композиция для встраивания лекарственных субстанций в липидную матрицу, композиция лекарственного средства с фосфолипидно-жирнокислотной системой и способы их получения

Формула изобретения

1. Композиция для встраивания лекарственных субстанций в липидную матрицу в виде лиофильно высушенных наночастиц размером 10-20 нм, включающая фосфатидилхолин растительного происхождения (73-94%), соль жирной кислоты и мальтозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Фосфатидилхолин	0-25
Соль жирной кислоты	1,5-10
Мальтоза	70-78

2. Композиция лекарственного средства с фосфолипидно-жирнокислотной системой в виде наночастиц размером 20-80 нм, включающая соль жирной кислоты, фосфатидилхолин растительного происхождения (73-94%), мальтозу и лекарственную субстанцию при следующем соотношений компонентов, мас.%:

Фосфатидилхолин	19-25
Соль жирной кислоты	1,5-10
Мальтоза	67-78
Лекарственная субстанция	1-10

3. Способ получения композиции по п.1, заключающийся в том, что соль жирной кислоты, фосфатидилхолин растительного происхождения и мальтозу эмульгируют в воде и полученную эмульсию подвергают нескольким циклам гомогенизации под высоким давлением 800-1500 бар при температуре 40-45°С с последующей лиофилизацией.

4. Способ получения композиции лекарственного средства по п.2, заключающийся в том, что в случае лекарственной субстанции белковой природы композицию по п.1 растворяют в деирнизованной воде, добавляют лекарственную субстанцию белковой природы, перемешивают при комнатной температуре, фильтруют и высушивают методом лиофилизации, а в случае лекарственной субстанции небелковой природы соль жирной кислоты, мальтозу и лекарственную субстанцию эмульгируют в воде, добавляют фосфатидилхолин и полученную суспензию подвергают нескольким циклам (1-10) гомогенизации под высоким давлением 800-1500 бар при температуре 40-45°С с последующей лиофилизацией.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и фармакологии и касается стабильной при хранении композиции в виде наночастиц размером 20-80 нм на основе солей жирных кислот, стабилизированных фосфатидилхолином и предназначенной для включения в наночастицу биологически активных соединений, а именно лекарственных субстанций, белков, пептидов и др. и увеличения биодоступности и терапевтической эффективности труднорастворимых лекарств.

В настоящее время одно из направлений применения нанотехнологий в медицине связано с развитием фарминдустрии, что можно объяснить уникальными свойствами появившихся в последнее время новых наноматериалов и наночастиц. Такое применение нанотехнологий способствовало развитию в последние годы новых стратегий в фармацевтике, направленных, прежде всего, на создание систем, способствующих повышению терапевтической эффективности лекарств, их биодоступности, снижению побочных действий. Среди этих стратегий важное место занимают системы транспорта лекарств к органам, тканям, клеткам-мишеням.

Снабжение лекарственных соединений системами транспорта устраняет многие недостатки разрабатываемых и уже существующих препаратов - низкую растворимость в воде, быструю сорбцию или метаболизм в организме, трудность перехода через естественные барьеры (мембраны клеток, гематоэнцефалический барьер и др.), побочные эффекты. Интенсивное развитие на основе нанотехнологий систем доставки приводит не только к продлению «жизненного цикла» известных лекарственных средств на фармацевтическом рынке, но и появлению препаратов с улучшенными фармакологическими и фармакокинетическими свойствами. Разработка лекарств, снабженных системами транспорта, не требует больших капиталовложений, а достигаемые эффекты весьма значительны для здравоохранения и экономики. В РФ производства лекарств, снабженных наносистемами транспорта, еще нет, что обуславливает актуальность проведения собственных, отечественных разработок. Это особенно важно для лекарств, применение которых в свободных формах ограничено их выраженной токсичностью.

Самыми распространенными наносистемами на современном фармацевтическом рынке в настоящее время являются липосомы. Наибольший прикладной интерес липосомы вызывают в качестве систем транспортной доставки лекарств in vivo, поскольку давно известно, что они обладают относительной селективностью, что способствует достаточно высокому накоплению лекарственного средства в месте доставки.

Наиболее эффективным подходом к конструированию липосомальных лекарственных препаратов является разработка технологий, позволяющих получать липосомальные препараты в виде наночастиц диаметром менее 50 нм, т.к. известно, что уменьшение размера липосом в 5 раз увеличивает ее время циркуляции в крови в 40 раз.

Известна оригинальная технология, позволяющая получать фосфолипидную транспортную наносистему с размером частиц менее 30 нм, и показана принципиальная возможность получения лекарственных композиций, в которых активная субстанция снабжается транспортной наносистемой на основе растительных фосфолипидов (патент РФ № 2373924). Показано, что в результате такого встраивания изменялась фармакокинетика лекарственных субстанций при введении в организм, увеличивалась их биодоступность и терапевтическая эффективность.

Наличие углеводородной области в фосфолипидных структурах, в том числе в мицеллах и липосомах, позволяет гидрофобным соединениям включаться в нее. На этом принципе может быть основано включение в фосфолипидные наночастицы ряда лекарственных субстанций, обладающих амфипатическими, липофильными и гидрофобными свойствами. Примером таких субстанций могут служить хлорин Е6, диклофенак, липоевая кислота, будесонид и др.

Известна стабильная при хранении наносистема с размером частиц до 10-30 нм, включающая фосфатидилхолин и мальтозу, предназначенная для включения в фосфолипидную наночастицу лекарственных средств (патент РФ 2391966).

Благодаря своей химической структуре, вышеуказанная фосфолипидная транспортная наносистема способна служить переносчиком как растворимых, так и нерастворимых в биологических жидкостях (гидрофобных) биоактивных препаратов, но, к сожалению, далеко не все лекарственные субстанции из-за своих физико-химических свойств и химической структуры могут встраиваться в транспортную систему, полученную на основе только фосфатидилхолина.

Целью изобретения является создание композиции на основе солей жирных кислот и растительных фосфолипидов, для встраивания биологически активных соединений и возможности их последующего транспорта в организме.

В соответствии с изобретением описывается композиция для встраивания лекарственных субстанций в липидную матрицу в виде лиофильно высушенных наночастиц размером 10-20 нм, включающая фосфатидилхолин растительного происхождения (73-94%), соль жирной кислоты и мальтозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Фосфатидилхолин	20-25
Соль жирной кислоты	1,5-10
Мальтоза	70-78

Описывается также композиция лекарственного средства с фосфолипидно-жирнокислотной системой в виде наночастиц размером 20-80 нм, включающая соль жирной кислоты, фосфатидилхолин растительного происхождения (73-94%), мальтозу и лекарственную субстанцию при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Фосфатидилхолин	19-25
Соль жирной кислоты	1,5-10
Мальтоза	67-78
Лекарственная субстанция	1-10

В соответствии с изобретением описывается способ получения композиции для встраивания лекарственных субстанций в липидную матрицу в виде лиофильно высушенных наночастиц размером 10-20 нм, включающей фосфатидилхолин растительного происхождения (73-94%), соль жирной кислоты и мальтозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Фосфатидилхолин	20-25
Соль жирной кислоты	1,5-10
Мальтоза	70-78

заключающийся в том, что соль жирной кислоты, растительный фосфатидилхолин и мальтозу эмульгируют в воде и полученную эмульсию подвергают нескольким циклам гомогенизации под высоким давлением 800-1500 бар при температуре 40-45°С с последующей лиофилизацией.

Описывается также способ получения композиции лекарственного средства с фосфолипидно-жирнокислотной системой в виде наночастиц размером 20-80 нм, включающей соль жирной кислоты, фосфатидилхолин растительного происхождения (73-94%), мальтозу и лекарственную субстанцию при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Фосфатидилхолин	19-25
Соль жирной кислоты	1,5-10
Мальтоза	67-78
Лекарственная субстанция	1-10

заключающийся в том, что в случае лекарственной субстанции белковой природы описанную выше композицию для встраивания лекарственных субстанций растворяют в деионизованной воде, добавляют лекарственное средство белковой природы, перемешивают при комнатной температуре, фильтруют и высушивают методом лиофилизации, а в случае лекарственной субстанции небелковой природы соль жирной кислоты, мальтозу и лекарственную субстанцию эмульгируют в воде, добавляют фосфатидилхолин и полученную суспензию подвергают нескольким циклам (1-10) гомогенизации под высоким давлением 800-1500 бар при температуре 40-45°С с последующей лиофилизацией.

Отличительным признаком разработанной композиции от известной фосфолипидной системы (патент РФ № 2391966) является характер взаимодействия с лекарственной субстанцией. В отличие от гидрофобного взаимодействия в фосфолипидной системе, в композиции на основе жирных кислот, стабилизированных растительными фосфолипидами, связь между жирной кислотой и биологически активным веществом происходит за счет электростатического взаимодействия, при этом значительный вклад может вносить также и гидрофобное взаимодействие фосфолипидной части композиции.

Существенное преимущество наночастиц, образованных солями жирных кислот, стабилизированных фосфатидилхолином, заключается в том, что помимо возможности встраивания гидрофобных лекарственных субстанция в гидрофобные области фосфолипидов возможно связывание за счет электростатического взаимодействия заряженных групп/областей лекарства с СОО-группой жирной кислоты. Важно отметить, что это взаимодействие является рН-зависимым и в связи с этим при изменении рН возможно контролируемое высвобождение лекарственного вещества. Полученные отрицательно заряженные нанофосфолипидные частицы с жирной кислотой могут быть использованы для посадки на них положительно заряженных лекарственных субстанций или положительно заряженных пептидов и белков при значениях рН 4,5-5,0.

Известно, что водорастворимые соединения ограниченно встраиваются в фосфолипидную транспортную систему (не более 10%), в связи с ограниченным внутренним объемом липосом. Система на основе жирных кислот связывается с активной субстанцией за счет электростатического взаимодействия и может таким образом переносить водорастворимые соединения. В свободном состоянии многие препараты на основе водорастворимых субстанций могут быстро вымываться из организма. Электростатическим же взаимодействием они удерживаются; при этом, что немаловажно, нужна меньшая доза препарата. Кроме того, водорастворимые соединения, включенные во внутреннее пространство липосом, быстро «вытекают» из этой системы, не успевая достигать тканей-мишеней.

Силы электростатического взаимодействия делают композицию с включенным биологически активным соединением достаточно стабильной и не дают ей возможности быстро разрушаться в условиях организма.

В предлагаемой композиции при использовании жирных кислот транспортируются соединения с избыточным положительным зарядом.

Образующиеся мицеллы на основе ЖК в воде агрегируют и при уменьшении рН раствора спонтанно образуют масло. При стабилизации же фосфатидилхолином образуются частицы размером 10-20 нм.

В качестве стабилизаторов могут использоваться многие поверхностно-активные вещества (ПАВ): твины, полоксамеры, циклодекстрин и др. соединения. Поскольку применение многих из них ограничено по соображениям токсичности, растительные фосфолипиды, в частности фосфатидилхолин, оказался наиболее подходящим стабилизатором из большого набора ПАВ.

При получении композиции белков с транспортной системой на основе ЖК, стабилизированных фосфатидилхолином, необходимо учитывать, что для сохранения белка в нативном состоянии непригодны многие технологические операции, в частности озвучивание или гомогенизация под высоким давлением. Поэтому сначала должны быть получены частицы транспортной системы или композиции, включающие соль жирной кислоты в растворе сахара, стабилизированной фосфатидилхолином, к которой в дальнейшем при соблюдении особых предосторожностей может быть присоединен белок (см. пример 3).

В качестве криопротектора при лиофилизации конечного продукта традиционно используются сахара: мальтоза, лактоза, трегалоза и др.

Основные этапы технологии получения нанокомпозиции на основе жирных кислот, стабилизированных фосфолипидами растительного происхождения, могут быть проиллюстрированы следующим примером: навески растительного фосфолипида и соли жирной кислоты в соотношении 10:1 суспендируют в 10% водном растворе мальтозы (концентрация по фосфатидилхолину 25 мг/мл), смесь гомогенизируют с использованием озвучивания или гомогенизации под высоким давлением. Значение рН получаемых растворов доводят раствором 1М HCI до рН 7,0-7,5.

Данная наносистема является практически универсальной для встраивания субстанций различной природы. Кроме того, имеется возможность получения транспортной системы в сухом, компактном, удобном для хранения и дальнейшего использования виде.

Важной характеристикой разрабатываемой композиции является процент включения биологически активного вещества (лекарственной субстанции и др.) непосредственно в наночастицы системы. С этой целью использовался метод ультрафильтрации. Основные этапы количественного определения лекарственной субстанции в препарате заключаются в следующем:

1. Помещают 200-250 мкл испытуемого образца в специальный патрон, дно которого представляет собой калиброванную мембрану.

2. Центрифугируют патрон в течение 20-40 минут при 10000 об/мин до полного прохождения растворителя и низкомолекулярного лекарства в нижнюю часть патрона.

4. Определяют наличие лекарства. По разности полученных значений определяют ту часть активного компонента, которая не прошла в фильтрат, т.к. она связана с липидными частицами.

Следует отметить, что эта процедура имеет смысл для лекарственных субстанций или их солей/гидрохлоридных производных, которые растворимы в воде. Для субстанций, растворимость которых в воде крайне мала, этот этап можно пропустить, т.к. все лекарство находится в термодинамически выгодном для себя состоянии, а именно тем или иным способом оно оказывается встроенным в наночастицы транспортной системы.

В таблице 1 приведены примеры встраивания лекарственных субстанций в транспортную систему на основе олеиновой кислоты и стабилизированную растительными фосфолипидами.

Таблица 1
Субстанция	Процент включения	Размер частиц
Амброксол	96	15
Доксорубицин HCI	99	15
Амлодипин	96	20
Ремантадин	99	20
Дексаметазон	28,5	11
Преднизолон	73	19
Протионамид	37	12
Индометацин	76	18
Ловастатин	48	42
Резвератрол	100	20
Инсулин	99	73

Представленные результаты подтверждают, что описываемая лабораторная технология позволяет получать композицию лекарственных препаратов в виде наночастиц на основе солей жирных кислот, стабилизированных фосфатидилхолином.

При получении транспортной системы на основе только растительных фосфолипидов образуются наночастицы размером менее 30 нм. Транспортная система на основе солей жирных кислот, стабилизированных фосфатидилхолином, имеет размер частиц 10-20 нм. При встраивании лекарственных субстанций в фосфолипидно-жирнокислотную композицию размер частиц увеличивается. Например, для препарата ловастатин до 41-44 нм, для инсулина до 70-75 нм.

Настоящее изобретение характеризуется следующими примерами:

Пример 1. Получение композиции в виде наночастиц на основе солей жирных кислот, стабилизированных растительными фосфолипидами, для встраивания лекарственных субстанций

К раствору 20 г (78,7%) мальтозы моногидрата в 150 мл деионизованной воды при интенсивном перемешивании последовательно прибавляют 0,4 г (1,6%) натриевой соли олеиновой кислоты, 5 г (19,7%) растительного фосфолипида (содержание фосфатидилхолина 73-94%), доводят объем раствора деионизированной водой до 200 мл и перемешивают до состояния однородной грубой эмульсии.

Полученную эмульсию гомогенизируют при давлении 800 бар, поддерживая температуру продукта на выходе не более 45°С. 1 М раствором HCI доводят рН раствора до 7,3. Раствор фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм, разливают во флаконы по 10 мл и высушивают методом лиофилизации.

Получают 20 флаконов, содержащих по 1,26 г сухого белого кристаллического порошка с остаточной влажностью 2,41%, после растворения которого в 8,5 мл воды образуется раствор со светопропусканием при 660 нм 87,1%, размером частиц 17 нм, рН 7,3.

Аналогичным образом получают сухую композицию в виде наночастиц на основе растительных фосфолипидов и солей жирных кислот: линолевой, каприловой, каприновой, лауриновой, миристиновой, пальмитиновой (таблица 2).

Таблица 2.
жк	Соотношение Фосфолипид/ЖК/Мальтоза (Ф/ЖК/М)	ПАРАМЕТР
Размер частиц, нм	Т660, %	Примечание
Олеиновая	19,7:1,6:78,7	17	87,1
Линолевая	21,3:8,5:70,2	14	83,2
Каприловая	24,0:3,1:72,9	20	79,6
Каприновая	20,7:5,0:74,3	16	84,4
Лауриновая	22,0:2,0:76,0	18	80,3
Миристиновая	20,1:1,9:78,0	15	82,4
Пальмитиновая	23,2:4,3:72,5	19	78,9

Пример 2. Получение композиции на основе индометацина, натриевой соли линолевой кислоты и растительного фосфолипида

К раствору 20 г (77,5% по весу от сухой массы) мальтозы моногидрата в 150 мл деионизованной воды при интенсивном перемешивании последовательно добавляют 0,4 г (1,5% по весу) натриевой соли линолевой кислоты, 0,4 г (1,5% по весу) индометацина и 5 г (19,5% по весу) растительного фосфолипида (содержание фосфатидилхолина 73-94%), доводят объем раствора деионизированной водой до 200 мл перемешивают до состояния однородной грубой эмульсии.

Полученную грубую эмульсию гомогенизируют при давлении 1000 бар, поддерживая температуру продукта на выходе не более 45°С. В полученной наноэмульсии раствором 1М HCI доводят рН до 7,4.

Раствор фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм, разливают во флаконы по 10 мл и высушивают методом лиофилизации.

Полученный препарат был охарактеризован по следующим параметрам: средний размер частиц в полимодальном распределении по объему, светопропускание при длине волны 660 нм (Т₆₆₀), количество встроенной субстанции в % от исходного количества, остаточная влажность, рН раствора. Для этого содержимое флакона растворяют в 10 мл деионизированной воды и раствор анализируют.

Получают 20 флаконов, содержащих по 1,29 г сухого слегка желтоватого кристаллического порошка с остаточной влажностью 1,63%, после растворения которого в 8,5 мл воды дает раствор со светопропусканием при 660 нм 86,5%, размером частиц 24 нм, рН 7,4.

Аналогичным образом получают композиции в виде наночастиц на основе индометацина и солей жирных кислот: олеиновой, каприловой и каприновой, стабилизированных растительными фосфолипидами, и индометацина. Результаты измерений представлены в таблице 3.

Таблица 3
Характеристика композиций на основе индометацина, солей жирных кислот и растительных фосфолипидов
ЖК	Соотношение компонентов композиции Ф/ЖК/Инд/М	ПАРАМЕТР
Размер частиц, нм	Т660, %	% включения лекарственной субстанции от исх.
Олеиновая	19,5:1,5:1,5:77,5	18	88,4	76,0
Линолевая	24,2:4,4:2,7:68,2	24	86,5	68,0
Каприловая	21,0:3,2:2,1:73,7	15	87,2	90,4
Каприновая	23,3:4,8:3,0:68,9	19	84,6	71,6
Лауриновая	20,0:2,5:7,2:70,3	23	81,3	74,5
Миристиновая	22,1:2,1:6,4:69,4	17	78,9	82,1
Пальмитиновая	20,9:3,0:5,8:70,3	27	79,7	73,0

Пример 3. Получение композиции в виде наночастиц на основе ловастатина, натриевой соли каприловой кислоты и растительных фосфолипидов

К раствору 25,4 г (98,5% по весу) композиции, полученной в примере 1, где в качестве соли жирной кислоты используется натриевая соль каприловой кислоты, в 100,0 мл деионизированной воды прибавляют 0,20 г (1,5%) ловастатина, перемешивают до состояния однородной грубой эмульсии.

Полученную грубую эмульсию гомогенизируют при давлении 1200 бар, поддерживая температуру продукта на выходе не более 45°С. В полученной наноэмульсии раствором 1М HCI доводят рН до 7,4, фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм, разливают во флаконы по 10 мл и высушивают методом лиофилизации.

Получают 10 флаконов, содержащих по 2,58 г сухого белого кристаллического порошка с остаточной влажностью 2,41%, после растворения которого в 10 мл воды образуется раствор со светопропусканием при 660 нм 79,6%, размером частиц 27 нм, рН 7,3.

Аналогичным образом получают композиции в виде наночастиц на основе растительных фосфолипидов (содержание фосфатидилхолина 73-94%) и солей жирных кислот: олеиновой, линолевой, каприновой, лауриновой, миристиновой, пальмитиновой и индометацина.

Результаты измерений представлены в таблице 4.

Таблица 4
Характеристика композиций на основе ловастатина, в составе транспортной системы
ЖК	Соотношение композиции ловастатина Ф/ЖК/Л/М	ПАРАМЕТР
Размер частиц, нм	Т660, %	Встраивание, % от исх.
Олеиновая	19,4:1,6:1,5:77,5	42	79,0	87,0
Линолевая	20,4:8,1:4,1:67,4	44	85,1	91,9
Каприловая	23,6:3,1:1,5:71,8	27	79,6	82,5
Каприновая	20,0:4,8:3,5:71,7	30	84,3	94,1
Лауриновая	20,6:1,8:6,5:71,1	25	87,0	88,3
Миристиновая	19,1:1,7:75,1:4,1	29	81,1	69,9
Пальмитиновая	21,3:3,9:8,4:66,4	31	83,3	73,2

Пример 4. Получение композиции в виде наночастиц на основе инсулина и фосфолипидно-жирнокислотной системы

К раствору 20 г (77,5% по весу от сухой массы) мальтозы моногидрата в 150 мл деионизованной воды при интенсивном перемешивании последовательно добавляют 5 г (19,5%) растительного фосфолипида (содержание фосфатидилхолина 73-94%) и 0,4 г (1,5%) натриевой соли олеиновой кислоты, перемешивают до состояния однородной грубой эмульсии.

Полученную грубую эмульсию нагревают до 42-45°С и гомогенизируют при давлении 1500 бар, поддерживая температуру продукта на выходе не более 45°С. Полученную щелочную наноэмульсию (рН 9-10) нейтрализуют до рН 5,0 растворами KH₂PO₄ или 1М HCI.

Раствор последовательно фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм, разливают во флаконы по 10 мл и высушивают методом лиофилизации.

Получают 20 флаконов, содержащих по 2,5 г сухого белого кристаллического порошка, светопропускание при 660 нм 88,4%, размер частиц 28 нм, остаточная влажность 1,40%, рН 5,0.

Полученные отрицательно заряженные жирно-кислотные частицы, стабилизированные растительным фосфатидилхолином, могут быть использованы для посадки на них положительно заряженных лекарственных субстанций или положительно заряженных пептидов и белков при значениях рН 5,0.

25,0 г сухого остатка растворяют в 80 мл деионизованной воды, прибавляют 100 мг инсулина марки NOI-5500, доводят объем раствора до 100 мл, осторожно перемешивают при комнатной температуре.

Раствор фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм, разливают во флаконы по 10 мл и высушивают методом лиофилизации.

Процент включения инсулина определяют методом ультрафильтрации. Для ультрафильтрации используют специальный картридж (патрон) со встроенной калиброванной мембранной (Ultrafree-MC Filters NMWL на мол. вес. 10000). При ультрафильтрации фосфолипидные наночастицы задерживаются на мембране. Субстанция, связанная с фосфолипидными частицами, также задерживается на мембране. Субстанция, не связанная с частицами, фильтруется и обнаруживается в фильтрате. Определение инсулина проводят методом ВЭЖХ.

Получают 10 флаконов, содержащих по 2,51 г сухого белого кристаллического порошка с остаточной влажностью 1,37%, после растворения которого в 8,5 мл воды образуется раствор со светопропусканием при 660 нм 86,5%, размером частиц 74 нм, рН 6,5 и процентом встраивания 98%.

Для определения биодоступности полученных препаратов были проведены эксперименты на животных.

Пример 5. Сравнительное изучение на животных биодотупности свободного ловастатина и в виде композиции на основе растительных фосфолипидов и ЖК с различной длиной цепи

Количество крыс - 5 самцов весом 320±10 г.

Лиофилизаты готовых препаратов (из примера 2) растворяют в 1 мл дистиллированной воды, затем объем раствора доводят до:

3,3 мл - для препарата НФОле-Лов;

3,2 мл - для препарата НФЛин-Лов;

4,6 мл - для препарата НФКил-Лов;

2,0 мл - для препарата НФКин-Лов.

Также готовят суспензию 8,1 мг ловастатина в 3 мл воды (контроль).

1 мл суспензии вводят перорально крысе (доза 2,7 мг/крысу) и отбирают из хвоста по ~200 мкл крови через 30, 60, 120, 180, 240, 300 мин. Отбор производят в пробирки на 1,5 мл эппендорф, предварительно смоченные 15% раствором ЭДТА.

Цельную кровь центрифугируют в течение 20 мин при 8000 об/мин и температуре 4°С. Отбирают 100 мкл плазмы. Разбавляют плазму в 10 раз метанолом. Перемешивают. Центрифугируют 10 мин при тех же условиях. Отбирают по 400-500 мкл образца в виалы для анализа методом LC/MS.

Аналогично проводят сравнительное изучение на животных свободного индометацина и в виде композиции на основе растительных фосфолипидов и ЖК с различной длиной цепи.

В таблице 5 представлены полученные значения концентраций ловастатина и индометацина в плазме крови с учетом разбавления образцов.

Таблица 5
Сравнительная биодоступность in vivo лекарственной субстанции, введенной в свободном виде и в виде композиций на основе растительных фосфолипидов и ЖК с разной длиной цепи
Наименование ЖК в системе Фосфолипид/ЖК	Содержание Индометацина в крови через 30 мин после введения per os, мкг/мл плазмы	Содержание Ловастатина в крови через 30 мин после введения per os, нг/мл плазмы
Олеат натрия	6,6	13,7
Линолеат натрия	11,2	38,7
Каприлат натрия	14,6	19,9
Капринат натрия	16,2	13,2
Свободный препарат	0,6	7,5

Т.о., при сравнительном изучении in vivo биодоступности индометацина и ловастатина, введенных в эквивалентных количествах в свободном состоянии и в виде композиции на основе жирных кислот, стабилизированных фосфатидилхолином, показано значительное увеличение содержания препаратов в крови животных (от 2 до 27 раз).