способ аттенуации вакцинного туляремийного штамма

Формула изобретения

1. Способ аттенуации вакцинного туляремийного штамма путем введения делеции гена в результате аллельного обмена в хромосомную ДНК F. tularensis 15/10, отличающийся тем, что используют суицидную плазмиду pPVArecD с делетированным геном recD для обмена с гомологичной областью хромосомной ДНК вакцинного штамма.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что суицидная плазмида pPV recD получена на основе плазмиды pUC19, с генами sacB, cat, mob и фрагментом хромосомной ДНК F. tularensis 15/10 с делецией гена recD.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной генетики и может быть использовано в производстве вакцинных препаратов.

Для профилактики туляремии в РФ используется живая вакцина, созданная на основе штамма Francisella tularensis. subsp. holarctica 15/10 [Гайский H.A. Иркутский противочумный институт, 1944. изд.1.], однако, штамм сохраняет остаточную вирулентность и реактогенность [Ellis J., Р, Oyston С.F., Green М., Titball R.W. Tularemia. Clinical. Microbiol. Rev. 2002; 631-646].

Впервые живая аттенуированная вакцина была получена в 40-х гг. в СССР. Аттенуирование штамма было достигнуто способом многократных пассажей природного изолята на питательной среде, содержащей нормальную сыворотку (L.M.Khatenever, 1943. The allergic diagnosis, specific prophylaxis and vaccine therapy of tularemia. // In E.B.Balsky, I.G.Kochergin and V.V.Porin (ed.), Microbiology and epidemiology. Medical Publications Ltd, London, United Kingdom, p.62-79). Однако при этом способе аттенуации сохраняется остаточная вирулентность.

Известен способ стабилизации туляремийного вакцинного штамма, заявка № 2010141704 от 11.10.2010, заключающийся в инактивации гена гесА в хромосомной ДНК вакцинного туляремийного штамма.

Однако при стабилизации вакцинного туляремийного штамма не удалось существенно снизить вирулентность. Проблема аттенуации вакцинного туляремийного штамма остается актуальной.

Задачей настоящего изобретения является снижение вирулентности туляремийного вакцинного штамма Francisella tularensis. subsp. holarctica 15/10.

Поставленная задача решается тем, что предложен способ аттенуации вакцинного штамма F. tularensis subsp. holarctica 15/10 путем введения делеции гена recD в хромосомную ДНК F. tularensis 15/10 с помощью суицидной плазмиды pPV recD.

Способ аттенуации штамма F. tularensis. subsp.holarctica 15/10 приводит к получению штамма F. tularensis 15/10 recD с делецией гена recD в геноме.

Штамм получен в результате аллельного обмена участка ДНК с делетированным геном recD из плазмиды pPY recD на исходный вариант в хромосоме F. tularensis 15/10. Отбор клонов с фенотипом Cm^r проводили на среде с хлорамфениколом (3 мкг/мл). Для элиминации плазмиды pPW recD культуру выращивали на среде с сахарозой. Изолированные колонии анализировали методом ПЦР. В результате был отобран клон с делегированным фрагментом генома размером 2,895 т.п.о. без гена recD. Отсутствие гена recD подтверждено методом ПЦР с использованием специфических праймеров.

Штамм предназначен для приготовления живой вакцины против туляремийной инфекции.

Штамм F. tularensis 15/10 recD депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов «ГКПМ», коллекционный номер В-6823.

Полученный штамм характеризуется следующими свойствами:

Культурально-морфологические особенности штамма:

Растет на обогащенных естественными субстратами питательных средах (кровь, яичный желток), таких как FT-агар (ФГУН ГНЦ ПМБ) и питательной среде на основе эритрит-агара с добавлением черного альбумина. В среды можно добавлять полимиксин в концентрации 100 мкг мл ^-1 для подавления посторонней микрофлоры. Темп развития замедленный. Оптимальная температура выращивания 37°C, pH 7,0-7,5. На плотной среде на основе эритрит-агара с добавлением черного альбумина за 48-72 часа образуются колонии диаметром около 2,0-2,5 мм, выпуклые, блестящие, гладкие, голубовато-белые, непрозрачные, однородные. Под микроскопом бактериальные клетки видны как очень мелкие грамотрицательные коккообразные клетки около 0,5 мкм, неподвижные, спор и капсул не образуют. Ауксотроф.

Генетические особенности штамма

Делетирован фрагмент хромосомной ДНК с геном recD.

Устойчивость (чувствительность) к антибиотикам, фагам и т.п.

Устойчив к 100 мкг/мл полимиксина, 100 мкг/мл ампициллина, 50 мкг/мл эритромицина. Лизирующие фаги не обнаружены. Устойчив к бактерицидному действию нормальной сыворотки животных.

Способ хранения

В лиофилизированном состоянии: 40%-ная сахарозо-желатиновая защитная среда, хранение при температуре (4-8)°C, перезакладка через 5 лет.

Пример 1. Способ аттенуации штамма F. tularensis 15/10 осуществляется следующим образом

Конструирование плазмиды для аллельного обмена pPV recD.

Для получения фрагмента хромосомной ДНК с делецией recD гена получают два ампликона (амплифицируют два фрагмента ДНК) размерами: 1433 п.о. с использованием праймеров FSD и RBD и 1462 п.о. с использованием праймеров FBD и RSD (Табл.1). Расчет праймеров проводят с использованием нуклеотидной последовательности генома F. tularensis LVS (АМ233362), взятого из банка генов (www.ncbi.nlm.nih.gov). Концевая 5' часть праймера FSD содержит сайт рестрикции Sail, концевая 5' - часть праймера RBD содержит сайт рестрикции BamHI и стоп-кодон ТТА, аналогично концевая 5' часть праймера FBD содержит сайт рестрикции BamHI и стоп-кодон ТАА, а праймер RSD на 5' - конце содержит сайт рестрикции Sall.

ПЦР проводят с помощью высокоточной полимеразы (High fidelity enzymes mix, «Fermentas», Lithuania). Реакционная смесь содержит буфер для ДНК-полимеразы 10х, фирмы «Fermentas», Lithuania (75 мМ Трис-HCl pH 8,8, 20 мМ (NH₄) ₂SO₄, 0,01% Tween 20), 2,5 мМ MgCl₂ 0,5 мкМ прямого и обратного праймеров (праймеры указаны в таблице 1.), 0,2 мкМ каждого дНТФ (10 mM dNTP) и 1 ед. Taq-ДНК-полимеразы фирмы «Fermentas», Lithuania; 50-100 нг ДНК. ПЦР-амплификацию проводят в следующем режиме: 95°C - 3 мин, 1 цикл; 94°C - 30 сек, 51°C - 30 сек, 72°C - 1 мин, 30 циклов; 72°C - 7 мин, 1 цикл. Продукты реакции разделяют электрофорезом в 0,7% агарозном геле.

Очистку ампликонов проводят с использованием DNA Extraction Kit (Fermentas, Lithuania). Ампликоны размером 1433 п.о. и 1462 п.о. обрабатывают рестриктазами Sall и BamHI и встраивают в Sall сайт рестрикции векторной плазмиды pPV, предварительно линеаризованной рестриктазой Sall.

Полученную рекомбинантную плазмиду переносят в клетки штамма Е. coli DH5 методом кальциевой трансформации. Отбор трансформантов с плазмидой pPV recD проводят по признаку ампициллинустойчивости и наличия фрагмента хромосомной ДНК F. tularensis 15/10. с делецией гена recD с помощью ПЦР, используя праймеры FSD и RSD.

Создание штамма Е. coli для переноса плазмиды pPV recD из Е. coli в F. tularensis 15/10.

Плазмиду pPV recD переносят в клетки штамма Е. coli S17-l(thi thr leu tonA lacY supE recA::RP4-2-Tc::Mu, Kn::Tn7) методом кальциевой трансформации. Отбор трансформантов с плазмидой pPV recD проводят по признаку устойчивости к ампициллину, хлорамфениколу, чувствительности к сахарозе и наличия фрагмента хромосомной ДНК F. tularensis 15/10 с делецией гена recD с помощью ПЦР, используя праймеры FSD и RSD.

Коньюгационный перенос pPV recD в F. tularensis. Для скрещивания готовят суспензию объемом 100 мкл, содержащую 1·10⁸ клеток донорного штамма Е. coli S17-1(pPV recD) и 3·10¹⁰ клеток реципиентного штамма F. tularensis 15/10, наносят пятнами по 25 мкл на агаровую среду Лурия-Бертани (LB) и инкубируют при температуре 25°C в течение 18 час.

Бактериальную культуру из пятен собирают, суспендируют в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) и высевают из соответствующих разведений на плотную питательную среду FT-arap (ФГУН ГНЦ ПМБ), содержащую 100 мкг мл^-1 полимиксина В и 3 мкг мл^-1 хлорамфеникола, и инкубируют посевы при температуре 37°C.

Выросшие колонии через 120 час инкубации пересевают на среду FT-arap, содержащую 100 мкг мл^-1 полимиксина В и 5% сахарозы, до изолированных колоний и инкубируют при 37°C. Выросшие колоний через 48 часов инкубации проверяют по признаку чувствительности к хлорамфениколу.

Отобранные колонии проверяют в ГЩР с использованием праймеров FSD и RSD. Клоны, обладающие делеционным вариантом recD гена, дают синтез укороченного ампликона размером 2895 п.о., тогда как клоны исходного штамма 15/10 дают синтез ампликона размером 3497 п.о. В результате был отобран клон F. tularensis 15/10 с recD генотипом. Этот клон проверялся с помощью ПЦР на отсутствие гена cat (детерминирующего устойчивость к хлорамфениколу) с использованием праймеров CCF (5'-ACAATTGGAAGAGAAAAGА-3') и CCR (5'-CTATCTGACAATTCCTGA-3'). У исследованного клона отсутствовал ген cat.

Пример 2. Свойства штамма F. tularensis 15/10 recD.

Особенности роста F. tularensis 15/10 recD.

Для изучения динамики роста вакцинного штамма F. tularensis 15/10 recD используют жидкую питательную среду (г/л) следующего состава:

кислотный гидролизат казеина - 5 г;

дрожжевой экстракт - 5 г;

цистеина гидрохлорида моногидрат - 0,1 г;

фосфат калия однозамещенный - 12 г;

калий гидроксид - 3,9 г;

натрий хлористый - 5 г;

сульфат железа (II) семиводный - 6 мг;

глюкоза - 10 г;

вода - до 1 л.

pH среды - 7,2.

Автоклавирование среды проводят при 1 атм в течение 30 минут.

Культивирование проводят в качалочных колбах объемом 750 мл, содержащих 30 мл среды. Культивирование проводят на качалке с перемешиванием при 200 об/мин и температуре 37°C. Для сравнения динамики роста исследуемого штамма используют исходный вакцинный штамм F. tularensis 15/10.

Данные по величинам ОП (оптическая плотность суспензии на длине волны 595 нм) растущих культур приведены в таблице 2.

Таблица 2
Динамика роста вакцинных штаммов F.tularensis 15/10 и F.tularensis 15/10 recD, F. tularensis 15/10 recD (pHV33-mob/recD) в жидкой питательной среде.
Время инкубации, ч	Оптическая плотность
F.tularensis 15/10	F. tularensis 15/10 recD	F. tularensis 15/10 recD(pHV33-mob/recD)
0	1	1	1
1	1	1,35	1
2	1,70	1,76	1,65
3	2,33	2,41	2,3
4	3,14	2,73	3
5	4,25	3,44	4,3
6	5	4,20	5,35
7	5,83	5,58	6,25
Примечание: Начальное значение оптической плотности составляло для культур F.tularensis 15/10 0,048, F. tularensis 15/10 recD 0,034, F. tularensis 15/10 гесD(рНV33-mob/recD) 0,040.

После введения плазмиды pHV33-mob/recD в штамм F. tularensis 15/10 recD (комплементации гена recD) восстанавливаются ростовые свойства, характерные для культуры F. tularensis 15/10. Динамика скорости роста F. tularensis 15/10 recD(pHV33-mob/recD) увеличивается и приближается к исходному штамму F. tularensis 15/10 (Таблица 2.)

Плазмида pHV33-mob/recD была получена в результате встраивания в векторную плазмиду pHV33-mob по сайту рестрикции Sail ампликона размером 3497 п.о. с интактным геном recD. Этот ампликон был получен на матрице хромосомной ДНК F. tularensis 15/10 с праймерами FSD и RSD (Табл. 1).

Результаты, представленные в таблицах 2, свидетельствуют о том, что инактивация гена recD влияет на процессы роста F. tularensis 15/10.

Оценка внутриклеточного размножения штамма F. tularensis 15/10 recD в культуре макрофагоподобных клеток линии J774.A1

Мышиные макрофагоподобные клетки линии J774.A1 культивируют в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% инактивированной фетальной сыворотки теленка и 2 мМ глутамина в 24-луночных планшетах (Gibco BRL/Life Technologies АВ (Taby, Швеция). Через 18 ч вносят бактериальную взвесь различных штаммов F. tularensis в среде DMEM из расчета 100 бактериальных клеток на 1 макрофаг, инкубируют при температуре 37°C и 5% содержания углекислого газа в течение трех часов, затем для уничтожения внеклеточных бактерий обрабатывают гентамицином 10 мкг мл ^-1, обладающим бактерицидным действием в отношении F. tularensis, но не проникающим в макрофаги.

После трехкратного отмывания от антибиотика клеточный монослой в части лунок лизируют дистиллированной водой и делают высевы десятикратных разведений на чашки с FT-агаром. Макрофаги в остальных лунках продолжают культивировать в среде DMEM с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка до 24 ч и до 48 ч при 37°C и 5% углекислого газа, после чего также лизируют дистиллированной водой и делают высевы на чашки с FT-агаром. Жизнеспособность макрофагов определяют окрашиванием трипановым синим и последующим визуальным подсчетом мертвых клеток в камере Горяева. Процент мертвых клеток в культуре как сразу после выделения, так и после двухсуточного культивирования не должен превышать 5%. Эффективность размножения оценивают по разнице между десятичными логарифмами КОЕ, полученных для высевов через 3, 24 и 48 ч после инфицирования. Данные, полученные по высевам из макрофагов, инфицированных штаммами F. tularensis, приведены в таблице 3.

Таблица 3
Размножение рекомбинантного штамма F. tularensis 15/10ArecD и исходного штамма F. tularensis 15/10 в макрофагах линии J774.A1.
Показатель	Время фагоцитоза	Штаммы
15/10	recD
Lg	3 ч	4,1±0,08	3,6±0,18
КОЕ/мл	24 ч	6,0±0,05	4,9±0,20
	48 ч	6,0±0,19	4,5±0,16
разница Lg		1,9	0,9

Как видно из результатов таблицы, инактивация гена recD влияет на способность штамма F. tularensis 15/10 recD выживать и размножаться внутри мышиных макрофагоподобных клеток J774.1A. по сравнению с исходным вакцинным штаммом.

Частоты гомологичной рекомбинации у F. tularensis 15/10 recD и F.tularensis 15/10.

Для проверься способности полученного штамма F. tularensis 15/10 recD к гомологичной рекомбинации проводят коньюгационный перенос плазмиды pPV/ iglC (плазмида pPV, содержащая фрагмент хромосомы F.tularensis 15/10 с инактивированным геном iglC) из штамма Е. coli S17-1 в штамм F. tularensis 15/10 recA. В качестве контроля используют исходный штамм F. tularensis 15/10, в который также переносят плазмиду pPV/ iglC. Для определения эффективности переноса плазмид из Е. coli S17-1 в исследуемые штаммы F.tularensis используют штамм Е. coli S17-1 с плазмидой pHV33-mob. Высев конъюгантов проводят на FT-arap, содержащий 100 мкг мл^-1 полимиксина В и 3 мкг мл^-1 хлорамфеникола. Полученные результаты свидетельствуют о том, что частота коньюгационного переноса плазмиды pHV33-mob из Е. coli S17-1 в исследуемые штаммы F. tularensis одинакова и составляет 10^-2. Частота интеграции pPV/ iglC в хромосомную ДНК штамма F. tularensis 15/10 составила 10^-7, тогда как для F. tularensis 15/10 recD клоны с интегрированной плазмидой не были получены, т.е. частота интеграции составила менее 10^-9. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что деления recD гена приводит к репрессии механизма рекомбинации.

Определение вирулентности F. tularensis 15/10 recD для мышей линии BALB/c.

Мыши линии BALB/c (по 5 мышей в группе, возраст 6-8 недель) инфицируют подкожно бактериальной суспензией в дозах 1×10¹, 1×10 ², 1×10³ и 1×l0⁴ КОЕ/мышь. Животных наблюдают в течение 30 дней. LD₅₀ определяют по методу Кербера в модификации И.П.Ашмарина. Результаты определения LD₅₀ для штамма F. tularensis 15/10 recD представлены в таблице 4. Для сравнения в этой таблице приведено значение LD₅₀ для вакцинного штамма F.tularensis 15/10.

Таблица 4
LD50 для штаммов F. tularensis 15/10 и F.tularensis 15/10 recD
Штаммы F. tularensis	LD50, КОЕ
F. tularensis 15/10	5,0 ×102
F. tularensis 15/ recD	5,0×10 8

Данные, приведенные в таблице, показывают, что утрата способности продуцировать белок RecD приводит к снижению вирулентности делеционного варианта по гену recD на шесть порядков по сравнению с вакцинным штаммом F. tularensis 15/10.

Оценка протективности штамма F.tularensis 15/10 recD.

Мыши линии BALB/c (по 5 животных в группе) иммунизируют подкожно бактериальной суспензией исследуемого штамма F. tularensis дозами 1×10¹, 1×10 ², 1×10³ и 1×l0⁴ КОЕ/мьппь. Мышам контрольной группы был введен ЗФР. На 35 сутки после иммунизации проведено подкожное заражение животных всех групп штаммом F. tularensis 503 дозой 1×10² КОЕ/мышь (при подкожном заражении DCL F. tularensis 503 равна 1 клетке). Наблюдение за зараженными животными проводят в течение 21 суток. Протективные свойства штамма оценивают по доле выживших после заражения животных в процентах.

Данные по выживаемости животных, предварительно иммунизированных вакцинным штаммом F. tularensis 15/10 recD, представлены в таблице 5. Для сравнения в этой таблице приведены данные по выживаемости животных, предварительно иммунизированных вакцинным штаммом F.tularensis 15/10 и F.tularensis 15/10 recD.

Таблица 5
Протективность штамма F.tularensis 15/10 и F.tularensis 15/10 recD
Доза иммунизации, КОЕ/мышь	Доза заражения КОЕ/мышь	Процент выживших животных
Иммунизация 15/10	Иммунизация 15/10 recD
1×101		100	60
1×10 2		100	100
	1×10 2
1×103		100	100
1×l0 4		НД	100

Протективные свойства штаммов F. tularensis 15/10 и F. tularensis 15/10 recD практически не отличаются.

Данные примеры позволяют сделать выводы о том, что предложенный способ аттенуации штамма F.tularensis 15/10 путем введения делеции гена recD в геном приводит к снижению остаточной вирулентности для мышей, снижает способность к гомологичной рекомбинации, тем самым стабилизируя геном. Протективные свойства на мышиной модели туляремии не изменились по сравнению с вакцинным штаммом F. tularensis 15/10. Полученные результаты свидетельствует о положительным влиянии делеции гена recD на вакцинные свойства F. tularensis. subsp.holarctica recD 15/10.

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет снизить вирулентность, сохранить постоянство генома и протективные свойства вакцинного штамма.