способ витрификации биологических объектов

Формула изобретения

Способ витрификации биологических объектов, включающий помещение витрифицируемых биологических объектов в гибкую поликарбонатную пипетку для переноса гамет, эмбрионов и кумулюсооцитарных комплексов диаметром 130-600 мкм и размораживание, отличающийся тем, что в пипетку набирают небольшой объем витрификационного раствора без биологических объектов, затем в пипетку набирают витрификационный раствор с биологическими объектами, после чего осуществляют добавление витрификационного раствора так, чтобы биологические объекты были размещены не менее чем 10 милиметров от дистального конца гибкой поликарбонатной пипетки, после чего производят запаивание дистального конца пипетки и проверку герметичности шва посредством стриппетора, далее осуществляют запаивание проксимального конца пипетки, затем пипетку погружают в жидкий азот на время, равное не менее 20 с, после чего ее упаковывают в соломину-кожух объемом не менее 0,25 мл, и содержащую для смещения центра тяжести носителя металлический стержень, размещенный у одного из концов соломины-кожуха, который предварительно герметично запаивают, после помещения пипетки в соломину-кожух последнюю запаивают, а размораживание объектов осуществляют путем вскрытия внешней соломины-кожуха на конце, противоположном тому, на котором находятся витрифицированные биологические объекты, так, чтобы не нарушить целостность внутренней гибкой поликарбонатной пипетки, пипетку вынимают и помещают в водяную баню 37°С, после чего ее последовательно вскрывают сначала с широкого, а затем с узкого конца, затем с помощью груши, надетой на широкий конец пипетки, витрифицированные биологические объекты выпускают в среду для размораживания.

Описание изобретения к патенту

Предложение относится к области биологии и медицины, в частности к витрификации гамет и эмбрионов.

В настоящее время известен способ, в котором носитель для витрификации состоит из внутренней соломины объемом 0,25 мл, один из концов которой заполнен витрификационным раствором с витрифицируемыми объектами, и внешней соломины-кожуха объемом 0,5 мл, запаиваемой с обоих концов металлическими шариками и погружаемой затем в жидкий азот.(Aseptic technology of vitrification of human pronuclear oocytes using open-pulled straws, V. Isachenko et al. Hum. Reprod. (February 2005) 20(2); 492-496.) Размораживание объектов в данной системе осуществляется после вскрытия внешней соломины и извлечения внутренней соломины немедленным помещением заполненного витрификационным раствором с объектами конца внутренней соломины в раствор для размораживания.

Наиболее близким к патентуемому образцу является способ замораживания, при котором объекты помещаются в гибкую поликарбонатную предварительно укороченную пипетку для переноса гамет и эмбрионов, после чего пипетка помещается в запаянную с одного конца наружную соломину-кожух, которая затем запаивается с другого конца и погружается в жидкий азот; размораживание в данной системе осуществляется погружением конца пипетки с объектами в раствор для размораживания после вскрытия внешней соломины ножницами. (MicroSecure Vitrification (µ-S-VTF) Procedure: Optimum simplicity, security, cost-savings and effectiveness combining FDA-approved products, Mitchel C.Schiewe, The Journal of Clinical Embryology, Volume 13, Issue 2, 33-40).

Недостатками прототипа являются: сниженная скорость охлаждения объектов, возможность примерзания внутренней пипетки с эмбрионами к одному из концов наружной соломины за счет того, что пипетка не запаивается, необходимость использования большого (около 5 мл) объема раствора для размораживания.

Технической задачей и технологическим результатом способа является уменьшение себестоимости процедуры витрификации в сочетании с повышением скорости охлаждения объектов для оптимизации условий замораживания и обеспечением стопроцентной извлекаемости и безопасности хранения объектов за счет асептичности носителя.

Поставленная задача решается за счет того, что замораживание витрифицируемых биологических объектов осуществляется в гибкую поликарбонатную пипетку для переноса гамет, эмбрионов и кумулюсооцитарных комплексов диаметром 130-600 мкм; сначала в пипетку набирают небольшой объем витрификационного раствора без биологических объектов, затем в пипетку набирают витрификационный раствор с биологическими объектами, после чего осуществляют добавление витрификационного раствора так, чтобы биологические объекты были размещены на расстоянии не менее чем 10 мм от дистального конца поликарбонатной пипетки, после чего производят запаивание с дистального конца пипетки и проверку герметичности шва посредством стриппетора, далее запаивают проксимальный конец пипетки и погружают ее в азот на время, равное не менее 20 сек, после чего пипетку с витрифицированными объектами упаковывают в соломину-кожух объемом не менее 0,25 мл, содержащую металлический стержень с одного из концов, который предварительно герметично запаивают для смещения центра тяжести носителя, после помещения пипетки в соломину последнюю запаивают.

Способ поясняется прилагаемым графическим материалом, где:

на фиг.1 представлена внешняя соломина с хлопковым фильтром без внутреннего металлического стержня;

на фиг.2 - внешняя соломина с металлическим стержнем внутри, смещенным внутренним хлопковым фильтром, запаянная с дистального конца;

на фиг.3 - витрифицируемый биологический объект, находящийся внутри гибкой поликарбонатной пипетки, надетой на стриппетор;

на фиг.4 - запаянная с обоих концов гибкая поликарбонатная пипетка с находящимися внутри объектами;

на фиг.5 - запаянная поликарбонатная пипетка с находящимися внутри объектами и внешняя соломина погружены в жидкий азот;

на фиг.6 - запаянная поликарбонатная пипетка с витрифицированными объектами помещена и запаяна в наружную соломину.

Для реализации способа используют:

1 - внешнюю соломину-кожух, содержащую

2 - хлопковый фильтр и

3 - металлический стержень, смещающий центр тяжести соломины, которую предварительно

4 - запаивают. С помощью

5 - стриппетора в

6 - гибкую поликарбонатную пипетку набирают

7 - витрифицируемые объекты, затем

8 - пипетку запаивают и погружают в

9 - жидкий азот. Далее пипетку упаковывают в наружную соломину, которую затем герметично запаивают.

Загрузка замораживаемых объектов в пипетку и ее запаивание ультразвуковым или термическим запаивателем осуществляются следующим образом: сначала в пипетку набирают небольшой объем витрификационного раствора без замораживаемых объектов, далее набирают витрификационный раствор с объектами, затем витрификационный раствор, при этом необходимо, чтобы объекты располагались не менее чем на расстоянии 10 мм от дистального конца пипетки, что контролируется визуально в стереомикроскопе, для предотвращения их возможного повреждения при запаивании; после заполнения пипетки дистальный ее конец (через который загружались объекты) запаивается, герметичность образовавшегося шва контролируется следующим образом - на поршень стриппетора, с которым соединена пипетка осуществляются надавливания и в это время визуально контролируется перемещение мениска раствора внутри пипетки или истечение его наружу через место шва, в случае если имеется движение мениска или истечение раствора через несостоятельный шов, необходимо перезапаять пипетку выше первоначального уровня. После запаивания дистального конца пипетки ее снимают со стриппетора и запаивают противоположный уже запаянному конец.

После этого пипетка сразу же погружается в жидкий азот не менее чем на 20 секунд, затем она перемещается в предварительно маркированную наружную соломину-кожух со смещенным центром тяжести, причем утяжеленный конец внешней соломины находится в жидком азоте, а противоположный конец находится над его поверхностью, через него осуществляется загрузка пипетки в соломину. После загрузки пипетки в наружную соломину последнюю запаивают ультразвуковым или термическим запаивателем, не вынимая из жидкого азота, причем так, чтобы верхний конец расположенной внутри пипетки с замораживаемыми объектами не был запаян вместе с наружной соломиной в одном шве.

Наружная соломина-кожух изготавливается из коммерчески доступной соломины для медленного замораживания гамет и эмбрионов объемом не менее 0,25 мл, содержащей с одного из концов хлопковую пробку. Металлический стержень, соответствующий по диаметру внутреннему диаметру соломины, длиной 1-1,5 см вводится в соломину со стороны конца, на котором находится хлопковая пробка, таким образом, чтобы стержень сместил пробку кнутри и наружным концом углублялся на не менее чем 5 мм внутрь соломины. После введения стержня производится запаивание соломины, чтобы герметизировать ее и препятствовать выпадению металлического стержня. Данный стержень смещает центр тяжести носителя и препятствует всплытию того конца его, ближе к которому находятся витрифицированные объекты, что является дополнительным фактором температурной стабильности хранения и защиты от девитрификации.

Размораживание объектов, хранящихся в представленном носителе, осуществляется следующим образом: наружная соломина-кожух вскрывается при помощи приспособления для очистки проводов от обмотки таким образом, чтобы была нарушена целостность внешней соломины и не нарушена целостность внутренней пипетки. При этом большая часть носителя находится в жидком азоте и возвышается над его поверхностью только минимально необходимая часть для вскрытия. Далее откушенный фрагмент наружной соломины снимается и внутренняя пипетка извлекается за широкий запаянный конец, после чего она немедленно помещается в водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на 5-7 секунд. Затем пипетку обрабатывают 70% раствором этилового спирта и приступают к вскрытию с помощью острого лезвия либо стерильных острых ножниц. Частным случаем приспособления для вскрытия является бритвенное лезвие, фиксированное в хирургическом зажиме. Вскрытие осуществляется следующим образом: сначала отрезается запаянный конец пипетки с той ее стороны, где нет витрифицированных объектов, затем тотчас за местом запаивания отрезается конец, где находятся объекты. После вскрытия пипетки с обоих концов на широкий ее конец надевают грушу и, слегка надавливая на нее, выпускают объекты в раствор для размораживания. Далее порядок манипуляции с объектами соответствует инструкции к используемым растворам.

Таким образом, положительным результатом применения данного способа является уменьшение себестоимости носителя для витрификации и снижение расхода растворов для замораживания и размораживания, что в итоге выливается в уменьшение себестоимости всей процедуры. При этом обеспечивается стопроцентная извлекаемость объектов и высокая безопасность хранения за счет асептичности носителя.