали для скрининга методом ELISA. Для субъектов 5-8 процедуру обогащения с помощью Dynabeads^® повторяли дважды следующим образом: после 48 ч инкубации колонии соскабливали с чашек, суспендировали в PBS-b в пределах стандартов мутности МакФарланда от 3 до 5 (получали как в (13)). Как и прежде, аликвоту в 20 мкл этой суспензии добавляли в 180 мкл PBS-a. Процедуры обогащения и посева проводили в общей сложности три раза, как описано ранее.

Фекальные образцы следующих четырех субъектов (5 AB, 6 MU, 7 LH и 8 CA) обогащали по положительным по Core-1 бактериям. Процедуру обогащения немного модифицировали в том, что данное обогащение в общей сложности проводили три раза. То есть колонии, полученные после первичного выделения, соскабливали с чашек и подвергали дальнейшему обогащению. Таким образом было получено шестьдесят новых изолятов.

Пример 3. Идентификация изолятов

3.1. Биохимическая

Бактерии идентифицировали с помощью системы VITEK (Biomérieux, Marcy l'Etoile, France). Бактерии получали согласно инструкциям производителя и использовали следующие идентификационные карты: ANI-карты для анаэробных изолятов и факультативно анаэробных грамположительных палочек, способных к росту на MRS-бульоне (предполагаемые лактобациллы), GPI-карты для грамположительных изолятов и GNI+-карты для грамотрицательных аэробных изолятов.

Биохимическая идентичность изолятов, полученная с помощью системы VITEK (Biomérieux, Marcy l'Etoile, France), суммирована в таблице 5. Все анаэробные изоляты AG6, MU (1, 3-5) и AB12 принадлежат к группе Bacteroides fragilis, в то время как все аэробные изоляты являются членами Enterobacteriaceae; оба являются грамотрицательными.

Таблица 5 Идентификация выделенных штаммов, основанная на биохимических характеристиках (VITEK)
Штамм	Идентификация	Вероятность
AG6, MU (1, 3-5), AB12	Bacteroides ovatus	82-95%
AG3, LH (2-5, 8, 13-16, 18)	Escherichia coli	89-99%

3.2. Молекулярная (секвенирование)

ДНК экстрагировали с помощью набора Invisorb Genomic DNA Kit III (Invitek, Berlin, Germany), следуя инструкциям производителя для протокола III B, из промытых клеточных осадков, полученных из жидких культур, суспендированных в 1 мл лизисного буфера D. Для амплификации бактериального 16S рибосомального РНК-гена использовали праймеры 27f (5' AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG) и 1492r (5' TAC CTT GTT ACG ACT T) (10).

Каждую ПЦР проводили в тройных повторах, и реакционная смесь (50 мкл) содержала: 50 мМ KCl, 20 мМ Tris-HCl, 1 мМ MgCl₂, по 0,25 мМ каждого dNTP, по 1 мкМ каждого праймера, 2,5 единицы Taq ДНК-полимеразы (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) и 1 мкл ДНК-матрицы. ПЦР проводили по следующей программе: 94°C в течение 5 мин, 30 циклов при 94°C в течение 1 мин, 55°C в течение 1 мин и 72°C в течение 1 мин и в завершение - 72°C в течение 10 мин. Продукты ПЦР очищали с помощью набора High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Indianapolis, USA), следуя инструкциям производителя. Продукты анализировали электрофорезом в 1% агарозном геле (вес/объем) в Трис-ацетат-EDTA буфере (4,84 г/л Трис, 1,142 мл/л ледяной уксусной кислоты, 0,372 г/л EDTA, pH 8,0). Концентрацию ДНК оценивали с помощью набора низкомолекулярных ДНК-стандартов Low DNA Mass Ladder (Invitrogen, Carlsbad, USA).

Для секвенирования авторы изобретения использовали либо праймер 27f, 338f (5' GCT GCC TCC CGT AGG AGT) (2), 338r (5' ACT CCT ACG GGA GGC AGC), 968f (5' AAC GCG AAG AAC CTT AC) (14), либо 1492r. Реакции секвенирования проводили с помощью набора DYEnamic микроорганизмы и их фракции, индуцирующие специфичный к углеводу клеточный иммунитет, патент № 2460074 ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Amersham Biosciences, Little Chalfont, England), следуя инструкциям производителя. Продукты секвенирования анализировали с помощью системы MegaBACE 1000 System (Molecular Dynamics, Sunnyvale, USA). Последовательности соединяли и подгоняли вручную с помощью подпрограммы ContigExpress пакета программ Vector NTI Suite 9.0.0 (Invitrogen, Carlsbad, USA). Затем их выравнивали с высокогомологичными последовательностями (92% сходства или более) с помощью подпрограммы BLAST Национального центра биотехнологической информации (NCBI) (1). Процент сходства рассчитывали по однозначно выровненным последовательностям с помощью подпрограммы Sequence Identity Matrix пакетов программ Bioedit software, версия 5.0.9 или Similarity Matrix, версия 1.1 проекта баз данных по рибосомам (Ribosomal Database Project). Результаты секвенирования подтверждали сравнением с последовательностями, полученными от провайдера сервиса секвенирования гена 16S рРНК (AMODIA, Braunschweig, Germany).

Идентичность изолятов представлена в таблице 6, а некорневое филогенетическое древо на основе последовательностей изолятов AG6, MU1, их ближайших родственных форм и штамма E. coli типа ATCC 11755 представлено на фигуре 1.

Таблица 6 Идентификация выделенных штаммов на основании однозначно выровненных последовательностей генов 16S рРНК с помощью подпрограммы Similarity Matrix, версия 1.1 проекта баз данных по рибосомам (5)
Штамм	Идентичность	Сходство (%)	Со штаммом	Входящий номер
AG6	Bacteroides ovatus Bacteroides thetaiotaomicron	98,2 97,1	ATCC 8483T ATCC 29148T	X83952 L16489
MU1	Bacteroides ovatus Bacteroides thetaiotaomicron	98,0 97,1	ATCC 8483T ATCC 29148T	X83952 L16489
AG3	Escherichia coli	99,5	k12MG1655	AE000460
GH1	Lactobacillus paracasei sp. paracasei L paracasei sp. tolerans	99,4 99,4	JCM 8130T JCM 1171T	D79212 D16550
96	Staphylococcus warneri Staphylococcus pasteuri	99,2 99,0	ATCC 27836T ATCC 51129T	L37603 AF041361
TC7	Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus zeae	99,6 98,7	JCM 1136T ATCC 15820	D16552 D86516

3.3. Случайным образом амплифицированные полиморфные ДНК (RAPD)

Некоторые положительные по Core-1 изоляты, полученные с помощью повторной процедуры обогащения с использованием Dynabead^®, выглядят очень сходно по своей клеточной и колониальной морфологии, несмотря на то, что выделены из разных сред. Штаммы также были очень сходны в отношении своих биохимических профилей, полученных с помощью системы VITEK. Возникает вопрос, являются ли выделенные бактерии идентичными штаммами. RAPD представляет собой метод, не требующий информации по последовательностям, который можно использовать, чтобы различать штаммы. Вкратце, общую геномную ДНК амплифицируют ПЦР с праймером длиной 10 пар оснований в условиях пониженной жесткости так, что случайные последовательности ДНК амплифицируются по признаку гомологичных праймеру последовательностей, присутствующих в целевой ДНК. Полученные в результате продукты ПЦР можно разделять электрофорезом в агарозном геле, и итоговую картину можно сравнить между штаммами. Итоговые картины распределения полос для всех штаммов LH были аналогичны для пяти использованных RAPD-праймеров (OPL07, M13, OPX14, OPA16, OPA18). Данная картина явно отличается от таковой для штамма DSMZ 8697 E. coli (фигура 2a), штамма, который, как сообщалось, обладает активностью, связанной с группой крови B. Штаммы MU также выглядят очень похоже (фигура 2b); однако их характер распределения полос явно отличается от такового для других штаммов Bacteroides , включая AG6. По-видимому, один положительный по Core-1 штамм от каждого положительного донора многократно обогащался в процессе выделения. Выделенные штаммы отличались между индивидуумами.

Пример 4. Наращивание и фиксация бактерий для скрининга на основе ELISA

Хорошо разделенные колонии случайным образом отбирали с чашек с селективным и неселективным агаром и повторно трижды пересеивали штрихом на неселективные среды. Единичные колонии отбирали и инокулировали в ST (как и раньше, исключая агар), WC или MRS бульоны, в зависимости от того, какой обеспечивал наилучший рост, и выращивали в течение ночи при 37°C. Данные культуры инокулировали (1%) в 300 мл свежего ST, WC или MRS бульона и выращивали в течение ночи при 37°C. Клетки осаждали (8000×g, 15 мин, 4°C) и ресуспендировали в 10 мл PBS-c (8 г/л NaCl, 0,2 г/л KCl, 1,44 г/л Na₂HPO₄, 0,24 г/л KH₂PO₄) (12). Эту суспензию фиксировали от 3 до 4 ч при 4°C, добавляя 30 мл 4% раствора параформальдегида (PFA) (приготовленного согласно (8)) в PBS-c. Затем образцы промывали 40 мл PBS-c (8000×g, 15 мин, 4°C) и осадки суспендировали в 15 мл PBS-c, после чего добавляли равный объем 96% ледяного этанола. Образцы хранили при -20°C до анализа.

Чистоту культур проверяли, сравнивая клеточную морфологию, а также поведение при окрашивании по методу Грама. Культуры рассеивали аэробно на CBA для определения их способности расти в присутствии кислорода и для проверки отсутствия аэробных примесей.

Пример 5. Поддерживание изолятов

Замороженные посевные материалы поддерживали в пробирках Microbank (MAST Diagnostica, Reinfeld, Germany), следуя инструкциям производителя, и хранили при -80°C. Рабочие посевные материалы поддерживали в WC, ST или MRS бульоне. Их пересеивали каждые 14 дней. Чистоту культур определяли путем наблюдения за поведением при окрашивании по методу Грама, клеточной морфологией и путем периодического сравнения морфологий колоний, посеянных штрихом на чашки с CBA, как в аэробных, так и в анаэробных условиях.

Пример 6. Наращивание, фиксация и лиофилизация бактерий для экспериментов на животных

Для использования в экспериментах на животных бактерии выращивали и фиксировали, как описано в секции 3, со следующими модификациями: первоначальный объем культуры достигал примерно 4 л. Перед фиксацией бактерии один раз промывали 100 мл PBS-b (8000×g, 15 мин, 4°C) и ресуспендировали в минимально возможном объеме PBS-b. Эту суспензию разделяли на две равные порции: одну - для фиксации (6.1), другую - для лиофилизации (6.3).

6.1. Фиксация

Порцию для фиксации промывали (8000×g, 15 мин, 4°C) и ресуспендировали в 30 мл PBS-c. Эту суспензию добавляли к 90 мл раствора 4% PFA в PBS-c и фиксировали в течение 3-4 ч при 4°C. Для лучшего удаления PFA образцы три раза промывали 120 мл PBS-c (8000×g, 15 мин, 4°C). Клеточные осадки суспендировали в 45 мл PBS-c, с последующим добавлением равного объема 96% ледяного этанола. Образцы хранили при -20°C.

Перед введением животным фиксированные бактерии лиофилизировали в стерильных условиях в пробирках Lid_Bac (Eppendorf, Hamburg, Germany) для испарения этанола. Чтобы убедиться в нежизнеспособности фиксированных бактерий, их инокулировали (1%) в WC бульон, высевали на CBA и контролировали отсутствие роста в течение периода в одну неделю.

6.2. Пастеризация

Бактериальные суспензии дважды промывали в PBS и ресуспендировали в малом объеме PBS. Бактериальные суспензии инкубировали при 72°C в течение 30 мин. В качестве контроля успешной инактивации бактерии инкубировали в соответствующей культуральной среде, как описано в примере 4.

6.3. Лиофилизация

Порцию для лиофилизации добавляли к равному объему 24% стерильно профильтрованной сахарозы и разделяли на аликвоты по 300 мкл в пробирки на 2 мл Lid_Bac. Эти аликвоты мгновенно замораживали в жидком азоте, выдерживали в течение 1 ч и лиофилизировали (Alpha 2-4, Christ, Osterode, Germany), поместив их в заранее охлажденные до -80°C штативы. После лиофилизации крышки пробирок закрывали и их хранили при 4°C, применяя газогенераторную систему Anaerocult^® C mini (Merck, Darmstadt, Germany) с добавлением оранжевого силикагеля (Roth, Karlsruhe, Germany) в качестве высушивающего средства.

6.4. Подсчет препаратов бактерий

Общие числа клеток в фиксированных и лиофилизированных бактериальных препаратах определяли с помощью счетной камеры Тома глубиной 0,01 мм (LO-Laboroptik, Friedrichsdorf, Germany). Для лиофилизированных бактерий колониеобразующие единицы (КОЕ) определяли путем посева 10-кратных серийных разведений ночных культур на WC агар, сразу до и после лиофилизации. Для этого лиофилат растворяли в 300 мкл WC бульона, оставляли на 15 мин, ресуспендировали низкоскоростным перемешиванием на вортексе и серийно разводили. Значение КОЕ лиофилизированных препаратов подсчитывали до и после их применения в экспериментах на животных, чтобы убедиться в их жизнеспособности. Чистоту препаратов проверяли, как описано в секции 4.

Пример 7. Образцы сывороток

Кровь собирали с помощью S-муветной системы (Sarstedt, Nümbrecht, Germany), и сыворотку получали, следуя инструкциям производителя. Образцы сыворотки хранили по аликвотам при -80°C до анализа.

Пример 8. Экстракция фекальных IgA

Фекальные образцы собирали, хранили при -80°C. Фекалии лиофилизировали и регистрировали сухой вес нетто. Все процедуры проводили на льду. Фекальные IgA экстрагировали согласно работе Grewal (6) с некоторыми модификациями. Лиофилизированные образцы (~30 мг) суспендировали в пропорции 15 мкл/мг сухого веса в буфере для экстракции IgA (PBS-Dulbecco (Biochrom, Berlin, Germany) с 1 г/л BSA) с ингибиторами протеаз (5 мкг/мл леупептин (Calbiochem, Merck), 48 мкг/мл 4-(2-аминоэтил)бензолсульфонилфторид (Merck), 1 мкг/мл апротинин, 2 мкг/мл бестатин (Sigma, Steinheim, Germany) и гомогенизировали. Образцы перемешивали на вортексе каждые 10 мин. После инкубационного периода в 1 ч образцы центрифугировали (16000×g, 10 мин, 4°C), и супернатант собирали в новую пробирку. Оставшийся осадок суспендировали в пропорции 10 мкл/мг сухого веса в буфере для экстракции IgA и гомогенизировали. Процедуру экстракции повторяли и полученный супернатант объединяли с супернатантом с первого этапа экстракции. Эти супернатанты центрифугировали (16000×g, 10 мин, 4°C) и полученный супернатант распределяли по новым пробиркам, мгновенно замораживали в жидком азоте и до анализа хранили при -80°C.

Пример 9. Скрининг бактериальных штаммов иммуноферментным анализом

Фиксированные бактерии растворяли в PBS, количество клеток доводили до 1×10⁵, 1×10⁶ , 5×10⁶, 1×10⁷, 1×10⁸ или 5×10⁸ клеток/мл.

Каждую лунку 96-луночного планшета для микротитрования покрывали 50 мкл бактериального раствора в течение ночи при 37°C. Планшеты промывали 3 раза PBS/0,02% Tween-20 (такие же этапы промывки проводили после каждого этапа инкубации). После блокирования планшетов PBS/2% BSA планшеты для ELISA инкубировали с супернатантами гибридомных культур, содержащими различные моноклональные антитела, узнающие Core-1 (Nemod-TF1, Nemod-TF2 или менее специфичные A68/BA11,), либо контрольное антитело (A63-B/C2) в разных разведениях. В качестве вторичного антитела служили конъюгированные с пероксидазой поликлональные антитела козы против иммуноглобулина мыши (Dako P0260). Анализ проявляли, используя TMB в качестве субстрата, реакцию останавливали добавлением 2,5н H₂SO₄ и измеряли экстинкцию при 450/630 нм. Для определения чувствительности к периодатам связывания антител покрытые планшеты для ELISA инкубировали с периодатом натрия перед инкубацией с антителами. Таким образом, планшеты промывали натрий-ацетатным буфером (50 мМ, pH 4,5) в течение 5 мин и затем инкубировали с 10 мМ йодной кислотой в натрий-ацетатном буфере в течение 1 ч в темноте. Планшеты промывали натрий-ацетатным буфером (5 мин) и реакцию останавливали добавлением 50 мМ боргидрида натрия в PBS (30 мин).

Пример результатов такого анализа ELISA приведен на фигурах 3 и 3a.

Пример 10. Получение содержащих Core-1 компонентов бактерий

10.1. Анализ неочищенных капсулярных препаратов при помощи SDS-PAGE и вестерн-блоттинга

Неочищенные капсулярные препараты штамма AG6 получали согласно работе Pantosti et al. (1991, Infect. Immun. 59, 2075-2082).

Капсулярный препарат анализировали при помощи SDS-PAGE и полисахарид в препарате определяли окрашиванием альциановым синим по работе Karlyshev et al. (2001, J. Clin. Microbiol. 39, 279-284), которое выявило целый ряд содержащих углевод полос и высокий процент высокомолекулярных углеводов в препарате (фигура 4A). После проведения вестерн-блоттинга полисахариды выявляли с помощью набора DIG-Glycan Detection Kit (LaRoche Diagnostics), обнаружив интенсивные полосы в районе 37 и 26 кДа (фигура 4B). Содержащие Core-1 полисахариды на вестерн-блоте выявляли с помощью специфичного к Core-1 антитела NEMOD-TF2 (культуральный супернатант), обнаружив положительную по Core-1 полосу в районе 37 кДа (фигура 4C).

10.2. Хроматографическое обогащение положительных по Core-1 полисахаридов

В составе капсулярного препарата штамма AG6 все еще присутствовали примеси из числа липополисахаридов, как показано путем измерения содержания KDO, составившего 11,2 пкмоль/мкг, согласно Haraet et al. (1989, Anal. Biochem. 179, 162-166), а также при помощи SDS-PAGE.

Вследствие этого капсулярные полисахариды и липополисахариды разделяли хроматографией с обращенной фазой на колонке C18 в градиенте смеси пропанол/метанол (см. фигуру 5), согласно Hashimoto et al. (2001, Eur. J. Biochem. 268, 3139-3144). Полисахариды элюировали градиентом элюента B (72% пропанол/8% метанол в 0,1 M ацетате аммония pH 4,5). Полисахариды во фракциях выявляли с помощью дот-блота и набора DIG-Glycan-Kit. Core-1 выявляли с помощью специфичных к Core-1 антител Nemod-TF1 и Nemod-TF2. Полисахариды элюировали при концентрациях пропанола 14-19% и 25-43%. Специфичный по Core-1 углевод обнаружили только при 29-29,4% пропанола (RP1) и 39-42% пропанола (RP2), см. фигуру 5, демонстрирующую сильное обогащение положительного по Core-1 полисахарида этим методом.

Положительные по Core-1 фракции использовали для дополнительных хроматографических разделений путем мягкого кислотного гидролиза с последующей DEAE-хроматографией в градиенте 0-0,5 M NaCl согласно Tzianabos et al. (1992, J. Biol. Chem. 267, 18230-18235). Этим методом положительные по Core-1 полисахариды разделяли на три фракции, элюированные при: 0 M NaCl (D1), 0,04 M NaCl (D2) и 0,9-0,17 M NaCl (D3), что приводило к дальнейшему обогащению положительных по Core-1 полисахаридов.

Данным способом по настоящему изобретению очищали капсулярные полисахариды B. ovatus AG6 и данную структуру анализировали масс-спектрометрией. Предпочтительно капсулярные полисахариды B. ovatus AG6 концентрировали фенол-водной экстракцией с последующей эфирной экстракцией, как уже было описано в работе Pantosti et al. 1991. Затем положительный по Core-1 полисахарид концентрировали из неочищенного капсулярного препарата (CPS) хроматографией с обращенной фазой (C18 Synergi 4 микроорганизмы и их фракции, индуцирующие специфичный к углеводу клеточный иммунитет, патент № 2460074 Fusion-RP 80i, 250 мм×10 мм, Phenomenex). Моносахаридные составы неочищенного экстракта капсулярного полисахарида и очищенного положительного по Core-1 полисахарида определяли анализом HPAEC-PAD (анионообменная хроматография с высоким pH с импульсной амперометрической детекцией). И наконец, структуру положительного по Core-1 капсулярного полисахарида анализировали масс-спектрометрией.

10.3. Анализы моносахаридов неочищенного экстракта капсулярного препарата и очищенного капсулярного экстракта B. ovatus AG6

На первом этапе положительный по Core-1 полисахарид неочищенного капсулярного препарата B. ovatus AG6 концентрировали хроматографией с обращенной фазой, как уже описано ранее. Затем выход очистки, а также моносахаридный состав концентрированного положительного по Core-1 полисахарида определяли анализом HPAEC-PAD.

Перед началом анализов моносахаридов полисахаридные экстракты полностью гидролизовали 2 н. трифторуксусной кислотой (TFA) при 100°C в течение 4 ч. Во время TFA-гидролизов происходит потеря ацетильных групп. В связи с этим, моносахариды глюкозамин и галактозамин (GlcNH₂ и GalNH₂ ) невозможно отличать от N-ацетилглюкозамина и N-ацетилгалактозамина (GlcNAc и GalNAc). Моносахариды разделяли анионообменной хроматографией с высоким pH и детектировали импульсной амперометрией, как уже описано ранее. Для идентификации моносахаридов и определения их концентраций использовали внешние и внутренние стандарты моносахаридов.

Пропорциональный моносахаридный состав неочищенного экстракта CPS, который определяли для сравнения LPS и CPS (как было упомянуто ранее), явно отличается от пропорционального моносахаридного состава неочищенного экстракта CPS, определенного для данного сравнения. Оба неочищенных экстракта CPS получали из разных культур B. ovatus AG6, что могло бы служить объяснением упомянутого различия моносахаридных составов.

Выход положительных по Core-1 полисахаридов, концентрированных хроматографией с обращенной фазой, составил 30%. Сравнение пропорциональных моносахаридных составов неочищенных и очищенных капсулярных экстрактов показало повышенное содержание фукозы, GalNAc/GalNH₂, галактозы и глюкозы, принимая во внимание, что глюкоза может быть примесью (таблица 7). Пропорциональный состав рамнозы, GlcNH₂ /GlcNAc и маннозы может быть снижен в результате хроматографии с обращенной фазой (таблица 7). Галактуроновую кислоту и глюкуроновую кислоту, которые являются характерными компонентами капсулярных полисахаридов, невозможно идентифицировать в очищенном положительном по Core-1 полисахаридном экстракте. Это может указывать на то, что B. ovatus AG6 имеет более одного капсулярного полисахарида. Оба капсулярных полисахарида можно отделять друг от друга хроматографией с обращенной фазой. Tzianabos et al. (1992) также описали, что капсула B. fragilis состоит из двух разных полисахаридов.

Таблица 7 Анализы моносахаридов неочищенного капсулярного полисахаридного экстракта (CPS) и положительного по Core-1 полисахаридного экстракта, очищенного хроматографией с обращенной фазой. Пропорциональный моносахаридный состав сопоставлен с общим количеством моносахаридов
Моносахариды	Неочищенный CPS-экстракт (%)	Очищенный CPS-экстракт (%)
Фукоза	9,5	11,4
Рамноза	17,7	3,1
GalNH₂/GalNAc	5,2	14,9
GlcNH₂ /GlcNAc	14	3,5
Галактоза	4,6	6,9
Глюкоза	44,2	50
Манноза	18,2	6,9
Галактуроновая кислота	10	0
Глюкуроновая кислота	0,5	0
Не определены	3	2

Концентрирование фукозы, GalNH ₂/GalNAc и галактозы может служить показателем того, что данные моносахариды являются компонентами повторяющихся блоков положительного по Core-1 полисахарида, в то время как сильно сниженные моносахариды могут являться малыми примесями.

10.4. Структурные анализы положительного по Core-1 полисахарида масс-спектрометрией

Структуру положительного по Core-1 полисахарида анализировали время-пролетной масс-спектрометрией с лазерной ионизацией и десорбцией из матрицы (MALDI-TOF-MS), как уже описано выше, и масс-спектрометрией с ионизацией электрораспылением и ионной ловушкой (ESI-Ion-Trap-MS).

Для ESI-Ion-Trap масс-спектрометрии концентрированный положительный по Core-1 полисахарид фрагментировали либо гидролизом в 1% уксусной кислоте (1,5 ч, при 100°C), либо ферментативным расщеплением хондроитиназой ABC (расщепление по бета1-4GalNAc/GlcNAc связям) или бета1-3-галактозидазой. Кроме того, имела место фрагментация двойным расщеплением смесью хондроитиназа ABC/альфа1-3,4-фукозидаза или смесью 1% уксусная кислота/бета1-3-галактозидаза (все ферменты получены от Glyko GmbH). Все смеси для ферментативного расщепления инкубировали при 37°C в течение ночи. Масс-спектрометрические (и MS, и MS/MS) анализы проводили в положительном и отрицательном режиме. Перед началом анализа все образцы обессоливали с помощью Carbograph SPE (Alltech Associates Inc.), как описано в руководстве производителя, и разводили в смеси 2,5 мМ NH₃/40% ацетонитрил.

Структуру положительных по Core-1 гликановых фрагментов, которая уже была определена при помощи MALDI-MS анализов, можно проверять ESI-Ion-Trap определением. Дополнительные фрагменты также можно идентифицировать ESI-Ion-Trap масс-спектрометрией (таблица 8).

Таблица 8 Структурные анализы с использованием ESI-Ion-Trap масс-спектрометрии (положительный режим). Очищенный положительный по Core-1 полисахарид фрагментировали гидролизом в 1% уксусной кислоте в течение 1,5 ч при 100°C
MS	MS/MS
Определенные массы (M+H⁺/ M+NH₄ ⁺)	Идентифицированная последовательность	Определенные массы (M+Na⁺)	Идентифицированная последовательность
425/442	HexNAc-HexNAc
573/590	HexNAc(HexNAc)-Hex	390	HexNAc-Hex
749/766	HexNAc(HexNAc-Hex)-Hex	595	HexNAc-HexNAc-Hex
529/545	DesHex-desHexM-HexNAc
690/706	DesHex-desHexM-HexNAc-Hex
733/750	DesHex-HexNAc(HexNAc)-Hex
674/591	DesHex-desHex-desHexM-HexNAc	493	DesHex-desHex-desHexM
633/650	Hex-desHex-desHex-desHexM
HexNAc: N-ацетилгексозамин, Hex: гексоза, desHex: дезоксигексоза, M: метиловая группа.

Последовательность повторяющихся блоков положительного по Core-1 капсулярного полисахарида определяли по перекрывающимся фрагментам (фигура 6).

Масс-спектрометрические анализы ферментативно расщепленных положительных по Core-1 полисахаридов указывают на наличие гликозидных связей между моносахаридами. Кроме того, можно идентифицировать галактозу (успешное расщепление бета1-3-галактозидазой) и фукозу (успешное расщепление альфа1-3,4-фукозидазой) (фигура 7).

Данный результат находится в соответствии с анализами моносахаридов, упомянутыми ранее, выявившими концентрирование фукозы, галактозы и GalNAc.

10.5. Подтверждение структуры Core-1 как разветвленного дисахарида повторяющегося блока капсулярного полисахарида

Разветвленную структуру Core-1, Galбета1-3GalNAc в повторяющемся блоке следует определять двойным расщеплением экзогликозидазами бета1-3-галактозидазой и HexNAc-азой (расщепление бета1-2,3,4,6 GalNAc/GlcNAc) с последующими анализами моносахаридов, как описано выше.

Два образца, содержащие равные количества положительного по Core-1 полисахарида, фильтровали, чтобы очистить их от свободных моносахаридов. Затем один из двух образцов расщепляли бета1-3-галактозидазой при 37°C в течение ночи. Оба образца вновь фильтровали, чтобы отделить свободную галактозу от расщепленного образца, тогда как нерасщепленный образец использовали как отрицательный контроль. Затем концентраты собирали и расщепляли HexNAc-азой. В заключение оба образца вновь фильтровали. Все элюаты анализировали при помощи HPAEC-PAD.

Для контроля, действительно ли структура Core-1 исчезает при двойном расщеплении, но не затрагивается расщеплением HexNAc-азой (отрицательный контроль), данные концентраты анализировали дот-блотом с помощью набора DIG-Glykan Detection Kit (Roche Diagnostics) для обнаружения полисахаридов и специфичного к Core-1 антитела Nemod-TF1 для идентификации структуры Core-1.

В обоих элюатах дважды расщепленного образца можно идентифицировать галактозу (первый элюат) и GalNAc (второй элюат) при помощи анализов моносахаридов. Тогда как в элюате отрицательного контроля, который был расщеплен только экзогликозидазой HexNAc-азой, ни галактозу, ни GalNAc невозможно идентифицировать. Это является сильным аргументом в пользу разветвленной структуры Core-1, Galбета1-3GalNAc.

Дот-блот анализы с помощью набора DIG-Glykan detection Kit дважды расщепленного концентрата и расщепленного HexNAc-азой образца показали сходные концентрации полисахаридов, нанесенных на нитроцеллюлозную мембрану. Структуру Core-1 больше не выявляли в дважды расщепленном образце, в то время как в образце, расщепленном HexNAc-азой, структуру Core-1 все еще идентифицировали иммуноблоттингом с использованием антитела Nemod-TF1.

10.6. Подтверждение структуры положительного по Core-1 полисахарида с помощью анализов его разделенных фрагментов

Для дальнейшего подтверждения структуры положительного по Core-1 полисахарида гликан фрагментировали гидролизом в 1% уксусной кислоте (1,5 ч, 100°C). Гликановые фрагменты метили флюорофором 2-аминобензамидом (2-AB), как уже описано в работе J. C. Bigge et al. (1995). Для этого метода образцы переводили в состояние, свободное от частиц и солей, путем очистки на колонке Carbograph SPE (Alltech Associates Inc.) и лиофилизировали. Осадок растворяли в 5 мкл 2-AB в смеси DMSO/ледяная уксусная кислота/цианоборгидрид натрия и инкубировали при 60°C в течение 2 ч. Меченые 2-AB фрагменты отделяли от свободного 2-AB бумажной хроматографией. В заключение конъюгированные с 2-AB фрагменты элюировали водой. После лиофилизации осадок растворяли в 50% ацетонитриле. На основании размера фрагменты разделяли ВЭЖХ с нормальными фазами (колонка: Luna 3 микроорганизмы и их фракции, индуцирующие специфичный к углеводу клеточный иммунитет, патент № 2460074 NH₂ A100, Phenomenex, элюент A: 15 мМ NH₄-ацетат, элюент B: ацетонитрил) с флуоресцентной детекцией. Последовательность фрагментов анализировали ESI масс-спектрометрией. В заключение, для подтверждения гликозидных связей и лучшей идентификации моносахаридов, являющихся компонентами фрагментов, олигосахариды расщепляли экзогликозидазами бета1-3-галактозидазой, альфа1-3,4-фукозидазой и HexNAc-азой, как уже описано ранее. Успешность расщепления контролировали ESI масс-спектрометрией, а удаление концевых моносахаридов определяли с помощью HPAEC-PAD, как уже описано ранее.

Уже определенную структуру повторяющихся блоков положительного по Core-1 полисахарида подтверждали обоими анализами, получая ожидаемые олигосахаридные фрагменты и расщепленные моносахариды (таблица 9).

Таблица 9
Фрагменты олигосахаридов	Экзогликозидаза	Анализы ESI-MS	Анализы моносахаридов
HexNAc-Hex	бета1-3-галактозидаза	HexNAc Hex HexNAc-Hex	GalNAc/GalNH₂ галактоза
DesHex-desHex-desHexM	альфа1-3,4-фукозидаза	desHexM DesHex-desHexM DesHex-desHex	фукоза
DesHex-desHex	альфа1-3,4-фукозидаза	desHex	фукоза
DesHex-desHexM-HexNAcM-HexNAc	HexNAc-аза (альфа1-2,3,4,6-GalNAc/GlcNAc)	HexNAc DesHex-desHexM-HexNAc	Не определено

В заключение, структуру повторяющихся блоков положительного по Core-1 капсулярного полисахарида (фигура 8) подтверждали рядом анализов.

Кроме того, результаты выявили (см. также фигуру 19, в частности, № 5), что гликозидный мост между Gal-GalNAc и молекулой GalNAc основной цепи является альфа-аномерным. Этот факт подтвержден данными дот-блот анализов с мАТ (mAbs) TF1, TF2 и HH8, специфичными для альфа-аномера TF. Также использовали мАТ A68-E/A2 и A68-E/E3, специфичные для TFбета. Таким образом, внутри разветвленной структуры капсулярного полисахарида B. ovatus AG6 идентифицировали опухолеспецифичный антиген TFальфа.

Пример 11. Модели на животных

11.1. Внутрибрюшинная иммунизация мышей убитыми бактериями

11.1.1. Анализ сывороток мышей с помощью теста 1 на гуморальный иммунный ответ

Самок мышей Balb/c (Charles River, 4 на группу) обрабатывали циклофосфамидом в дозе 50 мг/кг массы тела в день -1. В дни 0, 7 и 14 мышам внутрибрюшинно инъецировали дозу 5×10⁸ бактерий (отрицательных по Core-1 штаммов AG3 (группа I), 32 или 53, или положительного по Core-1 штамма AG6 (группа K)) в PBS, либо только PBS (группа L). Образцы сыворотки отбирали в дни - 4, 21, 27 и 30.

Сыворотки мышей анализировали на связывание с Core-1 методом ELISA. В качестве несущего Core-1 антигена служил асиалогликофорин. В качестве отрицательного контроля использовали асиалогликофорин, обработанный йодной кислотой. Периодатная обработка разрушает внешнее углеводное кольцо Core-1, тем самым разрушая эпитоп Core-1.

Лунки 96-луночных плоскодонных планшетов для микротитрования покрывали асиалогликофорином A (AGP) в концентрации 2 мкг/мл. Планшет трижды промывали PBS/Tween. Половину планшета обрабатывали периодатом следующим образом.

Лунки инкубировали в течение 5 минут в 50 мМ натрий-ацетатном буфере pH 4,5 с последующей инкубацией в течение 1 ч в 10 мМ йодной кислоте в ацетатном буфере в темноте. Лунки инкубировали в течение 5 минут в 50 мМ натрий-ацетатном буфере pH 4,5. Реакцию останавливали инкубацией в боргидриде натрия (50 мМ в PBS, 30 мин). Затем планшеты промывали 5 раз PBS/Tween.

Планшеты затем блокировали добавлением 2% BSA на 30 мин.

Инкубацию с сыворотками мышей в разных разведениях проводили в течение 1,5 ч. Связавшийся иммуноглобулин мышей обнаруживали при помощи конъюгированного с пероксидазой антитела козы против IgM мыши (1:5000 в PBS/1% BSA). Анализ проявляли, используя TMB в качестве субстрата, и реакцию останавливали добавлением 2,5н H₂SO₄.

На фигуре 9 показано связывание IgM антител сыворотки с положительным по Core-1 AGP и отрицательным по Core-1 AGP (AGP+PJ). Только сыворотки трех из четырех мышей, иммунизированных положительными по Core-1 бактериями (группа K), демонстрировали сильное связывание с AGP, тогда как сигнал понижался после расщепления Core-1 с помощью PJ.

Таким образом, положительные по Core-1 бактерии способны индуцировать направленный против Core-1 гуморальный иммунитет у мышей.

11.1.2. Анализ сывороток мышей с помощью теста 2 на гуморальный иммунный ответ

Самцов мышей C3H (Charles River, 4 на группу) внутрибрюшинно иммунизировали дозой 5×10⁸ пастеризованных бактерий из положительных по Core-1 и отрицательных по Core-1 штаммов в 200 мкл PBS в дни 0, 7 и 14. Сыворотки собирали перед иммунизацией, а также в дни 13, 21 и 28 и анализировали с помощью теста 2 на гуморальный иммунный ответ.

Лунки 96-луночных плоскодонных планшетов для микротитрования покрывали конъюгатами различных углеводов с PAA (GlcNAc микроорганизмы и их фракции, индуцирующие специфичный к углеводу клеточный иммунитет, патент № 2460074 1-2Gal 1-3GalNAcальфа-PAA, Fucальфа1-2Gal 1-3GalNAcальфа-PAA, GalNAcальфа1-3Gal -PAA, Galальфа1-3-GalNAc микроорганизмы и их фракции, индуцирующие специфичный к углеводу клеточный иммунитет, патент № 2460074 -PAA, Galбета1-3GalNAcальфа1-PAA) в концентрации 5 мкг/мл в сенсибилизирующем буфере (8,4 г/л NaHCO₃, 3,56 г/л Na₂CO₃, pH=9,49) и инкубировали в течение ночи при 4°C.

Планшет трижды промывали PBS/Tween.

Планшеты затем блокировали добавлением 2% BSA на 30 мин.

На фигуре 10 представлено среднее значение сигналов ELISA в случае PAA конъюгата Galбета1-3GalNAcальфа1-PAA относительно сигнала ELISA в случае GlcNAc микроорганизмы и их фракции, индуцирующие специфичный к углеводу клеточный иммунитет, патент № 2460074 1-2Gal 1-3GalNAcальфа-PAA для сывороток от 4 мышей на группу в день 0 (преиммунная сыворотка) и день 21 [относительный сигнал ELISA рассчитывали по формуле: (сигналы ELISA для Galбета1-3GalNAcальфа1-PAA)×100/(сигнал ELISA для GlcNAc микроорганизмы и их фракции, индуцирующие специфичный к углеводу клеточный иммунитет, патент № 2460074 1-2Gal 1-3GalNAcальфа-PAA)]. Сыворотки считали положительными, если иммунная сыворотка демонстрировала увеличение сигнала как минимум на 50% относительно преиммунной сыворотки. Можно видеть, что только положительные по Core-1 штаммы AG6 и MU1 индуцировали специфичный к Core-1 гуморальный иммунный ответ у мышей.

11.1.3. Анализ сывороток мышей с помощью теста 3 на гуморальный иммунный ответ

Самок мышей Balb/c (Charles River, 4 на группу) обрабатывали циклофосфамидом в дозе 50 мг/кг массы тела в день -1. В дни 0, 7 и 14 мышам внутрибрюшинно инъецировали дозу 5×10⁸ бактерий (отрицательных по Core-1 штаммов AG3 (группа I), 32 или 53, или положительного по Core-1 штамма AG6 (группа K)) в PBS, или только PBS (группа L). Образцы сыворотки отбирали в дни - 4, 21, 27 и 30.

Проточно-цитометрические анализы проводили для того, чтобы анализировать связывание сывороток мышей с положительными по Core-1 и отрицательными по Core-1 линиями опухолевых клеток человека (NM-wt и NM-D4, соответственно; NM-wt является родительской клеточной линией для NM-D4, как описано в WO2005/017130 A2 и EP1654353, NM-D4 депонированы в DSMZ под № DSM ACC2605). 3×10⁵ клеток на пробирку осаждали и осадок ресуспендировали в 50 мкл сыворотки мыши (разведенной 1:50 в PBS/10% FCS), контрольного антитела или только PBS/10% FCS. Образцы инкубировали в течение 20 мин при 4°C, промывали PBS и центрифугировали. Затем клетки инкубировали с Cy3-конъюгированным антителом козы против IgM мыши (Jackson Immuno Research, 1:200 в PBS/10% FCS) в течение 20 мин при 4°C, промывали PBS и ресуспендировали в 200 мкл PBS для проточно-цитометрического анализа.

На фигурах 11 a и b представлено связывание IgM антител из сывороток мышей с линиями клеток человека NM-wt (отрицательная по Core-1) и NM-D4 (положительная по Core-1). В то время как связывание с отрицательной по Core-1 линией NM-wt сравнимо для мышей, иммунизированных отрицательными по Core-1 бактериями (группа I) и положительными по Core-1 бактериями (группа K), наблюдается значительно более сильное связывание у 3 из 4 мышей группы K с положительной по Core-1 линией NM-D4. Это служит признаком специфичности к Core-1 гуморального иммунного ответа у мышей, иммунизированных положительными по Core-1 бактериями.

11.1.4. Анализ сывороток мышей с помощью тестов 1, 2 и 3 на гуморальный иммунный ответ

Мышей C3H (Charles River, 4 мыши на группу) внутрибрюшинно иммунизировали дозой 1×10⁹ пастеризованных бактерий из положительного по Core-1 штамма Bacteroides ovatus MU-1, положительного по A68-BA11 штамма LH2 E. coli и отрицательных по Core-1 штаммов E.coli (AG3, E.coli О86 DSMZ 8697 =32) в 200 мкл PBS в дни 0, 7 и 14. Сыворотки собирали перед иммунизацией, а также в дни 13, 21 и 28, и анализировали с помощью тестов 1, 2 и 3 на гуморальный иммунный ответ, как описано выше.

В то время как штамм AG3 являлся отрицательным по всем тестам на гуморальный иммунный ответ, в сыворотке, собранной у мышей после иммунизации штаммами О86 и LH2 E.coli, обнаружили наличие AGP-реактивных антител в тесте 1. Тем не менее, только положительный по Core-1 штамм MU-1 демонстрировал сильные анти-Core-1 специфичные гуморальные иммунные ответы против Core-1 на PAA-конъюгатах (тест 2) и на опухолевых клетках человека (тест 3) в дополнение к индукции специфичных к AGP антител в тесте.

Таким образом, авторам изобретения удалось индуцировать сильный специфичный к Core-1 гуморальный иммунный ответ только с помощью положительных по Core-1 микроорганизмов Bacteroides ovatus (MU-1).

На фигуре 11 c-e представлены данные результаты.

11.2. Пероральная иммунизация безмикробных мышей живыми положительными по Core-1 бактериями

Безмикробных мышей C3H перорально иммунизировали дозой 2×10⁹ живых бактерий штамма AG6 в дни 2, 3, 4, 9, 10, 11, 16, 17 и 18. Образцы сыворотки отбирали в день 0 (преиммунные сыворотки), а также в дни 14 и 21, и анализировали на наличие специфичных к AGP IgM антител в тесте 1 на гуморальный иммунный ответ.

У иммунизированных мышей наблюдали повышенные титры антител против Core-1 по сравнению с контрольными мышами, как продемонстрировано связыванием сывороток мышей с покрытыми AGP планшетами для микротитрования. Связанные IgM мыши выявляли с помощью конъюгированных с пероксидазой антител против IgM мыши. Специфичность сигнала для Core-1 была доказана снижением сигнала ELISA после обработки йодной кислотой (разрушающей углеводную структуру). После 14 или 21 дней 3 из 3 мышей имели повышенные уровни IgM антител к Core-1, тогда как у контрольных мышей не наблюдали никакого увеличения сигналов ELISA к AGP по сравнению с AGP+PJ, как показано на фигуре 12.

11.3. Пероральная иммунизация конвенциональных мышей пастеризованными и живыми положительными по Core-1 бактериями

Мышей C3H перорально иммунизировали дозой 1×10¹¹ (группа A) или 1×10¹⁰ (группа B) пастеризованных бактерий штамма AG6 ежедневно в дни с 0 по 28. Образцы сыворотки отбирали в день -1 (преиммунные сыворотки), а также в дни 13, 21, 28 и 35, и анализировали на наличие специфичных к AGP IgM антител в тесте 1 на гуморальный иммунный ответ.

В сыворотке, собранной у мышей после иммунизации, обнаружили повышенные титры антител против Core-1, как продемонстрировано связыванием сывороток мышей с покрытыми GP или AGP планшетами для микротитрования (с периодатной обработкой и без нее). Связанные IgM мыши выявляли с помощью конъюгированных с пероксидазой антител против IgM мыши. Специфичность сигнала для Core-1 была доказана снижением сигнала ELISA после обработки йодной кислотой (разрушающей углеводную структуру, снижение как минимум на 30%), а также по меньшему сигналу в случае GP (увеличение сигнала для AGP, как минимум, на 50%).

Показано, что 5 из 6 мышей группы A и 5 из 8 мышей группы B продуцировали специфичные к Core-1 антитела на день 21 (фигура 13).

В тесте 3 на гуморальный иммунный ответ сыворотки мышей анализировали методом проточной цитометрии на связывание с линией положительных по Core-1 опухолевых клеток NM-D4 по сравнению с линией отрицательных по Core-1 клеток NM-wt. 3×10⁵клеток на пробирку осаждали, и осадок ресуспендировали в 50 мкл сыворотки мыши (разведенной 1:300 в PBS/1% BSA), контрольного антитела или только PBS/1% BSA. Образцы инкубировали в течение 60 мин при 4°C, промывали PBS и центрифугировали. Затем клетки инкубировали с конъюгированным с биотином антителом козы против IgM мыши (Jackson Immuno Research, 1:200 в PBS/1% BSA) в течение 60 мин при 4°C и промывали PBS. Затем клетки инкубировали с Cy3-конъюгированным стрептавидином (Jackson Immuno Research, 1:200 в PBS/1% BSA) в течение 60 мин при 4°C и ресуспендировали в 200 мкл PBS для проточно-цитометрического анализа.

Результаты рассчитывали по следующей формуле:

(% положительных клеток по NM-D4_{иммунной сыворотке} - % положительных клеток по NM-D4_{преиммунной сыворотке})/(% положительных клеток по NM-wt_{иммунной сыворотке} - % положительных клеток по NM-wt_{преиммунной сыворотке})=X

Сыворотки мышей с индексом X микроорганизмы и их фракции, индуцирующие специфичный к углеводу клеточный иммунитет, патент № 2460074 10 считались положительными (с % положительных клеток по NM-wt_{иммунной сыворотке} - % положительных клеток по NM-wt_{преиммунной сыворотке} микроорганизмы и их фракции, индуцирующие специфичный к углеводу клеточный иммунитет, патент № 2460074 1).

На день 28 у 11 из 13 мышей развился гуморальный иммунный ответ против положительной по Core-1 линии опухолевых клеток NM-D4 человека, как показано на фигуре 14.

В тесте 2 на гуморальный иммунный ответ сыворотки мышей дня 28 анализировали на связывание с Gal микроорганизмы и их фракции, индуцирующие специфичный к углеводу клеточный иммунитет, патент № 2460074 1-3GalNAcа-PAA (PAA 48) или Gal 1-3GlcNAcа-PAA (PAA 43).

Лунки 96-луночных плоскодонных планшетов для микротитрования покрывали либо Gal микроорганизмы и их фракции, индуцирующие специфичный к углеводу клеточный иммунитет, патент № 2460074 1-3GalNAcа-PAA (PAA 48), либо Gal 1-3GlcNAcа-PAA (PAA 43) в концентрации 5 мкг/мл в сенсибилизирующем буфере (8,4 г/л NaHCO₃, 3,56 г/л Na₂CO₃, pH=9,49) и инкубировали в течение ночи при 4°C. После блокирования проводили инкубации с сыворотками в течение 1,5 ч. Связавшиеся иммуноглобулины мыши выявляли конъюгированным с пероксидазой антителом козы против IgM мыши (1:5000 в PBS/1% BSA). Анализ проявляли, используя TMB в качестве субстрата, и реакцию останавливали добавлением 2,5н H₂SO₄ .

Результаты представлены на фигуре 21. Показано, что 5 из 13 мышей продуцировали специфичные к Core-1- антитела на день 28.

Пример 12. Способность положительных по Core-1 бактерий к индукции клеточного иммунного ответа ( in vitro)

12.1. Получение функциональных дендритных клеток

Линию дендритных клеток NemodDC (pNM-DC) использовали как источник антигенпрезентирующих клеток (APC). Клетки pNM-DC дифференцировали в iNM-DC с последующим нагружением бактериальными лизатами (BaLy) следующих бактериальных штаммов: AG6, MU1, 52 и 53. По 50 мкг/мл каждого BaLy добавляли вместе с цитокинами созревания в культуральные среды и iNM-DC дифференцировали до их зрелого состояния (mNM-DC).

Подробнее, на первом этапе pNM-DC (1×10⁵ клеток/мл) дифференцировали в iNM-DC семидневной инкубацией в NemodDC-среде (70% MEM-альфа, 20% FCS, 10% CM5637) с добавлением 1000 Ед/мл GM-CSF, 100 Ед/мл IL-4 и 2,5 нг/мл TNF-альфа. Затем 1×10⁶ клеток/мл незрелых NM-DC (iNM-DC) нагружали либо бактериальными лизатами (50 мкг/мл), либо лизатами опухолевых клеток (1×10⁶ лизированных опухолевых клеток для нагружения 1×10⁶ NM-DC), либо AGP- и GP-белками (20 мкг/мл) и оставляли созревать в течение 2 дней при добавлении 75 нг/мл TNF-альфа.

Зрелый фенотип mNM-DC очень важен для успешной активации T-клеток и его проверяли методом проточной цитометрии на экспрессию CD1a, CD11c, CD14, CD40, CD35, CD80, CD83, CD86, CD116, HLA-ABC и HLA-DR. Только DC, обладавшие фенотипом, соответствующим фенотипу зрелых DC, использовали для активации T-клеток.

12.2. Получение активированных T-клеток против Core-1 и определение продукции GM-CSF (тест 1 на клеточный иммунный ответ) и TNF-альфа (тест 2 на клеточный иммунный ответ) методом ELISA

Через 7-10 дней после примирования T-лимфоцитов NM-DC, нагруженными положительными по Core-1 бактериальными лизатами, полученные в результате T-клетки (0,7-1×10⁶ клеток/мл) повторно стимулировали mNM-DC (1×10⁵ клеток/мл), нагруженными положительными по Core-1 лизатами опухолевых клеток (50 мкг/мл). После 48 часов инкубации супернатанты собирали и анализировали, используя для количественной оценки продукции цитокинов в ответ на линию положительных по Core-1 опухолевых клеток NM-D4 человека наборы GM-CSF- и TNF-альфа-BD OptEIA микроорганизмы и их фракции, индуцирующие специфичный к углеводу клеточный иммунитет, патент № 2460074 Kits.

Лунки 96-луночных планшетов предварительно покрывали 50 мкл подходящих в качестве иммобилизованных антител против GM-CSF или TNF-альфа человека, разведенных 1:250 в сенсибилизирующем буфере. По окончании этапов промывки и блокирования по 100 мкл супернатантов или стандартов добавляли в лунки и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Для калибровочной кривой использовали рекомбинантный GM-CSF человека в концентрациях 0; 7,8; 15,6; 31,2; 62,5; 125; 250 пкг/мл и рекомбинантный TNF-альфа человека в концентрациях 0; 4,7; 9,4; 18,8; 37,5; 75; 150; 300 пкг/мл. После промывания добавляли по 100 мкл подготовленного рабочего раствора для детекции на лунку и планшет инкубировали 1 ч при комнатной температуре. На следующем этапе добавляли по l00 мкл одноэтапного субстратного реагента TMB на лунку. После последней инкубации в течение 30 минут и добавления 50 мкл останавливающего раствора измеряли экстинкции при 450 нм.

Результаты, представленные на фигурах 15 A и B, наглядно свидетельствуют, что T-клетки, полученные к положительным по Core-1 бактериальным лизатам, способны узнавать DC, нагруженные положительным по Core-1 клеточным лизатом из клеток линии NM-D4 человека, судя по продукции ингибирующих опухоли цитокинов, таких как TNF-альфа и GM-CSF. Напротив, в ответ на отрицательные по Core-1 клеточные лизаты секретировались очень низкие уровни цитокинов. Кроме того, такое узнавание специфически ингибировалось путем преинкубации нагруженных лизатами NM-DC со специфичным к Core-1 антителом.

12.3. Анализ ELISpot для оценки секреции IFN-гамма активированными T-лимфоцитами, направленными против Core-1 (тест 2 на клеточный иммунный ответ)

Для оценки секреции IFN-гамма в ответ на специфическую стимуляцию антигеном использовали анализ ELISpot. Этот анализ позволяет определить количественно функциональную способность предварительно сенсибилизированных T-клеток узнавать антигены Core-1 специфическим для антигена образом.

Сначала T-лимфоциты активировали in vitro путем совместного культивирования с DC, нагруженными бактериальными лизатами. Через 7-10 дней после примирования активированные T-клетки собирали и повторно сенсибилизировали с помощью DC (в пропорции T-клетки к DC 10:1), нагруженных положительными по Core-1 (NM-D4) и отрицательными по Core-1 (NM-wt) лизатами опухолевых клеток человека.

Лунки планшета для ELISpot заранее покрывали антителом мыши против IFN-гамма человека (Mabtech-Kit), которое связывается с нитроцеллюлозным основанием планшета для ELISpot. Повторно сенсибилизированные T-клетки переносили в лунки, и цитокины секретировались во время периода инкубации. IFN-гамма, который локально секретируется вокруг каждой T-клетки, связывается и, таким образом, «захватывается» специфическим антителом. После 24 часов инкубации клетки удаляли. В лунки добавляли вторичное антитело против IFN-гамма человека в концентрации 1 мкг/мл; это биотинилированное антитело связано с ферментом, способным превращать субстрат в нерастворимый окрашенный продукт. Планшеты промывали еще раз и добавляли стрептавидин, конъюгированный с ферментом-AP в концентрации 1 мкг/мл. В завершение добавляли преципитирующий субстрат BCIP+NBT и планшет инкубировали до тех пор, пока появятся пятна на стороне прореагировавших T-клеток. Окрашенные пятна просчитывали и анализировали с помощью цифровой системы изображения.

Результаты свидетельствуют о том, что T-клетки, полученные к положительным по Core-1 бактериальным лизатам (AG6 и MU1), способны узнавать DC, нагруженные положительным по Core-1 клеточным лизатом из опухолевых клеток линии NM-D4 человека, судя по продукции ингибирующего опухоль цитокина IFN-гамма (фигура 16). В ответ на отрицательные по Core-1 клеточные лизаты (R+DC/wt) секретировались очень низкие уровни цитокинов. Кроме того, специфичность узнавания положительного по Core-1 клеточного лизата (R+DC/D4) доказывали блокированием секреции цитокинов специфичным к Core-1 антителом Nemod-TF1 (R+DC/D4+Ak).

12.4. Тест 3 на клеточный иммунный ответ: анализ пролиферации T-клеток

Сенсибилизированные и повторно стимулированные, как ранее описано для анализа ELISpot, T-клетки после инкубации переносили из планшета для ELISpot в 96-луночный планшет и анализировали с помощью колориметрического реагента на пролиферацию клеток Cell Proliferation Reagent WST-1 (Roche Molecular Biochemicals), тетразолиевая соль которого расщепляется митохондриальными ферментами так, что количество проявившегося красителя (считывание при 450 нм) прямо коррелирует с количеством метаболически активных клеток в культуре. Поглощение культуральной среды плюс wst-1 в отсутствие клеток является нулевой точкой для ридера при твердофазном иммуноферментном анализе. Метод состоит из одноэтапного добавления 10 мкл на лунку реагента WST-Proliferation reagent (Roche) и инкубации в течение 3 часов при 37°C с последующим измерением при 450 нм.

Результаты, представленные на фигуре 17, наглядно свидетельствуют, что T-клетки, полученные к положительным по Core-1 бактериальным лизатам, узнают DC, нагруженные положительным по Core-1 клеточным лизатом из опухолевых клеток линии NM-D4 человека, как показано с помощью специфической пролиферации. Кроме того, такое узнавание специфически ингибировалось при преинкубации нагруженных лизатом NM-DC со специфичным к Core-1 антителом.

12.5. Тест 4 на клеточный иммунный ответ: иммунофлуоресцентный тест на презентацию Core-1 на DC, нагруженных бактериальными лизатами

Для того чтобы анализировать процессирование и презентацию Core-1 нагруженными бактериальными лизатами NM-DC, проводили иммунофлуоресцентные анализы с помощью специфичных к Core-1 моноклональных антител (Nemod-TF1, NEMOD-TF2). Презентация процессированного антигена Core-1 на поверхности зрелых DC продемонстрирована с помощью иммунофлуоресценции. Иммунофлуоресценция (IF) является методом, позволяющим визуализировать специфический антиген (Core-1) на клетках путем связывания специфичного к Core-1 антитела с последующим добавлением вторичного антитела, меченного флуорохромом, которое используют для узнавания первичного антитела.

На первом этапе pNM-DC (1×10⁵ клеток/мл) дифференцировали в iNM-DC семидневной инкубацией в NemodDC-среде (70% MEM-альфа, 20% FCS, 10% CM5637) с добавлением 1000 Ед/мл GM-CSF, 100 Ед/мл IL-4 и 2,5 нг/мл TNF-альфа. Затем 1×10⁶ клеток/мл незрелых NM-DC (iNM-DC) нагружали либо бактериальными лизатами (50 мкг/мл), либо лизатами опухолевых клеток (1×10⁶ лизированных опухолевых клеток для нагружения 1×10⁶ NM-DC), либо AGP- и GP-белками (20 мкг/мл) и оставляли созревать в течение 2 дней при добавлении 75 нг/мл TNF-альфа.

Зрелые и нагруженные антигеном DC промывали и по 1×10⁶ клеток в 50 мкл помещали в планшет для микротитрования для иммунофлуоресцентного окрашивания. 3 мкг/мл специфичного к Core-1 антитела (Nemod-TF1), разведенного в культуральной среде (10% FCS), инкубировали с клеточной суспензией в течение 1 часа при комнатной температуре. После этапов промывания добавляли 50 мкл разбавленного 1:200 Cy3-меченного вторичного АТ козы против IgM мыши (Jackson/Dianova) и инкубировали в течение 30 минут. После этапов промывания по 20 мкл клеточной суспензии помещали в каждую лунку Multitest-слайда (10 лунок, Roth). Иммунофлуоресцентно окрашенные образцы исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа Axioplan 2, оборудованного цифровой камерой AxioCam (Zeiss).

На фигуре 18 показано положительное специфичное для Core-1 окрашивание зрелых mNM-DC, которые процессировали положительные по Core-1 лизаты AG6 и NM-D4; и отрицательная иммунофлуоресценция на mNM-DC, нагруженных отрицательными по Core-1 лизатами (AG3 и NM-wt).

Хотя данное изобретение описано на примерах предпочтительных вариантов осуществления, квалифицированный специалист в данной области поймет в полной мере, что различные модификации, замены, пропуски и изменения могут быть произведены без отклонения от сущности данного изобретения. Соответственно, предполагается, что объем настоящего изобретения ограничен лишь объемом следующих далее пунктов формулы изобретения, включая эквиваленты вышеуказанных. Вследствие этого, как будет очевидно специалистам в данной области, к которой относится данное изобретение, настоящее изобретение может найти осуществление в формах иных, чем конкретно раскрытые выше, без отклонения от сущности или существенных характеристик данного изобретения. Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения, описанные выше, должны рассматриваться во всех аспектах как иллюстративные и неограничивающие. Объем настоящего изобретения скорее определяется, как указано в прилагаемой формуле изобретения, чем ограничивается примерами, содержащимися в предшествующем описании. Следует понимать, что различные альтернативы вариантов осуществления данного изобретения, описанных в данном документе, могут быть использованы при практическом осуществлении данного изобретения. Предполагается, что следующая далее формула изобретения определяет объем данного изобретения, и что способ и средства, входящие в объем данной формулы изобретения, а также их эквиваленты, охвачены данным изобретением.

Клеточные линии:

NM-D4 (DSM ACC2605), NM-F9 (DSM ACC2606), ZR-75-1 (ATCC CRL-1500), CAMA-1 (ATCC HTB-21), KG-1 (DSM ACC 14), или A-204 (DSM ACC 250). NM-wt или NM-H9 (или NM-H9D8 DSM ACC2806). Линии клеток NM-9 и NM-D4 депонированы в DSMZ компанией Nemod Biotherapeutics GmbH & Co. KG. Robert-Rossle-Strasse 10, 13125 Berlin, Germany (то есть депозитор), который уполномочивает заявителя настоящей заявки ссылаться на депонированный биологический материал, описанный в данном документе, и дает свое не ограниченное условиями и окончательное согласие заявителю настоящей заявки, что депонированный биологический материал, описанный в данном документе, будет доступен для неопределенного круга лиц согласно Инструкции 28 (1) (d) Европейской патентной конвенции. DSMZ расположен по адресу: Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany. Указанные депозиты в DSMZ были размещены в соответствии с условиями Будапештского соглашения по международному признанию депозитов микроорганизмов в рамках процедуры патентования.

AG6(DSM 18726), MU1(DSM 18728) и новый штамм Escherichia coli LH2(DSM 18727) были депонированы в «DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH» в Брауншвейге (Германия), компанией Glycotope GmbH, Robert-Rössle-Str, 10, 13125 Berlin (Germany) 20 октября 2006.

Класс G01N33/53 иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого

способ диагностики поражения вегетативных парасимпатических узлов головы вирусной этиологии - патент 2529795 (27.09.2014)
способ диагностики поражения вегетативных парасимпатических узлов головы вирусной этиологии - патент 2529794 (27.09.2014)

способ оценки острой соматической боли - патент 2529793 (27.09.2014)
способ оценки эффективности противогерпетического действия фотодинамического воздействия на вирус простого герпеса (впг) in vitro - патент 2529792 (27.09.2014)
способ прогнозирования самопроизвольного выкидыша - патент 2529788 (27.09.2014)
способ идентификации вызывающих муковисцидоз мутаций в гене cftr человека, набор праймеров, биочип, набор мишеней и тест-система, используемые в способе - патент 2529717 (27.09.2014)
способ прогнозирования инфекционного осложнения атопического дерматита у ребенка - патент 2528908 (20.09.2014)
способ прогнозирования риска развития тяжелого поражения нервной системы у новорожденных детей с различным сроком гестации в неонатальном периоде - патент 2528907 (20.09.2014)
способ получения иммуносорбента для диагностики вируса простого герпеса 1 типа - патент 2528896 (20.09.2014)
способ прогнозирования развития психической дезадаптации - патент 2528886 (20.09.2014)

Класс G01N33/554 носителем, представляющим собой биологическую клетку или часть клетки, например бактерии, дрожжевые клетки

способ определения риска обострений хеликобактериоза - патент 2481584 (10.05.2013)
способ прогнозирования риска кровотечения из варикозно расширенных вен пищевода у больных циррозом печени - патент 2473914 (27.01.2013)
способ определения венозного застоя по большому кругу кровообращения у больных хронической сердечной недостаточностью - патент 2449289 (27.04.2012)
идентификация и классификация вирусных частиц на текстурированных электронных микрофотографиях - патент 2409855 (20.01.2011)
способ подавления иммунных реакций - патент 2393481 (27.06.2010)
способ диагностики степени тяжести пародонтита - патент 2386394 (20.04.2010)
диагностикум псевдотуберкулезный эритроцитарный моноклональный - патент 2377308 (27.12.2009)
способ культивирования бактерий lawsonia intracellularis, штаммы l.intracellularis, способ культивирования бактерий l.intracellularis (вариант), способ получения аттенуированного штамма l.intracellularis, способ определения наличия антител, вакцина, способ индукции иммунного ответа и аттенуированный штамм l.intracellularis n343np40wk - патент 2265849 (10.12.2005)
способ оценки пороговой чувствительности бактериальных культур на биологические и химические препараты - патент 2147610 (20.04.2000)
способ оценки иммунного статуса детей с атопическим дерматитом - патент 2130614 (20.05.1999)