штамм клеток e.coli bl21(de3)plyss, клон ptt9/asfvp30, содержащий рекомбинантную плазмиду со встройкой участка гена ср204l вируса африканской чумы свиней, кодирующего конформационный эпитоп белка p30, для изготовления диагностических препаратов

Формула изобретения

Штамм клеток E.coli BL21(DE3)pLysS, клон pTT9/ASFVp30, содержащий рекомбинантную плазмиду со встройкой участка гена CP204L вируса африканской чумы свиней, кодирующего конформационный эпитоп белка р30, инв. № 2966, депонированный в Коллекции микроорганизмов ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии, для изготовления диагностических препаратов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств диагностики вируса африканской чумы свиней (АЧС).

Африканская чума свиней (АЧС) - вирусная болезнь, характеризующаяся высокой летальностью и контагиозностью, сверхострым, подострым, острым и хроническим течением. В 2000 г. возбудитель отнесен к семейству Asfarviridae [1].

Африканская чума свиней (АЧС) известна почти на протяжении 100-летия как природно-очаговая вирусная инфекция диких африканских и домашних свиней местных и европейских пород. Передается от больных животных и вирусоносителей контактным и алиментарным путем. Кроме того, вирус АЧС может передаваться и трансплацентарно, вызывая аборты у супоросных свиноматок [2].

Экономический ущерб, наносимый АЧС, складывается из прямых потерь по радикальной ликвидации болезни, ограничений в международной торговле и измеряется десятками миллионов долларов [3].

Вакцины до настоящего времени против вируса АЧС не разработаны, поэтому ранняя и высокоэффективная диагностика болезни является ключевым моментом для ограничения ее распространения и иррадикации.

Известен штамм клеток E.coli M15 (Qiagen), в котором уровень накопления рекомбинантного белка р30 вируса АЧС при индукции IPTG составлял 1 мкг с 1 мл бактериальной культуры, время экспрессии - 2,5 ч при температуре 24±0,5°С [4]. Однако невысокий уровень накопления в указанной клеточной системе не позволял получать рекомбинантный антиген в производственных количествах с небольших объемов бактериальной культуры.

Известен штамм клеток E.coli BL21(DE3)pLysS, который используется для высокоэффективной экспрессии генов под контролем Т7 промотора и позволяет достигать высокого уровня экспрессии целевого гена при индукции с IPTG [5, 6]. Клетки этого штамма обладают свойством в присутствии индуктора (IPTG) преимущественно экспрессировать рекомбинантные белки и в минимальном количестве собственные белки.

Предлагаемый штамм - штамм клеток E.coli BL21(DE3)pLysS, клон pTT9/ASFVp30 (клон 11), содержащий рекомбинантную плазмиду со встройкой участка гена CP204L вируса африканской чумы свиней (АЧС), кодирующего конформационный эпитоп белка р30.

Целью настоящего изобретения является получение нового штамма клеток E.coli BL21(DE3)pLysS, клона pTT9/ASFVp30, содержащего рекомбинантную плазмиду со встройкой участка гена CP204L вируса африканской чумы свиней (АЧС), кодирующего конформационный эпитоп белка р30, - гиперпродуцента эпитопа рекомбинантного белка р30 размером в 101-ну аминокислоту с молекулярной массой 14.000 Da, который эффективно очищается методом хроматографии на целлюлозе и пригоден для использования в диагностических тест-системах для выявления антител к вирусу АЧС в сыворотках крови свиней и получения гипериммунных сывороток для выявления антигена вируса АЧС методом иммунофлуоресценции.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала источников рекомбинантных антигенов вируса АЧС, обладающих высокой биологической антигенной и иммуногенной активностью, сохраняющего свои основные иммунобиологические свойства после хроматографической очистки и пригодных для получения гипериммунных моноспецифических сывороток на лабораторных животных с целью изучения патогенеза и репродукции вируса АЧС in vitro и in vivo. Изобретение предполагает применение полученных к рекомбинантному р30, продуцируемому клетками E.coli штамма BL21(DE3)pLysS, клона pTT9/ASFVp30 (клона 11), иммуноглобулинов G (IgG) в диагностичеких целях (в реакции непрямой иммунофлюоресценции для выявления антигена вируса АЧС в мазках-отпечатках проб патологического материала, диагностический иммуноблоттинг).

Данный технический результат достигнут получением клона pTT9/ASFVp30 (клона 11) в клетках E.coli штамма BL21(DE3)pLysS, который является гиперпродуцентом рекомбинантного белка. Полученные рекомбинантные трансформанты скринировали на наличие встройки методом ПЦР и изучали культурально-биологические свойства клонов при накоплении в жидкой питательной среде SOB (pH 7,5-8,0) или LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, 50 мкг/мл канамицина, при оптимальной температуре 37,0±0,5°С. Однородность клонов изучали путем пересева на твердую питательную среду.

Установлено, что рекомбинантный клон устойчив к хлорамфениколу. Клетки клона способны стабильно продуцировать рекомбинантный р30 вируса АЧС в присутствии 1 мМ IPTG. Динамика накопления целевого антигена в различных температурных режимах культивирования представлена в таблице 1. В непрямом ТФ ИФА и в SDS-PAAG-электрофорезе по Laemmli U.K. показана стабильность экспрессии и полипептидный состав экспрессируемых белков.

Таблица 1
Сравнительный анализ влияния времени индукции промотора на выход рекомбинантного белка р30.
n=3
Время, часы	Выход рекомбинантного белка клона рТТ9р30-2 М15 (прототип), мкг/мл	Выход рекомбинантного белка клона pTT9/ASFVp30 BL21 pLysS, мкг/мл
0,5	0,1	0,1-0,2
1,0	0,3	0,5-0,6
1,5	0,6	1,0-1,2
2,0	0,8	1,4-1,6
2,5	1,0	2,0-2,5
3,0	н.и.	2,5-3,0
3,5	н.и.	3,0-3,5
4,0	н.и.	3,5-4,0

Полученный рекомбинантный клон депонирован в «Коллекции патогененых микроорганизмов, вирусов и бактерий, вызывающих особоопасные, в том числе зооантропонозы", Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии (ВНИИВВиМ) 09.09. 2011 года под регистрационным шифром 2966.

Штамм E.coli BL21(DE3)pLysS клон pTT9/ASFVp30 (клон 11) отличается от прототипов, более высоким уровнем экспрессии рекомбинантного антигена, в 2-4 раза превышающим уровень накопления целевого антигена первичным продуцентом в клетках E.coli штамма M15, что было достигнуто использованием компетентных клеток E.coli штамма BL21(DE3)pLysS. По сравнению с продуцентом рекомбинантного белка р30 в бакуловирусной системе, предлагаемый штамм отличается от прототипа дешевизной культивирования в сотни раз.

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма E.coli BL21(DE3)pLysS клона pTT9/ASFVp30 (клон 11) для изготовления средств диагностики вируса АЧС.

Штамм E.coli BL21(DE3)pLysS клон pTT9/ASFVp30 (клон 11) характеризуется следующими признаками и свойствами: клон однородный, стабилен при пассировании и культивировании в жидких и твердых питательных средах, устойчив к хлорамфениколу, культивируется в присутствии ампициллина и канамицина, способен стабильно экспрессировать рекомбинантный р30 вируса АЧС. Продуцируемый белок обладает высокой биологической антигенной и иммуногенной активностью, сохраняет свои основные иммунобиологические свойства после хроматографической очистки. Выход очищенного рекомбинантного антигена с 1 л бактериальной культуры составляет 2-4 мг.

Основные маркерные характеристики штамма E.coli BL21(DE3)pLysS клон pTT9/ASFVp30 (клон 11) приведены в таблице.

Маркерные характеристики штамма E.coli BL21(DE3)pLysS клон pTT9/ASFVp30

№ п/п	Основные свойства	Характеристика свойств
1	2	3
1.	Молекулярно-генетические свойства	Штамм E.coli BL21(DE3)pLysS клон pTT9/ASFVp30 (клон 11) содержит рекомбинантноую плазмиду рТТ9р30-9, несущую участок гена CP204L вируса АЧС с 212-й по 584-ю пару оснований, кодирующего последовательность растворимого эпитопа белка р30 вируса АЧС с 90-й по 190-ю аминокислоту, имеющего молекулярную массу 14.000 Da. В структуре рекомбинантной плазмиды содержится последовательность целлюлозо-связывающего домена (CBD), за счет чего возможна очистка целевого антигена на целлюлозном сорбенте.
Штамм клеток E.coli BL21(DE3)pLysS, который используется для высокоэффективной экспрессии генов под контролем Т7 промотора. Клетки BL21(DE3)pLysS содержат плазмиду pLysS, несущую ген, кодирующий Т7 лизоцим. Лизоцим Т7 снижает уровень экспрессии под контролем Т7 промотора, но позволяет достигать высокого уровня экспрессии целевого гена при индукции с IPTG.
Генотип клеток E.coli BL21(DE3)pLysS: F-, ompT, hsdSB (rB-,mB-), dcm, gal, DE3, pLysS, Cmr.
2.	Ростовые свойства	Клон репродуцируется в среде SOB, содержащей 2% бакто-триптона (Difco), 0,5% дрожжевого экстракта (Difco), 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl и 20 мМ Mg2+ , pH 7,5-8,0, или в среде LB, содержащей 1% бакто-триптона (Difco), 0,5% дрожжевого экстракта (Difco), 170 мМ NaCl, 10 мМ MgSO 4, pH 7,0-7,4, в присутствии 100 мкг/мл ампициллина,
		50 мкг/мл канамицина при оптимальной температуре культивирования 37,0±0,5°С. Перед индукцией экспрессии целевого антигена проводят процедуру подращивания освеженной культуры(ночной культуры) на свежеприготовленную среду при оптимальной температуре 37,0±0,5°С в течение 3-4 часов до оптической плотности ростовой среды - 0,6-0,8 ед. при длине волны 600 нм. Максимальный уровень экспрессии достигается в присутствии 1 мМ IPTG при оптимальной температуре 28,0±0,5°С через 4-5 часов культивирования.
3.	Патогенные свойства	Штамм апатогенен для лабораторных и восприимчивых животных.
4.	Свойства полезного вещества, продуцируемого штаммом	Штамм продуцирует растворимый белок, представляющий конформационный эпитоп р30 вируса АЧС (с 90-й по 190-ю аминокислоту), молекулярная масса 14.000 Da.
По структуре представляет собой фосфопротеин.
Рекомбинантный белок р30 при использовании в ELISA в 3 раза активнее по сравнению с цитоплазматическим вирусспецифическим антигеном.
Преимущества использования рекомбинантного р30 для ELISA объясняются количеством линейных и конформационных эпитопов, содержащихся в этом белке. Показано, что рекомбинантный р30 содержит в основном конформационные эпитопы, за счет этого некоторые сыворотки реагируют лучше с рекомбинантными белками, чем с вирусиндуцированными.
5.	Терморезистентность (Т)	Штамм E.coli BL21(DE3)pLysS клон pTT9/ASFVp30 (клон 11) инактивируется при температуре выше 42,0±0,5°С.
6.	Ингибиторочув-ствительность	Под воздействием хлороформа, эфира и других растворителей, а также под воздействием растворов формальдегида, сернокислой меди, теотропина полностью утрачивается жизнеспособность клеток E.coli BL21(DE3)pLysS клона pTT9/ASFVp30 (клон 11).
7.	Стабильность генетических и иммуногенных	Стабильность генетических и иммуногенных признаков штамма сохранялась при его пассировании в жидкой питательной среде в

	признаков	течение не менее 20 пассажей (срок наблюдения).
8.	Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами	Штамм не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами.
9.	Культуральные свойства и стандартные условия выращивания	Штамм устойчив к хлорамфениколу. Клон репродуцируется в среде SOB или в среде LB в присутствии 100 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл канамицина при оптимальной температуре культивирования 37,0±0,5°С, способен стабильно экспрессировать рекомбинантный р30 вируса АЧС.
10.	Сохраняемость и условия хранения	Штамм стабилизируют в глицерине до концентрации его 50% и хранят в замороженном состоянии при температуре не менее минус 60°С. Освежают культивированием его в жидкой питательной среде SOB или в среде LB в присутствии 100 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл канамицина при оптимальной температуре культивирования 37,0±0,5°С в течение 18 часов при умеренном встряхивании 110-120 об/мин один раз в 3 года.
11.	Оригинальность и патентоспособность	Штамм E.coli BL21(DE3)pLysS клон pTT9/ASFVp30 (клон 11) по показателям антигенности и иммуногенности продуцируемого целевого антигена является оригинальным, новым, ранее неизвестным вариантом продуцента рекомбинантного белка р30 вируса АЧС, пригодного для получения гипериммунных сывороток для иммунофлуоресценции.

Сущность предлагаемого изобретения поясняется примерами его исполнения и использования.

ПРИМЕР 1. Культивирование и очистка продуцируемого штаммом рекомбинантного белка.

Для наращивания штамма E.coli BL21(DE3)pLysS клон pTT9/ASFVp30 (клон 11) и экспрессии бактериальной культурой рекомбинантного белка р30 осуществляли культивирование в среде SOB, pH 7,5-8,0 с добавлением 100 мкг/мл ампициллина, 50 мкг/мл канамицина, 20 мМ MgCl₂ и 1,0 мМ IPTG при оптимальной температуре 28,0±0,5°С в течение 4 часов. Предварительно перед индукцией экспрессии целевого антигена проводили процедуру подращивания пересеянной на свежеприготовленную среду ночной культуры при оптимальной температуре 37,0±0,5°С в течение 3-4 часов до достижения оптической плотности бактериальной массы, измеряемой при длине волны 600 нм, значения 0,6-0,8 ед.

Далее готовили лизаты клеток. Для этого бактериальную массу осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 40 мин при температуре 4°С. Разрушение клеток проводили в ультразвуковом дезинтеграторе с постоянным охлаждением смеси. Процедура озвучивания состояла из 3-х циклов по 2 мин при частоте 18 кГц/сек с перерывом между циклами в 15 минут. Процесс озвучивания контролировали микроскопически, окрашивая аликвоты лизата фуксином Пфейфера. Лизат клеток, содержащий рекомбинантный р30, ресуспендировали в ТЕ-буфере (рН 7,2-7,4) из расчета на 100 мг бактериальной массы 1 мл буфера [15].

Поскольку протеолитическая деградация секретируемого рекомбинантного белка является существенной проблемой, в буферы добавляли ингибитор протеаз - Pefablock SC до рабочей концентрации 0,25 мг/мл. Обе суспензии осветляли центрифугированием при 15000 об/мин в течение 20 мин и фильтровали через мембранные фильтры с размером пор 0,45 мкм[15].

Содержание общего белка в лизате определяли по методу Лоури [8].

Эффективность очистки рекомбинантного белка р30 оценивали в 12% и 10% SDS-ПААГ электрофорезе по Laemmli U.K. [7, 13].

Для изоляции из подготовленного лизата рекомбинантного белка р30 использовали адсорбцию в статических условиях - быстрый метод, позволяющий выделять вещества, находящиеся в небольшом количестве в неочищенных смесях [15].

Отмытую целлюлозу добавляли к суспензии обработанного ультразвуком(6 раз по 1 мин при 18 мг) и осветленного лизата из расчета 50-60 мкг белка на 1 мг сорбента. Сорбент инкубировали при 4°С в течение ночи при постоянном перемешивании. Затем сорбент промывали 10-кратным объемом 1% раствора тритона Х-100. Процедуру отмывки повторяли трижды, интенсивно перемешивая сорбент. Элюцию рекомбинантного белка р30 проводили 100% формамидом. Собранные фракции диализовали в течение ночи при 4°С против 0,01М трис-HCl (рН 8,5-9,0), содержащего 0,15M NaCl [15].

Т.к. в плазмиде рТТ9р30-9 имеется ген CBD, кодирующий в структуре рекомбинантного белка целлюлозо-связывающий домен, с помощью которого рекомбинантный белок р30 способен связываться с целлюлозными матрицами, то очистку белка проводили на микрокристаллической целлюлозе марки Avicel® (Merck), которую предварительно активировали в растворе 0,5М NaOH в течение 30 минут с последующей отмывкой до рН 8,0-8,5. Такая предварительная подготовка целлюлозы и проведение адсорбции «в объеме» (адсорбции в статических условиях) позволили увеличить ее сорбционную емкость до 60 мкг белка на 1 мг сорбента.

В результате проведенных опытов было получено 8 аналитических серий очищенного рекомбинантного р30. Выход составил приблизительно от 2 до 4 мг белка на серию, получаемого с 1 л бактериальной культуры, концентрация белка в образце достигала значений 0,4-0,5 мг/мл. Одной аналитической серии достаточно для сенсибилизации около 100 штук 96-луночных панелей для выявления антител к вирусу АЧС в непрямом ТФ ИФА.

Степень чистоты белка подтверждалась электрофорезом в ПААГ. Анализ электрофореграмм очищенного рекомбинантного белка показал, что он был представлен четкой единичной полосой в области 14 кДа.

ПРИМЕР 2. Антигенность рекомбинантного белка, продуцируемого штаммом, и безопасность его применения.

Для получения моноспецифической гипериммунной сыворотки крови к рекомбинантному р30 вируса АЧС проводили процедуру «праймирования» - животным в возрасте не более 6 мес., массой 2,5-3,0 кг вводили в область бедра внутримышечно или подкожно в непосредственной близости от регионарных лимфатических узлов водный раствор плазмидной ДНК из расчета 100 мкг/кг живого веса, а через 10 сут. животным инъецировали в ту же область препарат очищенного рекомбинантного белка р30 вируса АЧС из расчета 100 мкг/кг живого веса 3-кратно с интервалом в 10-14 сут. Через 14 сут после последней иммунизации обескровливали животных согласно «Методическим рекомендациям по обескровливанию лабораторных животных».

Специфичность и активность полученных сывороток оценивали в непрямом варианте ТФ ИФА и реакцией непрямой иммунофлюоресценции с ФИТЦ-конъюгатом протеина А.

Полученная гипериммунная моноспецифическая сыворотка крови кролика к рекомбинантному р30 в непрямом варианте ТФ ИФА специфично реагировала со специфическим вирусным антигеном АЧС и с хроматографически очищенным рекомбинантным белком р30 вируса АЧС и не взаимодействовала с отрицательными антигенами - с лизатом интактной культуры клеток CV-1 и лизатом клеток E.coli штамма BL21(DE3)pLysS. Оптическая плотность лунок, сенсибилизированных специфическими антигенами, в которых инкубировали гипериммунную моноспецифическую сыворотку крови кролика, превышала таковую в 2,1 и более раза в лунках, в которых инкубировали отрицательную сыворотку крови кролика.

Титр полученной сыворотки с рекомбинантным хроматографически очищенным р30 1:1600-1:3200, а со специфическим вирусным антигеном АЧС 1:400-1:800.

ПРИМЕР 3. Выявление антигенов вируса АЧС в культуре инфицированных клеток и мазках отпечатках с помощью гипериммунной моноспецифической сыворотки к рекомбинантному р30.

Выявление антигенов вируса АЧС в культуре инфицированных клеток и мазках отпечатках проводили с использованием специфической сыворотки крови свиньи к вирусу АЧС и полученной гипериммунной моноспецифической сыворотки к рекомбинантному р30 вируса АЧС в реакции иммунофлюоресценции (РНИФ) непрямым вариантом.

С целью определения активности испытуемой сыворотки крови кролика и ее специфичности проводили ее титрование в РНИФ.

Полученная гипериммунная моноспецифическая сыворотка крови кролика к рекомбинантному р30 специфично реагировала только со специфическими антигенами вируса АЧС инфицированных культуральных тест-препаратов и мазков отпечатков инфицированных органов и не взаимодействовала с интактными клетками культуральных тест-препаратов перевиваемой культуры клеток CV-1. Титр полученной сыворотки в РНИФ 1:128-1:256.

Источники информации