способ изготовления панели сывороток с hbsag ad- и ay-субтипов для контроля качества диагностики гепатита в

Формула изобретения

1. Способ изготовления панели сывороток с HBsAg AD- и AY-субтипов для контроля качества диагностики гепатита В, включающий проверку донорских сывороток на наличие анти-HIV, анти-HCV и анти-HBs антител, а также неспецифического связывания HBsAg; отбор образцов с отрицательным (по данным ИФА и spike/recovery test) результатом по указанным показателям; приготовление на основе отобранных сывороток разводящих растворов (РР), предусматривающее введение стабилизирующей добавки; аттестацию ИФА монопрепаратов AD- и AY-субтипов HBsAg путем титрования их разведений в РР относительно международных стандартов с определением точных количеств (разведений) аттестованных монопрепаратов HBsAg в РР, обеспечивающих получение заданных конечных концентраций; лиофильное высушивание сывороток до остаточной влажности примерно 1-1,5%; проведение теста панели на термодеградацию для определения срока годности, отличающийся тем, что титрование в разводящем растворе образцов указанных монопрепаратов HBsAg AD- и AY-субтипов производят в диапазоне от 0.01 до 0,5 МЕ/мл с получением их конечных концентраций 0,1; 0,05 и 0,01 МЕ/мл, а в качестве стабилизирующей добавки при изготовлении разводящих растворов используют пролин в количестве 200-250 мМ и бензойную кислоту в количестве 0,05-0,08 мас.%.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве препаратов HBsAg используют плазменные 100%-ные антигены, содержащие AD- или AY-субтип HBsAg.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для формирования панели субтипов изготовляют 6 образцов с концентрацией HBsAg 0,1; 0,05 и 0,01 МЕ/мл, в том числе 3 образца AY-субтипа и 3 образца AD-субтипа, и 2 отрицательных образца для контроля специфичности тест-систем.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к технологии изготовления референс-панелей сывороток, содержащих антигены наиболее опасных вирусных инфекций, в частности вируса гепатита В (ВГВ), и может быть использовано в медицине и биотехнологии.

Образцы крови доноров в России обязательно исследуют на присутствие маркеров HIV 1 и 2, гепатитов В и С и сифилиса. Приблизительно 1% всех образцов посылается на повторное подтверждение в контрольные лаборатории. Однако эффективность подтверждения результатов зависит от квалификации сотрудников клинической диагностической лаборатории, качества тест-систем и от наличия в контрольных лабораториях стандартных препаратов на анализируемые инфекционные маркеры (VQC Pelispy Multi - Marker, run control. Central Laboratory of Red Cross, Netherlands, 1998) [1].

При использовании высокочувствительных HBsAg скриннинговых тестов носители гепатита В с очень низкой концентрацией HBsAg могут быть выявлены, в частности, среди лиц, которые являются носителями анти-НВс антител.

Использование в каждодневной работе референс-препаратов различных субтипов HBsAg позволит расширить спектр диагностируемых маркеров и использовать эти материалы для выявления HBsAg в препаратах крови, предназначенных для переливания или переработки.

По оценке экспертов в области молекулярной биологии количество и виды мутаций в биомолекулах в значительной мере определяются региональными особенностями: климата, набора продуктов питания, представительностью химических элементов Fe, Co, Cr, Ni и Cu.

Повышение качества диагностики ВГВ идет параллельно с повышением чувствительности диагностических тест-систем. По мере совершенствования качества иммунологических препаратов чувствительность диагностических систем на выявление HBsAg повышалась от 0,1 МЕ/мл до 0,05 МЕ/мл. Теперь перед практическим здравоохранением поставлена задача диагностировать HBsAg в препаратах крови на уровне 0,01 МЕ/мл для контроля квалификации сотрудников контрольно-диагностических лабораторий (КДЛ), качества тест-систем и вакцин против гепатита В.

Уже появились коммерческие тест-системы с заявленной чувствительностью 0,01 МЕ/мл (ЗАО Диагностические системы, ЗАО Вектор Бест и др.). Однако для подтверждения такой чувствительности и внедрения этих тестов в клиниках и на станциях переливания крови необходимы сертифицированные стандартные препараты. Задача чрезвычайно сложная, т.к. валидизировать образцы с концентрацией 0,01 МЕ/мл необходимо с применением тест-систем с чувствительностью - 0,01 МЕ/мл.

Из литературы известны способы-аналоги изготовления панелей, например способ приготовления панелей сывороток, разработанный в лаборатории стандартов Красного Креста (Голландия) для приготовления референс-панелей PELICHECK и PELISPY RUN controls [l]. Эти панели представляют собой образцы референс-препаратов AY и AD субтипов HBs Ag, разведенных в пуле донорских сывороток, не содержащих маркеров опасных вирусных инфекций, в концентрации до 0,1 нг/мл. Способ включает приготовление стандартных сывороток, содержащих HBs Ag и имеющих разную концентрацию этого белка.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ приготовления панелей сывороток HBV DNA Genotype Performance Panel, разработанный в лаборатории Boston Biomedical Inc. (США) - BBI. Эта панель включает 10 образцов с генотипами A-D (Product catalog 2003/2004 Boston Biomedica, Inc., 2004, p.28) [2]. Образцы панели представляют HBV DNA сыворотки, разведенные в пуле донорских сывороток, не содержащих маркеров опасных вирусных инфекций.

Однако эти панели не отвечают потребностям практического здравоохранения, т.к. аттестованы количественно по концентрации DNA вируса гепатита В, а не по концентрации HBsAg. Кроме того, сыворотки, входящие в состав этих панелей, представлены в жидкой форме и поэтому должны храниться в замороженном состоянии. Рассылка и хранение BBI панелей требуют строгого соблюдения низкотемпературных режимов (Damen, M., Cuypers, H.T.M., Zaaijer, H.L., Reesink, H.W., Schaasberg, W.P., Gerlich, W.H., Niesters, H.G.M., Leiie P.N. (1996) International collaborative study on the second EUROHEP HCV-RNA reference panel. J. Virol. Methods 58, 175-185) [3].

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание такого способа изготовления панели сывороток для контроля качества диагностики гепатита В, который обеспечивает получение образцов указанной панели сывороток с аттестованной предельно низкой концентрацией AD и AY субтипов HBsAg и сохранение специфических характеристик этих образцов в течение длительного времени.

Указанный технический результат достигается тем, что способ изготовления панели сывороток с предельно низкими концентрациями HBsAg AD и AY субтипов для контроля качества диагностики гепатита В включает проверку донорских сывороток методом полимеразной цепной реакции на наличие ДНК вируса гепатита В, анти-HIV, анти-HCV и анти-HBs антител неспецифического связывания HBsAg, отбор донорских сывороток, не содержащих специфические антитела к основным маркерам вирусных инфекций по значениям эффекта подавления HBsAg (spike/recovery test) и имеющих отрицательный результат в иммуноферментном анализе, изготовление разводящих растворов на основе отобранных сывороток, аттестацию монопрепаратов HBsAg AD и AY субтипов методами иммуноферментного анализа, титрование в разводящем растворе образцов указанных монопрепаратов HBsAg AD и AY субтипов от 0.01 до 0,5 МЕ/мл, построение калибровочных кривых титрования в разводящем растворе от 0.01 до 0,5 МЕ/мл AD и AY субтипов HBsAg относительно международных стандартов и их статистический анализ, в соответствии с которым определяют количество монопрепаратов HBsAg каждого субтипа, необходимое для введения в разводящий раствор для получения их конечной концентрации в соответствии с данными калибровочных кривых, и изготовление панели сывороток с предельно низкими концентрациями HBsAg AD и AY субтипов путем разведения монопрепаратов HBsAg AD и AY субтипов разводящим раствором для получения их конечных концентраций 0,1 МЕ/мл; 0,05 МЕ/мл и 0,01 МЕ/мл соответственно в соответствии с данными калибровочных кривых.

В качестве монопрепаратов HBsAg используют плазменные 100%-ные антигены, содержащие AD и AY субтипы HBsAg.

В качестве стабилизирующей добавки используют пролин в количестве 200-250 мМ и бензойную кислоту в количестве 0,05-0,08 мас.%.

Приготовленные образцы панели сывороток с предельно низкими концентрациями HBsAg AD и AY субтипов лиофильно высушивают до остаточной влажности менее 2.0 мас.%.

Образцы панели сывороток с предельно низкими конценрациями HBsAg AD и AY субтипов исследуют с помощью теста термодеградации для установления срока их годности.

Юстирование стандартных образцов до требуемой концентрации HBsAg проводят, используя коэффициенты разведения исходных препаратов AY & AD субтипов, вычисленные по уравнениям калибровочных кривых AY & AD препаратов HBsAg в разводящем стабилизированном растворе до требуемой концентрации HBs Ag (0.1 ME/мл, 0,05 МЕ/мл и 0,01 МЕ/мл). В качестве исходных препаратов HBs Ag используют препараты с содержанием HBsAg до 100% по искомому белку.

Ниже приведена схема изготовления панели сывороток с предельно низкими концентрациями HBsAg субтипов AY & AD.

1. Тестирование образцов донорских сывороток с помощью лабораторного стандарта HBsAg для изучения величины подавления аналитического сигнала компонентами тестируемой плазмы. Из донорских сывороток с минимальным уровнем подавления готовят разводящий раствор (РР) для изготовления образцов панели сывороток с предельно низкими концентрациями (ПНК) HBsAg.

2. Титрование препарата HBsAg AY субтипа (пр-во НПК «Препарат», Нижний Новгород) и препарата AD субтипа (производство коипании GeneLab Diagnostics, Singapore) в приготовленном РР на одном планшете совместно с международными стандартами - 2^nd International Standard ADW2 code 00/588 (NIBSC, Англия) и стандарта института П. Эрлиха (ФРГ) - AD субтипа в различных тест-системах.

3. Статистическая обработка результатов калибровочных титровок на уровне доверительной вероятности 95% для вычисления коэффициентов разведения 100% препаратов HBsAg в стабилизированном РР до необходимой концентрации.

4. Приготовление кандидатов ПНК AY & AD субтипов HBsAg.

5. Валидация кандидатов ПНК AY & AD субтипов в ИФА тест-системах с заявленной чувствительностью 0,01 ME (в разных лабораториях) параллельно со 2-ным Международным стандартом HBsAg (NIBSC, 33 МЕ/мл) и Р. Ehrlich стандартом (100 МЕ/мл).

6. Приготовление сухой стабилизированной формы кандидатов ПНК методом лиофилизации.

7. Проведение теста ускоренной инактивации кандидатов ПНК при повышенных температурах для определения срока годности стандарта.

Для определения соотношения между величиной аналитического сигнала ИФА и количеством HBs Ag в разводящем растворе необходимо использовать ИФА тест-системы, которые в диапазоне от 0,3 до 0.02 МЕ/мл сохраняют прямолинейную связь между оптической плотностью и концентрацией HBs Ag в растворе.

Для решение проблемы аттестации образцов панели сывороток по концентрации HBs Ag следует проводить следующие действия:

- использовать для создания образцов панели образцы плазмы, содержащие различные концентрированные препараты плазменного или рекомбинантного антигенов с содержанием HBs Ag не менее 95% от общего белка, не имеющих инфекционной опасности;

- в качестве разводящего раствора (РР) использовать стабилизированный пул сывороток нормальной человеческой крови, который не содержит маркеров основных инфекций и не подавляет аналитический сигнал от HBsAg.

Предлагаемая модель панели сывороток предельно низких концентраций HBsAg AD и AY субтипов включает 8 образцов: 2 образца донорских сывороток, 3 образца AY субтипа HBsAg и 3 образца AD субтипа HBsAg, приготовленных разведением образцов в стабилизированном пуле донорских сывороток (РР) до концентрации 0.1 ME/мл, 0,05 МЕ/мл и 0,01 МЕ/мл антигена.

Для изготовления образцов панели сывороток используют концентрированные препараты AD и AY субтипов HBsAg, но не нативные сыворотки. В процессе концентрирования препаратов HBsAg проводят обработку сывороток трипсином, фильтрование через 0.45 мкм и 0.22 мкм фильтры, скоростное центрифугирование и концентрирование. Полученный продукт под названием "очищенный плазменный HBs-антиген" аттестуют на содержание белка и активность взаимодействия с анти-HBs антителами. Содержание искомого белка HBsAg у таких препаратов превышает 95%.

Важным значением при использовании панелей сывороток в клинических диагностических лабораториях является правильность результатов анализа Rezapkin G., Dragunsky E. and Chumakov К. (2005) Improved ELISA test for determination of potency of Inactivated Poliovirus Vaccine (IPV) // Biologicals 33, IP-27 [4]. Основным критерием правильности результатов серологического анализа служит аттестованное значение аналитического сигнала (например, оптическая плотность ОН в ИФА) для каждого образца панели. При этом обязательным условием применения референс-препаратов HBsAg является неизменный уровень этого аналитического сигнала в процессе длительного хранения.

Сохранение специфических свойств сывороток панели, содержащих IgG-антитела путем введения консерванта - бактерицидной добавки (мертиолят 0.01% и гентамицин 0,2%), известно из патента РФ № 2265028, МПК G01N 33/96, опубл. 27.11.2005 [5]. В настоящем изобретении для стабилизации уровня антигена HBs Ag предлагается использовать стабилизатор, включающий 200-250 мМ пролина (L - пролин, 99%, для синтеза, каталог № 163646 1206) и 0,05-0,08 мас.% бензойной к-ты. Введение пролина является важным методическим приемом. Пролин обладает мощным дезинтегрирующим потенциалом, предотвращающим процесс ассоциации моночастиц HBsAg. Кроме того, пролин, как первичная аминокислота, не вносит в состав растворов посторонних ингредиентов (Bolli R., Woodtii К., Bartschi M. et al. L-proline reduces IgG dimmer content and enhances the stability of intravenous immunoglobulin solutions // Biologicals 38 (2010), 150-157) [8]. Бензойная кислота является классическим антиоксидантом, использующимся для стабилизации медпрепаратов и пищевых продуктов, проявляет антимикробное и антигрибковое действие, оказывает угнетающее воздействие на плесень, дрожжи и некоторые виды бактерий.

Низкая вязкость раствора стабилизатора для стандартного препарата является критичным параметром для выявления HBsAg на практике, т.к. многие производители тест-систем стараются сократить время анализа. В этих условиях большое значение приобретает снижение диффузионного торможения процесса взаимодействия МКА+HBsAg, обусловленное, в первую очередь, уменьшением вязкости раствора (Kanev A.N., Bakirov T.S., Yudina I.V. and Zaitsev B.N. Simulation of interaction of particles HBsAg with antibodies immobilized on a surface of the microplate well at ELISA // Biotechnology, 2005, 6, 74-82) [6].

Таким образом, процедура аттестации сывороток панели включает три этапа, результаты которых независимы и позволяют надежно идентифицировать концентрацию различных субтипов HBs Ag. Сравнение панелей сывороток ПНК HBsAg, приготовленных в соответствии с заявляемым способом, с панелями-аналогами того же назначения показало, что отличная от прототипа совокупность существенных признаков обеспечивает новое ранее неизвестное свойство: возможность изготовления панелей HBsAg в сухой (лиофильной) форме с предельно низкой аттестованной концентрацией основных субтипов HBsAg, что позволяет оценивать чувствительность тест-систем на уровне 0,01 МЕ/мл и специфичность к различным субтипам HBsAg, контролировать уровень профессионального мастерства работников клинических диагностических лабораторий и контролировать количественно вакцины против гепатита В.

Изобретение поясняется чертежом на фиг.1, на котором приведены средневзвешенные кривые титрования AY & AD образцов HBsAg и кривые среднеквадратических погрешностей Y± Y, где:

ОСО - отраслевой стандартный образец ГИСК им. Л.А.Тарасовича

ЛС - лабораторный стандарт ГНЦ ВБ Вектор;

Р.Er. - стандарт ин-та П.Эрлиха

Ycp - среднее значение Ln ОП

SY - дов. интервал

При обработке кривых титрования используют значения ОП*=ОПэк-Опф.

Общая среднеквадратичная погрешность на выбранном уровне вычисляется (таблица 2) как корень квадратный из суммы квадратов внутригрупповой и межгрупповой погрешностей. Например, для образца № 1 внутригрупповые погрешности, связанные с ошибкам титрования в различных лабораториях, составляют 4,25% (VB) и 9,22% (DS).

Межгрупповой разброс между тест-системами для AD образцов составляет (1,03-0,946)/2*100%=4,42% плюс максимальный дополнительный разброс погрешностей между средними значениями и значениями на выбранном уровне 7,2-4,2=4,33%. В сумме межгрупповой разброс на данном уровне ОП составляет 8,75%. Суммарная погрешность ( ) определения на фиксированном уровне концентрации HBsAg (0,1 МЕ/мл) составляет

Пример выполнения способа изготовления панели сывороток с предельно низкими концентрациями HBsAg AY и AD субтипов

Приготовление разводящего раствора. В качестве РР для приготовления положительных образцов панели с определенной концентрацией HBsAg в работе используют донорские сыворотки, не содержащие маркеров вирусных инфекций. Сыворотки готовят сразу после забора крови. Центрифугируют со скоростью 2800-3200*об/мин цельную кровь при температуре 10-12°С в течение 15 мин и декантируют надосадочный раствор. Хранят до использования при температуре +(2-4)°С. Для приготовления панели отбирают образцы сывороток янтарного цвета, прозрачные на свету. Всего отобраны 9 качественных сывороток.

Контроль донорских сывороток, предназначенных для разведения HBsAg препаратов, на содержание общего белка (норма 6.5-8.5%).

После приготовления все сыворотки анализируют на анти-HBs антитела и вирусную контаминацию.

На следующем этапе ставят тест на подавление аналитического сигнала компонентами тестируемой плазмы. С этой целью отбирают аликвоты по 1 мл от каждого номера сыворотки и вводят в них одинаковое количество HBsAg, рассчитанное на конечную концентрацию 0,2 МЕ/мл для каждой сыворотки (таблица 1). Учет результатов теста подавления позволяет забраковать 2 сыворотки по величине ОП в ИФА.

Далее готовят стабилизатор (стабилизирующую добавку) по следующей рецептуре. К 1 л пула донорских сывороток добавляют 250 мМ L-пролина и 0,07% бензойной к-ты в качестве антиоксиданта. Пул доводят до рН 6,8-7,1 с помощью 0,1 М NaCl. В качестве бактерицидной добавки вводят мертиолят в количестве 0,01% и гентамицин - 0.2% от массы раствора. РР разливают в емкости по 250 см³ и используют сразу или хранят при температуре (2-8)°С в течение не более 1 месяца.

Таблица 1
Результаты теста подавления (spike/recovery) HBsAg в сыворотках донорской крови при введении 0,2 МЕ/мл HBsAg
Контроли	Образец №	ОН, о.е.	Образец №	ОП, о.е.
К-0,011	7831	1,741	10384	1,656
К-0,011	10345	1,345	10379	1,326
0,019	10373	0,814	10390	1,483
К+3,696	10364	1,520	8947	2,947
K+ low 0,457	10376	1,569
Примечание. Образцы 10373 и 8947 не включены в состав пула РР

Несмотря на то, что свойства отдельных компонентов стабилизирующей добавки известны из уровня техники, указанный стабилизатор представляет собой состав, который обладает синергическим стабилизирующим действием, обеспечивающим сохранение свойств предельно низких концентраций антигенов, содержащих AD или AY субтип HBsAg в процессе приготовления панели сывороток, сушки и ее хранения.

Экспериментальные исследования свидетельствуют о том, что сохранение свойств предельно низких концентраций антигенов, содержащих AD или AY субтип HBsAg в панели сывороток, является сложной задачей, которая не решается обычным методом проб и ошибок. Панель сывороток требует соблюдения особого температурного режима для сохранения стабильности.

Анализ результатов исследований показывает, что отдельно пролин в концентрации 200-250 мМ и более, а также отдельно бензойная кислота в концентрации 0,05-0,08% и более не обеспечивают сохранение свойств антигенов в панели сывороток длительное время (см. таблицу).

Кроме того, введение пролина является важным методическим приемом. Пролин обладает мощным дезинтегрирующим потенциалом, предотвращающим процесс ассоциации моночастиц HBsAg. Пролин, как первичная аминокислота, не вносит в состав растворов посторонних ингредиентов (Bolli R., Woodtli К., Bartschi M. et al. L-proline reduces IgG dimmer content and enhances the stability of intravenous immunoglobulin solutions// Biologicals 38 (2010), 150-157). Бензойная кислота является классическим антиоксидантом, использующимся для стабилизации медпрепаратов и пищевых продуктов, проявляет антимикробное и антигрибковое действие, оказывает угнетающее воздействие на плесень, дрожжи и некоторые виды бактерий.

Низкая вязкость раствора-стабилизатора для стандартного препарата является критичным параметром для выявления HBsAg на практике, т.к. многие производители тест-систем стараются сократить время анализа. В этих условиях большое значение приобретает снижение диффузионного торможения процесса взаимодействия МКА+HBsAg, обусловленное, в первую очередь, уменьшением вязкости раствора (Kanev A.N., Bakirov T.S., Yudina I.V. and Zaitsev B.N. Simulation of interaction of particles HBsAg with antibodies immobilized on a surface of the microplate well at ELISA//Biotechnology, 2005, 6, 74-82.

В таблице 1а приведены сравнительные данные активности образцов ПНК HBsAg для заявляемого способа на основе ускоренных испытаний при повышенных температурах хранения с использованием заявляемого состава стабилизатора и отдельных его компонентов.

Таблица 1а
Сравнительные данные активности образцов панели ПНК HBsAg на основе их ускоренных испытаний, полученных заявляемым способом при повышенных температурах хранения
Температура хранения, град. С	Потеря активности за год, %	Потеря активности за месяц, %
Заявлен. состав	Пролин	Бенз. кислота	Заявлен. состав	Пролин	Бенз. кислота
4	0,48	49	57	0,04	1,9	2,5
37	53	100	100	6,1	17	21
50	76	100	100	11,2	26	29

Приготовление положительных образцов стандартной панели. Для приготовления образцов стандартной панели ПНК HBsAg субтипов используют препарат HBsAg субтипа AY (НПК Препарат, НН) и препарат HBsAg AD, термоинактивированный (GeneLabs Diagnostis, Singapore, # 118259).

В таблице 2 приведены средневзвешенные кривые титрования AD образца HBsAg (фиг.1)

III. тест-система "ДС-ИФА-HBsAg" (DS)

Препарат HBsAg, Ad (GeneLab Diagnostic)

Препарат разводили в РР с 0,05 М ФСБ при титровании.

Режим анализа:

1. 2 час при 37С на шейкере, 400 об/мин;

2. Промывка 5 раз ФСБТ;

3. Инкубация с конъюгатом моноклональное Ат: ПХ, 1 час, 37°С, шейкер;

4. Промывка 5 раз ФСБТ;

5. Инкубация с перекисным раствором субстрата - ТМБ, 25 мин;

6. Стоп реагент 2М H₂SO ₄.

Таблица 2
Средневзвешенные кривые титрования AD образца HBsAg
ОСО	Препарат HBsAg, ad субтип
Концентрация HBsAg, МЕ/мл	ОП450	Разведение	ОП450
0,5	3,436	3,253	±0,33	0.1 МЕ АУ/105	1.051	0.985	±0,15
0,05	0,482	0,455	±0,092	0,05 МЕ АУ/2×105	0.584	0.565	±0,092
0,05	0,472	0,459	±0,092	0.017 МЕ АУ/6×105	0.308	0.279	±0,087
0,02	0,208	0,206	±0,061	0,2 ME АД/5×106	0.821	0.837	±0,123
0,02	0,209	0,196	±0,061	0,1 ME АД/107	0.532	0.521	±0,15
0,01	0,123	0,115	±0,057	0,03 ME АД/3×107	0.263	0.253	±0,118
0,01	0,126	0,119	±0,057	Пул отр.	0.134	0.126	±0,063
Контроль н.ч.с.	0,022	0,024	±0,013	Пулотр.	0.148	0.128	±0,063
Угол наклона,b	-0,637±0,073	Угол наклона, b	- 0,66±0,072

Титруют с шагом 2 эти препараты в РР до разведений, соответствующих концентрации ниже 0,01 МЕ/мл на одном микропланшете со стандартными препаратами:

Стандарт HBsAg ин-та Р. Ehrlich, Ad субтипа - 100 МЕ/мл и WHO 2^nd International standard HBsAg, adw2 subtype, code 00/588 (NIBSC, UK).

Полулогарифмические прямые титрования с коэффициентом корреляции - R²>0,99 - обрабатывали статистически для определения угла наклона - bi, отсечки на оси OY - а и коэффициент вариации CV,%, который не должен превышать 10%. Пересчитывают прямые титрования к одному b=b (стандарта Р. Ehrlich). По усредненной калибровочной кривой определяют, какое количество препарата HBsAg каждого субтипа необходимо ввести в РР, чтобы конечная концентрация антигена соответствовала 0.1 МЕ/мл, 0,05 МЕ/мл и 0,01 МЕ/мл.

Выводы. На основании проведенных измерений концентрация ad-субтипа HBsAg в 100%-ном препарате в ME составляет примерною⁶ ME.

Таблица 3
Результаты аттестации образцов ПНК HBsAg
ОП контролей т/с ДС -ИФА - HbsAg	Образцы панели, полученной заявл. способом	ОП,[ое] (Вектор-Бест)	ОП,[ое] (Диагн. сист.)	CV, %
ОСО 0,4 ME-1,933	1-AY	1,132±0,056	1,27±0,064	7,75
ОСО 0,2 ME-1,015	2-AY	0,643±0,078	0,590±0,086	14,0
ОСО 0,1 ME-0,538	3-AY	0,171±0,14	0,171±У-0,15	60,0
OCO 0,05 ME-0,311	4-AD	0,946±0,048	1,03±0,069	13,4
OCO 0,02 ME-0,173	5-AD	0,528±0,075	0,648±0,086	14,0
P.Ehr-1:200-2,822	6-AD	0,174±0,13	0,175±0,15	56,7
2nd Internat Standard (0,33ME) - 1,560	7 (donor)	0,042±0,01	0,035±0,01	10,4
Cc - 0,003	8 (donor)	0,028±0,01	0.046±0,01	9,1
Cut off		0,121	0,118
Примечание. Статистическая обработка выполнена для ОП*=ОПэкс-ОПфон
ОСО - отраслевой стандартный образец ГИСК им.Л.А.Тарасевича
ЛС - лабораторный стандарт ГНЦ ВБ Вектор
P.Ehr. - стандарт института П. Эрлиха

Для приготовления 3-х образцов стандартной панели AD субтипа используют препарат HBsAg субтипа AD (Genelab Diagnostics, Singapore). Аналогично образцы AY HBsAg готовят из препарата HBsAg AY субтипа (НПК Препарат, НН) с концентрацией 0,1 МЕ/мл, 0,05 МЕ/мл и 0,01 МЕ/мл.

Юстировку стандартов выполняют с использованием тест-систем «HBsAg - ИФА - Бест - 0,01» и «ДС - ИФА - HBsAg - 0,01» добавлением или HBsAg, или PP.

На последнем этапе все образцы панели фильтруют через фильтры 0.45 мкм.

Определение ОП сывороток всех номеров проводят в ИФА тест-системах различного формата российского и иностранного производства.

По результатам испытаний образцов ПНК HBsAg получены следующие результаты, приведенные в таблице 3.

Общая среднеквадратичная погрешность препаратов AY на выбранном уровне вычисляется так же, как корень квадратный из суммы внутригрупповой и межгрупповой дисперсий. Например, для образца № 1 внутригрупповые дисперсии, связанные с погрешностью титрования в различных лабораториях, составляют 4,95% и 5,03%. Межгрупповая дисперсия между лабораториями составляет (1,27-1,132)/(1,27+1,132)*100%=5,99%. Среднеквадратическая погрешность на выбранном уровне ОП(АУ)=0,1 ME составляет

Таким образом, CV, % = 9,3/1,2=7,75%.

Профильтрованные образцы ПНК HBsAg разливают в ламинарном шкафу по 0.5 мл во флаконы объемом 2 мл, закрывают резиновыми пробками и размещают в металлические кассеты для замораживания. Замораживание препарата во флаконах проводят при температуре прилавка -(50-60)°С в течение 10-12 ч. Замороженные образцы во флаконах переносят в сублимационную камеру лиофильной установки TG-50, полки которой охлаждены до минус 32°С. Температуру препарата на стадии сублимационного обезвоживания поддерживают ниже температуры его стеклования

(-30°С). Включают компрессор установки для охлаждения десублиматора и полок сушильной камеры. На каждую из пяти полок помещают по кассете с флаконами, в один из которых вморожен датчик измерения температуры материала. Заданная температура на всем протяжении сушки поддерживается автоматически с погрешностью 1-3 град. Значения температуры каждой полки, температуру материала на каждой полке, а также температуру сублиматора записывают постоянно самописцем КП-35. Температура материала в момент включения вакуум-насоса не должна превышать минус 30°С. Средняя скорость нагревания материала на этапе досушивания составляет 6°С/мин, время термостатирования при 27°С составляет 10 ч. Флаконы с препаратом укупоривают под вакуумом. Контроль окончания процесса сушки осуществляют по показаниям датчика остаточного давления. Лиофильно высушенный препарат имеет остаточное содержание воды около 1,0-1,5 мас.%. Определение проводят по методике термогравиметрии. Общее среднее время сушки составляет 32 ч.

Объединенная выборка лиофилизованных кандидатов AY & AD субтипов была исследована в тесте ускоренной термодеградации. Образцы термостатировали в условиях контролируемой температуры при - 20С, +4С +37С и +50С, извлекали через определенные промежутки времени, растворяли в бидистиллированной воде и анализировали в дублях в тест-системе «HBsAg - ИФА - Бест». Активность термостатированных образцов определялась относительно активности образцов, хранившихся при -20°С.

Оценки активности препаратов, хранившихся при повышенных температурах, были далее использованы для предсказания стабильности их при длительном хранении при различных температурах с использованием формальной кинетики Аррениуса (Kirkwood, T.B.L. Принципы приготовления и утверждения международных и других стандартов и эталонных материалов биологических препаратов. Сер. техн. докл. N 37. ВОЗ, Женева, 1990. 14а // J. biol. Standardization. - 1984. - Vol.12. - P.207-224) [7]. Рассчитанные % потери активности за месяц и за год приведены в таблице 4. Образцы продемонстрировали высокую стабильность. Предсказываемая потеря активности за год при +4°С составляет около 0.3% для кандидатов. Предсказанная потеря активности за месяц составляет примерно 4,4% при 37°С.

Следовательно, имеются определенные основания предполагать, что оба кандидата AY и AD субтипов требуют соблюдения температурного режима для сохранения стабильности. В таблице 4 приведен прогноз активности образцов ПНК HBsAg для заявляемого способа на основе ускоренных испытаний при повышенных температурах хранения.

Таблица 4
Прогноз активности образцов панели ПНК HBsAg на основе ускоренных испытаний образцов панели сывороток, полученных заявляемым способом при повышенных температурах хранения
Температура хранения, °С	Потеря активности за год, %	Потеря активности за месяц, %
4	0,48	0,04
37	53	6,1
50	76	11,2

Растворенные образцы панели сывороток, полученных заявляемым способом, рекомендуется хранить при +4°С в течение 1 недели. Стабильность жидких образцов ПНК HBsAg испытывали в тесте замораживание-оттаивание. Результаты испытаний показали, что специфические свойства кандидатов не изменяются в течение 3-х циклов замораживания-оттаивания.

Экономическая эффективность. HBsAg субтипов AY & AD используется как прогностический маркер гепатита В. Он циркулирует в крови инфицированных на 2-3 недели раньше, чем появляются антитела. Более раннее выявление HBsAg при повышении чувствительности тест-систем способствует сокращению сроков постановки диагнозов для инфицированных пациентов. Более ранняя медицинская помощь и контролируемое по количеству и субтипам HBsAg составляют социально значимую экономическую эффективность, связанную с сокращением сроков лечения людей. Введение российской панели сывороток ПНК HBsAg, полученной заявляемым способом, значительно уменьшит расходы средств контрольных организаций здравоохранения на приобретение дорогостоящих зарубежных препаратов-аналогов.