композиция и микросфера с контролируемым высвобождением экзендина и способ получения микросферы

Формула изобретения

1. Микросфера с контролируемым высвобождением, имеющая покровный слой и содержащая

ядро, содержащее экзендин в качестве активного ингредиента и биоразлагающийся полимер, и

покровный слой, который покрывает ядро покрывающим материалом, при этом экзендин является экзендином-4 (SEQ ID NO:2), биоразлагающийся полимер представляет собой полимер, выбранный из группы, состоящей из полилактида (PLA), полигликолида (PGA), сополимера лактида и гликолида (PLGA), сложного полиортоэфира, полиангидрида, полигидроксимасляной кислоты, поликапролактона и полиалкилкарбоната; сополимера или простой смеси двух или более полимеров, выбранных из указанной группы полимеров; сополимер указанного полимера и полиэтиленгликоля (PEG); или полимерно-сахарный комплекс, в котором сахар связан с указанным полимером или указанным сополимером,

покрывающий материал выбран из группы, состоящей из основных аминокислот, полипептидов и органических азотистых соединений, причем основная аминокислота является одной или более, выбранной из группы, состоящей из аргинина, лизина и гистидина; полипептид представляет собой L-Lys-L-Thr-L-Thr-L-Lys-L-Ser; а органическое азотистое соединение выбрано из группы, состоящей из креатина, креатинина и мочевины, причем содержание покровного слоя составляет от 0,01 до 5 мас.ч. в расчете на 100 мас.ч. микросферы.

2. Микросфера с контролируемым высвобождением по п.1, в которой биоразлагающийся полимер имеет характеристическую вязкость от 0,1 до 0,6 дл/г.

3. Микросфера с контролируемым высвобождением по п.1, в которой биоразлагающийся полимер имеет характеристическую вязкость от 0,15 до 0,31 дл/г.

4. Микросфера с контролируемым высвобождением по п.1, в которой содержание экзендина составляет от 0,1 до 10 мас.ч. в расчете на 100 мас.ч. микросферы.

5. Микросфера с контролируемым высвобождением по любому из пп.1-4, дополнительно содержащая один ингредиент или более, выбранный из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых защитных коллоидов и наполнителей.

6. Способ получения экзендинсодержащей микросферы с контролируемым высвобождением, имеющей покровный слой, по п.1, содержащий следующие операции:

смешивание экзендина и биоразлагающегося полимера для получения эмульсии типа «вода в масле» или гомогенной смеси; и

эмульгирование путем добавления эмульсии или гомогенной смеси в водный раствор покрывающего материала для образования покровного слоя,

при этом экзендин является экзендином-4 (SEQ ID NO:2), биоразлагающийся полимер представляет собой полимер, выбранный из группы, состоящей из полилактида (PLA), полигликолида (PGA), сополимера лактида и гликолида (PLGA), сложного полиортоэфира, полиангидрида, полигидроксимасляной кислоты, поликапролактона и полиалкилкарбоната; сополимера или простой смеси двух или более полимеров, выбранных из указанной группы полимеров; сополимер указанного полимера и полиэтиленгликоля (PEG); или полимерно-сахарный комплекс, в котором сахар связан с указанным полимером или указанным сополимером, а

покрывающий материал выбран из группы, состоящей из основных аминокислот, полипептидов и органических азотистых соединений, причем основная аминокислота является одной или более, выбранной из группы, состоящей из аргинина, лизина и гистидина; полипептид представляет собой L-Lys-L-Thr-L-Thr-L-Lys-L-Ser; а органическое азотистое соединение выбрано из группы, состоящей из креатина, креатинина и мочевины, причем содержание покровного слоя составляет от 0,01 до 5 мас.ч. в расчете на 100 мас.ч. микросферы.

7. Способ по п.6, в котором концентрация водного раствора покрывающего материала составляет от 0,01 М до 1 М.

8. Способ получения экзендинсодержащих микросфер с контролируемым высвобождением, имеющих покровный слой, по п.1, содержащий следующие операции:

смешивание экзендина и биоразлагающегося полимера для образования эмульсии или гомогенной смеси;

отверждение полученной эмульсии или гомогенной смеси для изготовления первичных микросфер; и

суспензирование полученных первичных микросфер в водном растворе покрывающего материала для образования покровного слоя на каждой микросфере,

при этом экзендин является экзендином-4 (SEQ ID NO:2) биоразлагающийся полимер представляет собой полимер, выбранный из группы, состоящей из полилактида (PLA), полигликолида (PGA), сополимера лактида и гликолида (PLGA), сложного полиортоэфира, полиангидрида, полигидроксимасляной кислоты, поликапролактона и полиалкилкарбоната; сополимера или простой смеси двух или более полимеров, выбранных из указанной группы полимеров; сополимер указанного полимера и полиэтиленгликоля (PEG); или полимерно-сахарный комплекс, в котором сахар связан с указанным полимером или указанным сополимером, а

покрывающий материал выбран из группы, состоящей из основных аминокислот, полипептидов и органических азотистых соединений, причем основная аминокислота является одной или более, выбранной из группы, состоящей из аргинина, лизина и гистидина; полипептид представляет собой L-Lys-L-Thr-L-Thr-L-Lys-L-Ser; а органическое азотистое соединение выбрано из группы, состоящей из креатина, креатинина и мочевины, причем содержание покровного слоя составляет от 0,01 до 5 мас.ч. в расчете на 100 мас.ч. микросферы.

9. Способ по п.8, в котором операцию отверждения осуществляют способом разделения фаз или способом распылительной сушки.

10. Способ по п.8, в котором концентрация водного раствора покрывающего материала составляет от 0,01 М до 1 М.

Описание изобретения к патенту

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

Данная заявка заявляет льготное право приоритета корейской патентной заявки № 10-2007-0029586, поданной 27 марта 2007, которая настоящим включена посредством ссылки для всех целей, как будто она полностью изложена в настоящем описании.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

(a) Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композиции с контролируемым высвобождением и микросфере с контролируемым высвобождением, содержащим экзендин в качестве активного ингредиента, а также к способу их получения.

(b) Описание аналогов

Экзендины представляют собой агонисты глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1), действующие как GLP-1 в организме, а экзендин-4 обладает 53%-ной гомологией последовательностей с аминокислотной последовательностью GLP-1(7-36)NH₂ (Goke, et al., J. Biol. Chem., 268: 19650-19655, 1993).

GLP-1, типичный инкретиновый гормон, является пептидом, выделенным из L-клеток кишечника, выделяется при попадании пищи в пищеварительный тракт и снижает уровень сахара в крови путем стимулирования секреции инсулина из бета-клеток поджелудочной железы (Orskov, et al., Diabetes, 42:658-661, 1993). Кроме того, GLP-1 ингибирует высвобождение глюкагона из альфа-клеток поджелудочной железы (D'Alessio, et al., J. Clin. Invest., 97:133-138, 1996) и увеличивает время освобождения желудочно-кишечного тракта, что приводит к ингибированию всасывания пищи (Schira, et al., J. Clin. Invest., 97:92-103, 1996). Функции GLP-1 заключаются не только в стимулировании секреции инсулина из бета-клеток поджелудочной железы, но также в повышении скорости пролиферации и уровня выживаемости бета-клеток (Buteau, et al., Diabetologia, 42:856-864, 1999). Однако GLP-1 теряет способность выполнения своей функции с расщеплением его N-терминального участка посредством дипептидилпептидазы-4 (DPP-4) и имеет очень короткое время полужизни, составляющее приблизительно 2 минуты (Pridal, et al., Eur. J. Drug. Metab. Pharmacokinet., 21:51-59, 1996; Deacon, et al., Diabetes, 47:764-769, 1998).

Экзендины известны способностью повышать секрецию инсулина в зависимости от уровня сахара в крови в организме, ингибировать высвобождение глюкагона после еды, а также снижать скорость освобождения желудочно-кишечного тракта, что приводит к ингибированию всасывания пищи. Кроме того, экзендины обладают преимуществом более длительного времени полужизни по сравнению с GLP-1, поскольку экзендин, в отличие от GLP-1, не расщепляется на N-терминальном участке посредством DPP-4, и поэтому экзендины могут проявлять свое действие в организме в течение более длительного времени, чем GLP-1 (Thum, et al., Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes., 110:113-118, 2002). Экзендины обнаруживаются в выделениях слюнных желез ящерицы Хила (Gila monster) и мексиканского ядозуба (Mexican Beaded Lizard), причем экзендин-3 обнаружен у мексикансого ядозуба, Heloderma horridum, a экзендин-4 обнаружен у ящерицы Хила, Heloderma suspectum (Eng, J., et al., J. Biol. Chem., 265:20259-62, 1990; Eng., J., et al., J. Biol. Chem., 267:7402-05, 1992).

Посредством внутрибрюшинных инъекций экзендина-4 мышам с диабетом, обусловленным ожирением (ob/ob-мышам) один раз в день было подтверждено, что экзендин-4 обладает пролонгированным эффектом снижения уровня сахара в крови (Greig et al., Diabetologia 42:45-50, 1999). Недавно был разработан состав для экзендина-4 в качестве агента инъекции, который вводится подкожно два раза в день в дозе, составляющей 5 мкг или 10 мкг. Несмотря на то что экзендин проявляет стабильность в отношении энзима DPP-4, он также известен способностью вызывать такие побочные эффекты, как рвота, тошнота, головные боли и тому подобное, при подкожном введении человеку в дозе 0,2 мкг/кг или более (Drug Development Research, 53:260-267, 2001). При введении экзендинов ограничение дозы из-за побочных эффектов, связанных с начальным пиком и начальной высокой концентрацией в крови, представляет собой самое большое препятствие для разработки агента с контролируемым высвобождением экзендина.

В общем случае агент с контролируемым высвобождением водного лекарственного препарата демонстрирует очень высокий уровень высвобождения на начальной стадии после введения, и были проведены различные исследования с целью снижения чрезмерного начального пика. В частности, при разработке агента с контролируемым высвобождением экзендинов важно снижение начального пика для предупреждения таких побочных эффектов, как рвота, тошнота, головные боли и тому подобное, вызванных чрезмерным начальным пиком.

С целью снижения начального пика микросфер с контролируемым высвобождением, содержащих октреотид (octreotide), обладающий терапевтическим эффектом против акромегалии и подобных заболеваний, было проведено исследование по получению микросфер посредством получения первичной эмульсии лекарственного препарата вместе с глюкозой, и последующего осуществления способа двойного эмульгирования. В процессе данного исследования было обнаружено, что начальный пик может быть снижен посредством введения лекарственного препарата одновременно с глюкозой. Однако в условиях получения, в которых начальный пик от микросфер составляет приблизительно 5%, добавление глюкозы не может привести к увеличению вводимого количества, и скорее увеличивает начальный пик (J. Wang et al., Biomaterials, 25:1919-1927, 2004).

Поэтому технология, раскрытая в вышеупомянутом документе, весьма сложна для применения с целью получения состава с контролируемым высвобождением экзендина, у которого начальный пик должен составлять 5% или ниже для снижения побочных эффектов, вызванных начальным пиком.

Патент США № 7164005 и US2005/0271702 раскрывают способ получения экзендинсодержащих микросфер методом разделения фаз с использованием сополимера лактида и гликолида (PLGA)), у которого соотношение лактида и гликолида составляет 50:50. В вышеуказанных документах в качестве полимера используются полимер 3А (IV=0,38 дл/г (IV - сокращ. от Inherent Viscosity - характеристическая вязкость - примеч. перевод)), полимер 4А (IV=0,42 дл/г) и им подобные, в особенности, полимер 4А, предоставляемый компанией Alkermes Inc. В вышеуказанных документах микросферы получают путем смешивания пептидного лекарственного препарата с высаливающими компонентами, например, сульфатом аммония, и сахаров, например, сахарозой и маннитолом, для получения первичной эмульсии с целью улучшения биодоступности микросфер, состоящих из экзендина и полимера 3А или 4А, а также стабильности пептидного лекарственного препарата. То есть указанные документы предназначены для улучшения биодоступности посредством добавления добавок, например, сахаров, сульфата аммония, и им подобных, что обеспечивает достаточное высвобождение экзендина из полимерной матрицы. В результате биодоступность может быть улучшена до некоторой степени, однако значение максимальной концентрации (Cmax) остается высоким, что обуславливает проблему побочных эффектов, вызванных высоким начальным пиком. То есть при повышении биодоступности начальный пик становится чрезмерным, в то время как при снижении начального пика биодоступность снижается.

Как описано выше, существующая технология получения микросферы с контролируемым высвобождением ограничивается тем, что полученная микросфера имеет чрезмерно высокий начальный пик и неудовлетворительную биодоступность для применения в получении экзендинсодержащих микросфер с контролируемым высвобождением, которые требуют минимизации побочных эффектов, вызванных высоким начальным пиком, наряду с улучшением биодоступности.

Поэтому для разрешения вышеизложенных проблем необходимо разработать биоразлагающийся экзендинсодержащий состав, проявляющий низкий начальный пик и улучшенную биодоступность.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Чтобы удовлетворить вышеописанные нужды, целью настоящего изобретения является обеспечение агента с контролируемым высвобождением с высокой биодоступностью, содержащего экзендин в качестве активного ингредиента и биоразлагающийся полимер в качестве носителя, в котором снижен чрезмерный начальный пик, представляющий собой одну из проблем существующих агентов с контролируемым высвобождением, и способ его получения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой график, показывающий изменение концентрации лекарственного препарата в крови у крыс в зависимости от наличия покровного слоя в экзендинсодержащем составе RG502H.

Фиг.2 представляет собой график, показывающий изменение концентрации лекарственного препарата в крови у крыс в зависимости от наличия покровного слоя в экзендинсодержащем составе RG503H.

Фиг.3 представляет собой график, показывающий изменение концентрации лекарственного препарата в крови у крыс в зависимости от наличия покровного слоя и типа покрывающих материалов в экзендинсодержащей смеси составов RG502H:RG503H=1:1.

Фиг.4а представляет собой изображение микросфер под электронным микроскопом, полученных обычным методом двойного эмульгирования.

Фиг.4b представляет собой изображение микросфер под электронным микроскопом, покрытых специальными покрывающими материалами методом двойного эмульгирования в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг.4с представляет собой изображение микросфер под электронным микроскопом, полученных методом двойного эмульгирования с покрывающими материалами в первичной водной фазе.

Фиг.4d представляет собой изображение микросфер под электронным микроскопом, полученных методом двойного эмульгирования с покрывающими материалами, растворенными с полимерами масляной фазы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Более полная оценка изобретения и множества присущих ему преимуществ будет сразу очевидна, как только это будет лучше понято посредством ссылки на нижеследующее подробное описание.

Настоящее изобретение относится к композиции с экзендинсодержащими микросферами с контролируемым высвобождением с высокой биодоступностью и минимизированным начальным пиком лекарственного препарата при введении в организм.

Корейский патент № 140209 раскрывает способ получения микросферы путем растворения водного лекарственного препарата со специфическими основными органическими материалами для получения первичной эмульсии и последующего осуществления метода двойного эмульгирования для ингибирования начального пика водного лекарственного препарата. Вышеуказаный документ раскрывает повышение эффективности насыщения лекарственным препаратом и ингибирование излишне высокого уровня начального пика посредством формирования прочного слоя путем взаимодействия между кислотными остатками биоразлагающихся полимеров и основными остатками лекарственного препарата. Как раскрыто в вышеуказанном документе, вышеуказанный способ может быть использован для получения композиции с контролируемым высвобождением, содержащей основный или нейтральный полипептид, например гонадотропин-высвобождающий гормон (LHRH), тиротропин-высвобождающий гормон (TRH) и их производные. Однако данный способ не может быть использован вследствие характеристик вводимых лекарственных препаратов, в частности, при получении композиции с контролируемым высвобождением, содержащей кислотный лекарственный препарат с относительно высокой молекулярной массой по сравнению с LHRH и TRH, например экзендин и ему подобные. Кроме того, в вышеуказанном способе добавление основных материалов вызывает увеличенную пористость поверхности полученных микросфер, и следовательно, данный способ не подходит для получения состава с контролируемым высвобождением, содержащего экзендин, который проявляет различные побочные эффекты, вызываемые начальным пиком.

Авторы настоящего изобретения подтвердили, что микросферы, имеющие высокую биодоступность и не имеющие побочных эффектов вследствие чрезмерного начального пика, могут быть выполнены посредством их покрытия специфическими покрывающими материалами во время или после получения экзендинсодержащих микросфер с использованием биоразлагающихся полимеров в качестве носителей, чтобы сделать настоящее изобретение.

Во-первых, настоящее изобретение обеспечивает композицию с контролируемым высвобождением, содержащую экзендин в качестве активного ингредиента, биоразлагающийся полимер со специфической вязкостью и покрывающие материалы с высокой биодоступностью и длительным высвобождением активного ингредиента в эффективной концентрации в течение определенного периода времени без чрезмерного начального пика активного ингредиента.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает микросферу с контролируемым высвобождением, содержащую ядро, включающее экзендин в качестве активного ингредиента и биоразлагающийся полимер; и покровный слой, покрывающий ядро.

Далее настоящее изобретение описывается более конкретно.

В настоящем изобретении экзендин может быть одним или более, выбранным из группы, состоящей из экзендина-3 (SEQ ID NO:1), экзендина-4 (SEQ ID NO:2), их фрагментов и производных и их фармацевтически приемлемых солей.

Производные экзендина могут быть соединением, представленным следующей химической формулой I, или его фармацевтически приемлемой солью.

(Химическая формула I)

Xaa1 Хаа2 Хаа3 Хаа4 Хаа5 Хаа6 Хаа7 Хаа8 Хаа9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Хаа13 Хаа14 Хаа15 Хаа16 Хаа17 Ala Xaa19 Хаа20 Хаа21 Хаа22 Хаа23 Хаа24 Хаа25 Xaa26 Xaa27 Xaa28-Z1,

где:

Xaa1 представляет собой His, Arg, Tyr, Ala, Norval, Val, Norleu или 4-имидазопропионил;

Хаа2 представляет собой Ser, Gly, Ala или Thr;

Хаа3 представляет собой Ala, Asp или Glu;

Хаа4 представляет собой Ala, Norval, Val, Norleu или Gly;

Хаа5 представляет собой Ala или Thr;

Хаа6 представляет собой Ala, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Хаа7 представляет собой Thr или Ser;

Хаа8 представляет собой Ala, Ser или Thr;

Хаа9 представляет собой Ala, Norval, Val, Norleu, Asp или Glu;

Xaa10 представляет собой Ala, Leu, Ile, Val, пентилглицин или Met;

Xaa11 представляет собой Ala или Ser;

Xaal2 представляет собой Ala или Lys;

Хаа13 представляет собой Ala или Gln;

Хаа14 представляет собой Ala, Leu, Ile, пентилглицин, Val или Met;

Хаа15 представляет собой Ala или Glu;

Хаа16 представляет собой Ala или Glu;

Хаа17 представляет собой Ala или Glu;

Xaa19 представляет собой Ala или Val;

Хаа20 представляет собой Ala или Arg;

Хаа21 представляет собой Ala, Leu, или Lys-NH -R (где R представляет собой Lys, Arg либо линейный или разветвленный алканоил с 1-10 атомами углерода);

Хаа22 представляет собой Ala, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Хаа23 представляет собой Ile, Val, Leu, пептилглицин, трет-бутилглицин или Met;

Хаа24 представляет собой Ala, Glu или Asp;

Хаа25 представляет собой Ala, Trp, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Хаа26 представляет собой Ala или Leu;

Хаа27 представляет собой Ala или Lys;

Хаа28 представляет собой Ala или Asn; и

Z1 представляет собой -ОН,

-NH2,

Gly-Z2,

Gly Gly-Z2,

Gly Gly Xaa31-Z2,

Gly Gly Xaa31 Ser-Z2,

Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z2,

Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z2,

Gly Gly Xaa31 Ser Ser GlyAla-Z2,

Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2,

Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Хаа36 Xaa37-Z2,

Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Хаа36 Xaa37 Xaa38-Z2 или

Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Хаа36 Xaa37 Xaa38 Xaa39-Z2,

(где Xaa31, Хаа36, Xaa37 и Xaa38 являются независимо Pro, гомопролином, 3Нур, 4Нур, тиопролином, N-алкилглицином, N-алкилпентилглицином или N-алкилаланином, Хаа39 представляет собой Ser или Tyr, а более предпочтительно - Ser, и Z2 представляет собой -ОН или -NH₂),

при условии, что не более трех из Xaa3, Хаа4, Хаа5, Хаа6, Хаа8, Хаа9, Xaa10, Xaa11, Xaa12, Хаа13, Хаа14, Хаа15, Хаа16, Хаа17, Хаа19, Хаа20, Хаа21, Хаа24, Хаа25, Хаа26, Хаа27 и Хаа28 представляют собой Ala, и если Xaa1 представляет собой His, Arg или Tyr, по меньшей мере, одна из Xaa3, Хаа4, и Хаа9 представляет собой Ala.

Предпочтительные N-алкильные группы для N-алкилглицина, N-алкилпентилглицина и N-алкилаланина могут включать низшие алкильные группы, предпочтительно из 1 до приблизительно 6 атомов углерода, более предпочтительно, из 1 до 4 атомов углерода. Соединение, представленное химической формулой I, может включать соединения, идентифицированные в примерах 1-89 (Соединения 1-89, соответственно), и соответствующие соединения, идентифицированные в примерах 104 и 105 заявки РСТ с серийным номером PCT/US98/24273, поданной 13 ноября 1998 г. с названием «Новые соединения агониста экзендина» ("Novel Exendin Agonist Compounds"), которая приведена здесь в качестве ссылки.

Предпочтительные производные экзендина химической формулы I могут включать те, в которых Xaa1 представляет собой His, Ala, Norval или 4-имидазопропионил, более предпочтительно, Xaa1 представляет собой His, Ala или 4-имидазопропионил, и еще более предпочтительно, Xaa1 представляет собой His или 4-имидазопропионил).

Предпочтительные производные экзендина химической формулы I могут быть теми, в которых Хаа2 представляет собой Gly.

Предпочтительные производные экзендина химической формулы I могут быть теми, в которых Хаа3 представляет собой Ala.

Предпочтительные производные экзендина химической формулы I могут быть теми, в которых Хаа4 представляет собой Ala.

Предпочтительные производные экзендина химической формулы I могут быть теми, в которых Хаа9 представляет собой Ala.

Предпочтительные производные экзендина химической формулы I могут быть теми, в которых Xaa14 представляет собой Leu, пентилглицин или Met.

Предпочтительные производные экзендина химической формулы I могут быть теми, в которых Хаа21 представляет собой Lys-NH -R (где R представляет собой Lys, Arg либо линейный или разветвленный алканоил с 1-10 атомами углерода).

Предпочтительные производные экзендина химической формулы I могут быть теми, в которых Хаа25 представляет собой Trp или Phe.

Предпочтительные производные экзендина химической формулы I могут быть теми, в которых Хаа6 представляет собой Ala, Phe или нафтилаланин, Хаа22 представляет собой Phe или нафтилаланин, и Хаа23 представляет собой Ile или Val. Кроме того, предпочтительные производные экзендина химической формулы I могут быть теми, в которых Хаа31, Хаа36, Хаа37 и Хаа38 независимо выбраны из группы, состоящей из Pro, гомопролина, тиопролина и N-алкилаланина, и более предпочтительно Z1 представляет собой -NH2, a Z2 представляет собой -NH2.

В другом аспекте предпочтительные производные экзендина химической формулы I могут быть теми, в которых Xaa1 представляет собой Ala, His или Tyr, и более предпочтительно - Ala или His; Xaa2 представляет собой Ala или Gly; Хаа6 представляет собой Phe или нафтилаланин; Xaa14 представляет собой Ala, Leu, пентилглицин или Met; Xaa22 представляет собой Phe или нафтилаланин; Хаа23 представляет собой Ile или Val; Хаа31, Хаа36, Хаа37 и Хаа38 независимо выбраны из группы, состоящей из Pro, гомопролина, тиопролина и N-алкилаланина; Хаа39 представляет собой Ser или Tyr и более предпочтительно - Ser; и предпочтительно Z1 представляет собой -NH2.

В соответствии с особенно предпочтительным аспектом особенно предпочтительные производные экзендина химической формулы I могут быть теми, в которых Xaa1 представляет собой His или Ala; Xaa2 представляет собой Gly или Ala; Хаа3 представляет собой Ala, Asp или Glu; Xaa4 представляет собой Ala или Gly; Хаа5 представляет собой Ala или Thr; Хаа6 представляет собой Phe или нафтилаланин; Хаа7 представляет собой Thr или Ser; Хаа8 представляет собой Ala, Ser или Thr; Хаа9 представляет собой Ala, Asp или Glu; Хаа10 представляет собой Ala, Leu или пентилглицин; Xaa11 представляет собой Ala или Ser; Хаа12 представляет собой Ala или Lys; Xaal3 представляет собой Ala или Gln; Xaa14 представляет собой Ala, Leu, Met или пентилглицин; Xaa15 представляет собой Ala или Glu; Xaa16 представляет собой Ala или Glu; Xaa17 представляет собой Ala или Glu; Xaa19 представляет собой Ala или Val; Хаа20 представляет собой Ala или Arg; Xaa21 представляет собой Ala или Leu; Xaa22 представляет собой Phe или нафтилаланин; Хаа23 представляет собой Ile, Val или трет-бутилглицин; Хаа24 представляет собой Ala, Glu или Asp; Xaa25 представляет собой Ala, Trp или Phe; Хаа26 представляет собой Ala или Leu; Хаа27 представляет собой Ala или Lys; Хаа28 представляет собой Ala или Asn; Z1 представляет собой -ОН, -NH2, Gly-Z2, Gly Gly-Z2, Gly Gly Xaa31-Z2, Gly Gly Xaa31 Ser-Z2, Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z2, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z2, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z2, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Хаа36 Xaa37-Z2, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Хаа36 Xaa37 Xaa38-Z2 или Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Хаа36 Xaa37 Xaa38 Xaa39-Z2; Xaa31, Хаа36, Xaa37 и Xaa38 независимо представляют собой Pro, гомопролин, тиопролин или N-метилаланин; Хаа39 представляет собой Ser или Tyr, а более предпочтительно Ser; и Z2 представляет собой -ОН или -NH2, при условии не более, чем три из Хаа3, Хаа5, Хаа6, Хаа8, Xaa10, Xaa11, Xaa12, Хаа13, Хаа14, Хаа15, Хаа16, Хаа17, Хаа19, Хаа20, Хаа21, Хаа24, Хаа25, Хаа26, Хаа27 и Хаа28 представляют собой Ala, и если Xaa1 представляет собой His, Arg или Tyr, по меньшей мере, одна из Хаа3, Хаа4 и Хаа9 может быть Ala.

Особенно предпочтительные соединения химической Формулы I могут включать те, которые имеют аминокислотные последовательности от SEQ ID NO:5 до SEQ ID NO:93, изложенные в заявке РСТ с серийным номером PCT/US98/25728, или те, которые изложены в предварительной заявке США 60/066029, включенные в данное описание в качестве ссылки.

В соответствии с особенно предпочтительным аспектом обеспечиваются соединения, в которых Xaa14 представляет собой Leu, Ile, Val или пентилглицин, а более предпочтительно Leu или пентилглицин; и Хаа25 представляет собой Ala, Phe, Tyr или нафтилаланин, а более предпочтительно Phe или нафтилаланин. Эти соединения будут менее чувствительны по отношению к окислительной деградации, как в условиях in vitro, так и in vivo, равно как и во время синтеза соединения.

В другом аспекте производные экзендина также могут включать соединения, представленные химической Формулой II, или их фармацевтически приемлемыми солями.

(Химическая формула II)

Xaa1 Хаа2 Хаа3 Хаа4 Хаа5 Хаа6 Хаа7 Хаа8 Хаа9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Хаа13 Хаа14 Хаа15 Хаа16 Хаа17 Ala Хаа19 Хаа20 Хаа21 Хаа22 Хаа23 Хаа24 Хаа25 Хаа26 X1-Z1,

где

Xaa1 представляет собой His, Arg, Tyr, Ala, Norval, Val, Norleu или 4-имидазопропионил;

Xaa2 представляет собой Ser, Gly, Ala или Thr;

Хаа3 представляет собой Ala, Asp или Glu;

Xaa4 представляет собой Ala, Norval, Val, Norleu или Gly;

Xaa5 представляет собой Ala или Thr;

Хаа6 представляет собой Ala, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Хаа7 представляет собой Thr или Ser;

Хаа8 представляет собой Ala, Ser или Thr;

Хаа9 представляет собой Ala, Norval, Val, Norleu, Asp или Glu;

Xaa10 представляет собой Ala, Leu, Ile, Val, пентилглицином (pentylglycine) или Met;

Xaa11 представляет собой Ala или Ser;

Xaa12 представляет собой Ala или Lys;

Xaa13 представляет собой Ala или Gln;

Xaa14 представляет собой Ala, Leu, Ile, пентилглицин, Val или Met;

Xaa15 представляет собой Ala или Glu;

Xaa16 представляет собой Ala или Glu;

Xaa17 представляет собой Ala или Glu;

Хаа19 представляет собой Ala или Val;

Хаа20 представляет собой Ala или Arg;

Хаа21 представляет собой Ala, Leu или Lys-NH -R (где R представляет собой Lys, Arg, линейный или разветвленный алканоил с 1-10 атомами углерода или циклический аллил-алканоил);

Хаа22 представляет собой Phe, Tyr или нафтилаланин;

Хаа23 представляет собой Ile, Val, Leu, пентилглицин, трет-бутилглицин или Met;

Хаа24 представляет собой Ala, Glu или Asp;

Хаа25 представляет собой Ala, Trp, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Хаа26 представляет собой Ala или Leu;

X1 представляет собой Lys Asn, Asn Lys, Lys-NH -R Asn, Asn Lys-NH -R, Lys-NH -R Ala, Ala Lys-NH -R (где R представляет собой Lys, Arg, линейный или разветвленный алканоил с 1-10 атомами углерода или циклоалкилалканоил);

Z1 представляет собой -ОН,

-NH2,

Gly-Z2,

Gly Gly-Z2,

Gly Gly Xaa31-Z2,

Gly Gly Xaa31 Ser-Z2,

Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z2,

Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z2,

Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z2,

Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2,

Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Хаа36 Xaa37-Z2,

Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Хаа36 Xaa37 Xaa38-Z2 или

Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Хаа36 Xaa37 Xaa38 Xaa39-Z2,

(где Xaa31, Хаа36, Xaa37 и Xaa38 независимо выбраны из группы, состоящей из Pro, гомопролина, 3Нур, 4Нур, тиопролина, N-алкилглицина, N-алкилпентилглицина и N-алкилаланина, Xaa39 представляет собой Ser или Tyr, и Z2 представляет собой -ОН или -NH₂),

при условии, что не более трех из Xaa3, Хаа4, Хаа5, Хаа6, Хаа8, Хаа9, Xaa10, Xaa11, Xaa12, Хаа13, Хаа14, Хаа15, Хаа16, Хаа17, Хаа19, Хаа20, Хаа21, Хаа24, Хаа25 и Хаа26 представляют собой Ala, а если Xaa1 представляет собой His, Arg, Tyr или 4-имидазопропионил, по меньшей мере, один из Xaa3, Хаа4 и Хаа9 представляет собой Ala.

Предпочтительные производные экзендина химической формулы II могут быть теми, в которых Xaa1 представляет собой His, Ala, Norval или 4-имидазопропионил, предпочтительно His, 4-имидазопропионил или Ala, а более предпочтительно His или 4-имидазопропионил.

Предпочтительные производные экзендина химической формулы II могут включать в себя те элементы, в которых Хаа2 представляет собой Gly.

Предпочтительные производные экзендина по Химической Формуле II могут быть теми, в которых Хаа4 представляет собой Ala.

Предпочтительные производные экзендина химической формулы II могут быть теми, в которых Хаа9 представляет собой Ala.

Предпочтительные производные экзендина химической формулы II могут быть теми, в которых Хаа14 представляет собой Leu, пентилглицин или Met.

Предпочтительные производные экзендина химической формулы II могут быть теми, в которых Хаа25 представляет собой Trp или Phe.

Предпочтительные производные экзендина химической формулы II могут быть теми, в которых Хаа6 представляет собой Ala, Phe или нафтилаланин, Хаа22 представляет собой Phe или нафтилаланин, и Хаа23 представляет собой Ile или Val.

Предпочтительные производные экзендина по Химической Формуле II могут включать в себя те элементы, в которых Z1 представляет собой -NH2.

Предпочтительные производные экзендина химической формулы II могут быть теми, в которых Хаа31, Хаа36, Хаа37 и Хаа38 независимо выбраны из группы, состоящей из Pro, гомопролина, тиопролина и N-алкилаланина.

Предпочтительные производные экзендина химической формулы II могут быть теми, в которых Хаа39 представляет собой Ser или Tyr и предпочтительно Ser.

Предпочтительные производные экзендина химической формулы II могут быть теми, в которых Z2 представляет собой -NH2.

Предпочтительные производные экзендина химической формулы II могут быть теми, в которых Z1 представляет собой -NH2.

Предпочтительные производные экзендина химической формулы II могут быть теми, в которых Хаа21 представляет собой Lys-NH -R (где R представляет собой Lys, Arg либо линейный или разветвленный алканоил с 1-10 атомами углерода).

Предпочтительные производные экзендина химической формулы II могут быть теми, в которых X1 представляет собой Lys Asn, Lys-NH -R Asn или Lys-NH -R Ala (где R представляет собой Lys, Arg либо линейный или разветвленный алканоил с 1-10 атомами углерода).

Предпочтительные производные экзендина химической формулы II могут включать соединения, имеющие аминокислотные последовательности, идентифицированные как SEQ ID NO:95- SEQ ID NO:110, представленные в WO99/025728. Производные экзендина химической формулы II могут включать соединения, имеющие аминокислотные последовательности, идентифицированные как SEQ ID NO:5- SEQ ID NO:93, как описано в РСТ заявке PCT/US98/24210, поданной 13 ноября 1998 г. с названием «Новые соединения агониста экзендина» ("Novel Exendin Agonist Compounds"). В другом аспекте производные экзендина химической формулы II могут включать соединения, имеющие аминокислотные последовательности, идентифицированные как SEQ ID NO:37- SEQ ID NO:40, приведенные в WO99/007404. Вышеуказанные документы включены в настоящее описание в качестве ссылок.

Аббревиатуры, использованные в химических формулах I и II, имеют следующие значения.

"ACN" и "CH₃CN" означают ацетонитрил.

"Вое", "tBoc" и "Tboc" означают трет-бутоксикарбонил.

"DCC" означает N,N'-дициклогексилкарбодиимид.

"Fmoc" означает фторэнилметоксикарбонил.

"HBTU" означает 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3,-тетраметилурониума гексафторфосфат.

"HOBt" означает 1-гидроксибензотриазола моногидрат.

"homoP" и "hPro" означают гомопролин.

"MeAla" и "Nme" означает N-метилаланин.

"naph" означает нафтилаланин.

"pG" и "pGly" означают пентилглицин.

"tBuG" означает третичный бутилглицин.

"ThioP" и "tPro" означает тиопролин.

"3Нур" означает 3-гидроксипролин.

"4Нур" означает 4-гидроксипролин.

"NAG" означает N-алкилглицин.

"NAPG" означает N-алкилпентилглицин.

"Norval" означает норвалин.

В предпочтительном примере осуществления фрагменты или производные экзендина могут иметь С-конец, замещенный или не замещенный амидной группой, и могут быть выбраны из группы, состоящей из экзендина-4 (1-28) (SEQ ID NO:3), экзендина-4(1-28) амида, экзендина-4(1-30) (SEQ ID NO:4), экзендина-4(1-30) амида, экзендина-4 (1-31) (SEQ ID NO:5), экзендина-4(1-31) амида, ¹⁴Leu²⁵ Phe экзендина-4(SЕО ID NO:6), ¹⁴Leu²⁵Phe экзендина-4 амида и их фармацевтически приемлемых солей.

Согласно предпочтительному примеру осуществления композиция или микросферы с контролируемым высвобождением могут содержать экзендин в качестве активного ингредиента в количестве от 0,1 до 10 масс. частей, а более предпочтительно от 0,8 до 6 масс. частей, в расчете на 100 мас. частей композиции или микросферы, содержащих экзендин, биоразлагающиеся полимеры и покрывающие материалы. Если количество экзендина, содержащегося в композиции или микросферах в соответствии с настоящим изобретением, ниже вышеуказанного диапазона, действенный эффект экзендина не может быть получен, а если количество экзендина выше вышеуказанного диапазона, начальный пик экзендина повышается, тем самым вызывая побочные эффекты вследствие чрезмерного начального пика, и таким образом, предпочтительно, чтобы количество экзендина было в пределах вышеуказанного диапазона.

Биоразлагающийся полимер относится ко всем полимерам, не наносящим вред человеческому организму, так как при его введении в организм он может медленно разлагаться и выводится. Биоразлагающийся полимер может включать один полимер или более, выбранный из группы, состоящей из полилактида (PLA), полигликолида (PGA), сополимера лактида и гликолида (PLGA), сложного полиортоэфира, полиангидрида, полигидроксимасляной кислоты, поликапролактона и полиалкилкарбоната, а также сополимеров одного полимера или более и полиэтиленгликоля (PEG), при этом один полимер или более могут быть в форме сополимера или простой смеси.

Например, биоразлагающийся полимер может быть одним полимером или более, выбранным из группы, состоящей из сополимеров лактида и гликолида (PLGA), состоящих из RG502H (IV=0,16 0,24 дл/г), RG503H (IV=0,32 0,44 дл/г) и RG504H (IV=0,45 0,60 дл/г), имеющих соотношение лактида и гликолида, равное 1:1, и RG752H (IV=0,14 0,22 дл/г), имеющим соотношение лактида и гликолида, равное 75:25, полилактидов (PLA), R202H (IV=0,16 0,24 дл/г) и R203H (IV=0,25 0,35 дл/г), которые предоставляются Boehringer-Ingelheim company, Германия; сополимеров лактида и гликолида), 5050DL 2А (IV=0,15 0,25 дл/г), 5050DL 3А (IV=0,25 0,43 дл/г), и 5050DL 4А (IV=0,38 0,48 дл/г), которые являются сополимерами, предоставляемыми Lakeshore Biomaterials Company (ранее Alkermes Company), США, имеющими соотношение лактид и гликолида, равное 1:1; и тому подобное.

В другом аспекте биоразлагающийся полимер может быть полимерно-сахарным комплексом, в котором сахар связывается с полимером, выбранным из группы, состоящей из полилактидов (PLA), полигликолидов (PGA), сополимеров лактида и гликолида (PLGA), сложных полиортоэфиров, полиангидридов, полигидроксимасляных кислот, поликапролактонов и полиалкилкарбонатов,

сополимером, по меньшей мере, двух полимеров из указанной группы полимеров или

сополимером полиэтиленгликоля (PEG) и одного полимера из указанной группы полимеров.

В примере осуществления настоящего изобретения, полимерно-сахарный комплекс может относиться к комплексу, в котором полимер замещен гидкроксильной группой сахара. Сахар может включать моносахариды и полисахариды, которые включают от 1 до 8 сахаридных единиц, при этом каждая сахаридная единица включает от 3 до 6 гидроксильных групп, и линейные сахарные спирты, включающие от 3 до 6 гидроксильных групп и имеющие молекулярную массу 20,000 или меньше. Сахарные спирты могут включать маннитол, пентаэритритол, сорбитол, рибитол и ксилитол. Полимер связывается с сахаром по трем или более гидроксильным группам, присутствующим в сахаре.

В соответствии с вышеизложенным примером осуществления полимерно-сахарный комплекс в условиях in vivo обладает свойствами, схожими со свойствами полимера, связанного с сахаром, имеет различные скорости разложения в зависимости от типа используемого полимера и в организме разлагается до безвредного полимера и сахара, а следовательно, он может быть подходящим как биоразлагающийся полимер. В предпочтительном примере осуществления полимерно-сахарный комплекс может быть PLA-глюкозным комплексом, PGA-глюкозным комплексом или PLGA-глюкозным комплексом, при этом PLGA-глюкозный комплекс может быть комплексом, имеющим следующую структуру:

В микросфере с контролируемым высвобождением согласно настоящему изобретению покровный слой, выполненный на ее поверхности, позволяет обеспечить эффективный контроль начального пика экзендина, тем самым предотвращая побочные эффекты, вызванные чрезмерным начальным пиком. Биоразлагающийся полимер может использоваться без какого-либо ограничения вязкости.

В композиции с контролируемым высвобождением согласно настоящему изобретению биоразлагающийся полимер выполняет роль матрицы для сохранения активного ингредиента, экзендина, у которой неудовлетворительно низкая вязкость полимера не позволяет эффективно сохранять активный ингредиент, что, как следствие, повышает начальный пик, а чрезмерно высокая вязкость полимера вызывает снижение общего высвобождаемого количества активного ингредиента, что, как следствие, снижает его биодоступность. В настоящем изобретении не только биоразлагающийся полимер, но также и покрывающие материалы, содержащиеся в композиции, выполняют роль контролирования высвобождения лекарственного препарата, и таким образом, может быть использован биоразлагающийся полимер, имеющий относительно низкую вязкость. Следовательно, чтобы эффективно контролировать начальный пик лекарственного препарата и повысить биодоступность, характеристическая вязкость (IV) биоразлагающегося полимера, измеряемая для биоразлагающегося полимера, растворенного в хлороформе при концентрации 1% (масса/объем) при 25±0,1°C с использованием вискозиметра Уббелоде, предпочтительно может быть от 0,1 до 0,6 дл/г, более предпочтительно от 0,15 до 0,31 дл/г и еще более предпочтительно от 0,16 до 0,24 дл/г.

В композиции или в микросферах по настоящему изобретению биоразлагающийся полимер выполняет роль матрицы для сохранения активного ингредиента в процессе высвобождения и для контролирования скорости высвобождения, при этом его содержание в композиции или в микросферах предпочтительно может быть от 85 до 99.89 мас. частей, а более предпочтительно - от 91 до 99 мас. частей в расчете на 100 мас. частей композиции или микросфер, содержащих экзендин, биоразлагающийся полимер(ы) и покрывающий материал(ы).

Покрывающий материал используется для предупреждения чрезмерного высвобождения и повышения биодоступности активного ингредиента, и в микросферах по настоящему изобретению он может быть в виде покровного слоя на их поверхности. Покрывающий материал может быть одним материалом или более, выбранным из основных аминокислот, полипептидов и органических азотистых соединений. Основная аминокислота может включать аргинин, лизин, гистидин и их производные. Полипептид может включать от 2 до 10 аминокислот, а более предпочтительно от 2 до 5 аминокислот, в том числе одну аминокислоту или более, выбранную из аргинина, лизина и гистидина. Полипептид может включать в себя больше основных аминокислот, чем кислых аминокислот, тем самым проявляя свойства основания. Например, полипептид может быть L-Ala-L-His-L-Lys, L-Arg-L-Phe, Gly-L-His, Gly-L-His-Gly, Gly-L-His-L-Lys, L-His-Gly, L-His-Leu, L-Lys-L-Tyr-L-Lys, L-His-L-Val, L-Lys-L-Lys, L-Lys-L-Lys-L-Lys, L-Lys-L-Thr-L-Thr-L-Lys-L-Ser, и т.п. Кроме того, органическое азотистое соединение может быть креатином, креатинином, мочевиной и т.п.

Количество покрывающего материала, содержащегося в композиции по настоящему изобретению или нанесенного на микросферы, предпочтительно может составлять от 0,01 до 5 мас. частей, а более предпочтительно - от 0,015 до 3 мас. частей в расчете на 100 мас. частей композиции или микросфер, содержащих экзендин, биоразлагающийся полимер(ы) и покрывающий материал(ы). Эффективный контроль высвобождения лекарственного препарата не может быть достигнут, если содержание покрывающего материала ниже указанного диапазона, в то же время эффект контролирования начального пика дополнительно не возрастает, даже если содержание покрывающего материала повышается сверх вышеуказанного диапазона. Таким образом, вышеуказанный диапазон содержания покрывающего материала может быть предпочтительным.

В соответствии с настоящим изобретением каждая микросфера с контролируемым высвобождением имеет гладкую поверхность, покрытую покрывающим материалом, и средний размер от 1 до 50 мкм, и предпочтительно от 5 до 30 мкм (см. Фиг.4-b). Такая гладкая поверхность микросферы позволяет достичь эффективный контроль начального пика и наилучшую биодоступность.

В отличие от обычной формы микросфера с контролируемым высвобождением или микросфера, полученная из композиции в соответствии с настоящим изобретением, покрыта покрывающим материалом, обеспечивающим предупреждение чрезмерного начального пика и повышение биодоступности, которые не могут быть достигнуты в обычной экзендинсодержащей микросфере. В частности, чрезмерный начальный пик экзендина вызывает различные побочные эффекты, такие как рвота, тошнота, головная боль и тому подобные, а следовательно, снижение величины начального пика до 5% или ниже является очень важным. Микросфера с контролируемым высвобождением или микросфера, полученная из композиции в соответствии с настоящим изобретением, позволяет снизить высвобождаемое количество в первые 24 часа до 5% или ниже. С целью снижения побочных эффектов, связанных с введением экзендинсодержащих микросфер с контролируемым высвобождением, величина начального пика в первый час может быть предпочтительно 5% или ниже, а более предпочтительно - 1% или ниже, как измерено посредством теста на высвобождение in vitro, описанного здесь.

Было предпринято несколько попыток снизить побочные эффекты, обусловленные чрезмерным начальным пиком экзендинсодержащих микросфер, полученных обычными способами. Однако большинство таких попыток, в результате которых было достигнуто успешное предупреждение чрезмерного начального пика, имеют некоторые проблемы в том, что общее высвобождение снижается как и начальный пик, вследствие чего значительно снижается биодоступность лекарственного препарата. Однако микросферы по настоящему изобретению содержат покровный слой из покрывающего материала на их поверхности, что позволяет обеспечить эффективный контроль начального пика для исключения побочных эффектов, обусловленных чрезмерным начальным пиком, и получить продолжительное и достаточное высвобождение лекарственного препарата для достижения наилучшей биодоступности.

В примере осуществления настоящего изобретения композиция или микросферы могут дополнительно содержать наполнители, например защитные коллоиды и/или стабилизаторы.

Композиция или микросферы могут дополнительно содержать один защитный коллоид или более, выбранный из поливиниловых спиртов, альбуминов, поливинилпирролидонов, желатинов и т.п. Насмотря на то что защитный коллоид не обладает специальным свойством предупреждения чрезмерного начального пика экзендина, содержащегося в микросферах, он выполняет роль предупреждения аггрегации между микросферами и улучшать диспергируемость. С учетом данной роли содержание защитного коллоида предпочтительно может составлять по массовой доле от 0,02% до 1,0% в расчете на общую массу композиции или микросфер, содержащих экзендин, биоразлагающийся полимер(ы) и покрывающий материал(ы).

Кроме того, для повышения стабильности микросфер в процессе лиофилизации композиция или микросферы по настоящему изобретению дополнительно могут содержать наполнители, выбранные из маннитола, трегалозы, сахарозы, натрия карбоксиметилцеллюлозы и т.п., в массовой доле от 5% до 30%, а более предпочтительно - в массовой доле от 10% до 20% в расчете на общую массу композиции или микросфер, содержащих экзендин, биоразлагающийся полимер(ы) и покрывающий материал(ы).

Также композиция или микросферы по настоящему изобретению дополнительно могут содержать любые добавки и наполнители, обычно используемые в составе лекарственных средств, тип и содержание которых могут быть без труда определены специалистом в соответствующей области.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения экзендинсодержащих микросфер с контролируемым высвобождением, описанных выше. В соответствии с настоящим изобретением, экзендинсодержащие микросферы с контролируемым высвобождением могут быть получены различными способами, например путем покрытия поверхности микросфер посредством суспензирования микросфер в растворе покрывающего материала в процессе или после получения микросфер для получения микросфер с контролируемым высвобождением. Способ получения микросфер в соответствии с настоящим изобретением может быть осуществлен методом двойной эмульсии (метод «вода-масло-вода»), методом одинарной эмульсии (метод «масло-вода»), методом фазового разделения, методом распылительной сушки и т.п.

Конкретно способ получения экзендинсодержащих микросфер с контролируемым высвобождением может включать следующие операции:

смешивание экзендина и биоразлагающегося полимера(ов) для получения эмульсии типа «вода в масле» или гомогенной смеси; и

эмульгирование путем добавления эмульсии или гомогенной смеси в водный раствор покрывающего материала для образования покровного слоя.

Еще конкретнее, в случае использования метода двойной эмульсии, способ по настоящему изобретению может включать операции эмульгирования путем смешивания водного раствора экзендина и биоразлагающегося полимера, растворенного в органическом растворителе, для образования первичной эмульсии (типа «вода в масле»); суспензирования эмульсии в водном растворе покрывающего материала для образования эмульсии типа «вода-масло-вода»; нагрева эмульсии типа «вода-масло-вода» для удаления растворителя и затвердевания полученных микросфер; сбора и промывки затвердевших микросфер; и лиофилизации микросфер. Органический растворитель может быть любым органическим растворителем, который способен образовывать эмульсию путем растворения биоразлагающегося полимера и затем смешиваться с водным раствором, и, например, он может быть одним или более раствором, выбранным из группы, состоящей из хлороформа, этилацетата, метиленхлорида и метилэтилкетона, а более предпочтительно метиленхлорида. В данном случае покрывающий материал содержится во вторичной водной фазе (внешняя водная фаза эмульсии «вода-масло-вода»), для образования покровного слоя на внешней стороне микросфер, содержащих экзендин и биоразлагающийся полимер, когда удаляется органический растворитель.

В другом случае, если используется метод одинарной эмульсии, способ по настоящему изобретению может включать операции растворения экзендина и биоразлагающегося полимера в органическом растворителе для образования гомогенной смеси; добавления водного раствора, содержащего покрывающий материал, к полученной смеси для образования эмульсии; нагрева эмульсии для удаления растворителя и затвердения полученных микросфер; сбора и промывки затвердевших микросфер; и лиофилизации микросфер. Органическим растворителем может быть любой органический растворитель, способный как полностью смешивать экзендин и биоразлагающийся полимер для образования гомогенной смеси, так и смешиваться с водным раствором для образования эмульсии. Например, органическим растворителем может быть смешанный растворитель, в котором смешаны один растворитель или более, выбранный из группы, состоящей из спиртов, имеющих от 1 до 5 атомов углерода, ледяной уксусной кислоты, муравьиной кислоты, диметилсульфоксида и N-метилпирролидона, и один растворитель или более, выбранный из группы, состоящей из хлороформа, этилацетата, метилэтилкетона и метиленхлорида, и предпочтительно, в котором смешаны метанол и метиленхлорид. В этом случае поверхность окончательно полученных микросфер имеет покровный слой на ней за счет эмульгирования гомогенной смеси биоразлагающегося полимера и экзендина и добавления покрывающего материала к водному раствору для удаления органического растворителя.

В другом аспекте способ получения экзендинсодержащих микросфер с контролируемым высвобождением по настоящему изобретению может включать операции:

смешивания экзендина и биоразлагающегося полимера для образования эмульсии или гомогенной смеси;

отверждения полученной эмульсии или гомогенной смеси для получения первичных микросфер; и

суспензирования полученных первичных микросфер в водном растворе покрывающего материала для образования покровного слоя на каждой микросфере.

Способ отверждения не имеет ограничения и может быть любым способом отверждения, обычно используемым в соответствующей области, например, способом разделения фаз или способом распылительной сушки.

Более конкретно, в случае применения способа разделения фаз на операции отверждения способ по настоящему изобретению может включать операции:

смешивания водного раствора экзендина и биоразлагающегося полимера, растворенного в органическом растворителе, для образования эмульсии или смешивания экзендина и биоразлагающегося полимера в смешанном растворителе для образования раствора гомогенной смеси;

добавления масла, например силиконового масла, к полученной эмульсии или раствору для получения первичных микросфер;

добавления осадителя для биоразлагающегося полимера, например смешанного растворителя из спирта, имеющего от 1 до 5 атомов углерода, и алкана, имеющего от 1 до 12 атомов углерода, предпочтительно смешанного растворителя из этанола и гептана, для удаления органического растворителя из микросфер и затвердения микросфер;

суспензирования полученных микросфер в водном растворе покрывающего материала для образования покровного слоя на каждой микросфере; и

сбора, промывки и лиофилизации микросфер с образованным покровным слоем.

Органический растворитель может быть одним растворителем или более, выбранным из группы, состоящей из хлороформа, этилацетата, метиленхлорида и метилэтилкетона, а предпочтительно он может быть метиленхлоридом. Смешанный растворитель может быть таким, в котором смешаны один растворитель или более, выбранный из группы, состоящей из спирта, имеющего от 1 до 5 атомов углерода, ледяной уксусной кислоты, муравьиной кислоты, диметилсульфоксида и N-метилпирролидона, и один растворитель или более, выбранный из группы, состоящей из хлороформа, этилацетата, метилэтилкетона и метиленхлорида, и предпочтительно он может быть смешанным растворителем из метанола и метиленхлорида.

В другом случае, если используется способ распылительной сушки, способ по настоящему изобретению может включать операции:

смешивание водного раствора экзендина и биоразлагающегося полимера, растворенного в органическом растворителе, для образования эмульсии или смешивания экзендина и биоразлагающегося полимера в одинарном растворителе или смешанном растворителе для образования раствора гомогенной смеси;

распылительной сушки полученной эмульсии или раствора для получения первичных микросфер;

суспензирования полученных первичных микросфер в водном растворе покрывающего материала для образования покровного слоя на каждой микросфере; и

промывки и лиофилизации микросфер с образованным слоем покрытия.

Органический растворитель может быть одним растворителем или более, выбранным из группы, состоящей из хлороформа, этилацетата, метиленхлорида и метилэтилкетона, и предпочтительно он может быть метиленхлоридом. Одинарный растворитель может быть одним растворителем или более, выбранным из группы, состоящей из ледяной уксусной кислоты и муравьиной кислоты, а смешанный растворитель может быть таким, в котором смешаны один растворитель или более, выбранный из группы, состоящей из спирта, имеющего от 1 до 5 атомов углерода, ледяной уксусной кислоты, муравьиной кислоты, диметилсульфоксида и N-метилпирролидона, и один растворитель или более, выбранный из группы, состоящей из хлороформа, этилацетата, метилэтилкетона и метиленхлорида, смешаны, и предпочтительно он является смешанным растворителем из метанола и метиленхлорида.

В соответствии с настоящим изобретением, способ может дополнительно включать операцию добавления защитного коллоидного материала любым обычным способом, а предпочтительно защитный коллоидный материал может быть добавлен на операции покрытия микросфер покрывающим материалом.

Предпочтительная концентрация покрывающего материала, растворенного в водной фазе или в водном растворе, может быть от 0,01 М до 1 М, и предпочтительно, от 0,1 М до 0,5 М. Более низкая концентрация покрывающего материала, чем вышеуказанный диапазон, не позволяет полностью покрыть поверхность микросфер покрывающим материалом, в то время как более высокая концентрация покрывающего материала, чем вышеуказанный диапазон, приводит к перенасыщению раствора покрывающего материала, что не может привести к повышенному эффекту по контролированию начального пика, и таким образом, концентрация покрывающего материала предпочтительно может быть в вышеуказанном диапазоне.

В способе по настоящему изобретению, типы и содержание экзендина, биоразлагающихся полимеров и покрывающих материалов являются такими, что описаны выше.

Экзендинсодержащая композиция по настоящему изобретению может вводиться оральным или парентеральным путями, и предпочтительно парентеральным путем, например внутривенно, подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно и т.п. Следовательно, в предпочтительном примере осуществления настоящего изобретения экзендинсодержащая композиция может применяться в качестве раствора для инъекций в виде диспергированного раствора. Эффективное количество композиции может быть соответствующим способом подобрано в зависимости от возраста субъекта, типа и тяжести заболевания и состояния субъекта, а дозировка активного ингредиента в композиции может составлять от 0,01 до 100 мкг/кг/день, и более предпочтительно, от 0,1 до 10 мкг/кг/день, данная доза может быть введена одноразово или с разделением на несколько раз.

Далее настоящее изобретение объясняется более подробно со ссылкой на нижеследующие примеры. Эти примеры, однако, не должны толковаться как ограничивающие объем настоящего изобретения любым образом.

ПРИМЕР 1

<Пример 1> Получение микросфер, содержащих экзендин-4, способом распылительной сушки

4,850 г биоразлагающегося полимера, RG502H (лот № 1009848, IV=0,19 дл/г), и 0,150 г экзендина-4 (Polypeptide Laboratories, США) были растворены до однородного состояния в 97 мл ледяной уксусной кислоты. Чтобы получить микросферы, подготовленный раствор был помещен в распылительную сушилку (SODEVA, Франция), оснащенную ультразвуковым соплом (Sono-tek, 120 кГц) со скоростью потока 1,5 мл/мин с использованием поршневого насоса при подаче осушенного воздуха при температуре 180°С. Полученные микросферы суспензировались в 0,5 М водном растворе лизина (состав 1-1), в 0,01 М водном растворе лизина (состав 1-2), в 0,1 М водном растворе гистидина (состав 1-3) и в 0,5 М водном растворе аргинина (состав 1-4), соответственно, в которых растворы содержат 1% (масса/объем) поливинилового спирта (торговая марка поливинилового спирта Gohsenol, EG-50) в качестве защитного коллоида; перемешивались в течение трех часов, были собраны, промыты дистиллированной водой и затем подвергнуты сублимационной сушке. Для сравнения были осуществлены те же операции суспензирования, перемешивания, промывки и сублимационной сушки за исключением использования 1% водного раствора поливинилового спирта (масса/объем) без покрывающих материалов (состав 1).

<Пример 2> Эффекты композиции в зависимости от полимера

Микросферы, содержащие экзендин-4, были получены тем же способом, что и в примере 1, за исключением использования RG503H (лот № 1006370, IV=0,38 дл/г, составы 2, 2-1 и 2-2), смеси в том же количестве RG502H и RG503H (лот № 1009848: лот № 1006370=1:1, IV=0,29 дл/г, составы 3 и 3-1), RG504H (лот № 1016605, IV=0,51 дл/г, составы 4 и 4-1), 5050DL 2А (лот № LP-207, IV=0,18 дл/г, составы 5 и 5-1), и 5050DL 4А (лот № LP-206, IV=0,46 дл/г, составы 6 и 6-1), в качестве биоразлагающегося полимера.

<Экспериментальный пример 1-1> Испытание эффектов покрытия микросфер

Содержание экзендина в микросферах, полученных в примерах 1 и 2, было количественно определено следующим способом. Экзендин-4 (Polypeptide Laboratories, США) растворили в ДМСО (диметилсульфоксид), развели с помощью ДМСО до концентраций растворов 2, 5, и 10 мкг/мл, соответственно, которые были использованы в качестве стандартных растворов, и подвергли измерению флюоресцентным методом при возбуждении Ех 280 нм и излучении Em 350 нм с использованием флюоресцентного спектрометра (Cary Eclipse, Varian, США) для получения шкалы измерения. Полученные микросферы растворили в ДМСО до концентрации 150 мкг/мл, и затем флюоресценцию, измеренную по ним, экстраполировали в шкалу измерения, тем самым определив содержание экзендина в микросферах.

Для определения содержания покрывающих материалов, используемых в композиции по настоящему изобретению, и в частности, лизина, аргинина, гистидина и т.п., содержащихся в поверхности микросфер, был использован метод количественного анализа с флюорескамином. Раствор, в котором полученные микросферы растворили в ДМСО до концентрации в 150 мкг/мл, был смешан с 0,01% ацетоновым раствором флюорескамина (масса/объем) и 0,5М раствора натрия бората (рН 9,5), выдержан при комнатной температуре в течение 20 минут и подвергнут измерению флюоресцентным методом при возбуждении Ех 392 нм и излучении Em 480 нм с использованием флюоресцентного спектрометра (Сагу Eclipse, Varian, США). Применяя тот же самый метод, используемые покрывающие материалы растворили в ДМСО и развели посредством ДМСО до концентраций 2, 5, и 10 мкг/мл, соответственно, для получения стандартных растворов. После этого провели измерение флюоресцентным методом, чтобы получить шкалу измерений, осуществив таким образом количественный анализ покрывающих материалов в поверхности микросфер.

Для подтверждения ингибирующего эффекта начального пика за счет микросфер были произведены измерения in vitro высвобождаемых количеств из микросфер, покрытых покрывающим материалом, и из существующих микросфер без покрытия. 10 мг каждого вида микросфер были суспензированы в 1 мл контрольного раствора на высвобождение (10 мМ HEPES (биологический буфер, представляющий собой натриевую соль N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты - примеч. перевод.), рН 7,5, 100 мМ NaCl), и выдержаны при 37°C с постоянным вращением 5 оборотов в минуту. После 1 и 24 часов каждый образец был собран и подвергнут центрифугированию. Высвобожденное количество экзендина в надосадочной жидкости определяли посредством измерения методом флюоресценции при возбуждении Ех 280 нм и излучении Em 350 нм.

Содержание и начальный пик in vitro микросфер, полученных в данном примере, были изучены в соответствии с вышеизложенным описанием, а полученные результаты были суммированы в нижеследующей Таблице 1. Таблица 1 показывает снижение начального пика in vitro в зависимости от типов покрывающих материалов и биоразлагающихся полимеров.

Таблица 1
Состав №	Полимер	Суспензия	Наме чен ная нагрузка (%)	Действительное содержание лекарственного препарата (%)	Содержание основных органических материалов в поверхности(%)	Высвобождение после 1 часа (%)	Высвобожде ние после 24 часов (%)
1	502Н	1% поливиниловый спирт	3	2,76	-	4,50	9,90
1-1	502Н	1% поливиниловый спирт + 0,5М лизин	3	2,73	0,249	0,79	3,84
1-2	502Н	1% поливиниловый спирт + 0,01М лизин	3	2,72	0,099	3,76	5,66
1-3	502Н	1% поливиниловый спирт + 0,1М гистидин	3	2,71	0,015	1,53	3,51
1-4	502Н	1% поливиниловый спирт + 0,5М аргинин	3	2,56	0,156	1,46	4,60
2	503Н	1% поливиниловый спирт	3	2,88	-	1,40	1,50
2-1	503Н	1% поливиниловый спирт + 0,5М лизин	3	2,96	0,057	0,00	0,29
2-2	503Н	1% поливиниловый спирт + 0,1М гистидин	3	2,85	0,132	0,00	0,58
3	502Н:503Н	1% поливиниловый спирт	3	2,75	-	2,80	4,0
3-1	502Н:503Н	1% поливиниловый спирт + 0,5М лизин	3	2,91	0,056	0,00	0,75
4	504Н	1% поливиниловый спирт	3	2,46	-	1,23	2,25
4-1	504Н	1% поливиниловый спирт + 0,5М лизин	3	2,47	0,018	0,81	0,84
5	5050DL 2А	1% поливиниловый спирт	3	2,53	-	1,31	1,95
5-1	5050DL 2А	1% поливиниловый спирт + 0,5М лизин	3	2,54	0,034	1,02	1,66
6	5050DL 4А	1% поливиниловый спирт	3	2,40	-	1,21	2,03
6-1	5050DL 4А	1% поливиниловый спирт + 0,5М лизин	3	2,51	0,018	0,79	0,82

Как показано в Таблице 1, выявляется, что высвобожденные количества составов, покрытых покрывающими материалами в соответствии с настоящим изобретением, в течение первого часа и через 24 часа снижаются по сравнению с составами 1, 2, 3, 4, 5 и 6, которые только суспензируются в защитном коллоиде, растворе поливинилового спирта с последующей распылительной сушкой. Такие эффекты получаются независимо от диапазона вязкости полимера и являются важными в предотвращении побочных эффектов, вызванных резким повышением начальной концентрации в крови непосредственно после введения экзендинсодержащих микросфер с контролируемым высвобождением.

<Экспериментальный пример 1-2> Снижение концентрации препарата в крови на начальной стадии после введения в соответствии с вязкостью полимеров и покрывающих материалов

Поскольку побочные эффекты экзендинов вызваны резким повышением концентрации лекарственного препарата в крови на начальной стадии после введения, очень важно предупредить повышение концентрации лекарственного препарата в крови вследствие начального высвобождения лекарственного препарата непосредственно после его введения. Было обнаружено, что при использовании составов в соответствии с настоящим изобретением концентрации лекарственного препарата в крови достигают пикового значения в течение часа после введения и затем снижаются. Для определения биодоступности и пика начальной концентрации в крови (конц. через 1 час) после введения составов, полученных по примерам 1 и 2, эти составы были введены самцам крыс S. D. (генетической линии Sprague-Dawley - примеч. перевод.) (350±20 g). Экзендинсодержащие микросферы, полученные, как указано выше, были суспензированы в питательной среде (0,5% (массовая доля) натрия карбоксилметилцеллюлозы, 5% (массовая доля) маннитола и 0,1% (массовая доля) Твин 80 (полисорбат 80 - примеч. перевод.) и затем введены посредством подкожных инъекций с дозировкой 0,6 мг (экзендина)/кг после анестезии эфиром. Кровь взяли из хвостовой вены в момент времени 0 и в конце первого часа, а также в 1-й, 2-й, 4-й, 7-й, 14-й, 21-й и 28-й день после введения, и осуществили центрифугирование при 12000 оборотов в минуту при 4°С в течение 10 минут. Затем собрали полученную из нее сыворотку и поместили ее на хранение при -20°С. Экзендин в сыворотке был количественно определен с использованием набора для ферментного иммунологического анализа (ЕК-070-94, Phoenix Pharmaceuticals, Inc., США), а относительную биодоступность сравнили с площадью под кривой для полученного графика «концентрация в крови - время».

Полученные графики концентрации в крови показаны на Фиг.1-3, а полученные результаты суммированы в Таблице 2. Таблица 2 показывает результаты снижения концентрации лекарственного препарата в крови на начальной стадии после введения и сравнение площади под кривой в соответствии с вязкостью покрывающих материалов и полимеров.

Таблица 2
Сос тав №	Полимер	Суспензия	Действительное содержание лекарственного препарата (мас.%)	Концентрация через 1 час	Площадь под кривой (пг·день/мл)
1	502Н	1% поливиниловый спирт	2,76	10969 (1 час)	24169
1-1	502Н	1% поливиниловый спирт + 0,5М лизин	2,73	900 (1 час)	26681
2	503Н	1% поливиниловый спирт	2,88	3561 (1 час)	5401
2-1	503Н	1% поливиниловый спирт + 0,5М лизин	2,96	159 (1 час)	5569
3	502Н:503Н	1% поливиниловый спирт	2,75	6363 (1 час)	8030
3-1	502Н:503Н	1% поливиниловый спирт + 0,5М лизин	2,91	320 (1 час)	10909

Как показано на Фиг.1-3 и в Таблице 2, выявляется, что непокрытые составы проявляют более высокий пик концентрации в крови на начальной стадии после введения, чем покрытые составы. Кроме того, также выявляется, что полимер RG502H, обладающий самой низкой вязкостью, показал самую высокую величину площади под кривой, т.е. самую высокую биодоступность, и что покрытие покрывающими материалами дает улучшение биодоступности как составов с полимерами, имеющими высокую молекулярную массу, так и составов с полимерами, имеющими низкую молекулярную массу. В заключение, несмотря на то, что биодоступность зависит от вязкости используемого полимера, эффективное ингибирование начального пика, которое не может быть достигнуто при использовании существующих составов, полученных обычными способами, достигается за счет покрытия покрывающими материалами в соответствии с настоящим изобретением.

<Пример 3> Получение микросфер с различной лекарственной нагрузкой

Биоразлагающийся полимер RG502H и экзендин-4 были смешаны так, чтобы обеспечить содержание экзендина-4 с массовой долей 1% (составы 7 и 7-1) и массовой долей 7% (составы 8 и 8-1), соответственно, и смеси были растворены в ледяной уксусной кислоте. Полученные растворы подвергли распылительной сушке тем же способом, что и в примере 1 для получения микросфер. Полученные микросферы суспензировали в 1% водном растворе поливинилового спирта (составы 7 и 8), и водном растворе 1% поливинилового спирта и 0,5 М лизина (составы 7-1 и 8-1), соответственно, в течение трех часов, а затем собрали, промыли дистиллированной водой и подвергли лиофилизации.

<Экспериментальный пример 2> Снижение начального пика в зависимости от различной лекарственной нагрузки

Количественный анализ начального пика микросфер, полученных в Примере 3, был произведен тем же методом, что и в экспериментальном примере 1-1, а полученные результаты суммируются в Таблице 3. Таблица 3 показывает эффект покрытия покрывающими материалами в зависимости от содержания лекарственного препарата.

Таблица 3
Состав №	Намеченная нагрузка (%)	Действительное содержание лекарственного препарата (%)	Содержание основных органических материалов в поверхности(%)	Высвобождение через 1 час (%)	Высвобождение через 24 часа(%)
7	1	0,85	-	3,06	3,87
7-1	1	0,81	0,295	2,63	3,68
1	3	2,76	-	4,50	9,90
1-1	3	2,73	0,249	0,79	3,84
8	7	5,79	-	8,00	11,34
8-1	7	5,85	1,636	2,04	5,47

Как показано в Таблице 3, составы 1, 7 и 8, которые не покрыты покрывающими материалами, демонстрируют повышенный начальный пик в соответствии с увеличением количества экзендина, введенного в биоразлагающийся полимер, в то время как составы 1-1, 7-1 и 8-1, которые покрыты покрывающими материалами, демонстрируют значительно сниженный начальный пик, несмотря на количество экзендина, введенного в биоразлагающийся полимер.

<Пример 4> Получение микросфер, содержащих экзендин-4, методом двойной эмульсии

970 мг RG502H растворили в 3,23 мл дихлорметана (Junsei Chem.). 30 mg экзендина-4, растворенного в 0,3 мл дистиллированной воды, добавили к полученному раствору RG502H и диспергировали ультразвуком для получения первичной эмульсии типа «вода в масле». Полученную эмульсию инжектировали в 270 мл 0,5% (масса/объем) водного раствора поливинилового спирта при перемешивании со скоростью 5000 оборотов в минуту для получения эмульсии типа «вода-масло-вода». Эмульсию суспензировали при 4000 оборотов в минуту при 40°С в течение одного часа, таким образом обеспечив удаление дихлорметана и затвердение полимера, а затем полученные микросферы собрали. Собранные микросферы были дважды промыты дистиллированной водой и подвергнуты лиофилизации для получения микросфер. В процессе получения составов тем же способом, что и описан выше, суспензию для инжектирования первичной эмульсии суспензировали в 1% поливиниловом спирте (состав 9), 0,5 М водном растворе лизина + 1% поливиниловый спирт (состав 9-1), 0,5 М водном растворе Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethane - примеч. перевод.) + 1% поливиниловый спирт (состав 9-2), 0,5 М водном растворе мочевины + 1% поливиниловый спирт (состав 9-3), 0,05 М водном растворе креатинина + 1% поливиниловый спирт (состав 9-4), 0,5 М водном растворе креатинина + 1% поливиниловый спирт (состав 9-5), соответственно, в течение одного часа и собрали, промыли дистиллированной водой и подвергли лиофилизации.

Изображения полученных микросфер под электронным микроскопом, как описано выше, показаны на Фиг.4а и 4b. Фиг.4а показывает состав 9, который не покрыт покрывающим материалом, а Фиг.4b показывает состав 9-1, который покрыт покрывающим материалом. Как показано на Фиг.4b, выявляется, что состав по настоящему изобретению имеет гладкую поверхность.

<Экспериментальный пример 3> Снижение начального пика в зависимости от типа покрывающего материала

Количественный анализ высвобождения лекарственного препарата из микросфер, полученных в примере 4, в течение первых 24 часов после введения был осуществлен тем же методом, что и в экспериментальном примере 1-1, а полученные результаты суммируются в Таблице 4. Таблица 4 демонстрирует сниженный начальный пик в зависимости от покрывающего материала.

Таблица 4
Состав №	Суспензия	Высвобождение через 1 час (%)	Высвобождение через 24 часа (%)
9	1% поливиниловый спирт	7,45	13,88
9-1	1% поливиниловый спирт + 0,5М лизин	0,87	1,87
9-2	1% поливиниловый спирт + 0,5М tris	5,79	9,91
9-3	1% поливиниловый спирт + 0,5М мочевина	2,23	5,04
9-4	1% поливиниловый спирт + 0,05М креатинин	2,20	3,06
9-5	1% поливиниловый спирт + 0,5М креатин	0,89	1,23

Как показано в Таблице 4, несмотря на то, что сниженная величина начального пика незначительно варьируется в зависимости от типа используемого покрывающего материала, микросферы составов 9-1 9-5, покрытые покрывающими материалами, демонстрируют значительно сниженный начальный пик по сравнению с микросферами состава 9, не покрытыми покрывающими материалами.

<Сравнительный пример> Получение микросфер, нагруженных экзендином-4 и покрывающими материалами, и измерение начального пика

970 мг RG502H растворили в 3,23 мл дихлорметана (Junsei Chem.). 30 мг экзендина-4 и 6,68 мг лизина растворили в 0,3 мл дистиллированной воды и добавили к полученному раствору RG502H для получения первичной эмульсии типа «вода в масле». Полученную эмульсию суспензировали в водном растворе 1% поливинилового спирта, а микросферы состава 10 получили тем же способом, что и в примере 4. Кроме того, 970 мг RG502H и 6,68 мг лизина растворили в 3,23 мл дихлорметана (Junsei Chem.). К полученному раствору добавили 30 мг экзендина-4, растворенного в 0,3 мл дистиллированной воды для получения первичной эмульсии типа «вода в масле». Эмульсию суспензировали в водном растворе 1% поливинилового спирта для получения микросфер состава 11.

Изображения полученных выше составов 10 и 11 под электронным микроскопом, как описано выше, показаны на Фиг.4с и 4d. Как показано на Фиг.4с, полученные в сравнительном примере микросферы имеют множество пор на своих поверхностях.

Высвобождаемые количества из микросфер, полученных в сравнительном примере, в первые 1 час и 24 часа были соответствующим образом измерены тем же способом, что и в экспериментальном примере 1-1, а полученные результаты суммируются в Таблице 5. Таблица 5 демонстрирует изменение величины начального пика в зависимости от способов, посредством которых добавляются покрывающие материалы при изготовлении микросфер.

Таблица 5
Сос тав №	Первичная эмульсия	Суспензия	Высвобождение через 1 час (%)	Высвобождение через 24 часа (%)
9	502Н, экзендин-4	1% поливиниловый спирт	7,45	13,88
9-1	502Н, экзендин-4	1% поливиниловый спирт + 0,5М лизин	0,87	1,87
10	502Н, экзендин-4 + лизин (водная фаза)	1% поливиниловый спирт	65,63	71,64
11	502Н + лизин (масляная фаза), экзендин-4	1% поливиниловый спирт	80,31	87,00

Как показано в Таблице 5, когда покрывающие материалы просто введены вместе с экзендином без образования покровного слоя или используются просто смешанными с полимерами, возникает чрезмерный начальный пик, который представляет собой критический дефект, не позволяющий экзендину иметь форму с контролируемым высвобождением.

Как показано на Фиг.4с и 4d, добавление покрывающих материалов в масляной фазе или в водной фазе первичной эмульсии приводит к повышению пористости поверхности микросфер. В заключение, добавление покрывающих материалов внутрь микросфер повышает пористость поверхности, что, в конечном счете, приводит к чрезмерному начальному пику лекарственного препарата, содержащегося внутри них. И наоборот, микросферы, покрытые покрывающими материалами в соответствии с настоящим изобретением, не имеют никакого повышения пористости поверхности и демонстрируют более низкий начальный пик, чем состав 9, имеющий гладкую поверхность, но не покрытую покрывающими материалами.

В заключение, существующие экзендинсодержащие составы, получаемые обычными способами, например, раскрытыми в патенте Кореи № 140209, не позволяют достичь желаемого снижения начального пика, а следовательно, они не обладают преимуществом в использовании в качестве эффективных экзендинсодержащих составов из-за побочных эффектов, обусловленных чрезмерным начальным пиком. И наоборот, композиция по настоящему изобретению очень полезна при разработке экзендинсодержащих микросфер с контролируемым высвобождением, к которым предъявляются требования высококонтролируемого начального высвобождения. Кроме того, настоящее изобретение может достичь высокой биодоступности экзендинсодержащего состава, которая не может быть достигнута обычной технологией для контролирования начального пика экзендинсодержащего состава.

<Пример 5> Получение микросфер, содержащих экзендин-3, способом распылительной сушки

4,850 г биоразлагающегося полимера, RG502H (лот № 1009848, IV=0,19 дл/г), и 0,150 г экзендина-3 (Peptron Inc., Южная Корея), растворили до гомогенного состояния в 97 мл ледяной уксусной кислоты. Для получения микросфер полученный раствор был подан в распылительную сушилку (SODEVA, Франция), оснащенную ультразвуковым соплом (Sono-tek, 120 kHz), с использованием поршневого насоса при скорости потока 1,5 мл/мин и при подаче осушенного воздуха с температурой 180°С. Полученные микросферы суспензировали в 0,5 водного раствора лизина с добавленным 1% (масса/объем) поливиниловым спиртом (поливиниловый спирт, Gohsenol, EG-50) в качестве защитного коллоида, перемешивали в течение трех часов, собрали, промыли дистиллированной водой и затем подвергли лиофилизации.

<Пример 6> Получение микросфер, содержащих экзендин-4(1-28)амид, способом распылительной сушки

4,850 г биоразлагающегося полимера, RG502H (лот № 1009848, IV=0,19 дл/г), и 0,150 г экзендина-4(1-28)амида (Peptron Inc., Южная Корея), растворили до гомогенного состояния в 97 мл ледяной уксусной кислоты. Для получения микросфер подготовленный раствор был подан в распылительную сушилку (SODEVA, Франция), оснащенную ультразвуковым соплом (Sono-tek, 120 kHz), с использованием поршневого насоса при скорости потока 1,5 мл/мин и при подаче осушенного воздуха с температурой 180°С. Полученные микросферы суспензировали в 0,5 М водном растворе L-Lys-L-Thr-L-Thr-L-Lys-L-Ser с добавленным 1% (масса/объем) поливиниловым спиртом (поливиниловый спирт, Gohsenol, EG-50) в качестве защитного коллоида, перемешивали в течение трех часов, собрали, промыли дистиллированной водой, суспензировали в 10 мл 10% водного раствора D-маннитола (по массовой доле) и затем подвергли лиофилизации.

<Пример 7> Получение микросфер, содержащих экзендин-4, способом разделения фаз.

Для получения первичной эмульсии 0,1 г экзендина-4 (Polypeptide Laboratories, США) растворили в 1,86 мл дистиллированной воды, медленно инжектировали в раствор, в котором растворили 1,86 г RG502H (лот № 1009848, IV=0,19 дл/г) в 23,32 мл дихлорметана, и диспергировали ультразвуком. Полученную эмульсию гомогенизировали путем добавления к ней 58,8 г силиконового масла для образования зародышевых микросфер. Смесь 400 г гептана и 50 г этанола медленно добавили к сформированным зародышевым микросферам при перемешивании со скоростью 500 оборотов в минуту и поддержании температуры 3°С для затвердевания зародышевых микросфер. После перемешивания в течение приблизительно одного часа растворитель удалили путем декантации. Затем к полученному дополнительно добавили 200 г гептана и перемешивали в течение одного часа для удаления силиконового масла и дихлорметана из зародышевых микросфер. Полученные микросферы отфильтровали, собрали, промыли гептаном при 4°С и высушили в вакууме для подготовки микросфер. Подготовленные микросферы суспензировали в 0,5% (масса/объем) поливиниловом спирте и 0,5 М водном растворе лизина в течение одного часа, собрали, промывали дистиллированной водой и осуществили лиофилизацию для изготовления состава.

Как показано в вышеприведенных примерах, настоящее изобретение обеспечивает новый состав с экзендинсодержащими микросферами с контролируемым высвобождением, имеющий сниженные побочные эффекты и улучшенную биодоступность путем покрытия поверхности микросфер покрывающими материалами, что снижает чрезмерное высвобождение лекарственного препарата на начальной стадии после введения.