способ производства подсластителя с высоким содержанием ребаудиозида-a

Формула изобретения

1. Способ производства подсластителя, согласно которому: проводят экстракцию из растения Stevia rebaudiana или его сушеных листьев водосодержащим растворителем, при этом указанное растение содержит, по меньшей мере, 11,3:1 массового соотношения Ребаудиозида А к Стевиозиду и имеет полосу 2000 пар нуклеотидов при анализе методом случайно амплифицированной полиморфной ДНК (RAPD) с использованием праймеров SEQ ID NO:3 (GAGGGCGTGA), указанное растение получено из семян, задепонированных в Международном Депозитарии под номером FERM BP-10353 (IPOD) (Япония) или получено путем повторных скрещиваний или селекции растения, полученного из семян, задепонированных в Международном депозитарии под номером FERM BP-10353 (IPOD) (Япония).

2. Способ по п.1, в котором указанное растение принадлежит к виду Stevia Rebaudiana Bertoni.

3. Способ по п.1, в котором указанный подсластитель далее перекристаллизуют и представляет собой, по меньшей мере, 92% Ребаудиозида А.

4. Способ по п.1, в котором указанный подсластитель далее перекристаллизуют и представляет собой, по меньшей мере, 97% Ребаудиозида А.

5. Способ по п.1, в котором указанный подсластитель представляет собой, по меньшей мере, 92% Ребаудиозида А.

6. Способ по п.1, в котором указанный подсластитель представляет собой, по меньшей мере, 97% Ребаудиозида А.

7. Способ производства Ребаудиозида А, согласно которому проводят экстракцию из растения Stevia rebaudiana или его сушеных листьев растворителем Ребаудиозида А, удаляют указанный растворитель Ребаудиозида А и отделяют Ребаудиозид А, при этом указанное растение получено из семян, задепонированных в Международном Депозитарии под номером FERM BP-10353 (IPOD) (Япония).

8. Способ по п.7, в котором указанный Ребаудиозид А далее перекристаллизуют и имеет чистоту, по меньшей мере, 92%.

9. Способ по п.7, в котором указанный Ребаудиозид А далее перекристаллизуют и имеет чистоту, по меньшей мере, 97%.

10. Способ по п.7, далее содержащий перекристаллизацию Ребаудиозида А из 95% метанола для получения, по меньшей мере, 40 частей Ребаудиозида А к одной части Стевиозида, и указанный Ребаудиозид А имеет чистоту, по меньшей мере, 92,1%.

11. Способ по п.7, далее содержащий перекристаллизацию Ребаудиозида А из 75% метанола для получения, по меньшей мере, 972 частей Ребаудиозида А к одной части Стевиозида, и указанный Ребаудиозид А имеет чистоту, по меньшей мере, 97,2%.

Описание изобретения к патенту

Более ранние родственные заявки

Данная заявка является выделенной заявкой из российской заявки № 2007131961, по которой испрашивается приоритет по WO2006093229, поданной 02.03.2006 и JP2005-060930, поданной 04.03.2005. Каждая включена здесь в качестве ссылки в полном объеме.

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к растению, принадлежащему виду Stevia Rebaudiana Bertoni с высокой долей Ребаудиозида-А по сравнению со Стевиозидом, и способу получения подсластителя, экстрагированного из указанного растения и/или его сушеных листьев. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения Ребаудиозида А высокой чистоты из указанного подсластителя.

Предпосылки к созданию изобретения

Stevia представляет собой многолетнее растение Compositae Asteraceae, первоначально произраставшее в Парагвае, Южной Америке, и его научное название - Stevia Rebaudiana Bertoni. Stevia содержит сладкие компоненты, сладость которых в 300 или более раз выше, чем у сахара, и его выращивают для использования в качестве натурального подсластителя, полученного путем экстракции компонентов, придающих сладость.

Стевиозид (C₃₈ H₆₀O₁₈), Ребаудиозид А (С ₄₄Н₇₀О₂₃), Ребаудиозид С, D и Е, Дулкозид А и т.д. уже известны в качестве подсластителей. У обычно сажаемых сортов, Стевиозид (ST) является основным компонентом среди упомянутых выше сладких компонентов с количественным содержанием Ребаудиозида A (RA), составляющим примерно от 3/10 до 4/10 содержания Стевиозида и содержания Ребаудиозида С, составляющим несколько меньше, но в зависимости от сортов, существует Stevia, основным компонентом которой является Ребаудиозид С. То есть существуют различные сорта.

Среди вкусовых ощущений, таких как горечь и терпкость, сладкий вкус является очень тонким. Поскольку степень сладости Стевиозида в 300 раз выше, чем у сахара, его использовали в качестве натурального подсластителя в пищевой промышленности. Его сладкий вкус относительно похож на вкус сахара, однако существует недостаток в том, что во рту остается неприятный вкус, такой как горечь. Следовательно, для подсластителя является нежелательным содержание большого количества Стевиозида. С другой стороны, сладкий вкус Ребаудиозида А хорошего качества и степень сладости в 1,3-1,5 раз выш,е чем стевиозида.

Следовательно, необходимо снизить стоимость получения Ребаудиозида А для поддержания стабильного выхода сушеных листьев, для выведения сорта Stevia, с высоким количественным содержанием Ребаудиозида А отличного качества подслащивания, в качестве сырья для подсластителя, и в то же время для сохранения его длительных запасов и для получения отличного подсластителя на его основе.

Авторы настоящего изобретения вывели растение путем повторных селективных перекрестных опылений обычных сортов, получая, таким образом, сорта Stevia с высокой долей содержания Ребаудиозида (RA) относительно Стевиозида (ST), и подсластители, превосходные по относительному содержанию Ребаудиозида А к Стевиозиду (ST), получали экстракцией компонента, придающего сладкий вкус, из этих растений (смотри патентные источники информации с 1-1 по 1-3, описанные далее), однако требовалось вывести стабильные сорта с более высоким и лучшим относительным содержанием Ребаудиозида А.

С другой стороны, при выведении растений Stevia, проблемой является способ идентификации растений Stevia. В качестве способа идентификации улучшенных растений Stevia можно думать об идентификациях по высоте растений, форме листьев, и т.д., однако, поскольку Stevia не является самоопыляемым растением и имеет тенденцию к образованию гибридов, классификацией только по высоте растений, форме листьев и т.д. этого нельзя достичь.

Кроме того, существует сравнительная идентификация на основе устойчивости к заболеваниям патогенами, специфичными для Stevia, однако, хотя увядшие листья и черные точки на листьях, которые имеют место только у Stevia, вызываются грибком Septoria и Alternaria, эти грибы живут в почве. Следовательно, поскольку эти симптомы встречаются не только в Японии, а также по всему миру, только этих характеристик недостаточно для идентификации сорта.

У улучшенного сорта с высоким содержанием сахаристого вещества и высоким относительным содержанием ребаудиозида А по сравнению со стевиозидом, можно подумать о способе идентификации по этому относительному содержанию, однако поскольку изменение относительного содержания сахаристого вещества может неизбежно изменяться в зависимости от погодных условий во время периода роста, времени сбора урожая и т.д., этому способу недостает практичности.

В последнее время был разработан способ, которым осуществляют идентификацию путем идентификации ДНК на основе метода RAPD, в котором используют смесь праймеров (смотри патентные ссылки 2, приведенные ниже), однако не ясно, возможно ли применять этот способ для идентификации растения в соответствии с настоящим изобретением.

Патентная ссылка 1: выложенная патентная публикация Sho. 59/1984-045848 Gazette.

Патентная ссылка 2: выложенная патентная публикация Sho. 60/1985-160823 Gazette.

Патентная ссылка 3: выложенная патентная публикация Sho. 61/1986-202667 Gazette.

Патентная ссылка 4: выложенная патентная публикация No. 2003-9878 Gazette.

Краткое изложение сущности изобретения

Сокращения: ST = Стевиозид; RA = Ребаудиозид А

Настоящее изобретение относится к созданию сортов, превосходных по количественному содержанию компонента, придающего сладкий вкус, и соотношения содержания компонентов, придающих сладкий вкус, для возможности различать их гены методом RAPD для сохранения их характеристик, тем самым различая их с растениями других сортов Stevia, и предоставлению подсластителей, превосходных по подслащивающему свойству, и к способу их получения.

Первый аспект настоящего изобретения относится к сорту Stevia Rebaudiana Bertoni, содержащему 4 части по массе или более Ребаудиозида А к одной части по массе Стевиозида. Для этого, как будет описано далее, путем повторных скрещиваний и селекции были созданы новые растения, принадлежащие виду Stevia Rebaudiana Bertoni, которые содержат по меньшей мере 4 части по массе Ребаудиозида А к одной части по массе Стевиозида.

Второй аспект настоящего изобретения относится к способу получения подсластителя, который содержит 4 части по массе или более Ребаудиозида А к одной части по массе Стевиодиза, указанный способ получения характеризуется проведением экстракции из растения, описанного в предыдущем параграфе или его сушеных листьев, водой или водосодержащим растворителем.

Третий аспект настоящего изобретения относится к способу получения подсластителя высокой чистоты, содержащего 40 частей по массе или более Ребаудиозида А к одной части Стевиозида; указанный способ получения подсластителя, содержащего 40 частей по массе или более Ребаудиозида А к одной части по массе Стевиозида, их содержание составляет 92% или более, характеризуется проведением перекристаллизации подсластителя, полученного в предыдущем параграфе.

При улучшении сорта путем скрещивания и селекции способ идентификации выбранного сорта имеет важное значение. Авторы настоящего изобретения изучили способы идентификации, основанные на идентификации ДНК, с помощью метода RAPD.

Настоящее изобретение относится к подсластителю превосходного подслащивающего качества и способу его получения.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 представлена электрофоретическая диаграмма последовательностей оснований ДНК сорта Morita, SS и SN. Характеристические последовательности оснований указаны стрелками. Символы на Фиг.1 представляют собой следующее.

a:	Hind III маркер
b и е:	сорт SN
с и f:	сорт Morita
d и g:	сорт SS
h:	«лестничный» маркер ДНК 1 тыс. н.п.

На Фиг.2 представлена электрофоретическая диаграмма последовательности нуклеотидных оснований ДНК сорта Morita и SN. Характеристические последовательности оснований указаны стрелками. Символы на Фиг.2 означают следующее.

Mori:	сорт Morita
SN:	сорт SN
M:	ДНК маркер (100 н.п. «лестничный»)

Описание вариантов осуществления изобретения

Метод RAPD (метод случайно амплифицированной полиморфной ДНК), используемый для идентификации в настоящем изобретении, представляет собой один из аналитических ДНК методов и представляет собой способ анализа с помощью электрофореза образца ДНК, амплифицированного в области ДНК, помещенной посередине между одной и той же или сходными последовательностями праймеров, используемых в ПЦР (полимеразно-цепной реакции), используя многочисленные праймеры. Кроме того, для цетилтриметил аммония бромида (СТАВ) существует четвертичная аммонийная соль, имеющая алкильную группу с длинной цепью, и она образует нерастворимый комплекс с полианионом, таким как нуклеиновая кислота, ее можно использовать для выделения нуклеиновой кислоты.

В способах, которыми классифицируют сорт, исходя из различий в ДНК, ДНК геном отдельно выделяют из растения с помощью СТАВ, удаляют рибонуклеиновую кислоту (РНК) и ПЦР амплифицированный продукт, полученный методом ПЦР с использованием смеси праймеров, выделяют по различиям в отпечатках ДНК, полученных электрофорезом в агарозном геле. В случае растения по настоящему изобретению, как будет описано далее, было подтверждено, что характеристическая последовательность оснований показана на уровне 2000 пар оснований нижней части.

Фактически, с ДНК геномом, селективно преципитированным как образец растительного сырья, проводят 35 циклов реакции при 94 градусах (30 сек), 55 градусах (30 сек) и 72 градусах (120 сек), используя в качестве праймеров, например, набор А06 (ACTGGCCGAGGG (SEQ ID NO:1)) и А48 (CCGCAGGGACCA (SEQ ID NO:2)) и rTaq (Takara), и после этого реакция продолжается в течение 10 мин при 72 градусах. После этого ПЦР амплифицированный продукт подтверждается электрофорезом в агарозном геле, и, таким образом, это растение может быть подтверждено специфической полосой ДНК.

Для получения подсластителя, далее, указанное растение или его высушенные листья экстрагируют водой или растворителем, содержащим воду, экстракционный раствор концентрируют как есть или удаляют ионные примеси с использованием анионообменной смолы или катионообменной смолы, или активированным углем, компоненты, придающие сладкий вкус, оставляют для абсорбции в абсорбционную смолу, с последующей элюцией гидрофильным растворителем, и элюат концентрируют и сушат с получением подсластителя. Способ получения подсластителя может включать в себя обычные средства очистки, такие как стадии обесцвечивания, в дополнение к приведенным выше, как требуется соответствующим образом, и способ, которым получают Ребаудиозид А высокой чистоты, может включать обычные стадии, такие как мембранная сепарация, спиртовая экстракция и кристаллизация и т.д. Кроме того, в способе кристаллизации его можно соответствующим образом использовать путем добавления воды к органическому растворителю, такому как этанол или метанол, в качестве кристаллизующего растворителя. К полученному таким образом подсластителю можно добавлять другие природные или искусственные подсластители, разбавитель и т.д.

Для селекции сорта, содержащие относительно высокую концентрацию Ребаудиозида А, скрещивают и производят отбор. Сначала, SF5-1 и SF5-2 (описанные в выложенной патентной публикации № Hei 10/1998-271928 № 271928-1998 Gazette) с содержанием Ребаудиозида А в высокой концентрации, искусственно скрещивают, TD-1 (описанный в выложенной патентной публикации № 2003-9878 Gazette) отбирают из полученных таким образом семян, которые в дальнейшем искусственно скрещивают, сорт, устойчивый к грибку Septoria и грибку Alternaria отбирают из этих семян, анализируют содержание в нем компонента, придающего сладкий вкус, и проводят отбор растения, которое содержит 4 части по массе или более Ребаудиозида А к одной части Стевиозида, имеет высокое содержание подслащивающего компонента, и в общем и целом превосходное по устойчивости к заболеваниям. Кроме того, количество содержащихся компонентов, придающих сладкий вкус, соотношение подслащивающих компонентов и условия выращивания получали путем неоднократных исследований и сорт назвали Morita, гены которого исследовали.

Кроме того, в настоящее время заявитель завершил международное депонирование сорта Morita по этому изобретению (международный депозитарий патентуемых организмов (IPOD) (Япония) (входящий № FERM ВР-10353). Следовательно, можно легко получить растение по изобретению из семян сорта Morita этого депозитария. Stevia не является самоопыляемым растением, и хотя это не обязательно, что целевое растение всегда может быть получено из указанных семян, целевое растение может быть легко выбрано путем идентификации ДНК, описанной в этой заявке. И если необходимо, если оно скрещено с другим высококачественным сортом Stevia (например, TD-1) и отбор проводят в соответствии с осуществлением Примера 1, описанного далее, растение, которое содержит Ребаудиозид А в высокой концентрации, может быть легко получено. Эти растения все охватываются растениями, которые могут быть получены из семян сорта Morita, депонированного на международном уровне, т.е. сорта Morita.

Далее будет конкретно описан процесс скрещивания, его характеристики и т.д. Однако настоящее изобретение не ограничивается этими процессами скрещивания и способами культивирования.

Пример 1: Скрещивание и тестирования

Из семян, полученных скрещиванием сортов, содержащих Ребаудиозид А в относительно высокой концентрации, семена, полученные искусственным скрещиванием SF-1 и SF 5-2 (описанных в выложенной патентной публикации № Hei 10/1998-271928), содержащие Ребаудиозид А, сеяли в виниловой теплице в фермерском хозяйстве Nimi, проросшую рассаду пересаживали в горшочки для выращивания рассады, и 600 сеянцев высотой около 8 см или выше пересаживали на сельскохозяйственные угодья фермерского хозяйства в начале мая, на каждый ар земли вносили около 20 кг азотистых, фосфорных и калийных удобрений. В начале июля в качестве дополнительных удобрений в землю дополнительно вносили по 10 кг азотистого, фосфорного и калийного удобрения.

В начале сентября анализировали компоненты, придающие сладкий вкус, и отбирали сырье, сорт TD-1 (описан в выложенной патентной публикации № 2003-9878), содержащее в 3 раза больше Ребаудиозида А по сравнению со Стевиозидом.

В 1998 сорт TD-1 был выведен искусственным скрещиванием в виниловой теплице в фермерском хозяйстве Nimi, полученные семена сеяли в виниловой теплице в фермерском хозяйстве Nimi в марте 1999, проросшую рассаду пересаживали в горшочки для выращивания рассады и 300 сеянцев высотой около 7 см или выше пересаживали на сельскохозяйственные угодья фермерского хозяйства в начале мая, на каждый ар земли вносили около 20 кг азотистых, фосфорных и калийных удобрений. В начале июля в качестве дополнительных удобрений в землю дополнительно вносили по 10 кг азотистого, фосфорного и калийного удобрения.

В начале сентября анализировали компоненты, придающие сладкий вкус, и отбирали сырье, содержащее 4 части по массе или более, Ребаудиозида А по сравнению со Стевиозидом, и более устойчивое к заболеваниям, и обладающее лучшими ростовыми качествами, чем сорт TD-1. В середине апреля 2000, 100 побегов, проросших из них, срезали и сажали. В начале мая их высаживали подобным образом на сельскохозяйственные угодья фермерского хозяйства и в конце июля снова изучали их устойчивость к болезням и развитие и выверяли те, у которых были наилучшие соотношения компонентов, придающих сладкий вкус и количественное содержание. Кроме того, в течение 3 лет с 2001 было подтверждено, что устойчивость к болезням, соотношения компонентов, придающих сладкий вкус, количественное содержание компонента, придающего сладкий вкус, и выход сушеных листьев были лучше и больше, и не было изменений характеристик роста и компонентов, и это растение было названо сортом Morita.

Для сравнения сорта Morita и других сортов было сделано 40 срезов каждого растения TD-1 (TD), основным компонентом которых был Ребаудиозид А, и другого основного сорта Stevia (SN), основным компонентом, придающим сладкий вкус, которого был Стевиозид, второстепенным подслащивающим компонентом которого был Ребаудиозид А, и их высаживали аналогичным образом на сельскохозяйственных угодьях фермерского хозяйства.

Наличие или отсутствие вспышек какого-либо заболевания исследовали в каждых 10 вариантах, произвольно отобранных в начале июня из 200 саженцев сорта Morita, размноженных вышеупомянутыми черенками, пересаженными на сельскохозяйственные угодья в начале мая, и по 40 саженцев сорта TD и SN, и после этого, каждый саженец Morita, TD и SN срезали на высоте 15 см от земли, отделяли листья, и после высушивания, их использовали в качестве образцов для анализа.

Результаты анализа представляют собой следующее.

Таблица 1
Сравнительный тест 1 сортов Morita, TD и SN
Сорт	Появление пожелтевших или почерневших листьев	ST (%)	RA (%)	RA/ST
Morita	Черные точки у 0 черенков	2,3	9,3	4,04
TD	Черные точки у 1 черенка	2,5	9,1	3,64
SN	Появились у 7 черенков	6,9	2,8	2,46

В середине июля вносили дополнительные удобрения и после отбора 20 черенков из каждого сорта на одну секцию и изучения условий появления заболеваний, вызванных грибами Septoria и Alternaria, каждый сорт срезали наземные части, листья отделяли и после высушивания использовали в качестве образцов для анализа.

Результаты анализа представляют собой следующее.

Таблица 2
Сравнительный тест 2 сортов Morita, TD и SN
Сорт	Появление пожелтевших или почерневших листьев	ST (%)	RA (%)	RA/ST	Выход/растение (г)
Morita	Черные точки на нижних листьях у 3 черенков	1,1	13,1	11,9	12,9
TD	Черные точки на нижних листьях у 5 черенков	1,1	11,1	10,0	11,7
SN	Увядание нижних листьев у 12 черенков	9,8	3,9	0,39	9,3

У сорта Morita соотношение появления черных точек на нижних листьях было относительно меньше и он превосходил другие сорта по содержанию компонента, придающего сладкий вкус, и выходу высушенных листьев. У сорта TD, по сравнению с сортом Morita, наблюдалось большое количество черных точек, вызванных грибком Septoria, листья уже начинали желтеть из-за грибка Septoria. У сорта SN проявилось пожелтение листьев вплоть до 3-го узла нижних листьев из-за грибка Septoria, а листья первого узла увядали.

В марте 2004 сажали 200 срезов верхушек побегов, проросших из сорта Morita, в конце апреля их пересаживали на сельскохозяйственные угодья, собирали наземную часть растения в конце мая, в конце июня, в конце июля, в конце августа, в конце сентября и в конце октября после цветения, отделяли только листья и сушили, измеряли количественное содержание компонента, придающего сладкий вкус.

Компоненты со сладким вкусом определяли с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения.

Таблица 3
Сезонная продукция стевиозида и ребаудиозида А
Время сбора урожая	ST (%)	RA (%)	RA/ST
Конец мая	2,2	9,1	4,1
Конец июня	2,3	9,6	4,2
Конец июля	1,9	12,6	6,6
Конец августа	1,5	12,8	8,5
Конец сентября	1,0	13,2	13,2
Конец октября	1,0	10,1	10,1

У сорта Morita было показано различное количественное содержание компонентов, придающих сладкий вкус, и соотношения компонентов, придающих сладкий вкус, в зависимости от периода роста, наблюдалась тенденция увеличения количественного содержания компонента, придающего сладкий вкус, с удлинением периода роста, и с другой стороны, снижалось количественное содержание стевиозида. В конце октября, в период цветения, количественное содержание компонента, придающего сладкий вкус, снижалось.

Что касается количественного содержания компонента, придающего сладкий вкус, соотношения компонентов, придающих сладкий вкус, и выхода, поскольку сорт Morita был лучшим, сорт Morita идентифицировали методом ПЦР.

В ступку, стерилизованную высушиванием и нагреванием, помещали около 0,2 г листьев сорта Morita, к которым добавляли жидкий азот, размельчали пестиком и около 0,05 г за один раз помещали шпателем в микропробирки. Туда добавляли 300 мкл 2% раствора СТАВ (2% раствор СТАВ (50 мл1): состав 100 мМ, трис-HCl (рН 8,0) 20 мМ, EDTA (рН 8,0), 2% СТАВ, 1,4 М NaCl) и после переворачивания и перемешивания пробирки перемещали в жаровой шкаф, нагретый до 65°С, и нагревали в течение 30 мин. Туда добавляли равное количество хлороформа (300 мкл)/изоамилового спирта (24:1) с последующим постепенным перемешиванием. После центрифугирования и разделения при 14000 об/мин в течение 15 мин водный слой, который был верхним слоем разделенного на 2 слоя содержимого, переносили в новую пробирку.

Действия после вышеупомянутой стадии обработки хлороформом/изоамиловым спиртом повторяли еще один раз, и водный слой переносили в новую пробирку. Туда добавляли 400 мкл 1% раствора СТАВ (1% раствор СТАВ (50 мл): состав 1 М, трис-HCl 2,5 мМ, EDTA 1,0 мл, 1% СТАВ 0,5 г) и после переворачивания и перемешивания в течение 15 мин оставляли неподвижно стоять при комнатной температуре в течение 1 часа с последующим разделением центрифугированием при 14000 об/мин в течение 15 мин.

Супернатант отбрасывали, после чего добавляли 400 мкл 1М C_sCl, и осадок полностью растворяли пипетированием. Туда добавляли 900 мкл 100% этанола и после переворачивания и перемешивания оставляли неподвижно стоять при температуре -20°С в течение 20 мин, с последующим разделением центрифугированием при 14000 об/мин в течение 15 мин. Супернатант отбрасывали, затем к осадку добавляли 400 мкл 70% этанола, подвергали разделению центрифугированием при 14000 об/мин в течение 15 мин и после повторения этого действия супернатант отбрасывали, осадок сушили в вакуумной сушилке и растворяли в 30 мкл особо чистой воды. Раствор подвергали электрофорезу в агарозном геле, тем самым подтверждая, что была отделена только лишь ДНК.

Для удаления РНК проводили реакцию в 500 мкл растворе РНКазы (состав: 100 мкл раствора вышеуказанной выделенной ДНК и 5 мкл РНКазы (5 г/мл) при 37°С в течение 1 часа и в реакционный раствор добавляли равное количество раствора PCI (состав: раствор, полученный центрифугированием при 13000 об/мин в течение 5 мин и отделением водного слоя после примешивания фенола:хлороформа:изоамилового спирта (25:24:1) постепенно). После остановки реакции и постепенного перемешивая смесь центрифугировали при 13000 об/мин в течение 5 мин.

Водный слой (верхний слой) переносили в новую микропробирку, в которую добавляли равное количество раствора CIA (состав: хлороформ:изоамиловый спирт, объемное соотношение 24:1), хранившегося при комнатной температуре, и после постепенного перемешивания его центрифугировали при 15000 об/мин в течение 3 мин, водный слой переносили в новую пробирку с последующей обработкой раствором CIA еще раз, туда добавляли 3 М ацетата натрия в количестве 1/10 количества полученного супернатанта и 100% этанола в избытке в 2,5 раза, с последующим тщательным перемешиванием и охлаждением при -20°С в течение 20 мин или дольше, а затем центрифугировали при 15000 об/мин в течение 15 мин, тем самым осаждая ДНК, супернатант отбрасывали и после добавления к осадку 1 мл охлажденного 70% этанола центрифугировали при 15000 об/мин в течение 15 мин, супернатант отбрасывали и остаток сушили в течение 5 мин, используя сушильный шкаф, под пониженным давлением.

С полученной таким образом геномной ДНК в качестве матрицы, используя состав для ПЦР (Таблица 4), проводили 35 циклов реакции при 94°С (30 сек), 55°С (30 сек) и 72°С (120 сек), а затем подвергали реакции при 72°С в течение 10 мин. После реакции ее держали при 4°С и получали ПЦР амплифицированный продукт. Когда полоса ДНК в ПЦР амплифицированном продукте подтвердилась электрофорезом в 1% агарозном геле, характеристический фрагмент ДНК выверяли в положении, которое примерно на 2000 пар нуклеотидов ниже, как показано у Morita на Фиг.1.

Таблица 4а
ПЦР реакция (20 мкл)
Матричная ДНК (1 нг/мкл)	5 мкл
Смесь праймеров (16 пмоль/мкл каждого)	0,5 мкл каждого
A06*(SEQ ID NO:1: ACTGGCCGAGGG)
А48*(SEQ ID NO:2: CCGCAGGGACCA)
dNTP (2,5 мМ каждый)	1,6 мкл
10 х буфер	2 мкл
Дистиллированная вода	7,9 мкл
rTaq (Takara)	0,5 мкл
MgCl2	2 мкл
*Праймеры A06 и А48 изготовлены ВЕХ Corp.

Подобным образом полосы ДНК, полученные путем обработки, аналогичной приведенной выше, показаны на Фиг.1 для сорта SN (SN) и сорта SS (SS), основным компонентом которых является стевиозид и второстепенным компонентом ребаудиозид А.

Сорт Morita имеет характеристическую последовательность оснований в положении, которая примерно на 2000 пар нуклеотидов ниже, и, следовательно, ее легко отличить от других сортов путем детектирования ДНК с помощью агарозного электрофореза.

Используя праймеры, отличные от приведенных выше, сравнивали сорт Morita и сорт SN.

Экстракцию ДНК проводили с помощью СТАВ метода. Примерно по 0,5 г листьев сорта Morita и сорта SN замораживали жидким азотом в ступке, листья размалывали пестиком. Каждый размолотый образец смешивали с 20 мл 2% раствора СТАВ (100 мМ трис-HCl (рН 8,0) 20 мМ, EDTA (рН 8,0), 2% СТАВ, 1,4 М NaCl, 1% PVP) в пробирке Фалкона, объемом 50 мл, с последующей инкубацией при 65°С в течение 30 мин. Туда добавляли равное количество хлороформа:изоамилового спирта (24:1), с последующим перемешиванием в течение 10 мин, а затем подвергали разделению центрифугированием при 3500 об/мин в течение 15 мин и водный слой отбирали в другую 50 мл пробирку Фалкона.

Кроме того, туда добавляли равное количество 100% изопропанола с последующим разделением центрифугированием при 3500 об/мин в течение 15 мин, преципитат, собранный крючком, переносили в 1,5 мл микропробирку. После промывания преципитата 75% этанолом его сушили, а затем растворяли в 600 мкл ТЕ буфера. После добавления 1 мкл раствора РНКазы (1 мг/мл) и инкубирования при 37°С в течение 1 часа туда добавляли равное количество фенола, насыщенного ТЕ, с последующим перемешиванием и разделением центрифугированием при 15000 об/мин в течение 30 мин. Водный слой переносили в другую пробирку с последующим добавлением 3М ацетата натрия в количестве 1/10 и равное количество изопропанола и перемешиванием, а затем подвергали разделению центрифугированием при 15000 об/мин в течение 30 мин. После промывки полученного таким образом преципитата 75% этанолом дважды его сушили, растворяли в 50 мкл ТЕ буфера для получения образца ДНК.

С полученным таким образом образцом ДНК в качестве матрицы проводили ПЦР реакцию со следующим составом реакционной смеси. Что касается цикла ПЦР, после проведения реакции при 96°С в течение 30 сек, проводили 35 циклов при 96°С в течение 10 сек, при 42°С в течение 2 мин и 72°С в течение 2 мин, а затем реакцию снова проводили при 72°С в течение 4 мин. После проведения реакции ПЦР продукт фракционировали электрофорезом на 1,8% агарозном геле, и после его окрашивания с использованием EtBr, изображение получали под УФ излучением. В результате специфическая полоса сорта Morita могла быть подтверждена в окрестностях примерно 2000 пар нуклеотидов с праймером UBC-66. Кроме того, специфические полосы сорта SN были подтверждены в окрестностях примерно 600 пар нуклеотидов с праймером UBC-72 и в окрестностях примерно 700 пар нуклеотидов с UBC-106. В результате стало ясно, что сорт Morita и сорт SN являются генетически различными и это различие легко определяется с помощью RAPD анализа.

Таблица 4b
ПЦР реакция (50 мкл)
10 х ПЦР буфер	5 мкл
dNTP (2,0 мМ)	5 µ1
RAPD праймер * (10 mer)	5 мкл (5 мкМ)
UBC-66: (SEQ ID NO:3 GAGGGCGTGA)
UBC-72: (SEQ ID NO:4 GAGCACGGGA)
UBC-106: (SEQ ID NO:5 CGTCTGCCCG)
Blend Taq (торговое название) (Toyobo)	0,5 мкл1 (2,5 Ед/мкл)
ДНК Stevia	1 мкл1 (30 нг/мкл)
Стерильная вода	33,5 мкл

Пример 2: Получение подсластителя

Двадцать г сушеных листьев сорта Morita, полученных в конце сентября, экстрагирвали водой в 20-кратном избытке несколько раз, пока не переставал чувствоваться сладкий вкус, раствор пропускали через колонку, наполненную 20 мл катионобменной смолы (Amberlite IR-120B), и колонку, наполненную 20 мл анионообменной смолы (Duolite A-4) и 5 мл гранулированного активированного угля, раствор, который прошел через эту колонку, пропускали через колонку, заполненную 100 мл адсорбционной смолы (Diaion HP-20), адсорбируя, таким образом, компоненты, придающие сладкий вкус, и после достаточного промывания водой, растворяли в 300 мл этанола. Полученный таким образом элюент концентрировали под пониженным давлением и сушили, получая, таким образом, порошок светлого желтовато-белого цвета. Для сравнения, компоненты, придающие сладкий вкус, получали из TD и SN путем аналогичной обработки и анализировали.

Способ анализа	Жидкостная хроматография высокого разрешения
Используемая колонка	Hibar Licrosorb NH2 5 мк 4 мм (диа) × 250 мм
Скорость потока	1,5 мл/мин
Движущий растворитель	ацетонитрил:вода = 82:18
Длина волны измерения	210 нм

Результаты анализа экстрагированных и очищенных продуктов приведены в таблице.

Таблица 5
Сравнительный тест 3 сорта Morita, TD и SN
Сорт	ST (%)	RA (%)	RA/ST	Выход
Morita	5,7	75,9	13,3	3,52 г
TD	6,1	71,2	11,6	3,25 г
SN	53,2	21,0	0,39	2,20 г

Сенсорный анализ 1: каждый 0,1% раствор Morita и SN, полученные в примере 2, и 0,1% раствор желтого порошка готовили по отдельности и отбирали группу 10 участников, хорошо знакомых со вкусом подсластителей Stevia. И сравнивали горечь, терпкость и качество сладкого вкуса.

Таблица 6
Сенсорный анализ 1
Горечь	No. Утверждение, что Morita имеет горький вкус.	No. Утверждение, что SN имеет горький вкус
0	10
терпкость	No. Утверждение, что Morita имеет терпкий вкус.	No. Утверждение, что SN имеет терпкий вкус
0	10
сладость	No. Утверждение, что Morita имеет превосходный сладкий вкус	No. Утверждение, что SN имеет превосходный сладкий вкус
10	0

В каждом из образцов сорт Morita был улучшен по горечи и терпкости по сравнению с другими образцами, а его сладкий вкус был превосходным.

Сенсорный анализ 2: каждый 0,1% раствор Morita и TD, полученные в примере 2, представляющие собой желтый порошок, готовили по отдельности и отбирали группу 10 участников, хорошо знакомых со вкусом подсластителей Stevia. И сравнивали горечь, терпкость и качество сладкого вкуса.

Таблица 7
Сенсорный анализ 2
Горечь	No. Утверждение, что Morita имеет горький вкус.	No. Утверждение, что TD имеет горький вкус
2	8
терпкость	No. Утверждение, что Morita имеет терпкий вкус	No. Утверждение, что TD имеет терпкий вкус
3	7
сладость	No. Утверждение, что Morita имеет превосходный сладкий вкус	No. Утверждение, что TD имеет превосходный сладкий вкус
9	1

В каждом образце сорт Morita был улучшен по горечи и терпкости по сравнению с другими образцами, а его сладкий вкус был превосходным.

Пример 3: Получение ребаудиозида а

После нагревания и растворения 2 г экстрагированного и очищенного продукта (сорт Morita), полученного в Примере 2, в 95% метаноле в 10-кратном объеме, его оставляли стоять при 4°С в течение 6 дней, охлаждая его. Полученный таким образом кристалл отделяли, и после его промывания холодным метанолом сушили под пониженным давлением и получали 1,2 г белого кристалла. Для сравнения аналогичной обработкой из TD и SN получали 0,9 г белого кристалла и 0,6 г белого кристалла соответственно и анализировали их.

Способ анализа	Жидкостная хроматография высокого разрешения
Используемая колонка	Hibar Licrosorb NH2 5 мк 4 мм (диа) × 250 мм
Скорость потока	1,5 мл/мин
Движущий растворитель	ацетонитрил:вода = 82:18
Длина волны измерения	210 нм

Результаты анализа экстрагированных и очищенных продуктов приведены в Таблице 8.

Таблица 8
Сравнительный тест 4 сорта Morita, TD и SN
Сорт	ST (%)	RA (%)	RA/ST	Выход
Morita	2,3	92,1	40,0	1,2 г
TD	3,7	87,9	23,7	0,9 г
SN	94,2	2,0	0,02	0,6 г

Сенсорный анализ 3: готовили каждый 0,1% раствор белого порошка SN, полученного в Примере 3, и отбирали группу 10 участников, хорошо знакомых со вкусом подсластителей Stevia. Сравнивали горечь, терпкость и качество сладкого вкуса.

Таблица 9
Сенсорный анализ 3
Горечь	No. Утверждение, что Morita имеет горький вкус.	No. Утверждение, что SN имеет горький вкус
0	10
терпкость	No. Утверждение, что Morita имеет терпкий вкус.	No. Утверждение, что SN имеет терпкий вкус
0	10
сладость	No. Утверждение, что Morita имеет превосходный сладкий вкус	No. Утверждение, что SN имеет превосходный сладкий вкус
10	0

В каждом из образцов, сорт Morita был улучшен по горечи и терпкости по сравнению с другими образцами, а его сладкий вкус был превосходным. Степень извлечения из него продукта высокой чистоты была выше, чем у других.

Сенсорный анализ 4: готовили по 0,1% раствору белого порошка TD, полученного в Примере 3, и отбирали группу 10 участников, хорошо знакомых со вкусом подсластителей Stevia. Сравнивали горечь, терпкость и качество сладкого вкуса.

Таблица 10
Сенсорный анализ 4
Горечь	No. Утверждение, что Morita имеет горький вкус	No. Утверждение, что TD имеет горький вкус
2	8
терпкость	No. Утверждение, что Morita имеет терпкий вкус	No. Утверждение, что TD имеет терпкий вкус
2	8
сладость	No. Утверждение, что Morita имеет превосходный сладкий вкус	No. Утверждение, что TD имеет превосходный сладкий вкус
10	0

В каждом из образцов сорт Morita был улучшен по горечи и терпкости по сравнению с другими образцами, а его сладкий вкус был превосходным. Степень извлечения из него продукта высокой чистоты была выше, чем у других.

Пример 4: Очистка ребаудиозида А

После нагревания и растворения 2 г экстрагированного и очищенного продукта (сорт Morita), полученного в Примере 2, в 75% метаноле в 5-кратном объеме, его оставляли стоять при 4°С в течение 7 дней, охлаждая его. Полученный таким образом кристалл отделяли и после его промывания холодным метанолом сушили под пониженным давлением и получали 0,9 г белого кристалла и анализировали.

Таблица 11
Очистка RA
Сорт	ST (%)	RA (%)	RA/ST	Выход
Morita	0,1	97,2	972	0,9 г