введение противосвертывающей системы reg1

Формула изобретения

1. Способ введения противосвертывающей системы субъекту, где система включает аптамер, который связывает фактор IX/IXa, и антидот, который

связывает аптамер,

включающий:

a. измерение веса субъекта в килограммах;

b. введение субъекту дозы аптамера, эффективного для достижения ингибирования коагуляции у субъекта, где аптамер включат последовательность SEQ ID No:1, и где доза аптамера составляет от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 2,0 мг/кг, или от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг; и

c. введение дозы антидота аптамера субъекту, где антидот включает последовательность SEQ ID No: 2, и доза антидота основана только на соотношении вес/вес с дозой аптамера, и где соотношение вес/вес дозы антидота с дозой аптамера составляет от приблизительно 0,1:1 до приблизительно 20:1.

2. Способ по п.1, в котором доза аптамера составляет от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 1,5 мг/кг.

3. Способ по п.1, в котором доза аптамера составляет приблизительно 1,0 мг/кг.

4. Способ по п.1, в котором доза аптамера составляет от приблизительно 0,6 мг/кг до приблизительно 0,8 мг/кг.

5. Способ по п.1, в котором доза аптамера составляет от 0,1 до 2 мг/кг.

6. Способ по п.1, в котором доза аптамера составляет от 5 до 10 мг/кг.

7. Способ по п.1, в котором аптамер вводят путем внутривенного болюсного введения.

8. Способ по п.1, в котором аптамер вводят путем подкожной инъекции.

9. Способ по п.1, в котором аптамер и антидот вводят в соотношении вес/вес от приблизительно 0,25:1 до приблизительно 15:1.

10. Способ по п.1, в котором аптамер и антидот вводят в соотношении вес/вес от приблизительно 0,5:1 до приблизительно 12:1.

11. Способ по п.1, в котором аптамер и антидот вводят в соотношении вес/вес от приблизительно 1:1 до приблизительно 9:1.

12. Способ по п.1, в котором ингибирование свертываемости после введения дозы антидота уменьшена на менее чем 90%.

13. Способ по п.1, в котором активность аптамера уменьшена примерно на 50%.

14. Способ по п.1, в котором ингибирование свертываемости после введения дозы антидота полностью нейтрализовано.

Описание изобретения к патенту

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с американской предварительной заявкой № 60/808987, поданной 26 мая 2006 года, американской предварительной заявкой № 60/847809, поданной 27 сентября 2006 года, и американской предварительной заявкой № 60/865352, поданной 10 ноября 2006 года, которые все названы "Введение противосвертывающей системы REG1", раскрытия которых включены в настоящее описание в своей полноте.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Представлен способ введения системы аптамера и антидота для регуляции коагуляции крови у субъекта на основе режима дозирования компонентов системы, нормированных на вес или индекс массы тела.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Противосвертывающая терапия в условиях оказания неотложной помощи

Учитывая центральную роль тромбоза в патологии острой ишемической болезни сердца, противосвертывающие средства для инъекций стали основой лечения пациентов с острыми коронарными синдромами, такими как нестабильная стенокардия и инфаркт миокарда, и тех, которые проходят процедуры реваскуляризации коронарного русла (Harrington и др., 2004; Popma и др., 2004). В настоящее время доступные противосвертывающие средства включают нефракционированный гепарин (UFH), низкомолекулярные гепарины (LMWH) и прямые ингибиторы тромбина (DTI), такие как рекомбинантный гирудин, бивалирудин и аргатробан. Существующей парадигмой как для применения противосвертывающего средства, так и для создания антитромботического лекарственного средства длительного действия является установление баланса между эффективностью, что означает снижение риска ишемических осложнений, и безопасностью, что означает сведение к минимуму риска кровотечения (Harrington и др., 2004). Каждое из доступных средств несет повышенный риск кровотечения в сравнении с плацебо.

Главным побочным эффектом, связанным с противосвертывающими и антитромботическими лекарственными средствами, является кровотечение, которое может вызвать стойкую нетрудоспособность и смерть (Ebbesen и др., 2001; Levine и др., 2004). Как правило, кардиологи-клиницисты были склонны идти на компромисс с повышением риска кровотечения, если лекарственное средство может снизить риск ишемических осложнений или острых коронарных синдромов или процедур реваскуляризации коронарного русла. Однако недавно полученные данные заставляют предположить, кровотечения, особенно такие, которые требуют переливания крови, оказывают значительное влияние на результат и стоимость лечения пациентов с ОКС. Частота переливаний крови у больных, которым производится элективная операция аорто-коронарного шунтирования (CABG) составляют 30-60%, и переливание у указанных пациентов связано с увеличенной скорой, среднедлительной и отдаленной летальностью (Bracey и др., 1999; Engoren и др., 2002; Hebert и др., 1999). Кровотечение также является самым частым и дорогостоящим осложнением, связанным с чрескожными коронарными вмешательствами (PCI), с переливаниями, выполняемыми у 5-10% пациентов с дополнительными издержками $8000-$12000 (Moscucci, 2002). Кроме того, частота значимых кровотечений у больных, проходящих лечение по поводу ОКС, также высока, в интервале от 5% до 10% (исключая пациентов, которым выполняют АКШ), с кровотечением и переливанием, независимо связанным со значительным увеличением мгновенной летальности (Moscucci и др., 2003; Rao и др., 2004). Поэтому, несмотря на продолжающееся развитие новых антитромботических средств, существует выраженная клиническая потребность в более безопасных противосвертывающих средствах.

Быстрое прекращение действия лекарственного средства может быть достигнуто пассивно посредством композиции лекарственного средства, например средства для инфузионного введения с коротким периодом полувыведения с завершением инфузии в качестве способа прекращения, или активно посредством введения второго средства, антидота, который может нейтрализовать действие лекарственного средства.

Для пациентов, госпитализированных с острой ишемической болезнью сердца, идеальное противосвертывающее средство должно вводиться посредством внутривенной или подкожной инъекции, быть немедленно эффективным, легко дозируемым, а также не требовать частого контроля и быть немедленно и надежно обратимым.

Текущие подходы для решения проблемы

UFH в настоящее время является единственным обратимым посредством антидота противосвертывающим средством, которое одобрено для применения. Однако у UFH есть значимые ограничения. Во-первых, у гепарина сложная фармакокинетика, что делает надежность его применения затруднительной (Granger и др., 1996). Во-вторых, предсказуемость дозы его антидота, протамина, является затруднительной, и существуют серьезные побочные эффекты, связанные с его применением (Carr и Silverman, 1999; Welsby и др., 2005). Наконец, гепарин может вызывать тромбоцитопению (HIT) и тромбоцитопению с тромбозом (HITT) (Warkentin, 2005; Warkentin и Greinacher, 2004).

Несмотря на указанные ограничения, гепарин остается наиболее широко используемым противосвертывающим средством для госпитализированных пациентов прежде всего потому, что он "обратим". Противосвертывающие средства более нового поколения, такие как LMWH, обладают улучшенной предсказуемостью дозирования UFH и не требуют мониторирования в качестве практики при их обычном применении, основанного на лабораторных исследованиях. HIT и HITT реже встречаются при применении LMWH, чем UFH, но при их применении указанный риск не устранен. Два из трех коммерчески доступных DTI, лепирудин и аргатробана, в частности, одобрены для применения у больных, у которых развился HIT или был в анамнезе. Бивалирудин одобрен для применения в качестве противосвертывающего средства во время PCI и поэтому представляет привлекательную альтернативу UFH у больных с HIT. Однако не существует никаких прямых и эффективных антидотов для прекращения противосвертывающих эффектов ни для LMWH, ни для DTI, что представляет особый риск при их применении у пациентов, которым проводят хирургические или чрескожные процедуры реваскуляризации коронарных сосудов (Jones и др., 2002). Кровотечения у пациентов, которые получали LMWH или DTI, купируют введением препаратов крови, включая факторы свертывания.

Свертывание крови и FIX

Клеточная модель свертывания (фиг.1) на сегодняшний день представляет самое ясное объяснение, каким образом происходит физиологическое свертывание коагуляция in vivo (Hoffman и др., 1995; Kjalke и др., 1998; Monroe и др., 1996).

Согласно указанной модели, реакция свертывания проходит в три этапа: инициация, амплификация и распространение. Инициация коагуляции происходит на клетках, несущих тканевой фактор, таких как активированные моноциты, макрофаги и эндотелиальные клетки. Фактор коагуляции VIIa, который образует комплекс с тканевым фактором, катализирует активацию факторов свертывания крови IX (FIX) и X (FX), который, в свою очередь, производит небольшое количество тромбина из протромбина. В фазе амплификации (так же обозначаемая как фаза прайминга), небольшое количество тромбина, произведенного в фазе инициации, активирует факторы свертывания крови V, VIII и XI, а также активирует тромбоциты, которые представляют поверхность, на которой проходят последующие реакции свертывания. In vivo, небольших количеств тромбина, образованных во время фазы амплификации, недостаточно для превращения фибриногена в фибрин в силу наличия эндогенных ингибиторов тромбина, называемых серпинами, такие как антитромбин III, -2-макроглобулин и кофактор гепарина II. Заключительная фаза реакции коагуляции, распространение, встречается исключительно на поверхности активированных тромбоцитов. В фазе распространения значительные количества FIXa образуются посредством FXIa-катализируемой активации FIX. FIXa образует комплекс со своим обязательным кофактором FVIIIa, который активирует FX. Впоследствии, FXa образует комплекс со своим обязательным кофактором FVa. Комплекс FXa-FVa активирует протромбин, который приводит к "взрывному" образования тромбина и отложению фибрина. Конечным результатом является образование стабильного сгустка.

Основываясь на указанной модели, при свертывании FIXa играет две роли. В фазе инициации FIXa играет важную роль в образовании небольшого количества тромбина посредством активации FX в FXa и последующей активации протромбина. Однако указанная роль FIXa по меньшей мере частично перекрывается с превращением FX в FXa, которое катализируется тканевым фактором и FVIIa. Более критическая функция FIXa осуществляется в фазе распространения, в которой ферментативный комплекс FVIIIa/FIXa служит единственным катализатором образования FXa на поверхности активированного тромбоцита. Поэтому снижение активности FIXa, либо в силу генетической недостаточности FIX (то есть гемофилия B), либо в результате фармакологического ингибирования FIX/IXa, как ожидается, окажет несколько эффектов на коагуляцию. Во-первых, ингибирование или потеря действия FIXa должны частично затормозить инициацию коагуляции. Во-вторых, ингибирование или потеря действия FIXa должны иметь существенное воздействие на фазу распространения коагуляции, приводя к значительному сокращению или устранению образования тромбина. Наконец, ограничение образования тромбина во время фазы распространения по меньшей мере частично подавит амплификацию коагуляции по механизму обратной связи посредством снижения активации тромбоцитов и факторов свертывания крови, задействованных на более ранних этапах, таких как факторы V, VII и XI.

Оценка ингибиторов FIXa на животных и людях на предшествующем уровне техники

Ингибиторы активности FIX, такие как фактор IXa с инактивированным активным сайтом (FIXai) или моноклональные антитела против FIX (например, антитело BC2), обладают мощной противосвертывающей и антитромботической активностью в нескольких моделях на животных, включая различные животные модели артериального тромбоза и инсульта (Benedict и др., 1991; Choudhri и др., 1999; Feuerstein и др., 1999; Spanier и др., 1998a; Spanier и др., 1997; Spanier и др., 1998b; Toomey и др., 2000). В общем, в указанных исследованиях было показано, что ингибиторы FIXa обладают более высоким отношением антитромботической активности к риску кровотечения, чем нефракционированный гепарин у животных. Однако в указанных исследованиях, в дозах незначительно выше, чем эффективная доза, животные, которым проводили лечение указанными средствами, имели профили кровотечения, которые не отличались от таковых для гепарина. Указанный опыт контролируемых исследований на животных заставляет предполагать, что в клинических условиях способность управлять активностью ингибитора FIXa повысила бы его безопасность и облегчила бы его медицинское применение. Кроме того, было показано, что FIXai является безопасным и эффективным в качестве заместителя гепарина в нескольких хирургических моделях на животных, в которых требуется терапия противосвертывающим средством, включая модели ангиопластики синтетическим лоскутом на кроликах, так же, как и модели CABG с экстрапульмональным кровообращением на собаках и нечеловеческих приматах (Spanier и др., 1998a; Spanier и др., 1997; Spanier и др., 1998b). FIXai также успешно использовался у нескольких критически больных пациентов, нуждавшихся в экстрапульмональном кровообращении, и в создании других экстракорпоральных способов кровообращения, таких как экстракорпоральная мембранная оксигенация (Spanier и др., 1998a), врачами Columbia College of Physicians and Surgeons в рамках благотворительно-сострадательной помощи. Таким образом, FIXa является обоснованной мишенью для терапии противосвертывающими средствами при процедурах реваскуляризации коронарных сосудов (и CABG, и PCI) и для лечения и профилактики тромбоза у пациентов с острыми коронарными синдромами.

Разработка аптамерного лекарственного средства, пары лекарственное средство-антидот и REG1

Одним подходом к представлению контролируемой антикоагуляции является использование противосвертывающего средства со средне длительным и продолжительным действием ~12 часов и более, которое может достигнуть клинически адекватного действия в относительно низких дозах, в комбинации со вторым средством, способным к специфичному связыванию и нейтрализации первичного противосвертывающего средства. Такая комбинация "лекарственное средство-антидот" может гарантировать предсказуемую и безопасную нейтрализацию и прекращение противосвертывающей активности лекарственного средства (Rusconi и др., 2004, Nat Biotechnol. 22 (11):1423-8; Rusconi и др., 2002, Nature 419 (6902):90-4).

При открытии противосвертывающей системы REG1, основанной на аптамере (см. фиг.2), заявители применили технологию лекарственного средства-антидота. Аптамеры являются одноцепочечными нуклеиновыми кислотами, которые с высокой аффинностью и специфичностью связываются с белками-мишенями (Nimjee и др., 2005) подобно моноклональным антителам. Однако для того, чтобы связаться и заингибировать белок-мишень, аптамер должен принять определенную глобулярную третичную структуру. Образование указанной глобулярной третичной структуры требует того, чтобы аптамер принял правильную вторичную структуру (то есть правильные области спаренных и неспаренных оснований).

Как показано в схематической форме на фиг.2, введение олигонуклеотида, комплементарного части аптамера, может изменить структуру аптамера таким образом, что он больше не может связываться со своим белком-мишенью и таким образом эффективно прекращает или нейтрализует фармакологическую активность аптамерного лекарственного средства (Rusconi и др., 2004, Nat Biotechnol. 22 (11):1423-8; Rusconi и др., 2002, Nature 419 (6902):90-4).

RB006 (40 кДа сложный эфир P-L-guggaCUaUaCCgCgUaaUgCuGcCUccacT, в котором P=mPEG2-NHS; L=C6 NH₂ линкер; G=2'-OH G; g=2'-O-Me G; C=2'-F C; c=2'-O-Me C; U=2'-F U; u=2'-O-Me U; a=2'-O-Me A; и Т = инвертированный 2'-Н Т (SEQ ID NO 1); см. фиг.2), компонент лекарственного средства REG1 является прямым ингибитором FIXa, который связывается с фактором свертывания FIXa с высокой аффинностью и специфичностью (Rusconi и др., 2004, Nat Biotechnol. 22 (11):1423-8; Rusconi и др., 2002, Nature 419 (6902):90-4; см. также WO 05/106042 на имя Duke University). RB006 проявляет противосвертывающую активность посредством блокирования FVIIIa/FIXa-катализируемого превращения FX в FXa. RB006 является модифицированным РНК аптамером, 31 нуклеотид в длину, который умеренно стабилизирован против деградации эндонуклеазами посредством наличия 2'-фтор и 2'-O-метилсодержащих сахарных групп, и стабилизирована против деградации экзонуклеазами посредством 3'-инвертированного дезокситимидинового кэпа. Нуклеиновая часть аптамера конъюгирована с 40-килодальтонным полиэтиленгликолевым (ПЭГ) носителем для увеличения периода его полужизни в крови. При болюсной внутривенной инъекции период полужизни RB006 в мышах составляет приблизительно 8 часов и в обезьянах приблизительно 12 часов. Также, для поддержания состояния, противодействующего свертыванию, в течение более нескольких часов можно вводить RB006 в виде однократной болюсной инъекции, а не посредством внутривенной инфузии.

Как показано на фиг.2, RB007 (cgcgguauaguccac, в котором g=2'-О-Me G; c=2'-O-Ме C; u=2'-O-Me U; и а=2'-O-Me А (SEQ ID NO 2); см. фиг.2), антидотный компонент REG1, является олигонуклеотидом, который комплементарен части RB006, который может эффективно связываться с RB006 и таким образом нейтрализовать его анти-FIXa действие. RB007 представляет собой 2'-O-метил РНК олигонуклеотид, 15 нуклеотидов по длине, который комплементарен части компонента лекарственного средства REG1. 2'-O-метил модификация наделяет антидот умеренной устойчивостью к нуклеазам, что обеспечивает достаточную in vivo стабильность для того, чтобы позволить ему найти и связаться с RB006, но не поддерживает продолжительную in vivo персистенцию.

Неклинический этап разработки REG1

Заявители получили фармакологические данные, демонстрирующие специфичность аптамера RB006 к FIXa и аффинность антидота RB007 к аптамеру. Результаты неклинических фармакологическиих исследований могут быть вкратце сформулированы следующим образом: лекарственный компонент REG1 (RB006 и/или родственные соединения предшественники) может: (1) эффективно ингибировать активацию фактора свертывания X in vitro; (2) удлинять время свертывания плазмы крови in vitro в плазме людей и других видов животных; (3) оказывать системное противосвертывающее действие у животных при болюсном внутривенном введении; (4) предотвращать образование тромба в модели тромбоза при повреждении артерии на животных; (5) заменять гепарин в модели экстрапульмонального кровообращения у животных и (6) являться эффективным при повторном введении животным в течение 30 минут после нейтрализации антидотным компонентом REG1.

В неклинических фармакологических исследованиях к настоящему времени было показано, что антидотный компонент REG1 (RB007 и/или антидоты, специфичные к предшественникам лекарственного компонента REG1) может: (1) быстро и в течение длительного времени нейтрализовать противосвертывающую активность лекарственного компонента REG1 (RB006) in vitro в плазме людей и других видов животных; (2) быстро и в течение длительного времени нейтрализовать противосвертывающую активность лекарственного компонента REG1 in vivo после внутривенного болюсного введения животным, которым проводили системную противовертывающую терапию указанным средством; (3) предотвращать кровотечение, вызванное комбинацией сверхтерапевтических доз лекарственного компонента REG1 и хирургической травмы и (4) нейтрализовать противосвертывающую активность лекарственного компонента REG1 у животных после экстрапульмонального кровообращения. Кроме того, антидот не проявил никакой противосвертывающей или другой фармакологической активности in vitro в человеческой плазме или у животных после внутривенного болюсного введения.

Остается потребность в представлении надежного способа введения, который учитывает предсказуемый и воспроизводимый эффект системы аптамер-антидот.

СУЩНОСТЬ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Было обнаружено, что существует отчетливая связь между нормированной на вес дозой и, важно, нормированной на индекс массы тела дозой аптамера и его фармакодинамическим ответом. Кроме того, к удивлению было обнаружено, что доза антидота аптамера должна быть нормирована только на количество аптамера, введенного в организм, но не на какие-либо дополнительные критерии, для ингибирования активности аптамера до желаемого уровня. Это новое понимание представляет поддержку для определенных способов введения, которые учитывают предсказуемый и многократный режим дозирования при клиническом применении.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет улучшенный способ введения аптамерной противосвертывающей системы, включающий: 1) измерение индекса массы тела (ИМТ) субъекта; 2) определение желаемого фармакодинамического ответа; и 3) введение субъекту дозы аптамерного противосвертывающего средства для достижения желаемого фармакодинамического ответа, основываясь на сравнении дозы к ИМТ с фармакодинамическим ответом. В частных вариантах осуществления антидот аптамера впоследствии вводится субъекту, причем доза антидота представлена, основываясь на соотношении ранее введенной дозы аптамера к желаемому снижению активности аптамера. В частных случаях указанная доза антидота нормируется в зависимости от времени, которое прошло после введения аптамера. В частных случаях соотношение антидота к аптамеру снижено в два раза, если аптамер был введен ранее, чем за 24 часа.

В частных вариантах осуществления желателен максимальный уровень противосвертывающего эффекта. В указанных случаях аптамер может быть предоставлен в количестве 4 мг/ИМТ или более. В других случаях желателен уровень антикоагуляции приблизительно на 75% от максимального. В таких случаях субъекту вводится доза приблизительно 0,75-1,5 мг/ИМТ. В других случаях желательным является уровень антикоагуляции приблизительно 50% от максимального. В указанных случаях представленная доза составляет приблизительно 0,25-0,5 мг/ИМТ.

В частных общих вариантах осуществления дозировка используемого противосвертывающего средства составляет от 0,1 до 10 мг/ИМТ. В другом варианте осуществления дозировка составляет от 0,2 до 8 мг/ИМТ, или от 0,2 до 6 мг/ИМТ, от 0,2 до 5 мг/ИМТ, от 0,2 до 4 мг/ИМТ, от 0,2 до 3 мг/ИМТ, от 0,2 до 2 мг/ИМТ или от 0,2 до 1 мг/ИМТ. В некоторых вариантах осуществления доза противосвертывающего средства составляет приблизительно 0,1 мг/ИМТ, или приблизительно 0,2 мг/ИМТ, или приблизительно 0,5 мг/ИМТ, или приблизительно 0,75 мг/ИМТ, или приблизительно 1 мг/ИМТ, или приблизительно 2 мг/ИМТ, или приблизительно 3 мг/ИМТ, или приблизительно 4 мг/ИМТ, или приблизительно 5 мг/ИМТ, или приблизительно 6 мг/ИМТ, или приблизительно 7 мг/ИМТ, или приблизительно 8 мг/ИМТ, или приблизительно 9 мг/ИМТ, или приблизительно 10 мг/ИМТ.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение представляет улучшенный способ введения аптамерной противосвертывающей системы, включающий: 1) измерение веса субъекта; 2) определение желательного фармакодинамического ответа; и 3) введение субъекту дозы аптамерного противосвертывающего средства для достижения желаемого фармакодинамического ответа, основываясь на сравнении дозы на килограмм веса субъекта с фармакодинамическим ответом. В определенных вариантах осуществления антидот аптамера впоследствии вводится субъекту, причем вводимая доза антидота основана на соотношении к ранее введенной дозе аптамера, нормированной для желательного снижения активности аптамера. В частных случаях указанная доза антидота рассчитывается, основываясь на времени, которое прошло после введения аптамера. В частных случаях отношение антидота к аптамеру удвоено, если с момента введения аптамера прошло более 24 часов.

В частных вариантах осуществления желателен максимальный уровень противосвертывающего эффекта. В указанных случаях аптамер может быть введен в дозе 1,4 мг/кг или более. В других случаях желателен уровень антикоагуляции приблизительно на 75% от максимального. В таких случаях субъекту вводят дозу от 0,5 до 0,75 мг/кг. В других случаях желателен уровень антикоагуляции составляет приблизительно 50% от максимального. В указанных случаях вводят дозу приблизительно от 0,2 до 0,4 мг/кг.

В частных общих вариантах осуществления используемая доза составляет от 0,1 до 2 мг/кг, от 0,1 до 1,8 мг/кг, от 0,1 до 1,6 мг/кг, от 0,1 до 1,5 мг/кг, от 0,1 до 1,4 мг/кг, от 0,1 до 1,3 мг/кг, от 0,1 до 1,2 мг/кг, от 0,1 до 1,1 мг/кг, от 0,1 до 1,0 мг/кг, от 0,1 до 0,9 мг/кг, от 0,1 до 0,8 мг/кг, от 0,1 до 0,7 мг/кг, от 0,1 до 0,6 мг/кг, от 0,1 до 0,5 мг/кг, от 0,1 до 0,4 мг/кг, от 0,1 до 0,3 мг/кг или от 0,1 до 0,2 мг/кг. В других вариантах осуществления доза составляет от 1 до 20 мг/кг, от 1 до 18 мг/кг, от 1 до 15 мг/кг, от 2 до 15 мг/кг, от 3 до 15 мг/кг, от 4 до 15 мг/кг, от 5 до 20 мг/кг, от 5 до 15 мг/кг или от 1 до 10 мг/кг, или от 5 до 10 мг/кг, или составляет приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 2 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 4 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг, приблизительно 6 мг/кг, приблизительно 7 мг/кг, приблизительно 8 мг/кг, приблизительно 9 мг/кг, или приблизительно 10 мг/кг. В предпочтительном варианте осуществления аптамерной антикоагуляционной системой является система REG1, которая включает противосвертывающий аптамер и олигонуклеотидный антидот. В частных неограничивающих вариантах осуществления аптамером является RB006 (SEQ ID NO 1) и антидотом является RB007 (SEQ ID NO 2). В одном варианте осуществления фармакодинамический ответ измеряют в анализах коагулирующей активности, таких как АЧТВ (плазмы или цельной крови) или время активного свертывания (ВАС), и может быть выражено в виде абсолютного значения, процента от эффекта, процента изменения, средневзвешенного по времени значения или площади под кривой за определенный период времени.

Уровень фармакодинамического ответа может быть любым, который необходим для частной задачи. Например, в частных случаях, если у пациента низкий риск тромботического осложнения, то может быть желателен низкий уровень ответа. В частных случаях, возможно, не желательно достигать максимального ингибирования фактора свертывания, и в частности, ингибирования FIX или FIXа посредством использования избыточного количества противосвертывающего средства, в особенности аптамера для FIXа, такого как RB006. В других случаях, когда у пациента высокий риск тромбического осложнения или у него развивается тромбическое осложнение, может быть желателен высокий уровень ответа. В таких случаях может быть желательно максимальное увеличение ингибирования фактора свертывания и, в частности, FIX или ингибирование FIXа при использовании избыточного количества противосвертывающего средства, в частности аптамера к FIXа, такого как RB006.

В одном варианте осуществления противосвертывающий аптамер, такой как RB006, предназначен для внутривенного болюсного введения. В другом варианте осуществления противосвертывающий аптамер представлен для подкожной инъекции. В другом варианте осуществления, после внутривенного или подкожного болюсного введения аптамера проводят инъекцию антидота.

Процедуры, описанные в настоящем описании, позволяют пошагово вводить как противосвертывающее средство, так и антидот, что позволяет титровать или одно, или оба соединений до желательного уровня ингибирования и нейтрилизации активности мишени.

Отношение антидота к аптамеру рассчитывали, основываясь на желательном уровне ингибирования аптамера. Было обнаружено, что дозу антидота нужно рассчитывать только исходя из дозы аптамера, и не надо дополнительно нормировать на факторы, относящиеся к субъекту. В одном варианте осуществления отношение аптамера к антидоту составляет 1:1. В других вариантах осуществления отношение аптамера к антидоту составляет больше 1:1, такое как 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 или более. Указанные отношения можно также вычислить, основываясь на соотношении антидота к аптамеру, которое может, например, быть меньше приблизительно 1:1, такими как 0,9:1, или приблизительно 0,9:1, 0,8:1, или приблизительно 0,8:1, 0,7:1, или приблизительно 0,7:1, 0,6:1, или приблизительно 0,6:1, 0,5:1, или приблизительно 0,5:1, 0,45:1, или приблизительно 0,45:1, 0,4:1, или приблизительно 0,4:1, 0,35:1, или приблизительно 0,35:1, 0,3:1, или приблизительно 0,3:1, 0,25:1, или приблизительно 0,25:1, 0,2:1, или приблизительно 0,2:1, 0,15:1, или приблизительно 0,15:1, 0,1:1, или приблизительно 0,1:1, или меньше 0,1:1, такое как о 0,005:1 или меньше. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет от 0,5:1 до 0,1:1, или от 0,5:1 до 0,2:1, или от 0,5:1 до 0,3:1. В других вариантах осуществления соотношение составляет от 1:1 до 5:1, или от 1:1 до 10:1, или от 1:1 до 20:1.

В некоторых вариантах осуществления происходит только частичная нейтрализация активности аптамера. Например, в некоторых вариантах осуществления активность аптамера нейтрализована на 90% или меньше 90%, например приблизительно на 80%, приблизительно на 70%, приблизительно на 60%, приблизительно на 50%, приблизительно на 40%, приблизительно на 30%, приблизительно на 20%, приблизительно на 10% или менее. Соотношение антидота к аптамеру можно вычислить или посредством сравнения веса с весом, или на основе молей.

В частных вариантах осуществления по настоящему изобретению организмом или субъектом, которому применяют систему дозирования, является человек. В определенных вариантах осуществления организмом является человек, который нуждается в терапии антикоагулянтами. В определенных вариантах осуществления организмом является человек, которому проводят операцию на сосудах, например операцию по АКШ.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 изображена клеточная модель коагуляции. TF - тканевой фактор; vWF - фактор фон Виллебранда; II - протромбин; IIа - тромбин; Va, VIIa, VIIIа, IXa, Xa, XIa - активированные формы факторов свертывания V, VII, VIII, IX, X и XI.

На фиг.2 изображена противосвертывающая система REG1. Система состоит из ингибитора FIXa RB006 и подходящего для него антидота RB007. Узнавание лекарственного средства антидотом происходит как показано путем спаривания оснований по правилу Уотсона-Крика. RB006 является модифицированным РНК аптамером, состоящим из остатков 2'-фтора (верхний регистр), остатков 2'-O-метила (нижний регистр) и одного остатка 2'-гидроксила (подчеркнутый). RB006 конъюгирован с 40-кДa полиэтиленгликолевым носителем (P) через 6-углеродный аминолинкер (L) и защищен от деградации нуклеазами посредством инвертированного дезокситимидина на 3'-конце (idT). RB007 (антидот) является 2'-O-метил-модифицированным РНК олигонуклеотидом.

Фиг.3 является диаграммой кривой доза-ответ АЧТВ RB006 in vitro, на котором показано, что RB006 проявляет зависимое от концентрации увеличение АЧТВ нормальной объединенной человеческой плазмы. Средним значением, в секундах, является среднее АЧТВ. Данные подходили к четырехпараметрическому логистическому уравнению, что позволяет определить IC₅₀ по кривой.

На фиг.4 представлена диаграмма противосвертывающего эффекта RB006 в плазме пациентов. Противосвертывающую активность RB006 измеряли у 4 пациентов: двух женщин и двух мужчин. Образцы плазмы были получены из George King Biomedical (Overland Park, KS). Пациентов проскринировали и подтвердили норму в отношении уровней факторов свертывания. М/55 означает, что донором был мужчина, возраст 55 лет; F/49 означает, что донором была женщина, возраст 49 лет. В качестве реактива АЧТВ использовали MDA Platelin L (Biomeriux), который относительно более чувствителен к уровням FIX, чем реактив AЧТВ, используемый в исследовании, которое представлено на фиг.3.

На фиг.5 представлен график, показывающий нейтрализующую активность лекарственного средства антидотом RB007. Небольшой молярный избыток антидота RB007 по отношению к аптамеру RB006 полностью нейтрализует противосвертывающую активность RB006 в течение 10 минут. Показанные данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка средней для трех независимых измерений. Молярное соотношение основано на молях олигонуклеотидного аптамера и антидота (AD).

На фиг.6 представлен график повторного введения аптамера RB006 после нейтрализации антидота предшествующей дозой лекарственного средства. Свиньям вводили 2,5 мг/кг аптамера RB006 и через 15 минут вводили 3 мг/кг антидота RB007 (n=2) для нейтрализации указанной исходной дозы. Далее, через 30 минут после введения антидота RB007 (после 45 минут исходного введения аптамера) свиньям повторно вводили 2,5 мг/кг аптамера RB006. Изменение времени свертывания измеряли по (A) ВАС (O) в анализах цельной крови; или по (B) АЧТВ (O) в анализах свертывания плазмы. Показанные данные представлены как среднее значение ± диапазон для повторных измерений для каждого животного. Жирная линия (в A и B) является простой линией интерполяции экспериментальных точек.

На фиг.7 представлена диаграмма RB006 in vitro кривой доза-ответ АЧТВ в плазме яванских макак и людей. RB006 проявляет дозозависимую пролонгацию АЧТВ в плазме от обезьян, которая очень похожа на таковую, наблюдаемую в человеческой плазме. Эксперименты выполняли, используя реактив для АЧТВ такой же марки, APTT-LS, как использовали для анализа образцов плазмы в неклинических исследованиях токсичности, которые выполняли на обезьянах (REG1-TOX001 и REG1-TOX003). Поэтому полученные данные служат основанием для интерпретации результатов АЧТВ REG1-TOX001 и REG1-TOX003, представленных в разделах 8.4. Согласно изготовителю (Pacific Homeostasis, Middletown, VA), указанный реактив определяет АЧТВ ~87,3 секунды в образцах плазмы людей, содержащих <1% уровней FIX, 36,1 секунды в образцах, содержащих ~20% от нормальной активности FIX, и 27,5 секунды в образцах, содержащих 100% активности FIX. Цитратная объединенная плазма яванских макак была предоставлена Charles River Laboratories, Sierra Division.

На фиг.8 представлен график системной антикоагуляции у обезьян при введении RB006. Уровень антикоагуляции у обезьян мониторировали по АЧТВ. Для животных, которым вводили 15 мг/кг, данные по RB006 представлены в качестве среднего значения ± стандартная ошибка средней (с.о.с.). Для животных с уровнями дозировок 5 и 30 мг/кг данные представлены в качестве среднего значения ± диапазон, поскольку в каждой из указанных групп по уровню дозировки было только 2 животных.

На фиг.9 представлен график системной антикоагуляции у обезьян RB006 и нейтрализауии антидотом RB007. Уровень антикоагуляции у обезьян мониторировали по АЧТВ. RB007 вводили в t=3 часа после введения RB006. Данные представлены в качестве среднего значения ± с.о.с.

На фиг.10 представлена диаграмма фармакодинамической активности RB006 у людей.

На фиг.11 представлена диаграмма нейтрализации фармакологической активности RB006 у людей посредством RB007.

На фиг.11 представлена диаграмма, сравнивающая фармакодинамическую активность RB006 с введением и без введения RB007.

На фиг.12 представлена диаграмма, сравнивающая фармакодинамический ответ у субъектов, которым вводили 60 мг RB006, после чего через 3 часа вводили RB007 или плацебо.

На фиг.13 представлен более детальный анализ относительного увеличения АЧТВ относительно исходного значения в течение 0-3 часов у всех субъектов, которые получали RB006.

На фиг.14 представлена диаграмма AUC_0-3 для каждого субъекта в зависимости от уровня дозы RB006 (15, 30, 60 или 90 мг). Поскольку относительный эффект измеряют более 3 часов, значение "3" представляет отсутствие ответа на RB006, значение 6 указывает на в среднем 2-кратное увеличение относительного исходного уровня, и т.д.

На фиг.15 представлена диаграмма нормированной на вес дозы RB006 как функции уровня дозы RB006.

На фиг.16 представлена диаграмма AUC_0-3 в сравнении с нормированной на вес дозой RB006.

На фиг.17 представлена диаграмма нормированной на ИМТ дозы субъектов, которым вводили RB006, как функции уровня дозы RB006.

На фиг.18 представлена диаграмма AUC_0-3 для RB006 в зависимости от нормированной на ИМТ дозы.

На фиг.19 представлена диаграмма АЧТВ по сравнению с исходным уровнем в зависимости от % активности FIX, показывающая АЧТВ при различных дозах RB006 (15, 30, 60 и 90 мг).

На фиг.20 представлена диаграмма АЧТВ ответа в зависимости от использования четырех доз аптамера RB006 и антидота RB007, применяемых внутривенно у пациентов с болезнью коронарных артерий.

На фиг.21 представлена диаграмма, показывающая зависимость АЧТВ от времени после введения RB006 (0,75 мг/кг) на 1, 3 и 5 дни во всех группах лечения. Группа 1: субъекты, получившие однократную дозу аптамера (0,75 мг/кг RB006) на 1, 3 и 5 дни, после чего через один час следовало введение фиксированной дозы антидота (1,5 мг/кг RB007); группы 2 и 3: субъекты, получившие однократную дозу аптамера RB006 (0,75 мг/кг) на 1, 3 и 5 дни, после которой через один час вводили различные однократные дозы RB007.

На фиг.23 представлена диаграмма зависимости среднего АЧТВ от времени в группах, которым вводили RB006 (0,75 мг/кг) и RB007 в различных соотношениях по сравнению с RB006.

На фиг.24 представлена диаграмма, показывающая процент восстановления средневзвешенного во времени АЧТВ после введения RB006 через час RB007 в перечисленных соотношениях по сравнению с RB006.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Было установлено, что между нормированной на вес дозировкой и, что важно, нормированной на индекс массы тела дозировкой, существуют четкая связь, в частности, для аптамерного антикоагулянта и его фармакодинамического ответа. Кроме того, к удивлению было установлено, что для ингибирования активности аптамера до желательного уровня дозу антидота к аптамеру необходимо рассчитывать только на основании количества аптамера, введенного в организм, и не на каких-либо дополнительных критериях. Это новое понимание представляет поддержку определенным способам введения, которые позволяют осуществлять предсказуемый и многократный режим дозирования при клиническом использовании.

Разработка аптамеров

Аптамеры нуклеиновых кислот выделяют, используя способ экспоненциального обогащения путем системной эволюции лигандов, называемого SELEX. Указанный способ позволяет проводить in vitro эволюцию молекул нуклеиновых кислот с высокоспецифичным связыванием с молекулами-мишенями. Способ SELEX описан, например, в патенте США № 7087735, патенте США № 5475096 и патенте США № 5270163 (см. также WO 91/19813).

Способ SELEX включает селекцию смеси кандидатных олигонуклеотидов и пошаговые повторения связывания, разделения и амплификации, используя одинаковую общую схему отбора для достижения фактически любого желаемого критерия аффинности связывания и селективности. Начинаясь со смеси нуклеиновых кислот, например смесей, содержащих фрагменты рандомизированной последовательности, способ SELEX включает шаги по введению в контакт смеси с мишенью в условиях, благоприятных для связывания, отделению несвязавшихся нуклеиновых кислот от тех нуклеиновых кислот, которые специфично связались с молекулами-мишенями, разрушение комплексов нуклеиновой кислоты-мишени, амплификации нуклеиновых кислот, продиссоциировавших из комплексов нуклеиновая кислота-мишень для того, чтобы получить обогащенную лигандом смесь нуклеиновых кислот, а затем повторение шагов связывания, разделения, диссоциации и амплификации такое число раз, которое необходимо для получения высокоспецифичных, высокоаффинных аптамеров к молекуле-мишени.

Базовый способ SELEX был модифицирован для достижения нескольких частных целей. Например, патент США № 5707796 описывает применение SELEX в соединении с электрофорезом в геле для отбора молекул нуклеиновой кислоты с определенными структурными свойствами, например согнутые ДНК. Патент США № 5763177 описывает основанный на SELEX способ для отбора аптамеров, содержащих фотореактивные группы, которые способные связываться и/или образовывать поперечные связи при действии света и/или фотоинактивировать молекулу-мишень. Патент США № 5580737 описывает способ идентификации высокоспецифичных аптамеров, которые способны различать близко родственные молекулы, называемый Counter-SELEX. Патенты США № 5567588 и № 5861254 описывают способы на основе SELEX, которые достигают высокоэффективного разделения олигонуклеотидов, которые обладают высокой и низкой аффинностью к молекуле-мишени. Патент США № 5496938 описывает способы получения улучшенных аптамеров после проведения способа SELEX. Патент США № 5705337 описывает способы ковалентного соединения лиганда со своей мишенью.

Осуществимость идентификации аптамеров к маленьким пептидам в растворе была продемонстрирована в патенте США № 5648214. Способность использовать аффинную элюцию лигандом для получения аптамеров, которые направлены на специфический сайт на молекуле-мишени, иллюстрируется в патенте США № 5780228, который относится к получению высокоаффинных аптамеров, связывающихся с определенными лектинами. Способы получения аптамеров к определенным тканям, которые включают группы типов клеток, описаны в патенте США № 6127119. Получение определенных модифицированных высокоаффинных лигандов к щелочной фосфатазе из кишечника теленка описано в патенте США № 6673553. Патент США № 6716580 описывает автоматизированный способ идентификации аптамеров, который включает применение роботизированных манипуляторов.

В своей наиболее простой форме способ SELEX можно определить посредством следующего ряда шагов.

1) Получают смесь кандидатных нуклеиновых кислот с отличающейся последовательностью. Смесь кандидатов обычно включает области фиксированных последовательностей (то есть каждый из членов смеси кандидатов содержит одинаковые последовательности в одинаковом положении) и области рандомизированных последовательностей. Области фиксированных последовательностей выбирают либо: (a) для помощи во время шагов амплификации, описанных ниже, (b) для имитации последовательности, о которой известно, что она связывается с мишенью, или (c) для повышения концентрации данной структурной организации нуклеиновых кислот в смеси кандидатов. Рандомизированные последовательности могут быть полностью рандомизированными (то есть вероятность обнаружения основания в любом положении является одной четвертой) или только частично рандомизированными (например, вероятность обнаружения основания в любом положении можно установить на любом уровне от 0 до 100 процентов).

2) Смесь кандидатов вводят в контакт с выбранной мишенью в условиях, благоприятных для связывания мишени и членов смеси кандидатов. В указанных условиях взаимодействие между мишенью и нуклеиновыми кислотами смеси кандидатов можно рассматривать как образование пар нуклеиновая кислота-мишень между мишенью и теми нуклеиновыми кислотами, которые обладают самой сильной аффинностью к мишени.

3) Нуклеиновые кислоты с самой высокой аффинностью к мишени отделяют от нуклеиновых кислот с меньшей аффинностью к мишени. Поскольку в смеси кандидатов находится только чрезвычайно малое количество последовательностей (и возможно только одна молекула нуклеиновой кислоты), которые соответствуют нуклеиновым кислотам с самой высокой аффинностью, обычно желательно установить критерии разделения так, чтобы значительное количество нуклеиновых кислот в смеси кандидатов (приблизительно 5-50%) сохранялись во время разделения.

4) Те нуклеиновые кислоты, которые были отобраны во время разделения как обладающие относительно более высокой аффинностью к мишени, далее амплифицируют для создания новой смеси кандидатов, которая обогащена нуклеиновыми кислотами, которые обладают относительно более высокой аффинностью к мишени.

5) Повторяя вышеуказанные шаги по разделению и амплификации, вновь образованная смесь кандидатов содержит все меньше и меньше слабо связывающихся последовательностей, и средняя степень аффинности нуклеиновых кислот к мишени как правило возрастает. В самой крайней степени способ SELEX приведет к получению смеси кандидатов, содержащей одну или небольшое количество уникальных нуклеиновых кислот, представляющих те нуклеиновые кислоты исходной смеси кандидатов, которые обладают самой высокой аффинностью к молекуле-мишени.

Химические модификации

Одна из проблем, с которой сталкиваются при терапевтическом применении нуклеиновых кислот, состоит в том, что олигонуклеотиды в своей фосфодиэфирной форме могут быстро разлагаться в жидкостях организма внутриклеточными и внеклеточными ферментами, такими как эндонуклеазы и экзонуклеазы до проявления желательного эффекта. Определенные химические модификации аптамера могут быть сделаны для того, чтобы увеличить in vivo стабильность аптамера или усилить или осуществить доставку аптамера.

Модификации аптамеров включают, но не ограничены те, которые предоставляют другие химические группы, которые привносят дополнительный заряд, поляризуемость, гидрофобность, образование водородной связи, электростатическое взаимодействие и гибкость основаниям аптамера или к аптамеру в целом. Такие модификации включают, но не ограничены, модификации 2'-положения сахара, модификации пиримидина в 5-положении, модификации пурина в 8-положении, модификации внециклических аминов, замену в 4-тиоуридине, замену в 5-бром- или 5-йодурациле; модификации остова, модификации фосфоротиоатов или алкилфосфатов, метилирования, необычные комбинации при спаривании оснований, такие как изооснования изоцитидин и изогуанидин и т.п. Модификации могут также включать 3'- и 5'-модификации, такие как кэпирование.

Способ SELEX включает идентификацию высокоаффинных аптамеров, содержащих модифицированные нуклеотиды, придающие лиганду улучшенные характеристики, такие как улучшенную in vivo стабильность или улучшенные характеристики доставки. Примеры таких модификаций включают химические замены в положениях рибозы и/или основания и/или фосфата. Идентифицированные способом SELEX аптамеры, содержащие модифицированные нуклеотиды, описаны в патенте США № 5660985, который описывает олигонуклеотиды, содержащие производные соединения нуклеотидов, химически модифицированные в 5'- и 2'-положениях пиримидинов. Патент США № 5580737 описывает специфичные аптамеры, содержащие один или более нуклеотидов, модифицированных по 2'-амино (2'-NH ₂), 2'-фтор (2'-F) и/или 2'-O-метил (2'-OMe). Патент США № 5756703 описывает олигонуклеотиды, содержащие различные 2'-модифицированные пиримидины.

Метод SELEX включает комбинирование отобранных олигонуклеотидов с другими отобранными олигонуклеотидами и неолигонуклеотидными функциональными группами, как описано в патентах США № 5637459 и № 5683867. Патент США № 5637459 описывает высокоспецифичные аптамеры, содержащие один или несколько нуклеотидов, модифицированных по 2'-амино (2'-NH₂), 2'-фтор (2'-F) и/или 2'-O-метил (2'-OMe). Метод SELEX дополнительно включает комбинирование отобранных аптамеров с липофильными или неиммуногенными высокомолекулярными соединениями в диагностическом или терапевтическом комплексе, как описано в патенте США № 6011020.

Если аптамеры получены посредством метода SELEX, модификации могут быть пре- или пост-SELEX модификациями. Модификации пре-SELEX могут привести к аптамерам как со специфичностью для соответствующей мишени, так и с улучшенной in vivo стабильностью. Модификации пост-SELEX, направленные на 2'-ОН аптамеры, могут привести улучшенной in vivo стабильности, не воздействуя неблагоприятно на связывающую способность аптамеров. В одном варианте осуществления модификации аптамера включают 3'-3'-инвертированные фосфодиэфирные связи на 3'-конце молекулы и 2'-фтор (2'-F) и/или 2'-амино (2'-NH₂), и/или 2'-O-метил (2'-OMe) модификацию некоторых или всех нуклеотидов.

В одном варианте осуществления аптамер или его регулятор могут быть ковалентно присоединены к липофильному соединению, такому как холестерин, диалкилглицерол, диацилглицерол или неиммуногенному высокомолекулярному соединению или полимеру, такому как полиэтиленгликоль (ПЭГ). В указанных случаях могут быть усилены фармакокинетические свойства аптамера или модулятора. В других вариантах осуществления аптамер или модулятор могут быть инкапсулированы в липосоме. Липофильное соединение или неиммуногенное высокомолекулярное соединение может быть ковалентно связано или связано посредством нековалентных взаимодействий с аптамером или модулятором(ами). В вариантах осуществления, в которых используется ковалентное соединение, липофильное соединение или неиммуногенное высокомолекулярное соединение может быть ковалентно связано с аптамером или модулятором в различных положениях, таких как ациклическая аминогруппа у основания, в 5-положении пиримидинового нуклеотида, в 8-положении пуринового нуклеотида, с гидроксильной группой фосфата или гидроксильной группой или другой группой на 5'- или 3'-конце. В одном варианте осуществления ковалентное присоединение осуществляется к 5'- или 3'-гидроксильной группе. Присоединение олигонуклеотидного модулятора к другим компонентам комплекса может быть сделано напрямую или с использованием линкеров или спейсеров.

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут быть модифицированы по основанию, сахарной группе или фосфатному остову, например, для улучшения стабильности молекулы, гибридизации и т.д. Олигонуклеотид может содержать другие присоединенные группы. С указанной целью олигонуклеотид может быть конъюгирован с другой молекулой, например пептидом, сшивающим агентом, активируемым гибридизацией, транспортным агентом, расщепляющим агентом, активируемым гибридизацией, и т.д. Олигонуклеотид может содержать по меньшей мере одну модифицированную группу в основании, которая выбрана из группы, включающей, но не ограниченной, 5-фтороурацил, 5-бромурацил, 5-хлорурацил, 5-йодурацил, гипоксантин, ксантин, 4-ацетилцитозин, 5-(карбоксигидроксиметил)урацил, 5-карбоксиметиламинометилтиоуридин, 5- карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, бэта-D-галактозилквеуозин, инозин, N6-изопентиладенин, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N6-аденин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2 -тиоурацил, -D-маннозилквеуозин, 5'-метоксикарбоксиметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-N-изопентениладенин, урацилоксиуксусную кислоту, вибутоксоцин, псевдоурацил, квеуозин, 2-тиоцитозин, 5-метилтиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацилоксиуксусную кислоту(v), 5-метилтиоурацил, 3-(3-амино-3-N-карбоксипропил) и 2,6-диаминопурин.

Аптамер или модулятор по настоящему изобретению может также содержать по меньшей мере одну модифицированную сахарную группу, выбранную из группы, включающей, но не ограниченной, арабинозу, 2-фторарабинозу, ксилозу и гексозу. Аптамер или модулятор может содержать по меньшей мере один модифицированный фосфатный остов, выбранный из группы, включающей, но не ограниченной, фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфорамидотиоат, фосфорамидат, фосфородиамидат, метилфосфонат, сложный алкилфосфотриэфир и формацеталь или их аналоги.

Любой из олигонуклеотидов по настоящему изобретению может быть синтезирован посредством стандартных методов, известных в данной области техники, например, при помощи автоматизированного синтезатора ДНК (то есть которые коммерчески доступны, например, у Biosearch, Applied Biosystems).

Модуляторы

Модуляторы по настоящему изобретению могут быть олигонуклеотидами, малыми молекулами, пептидами, олигосахаридами, например аминогликозиды или другие молекулы, которые могут связываться с аптамером или иначе смодулировать действие аптамера, или химеру, или слияние, или связанный продукт любого из них.

В одном варианте осуществления модулятором является олигонуклеотид, комплементарный по меньшей мере части аптамера. В другом варианте осуществления модулятором может быть рибозим или дезоксирибозим, который направлен на аптамер. В дополнительном варианте осуществления модулятором может быть пептид-нуклеиновая кислота (PNA), морфолино-нуклеиновая кислота (MNA), закрытая нуклеиновая кислота (LNA) или псевдоциклические олигонуклеиновые основания (PCO), которые включают последовательность, которая является комплементарной или гибридизируется с по меньшей мере частью аптамера.

Аптамер обладает активной третичной структурой, которая зависит от образования правильной стабильной вторичной структуры. Поэтому в то время как механизм образования дуплекса между комплементарным олигонуклеотидным модулятором по настоящему изобретению и аптамером является таким же, как между двумя короткими линейными олигорибонуклеотидами, и правила для предсказания таких взаимодействий и кинетики образования такого продукта зависят от внутримолекулярной структуры аптамера. Скорость нуклеации важна для образования кончного стабильного дуплекса, и скорость указанного шага значительно увеличивается посредством направления олигонуклеотидного модулятора к одноцепочечным петлям и/или одноцепочечным 3'- или 5'-хвостов, присутствующих в аптамере. Для образования межмолекулярного дуплекса необходимо, чтобы свободная энергия образования межмолекулярного дуплекса была благоприятной в отношении образования существующих внутримолекулярных дуплексов внутри нацеленного аптамера.

Модуляторы могут быть разработаны таким образом, чтобы связывать конкретный аптамер с высокой специфичностью и желаемой аффинностью. Модуляторы также могут быть разработанными таким образом, что при связывании структура аптамера изменяется в сторону или более или менее активной формы. Например, модулятор может быть разработан таким образом, чтобы при связывании с аптамером-мишенью, трехмерная структура указанного аптамера изменялась таким образом, что аптамер больше не может связываться со своей молекулой-мишенью или связывается со своей молекулой-мишенью с меньшей аффинностью.

В качестве альтернативы, модулятор может быть разработан таким образом, чтобы при связывании трехмерная структура аптамера изменялась таким образом, чтобы аффинность аптамера к своей молекуле-мишени увеличивалась. То есть модулятор может быть разработан так, чтобы при связывании в аптамере образовывался структурный мотив таким образом, чтобы аптамер мог связаться со своей молекулой-мишенью.

В альтернативном варианте осуществления по настоящему изобретению, сам модулятор является аптамером. В указанном варианте осуществления сначала получают аптамер, который связывается с желательной терапевтической мишенью. Во втором шаге получают второй аптамер, который связывается с первым аптамером, используя метод SELEX, описанный в настоящей заявке, или другой метод, и модулирует взаимодействие между терапевтическим аптамером и мишенью. В одном варианте осуществления второй аптамер инактивирует эффект первого аптамера.

В других альтернативных вариантах осуществления аптамер, который связывается с мишенью, может быть PNA, MNA, LNA или PCO, и модулятор является аптамером. В качестве альтернативы, аптамер, который связывается с мишенью, является PNA, MNA, LNA или PCO, и модулятор является PNA. В качестве альтернативы, аптамер, который связывается с мишенью, является PNA, MNA, LNA или PCO, и модулятор является MNA. В качестве альтернативы, аптамер, который связывается с мишенью, является PNA, MNA, LNA или PCO, и модулятор является LNA. В качестве альтернативы, аптамер, который связывается с мишенью, является PNA, MNA, LNA или PCO, и модулятор является PCO. При желании любой из них можно использовать в стереохимии, которая встречается в природе, или в стереохимии, которая не встречается в природе. Например, в предпочтительном варианте осуществления аптамер находится в конфигурации D, и в альтернативном варианте осуществления аптамер находится в конфигурации L.

В одном варианте осуществления модулятор по настоящему изобретению является олигонуклеотидом, который содержит последовательность, комплементарную по меньшей мере части нацеленной последовательности аптамера. Например, олигонуклеотидный модулятор может содержать последовательность, комплементарную 6-25 нуклеотидам аптамера-мишени, как правило, 8-20 нуклеотидам, чаще 10-15 нуклеотидам. Преимущественно, олигонуклеотидный модулятор является комплементарным 6-25 последовательным нуклеотидам аптамера, или 8-20 или 10-15 последовательным нуклеотидам. Длина олигонуклеотидного модулятора может быть оптимизирована, принимая во внимание аптамер-мишень и желаемый эффект. Как правило, олигонуклеотидный модулятор состоит из 5-80 нуклеотидов в длину, чаще 10-30 и наиболее часто 15-20 нуклеотидов (например, 15-17). Олигонуклеотид может быть получен из нуклеотидов, обладающих D или L стереохимией, или их смеси. Встречающиеся в природе нуклеиновые основания имеют D конфигурацию.

Для определения оптимального сайта для связывания олигонуклеотида с аптамером-мишенью можно использовать различные стратегии. Можно использовать эмпирическую стратегию, согласно которой комплементарные олигонуклеотиды "проходятся" по аптамеру. Эксперимент «по прохождению» может включать два эксперимента, которые выполняются последовательно.

Можно получить новую смесь кандидатов, в которой у каждого из членов смеси кандидатов имеется фиксированная область нуклеиновой кислоты, которая соответствует олигонуклеотидному модулятору интереса. Каждый член смеси кандидатов также содержит область рандомизированных последовательностей. Согласно указанному методу возможно идентифицировать то, что упоминается как "расширенные" аптамеры, которые содержат области, которые могут связываться с более, чем одним связывающим доменом аптамера. В соответствии с указанным подходом можно использовать 2'-O-метил олигонуклеотиды (например, 2'-O-метил олигонуклеотиды) приблизительно 15 нуклеотидов в длину, которые координируются примерно 5 нуклеотидами аптамера (например, олигонуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 1-15, 6-20, 11-25 и т.д. аптамера). Эмпирическая стратегия может быть особенно эффективной, поскольку влияние третичной структуры аптамера на эффективность гибридизации может быть трудна для предсказания. Для оценки способности различных олигонуклеотидов гибридизироваться с определенным аптамером, в особенности на определение молярного избытка олигонуклеотида, который необходим для достижения связывания всего количества аптамера, можно использовать анализы, описанные в примерах, которые следуют далее. Способность различных олигонуклеотидных модуляторов увеличивать скорость диссоциации аптамера или ассоциации аптамера со своей молекулой-мишенью можно также определить посредством проведения стандартных кинетических исследований, например, анализов BIACORE. Модуляторы олигонуклеотидов могут быть выбраны таким образом, что 5-50-кратный молярный избыток олигонуклеотида или менее является необходимым для изменения взаимодействия между аптамером и его молекулой-мишенью желательным образом.

В качестве альтернативы, аптамер-мишень может быть модифицирован таким образом, чтобы содержать одноцепочечный конец (3' или 5') для улучшения ассоциации с олигонуклеотидным модулятором. Подходящие концы могут содержать от 1 до 20 нуклеотидов, предпочтительно 1-10 нуклеотидов, более предпочтительно 1-5 нуклеотидов и наиболее предпочтительно 3-5 нуклеотидов (например, модифицированные нуклеотиды, такие как 2'-O-метил последовательности). Аптамеры с одноцепочечными концами могут быть протестированы на связывание и биологическую активность (например, как описано в примерах, которые следуют далее) для проверки того, что добавление одноцепочечного конца не нарушает активную структуру аптамера. Ряд олигонуклеотидов (например, 2'-O-метил олигонуклеотиды), которые могут образовывать, например, 1, 3 или 5 пар оснований в последовательности одноцепочечного конца, можно разработать и проверить на их способность связываться только с аптамером, содержащим одноцепочечный конец, так же, как и на их способность увеличивать скорость диссоциации аптамера или ассоциации аптамера со своей молекулой-мишенью. Для проверки того, что эффекты осуществляются вследствие образования дуплекса, а не в результате неспецифических эффектов, можно использовать контроли с рандомизированными последовательностями.

Модуляторы олигонуклеотидов по настоящему изобретению содержат последовательность, комплементарную по меньшей мере части аптамера. Однако абсолютная комплементарность необязательна. Последовательность, "комплементарная по меньшей мере части аптамера", на которую ссылаются в настоящем описании, обозначает последовательность, обладающую достаточной комплементарностью для того, чтобы быть способной гибридизироваться с указанным аптамером. Способность гибридизироваться может зависеть и от степени комплементарности, и от длины антисмысловой нуклеиновой кислоты. Как правило, чем больше гибридизирующийся олигонуклеотид, тем больше ошибочных спариваний между основаниями аптамера-мишени он может содержать и все еще образовывать стабильный дуплекс (или триплекс в зависимости от обстоятельств). Специалист в данной области техники может установить терпимую степень ошибочных спариваний при помощи стандартных процедур определения точки плавления гибридного комплекса. В частных аспектах олигонуклеотид может состоять по меньшей мере из 5 или по меньшей мере из 10 нуклеотидов, по меньшей мере 15 или 17 нуклеотидов, по меньшей мере 25 нуклеотидов или по меньшей мере 50 нуклеотидов. Олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут быть ДНК или РНК или гибридными смесями, или производными соединениями, или их модифицированными версиями, одноцепочечными.

В одном варианте осуществления модулятором является рибозим или дезоксирибозим. Существует по меньшей мере пять классов рибозимов, и каждый обладает различным типом специфичности. Например, интроны I группы имеют размер приблизительно от 300 до >1000 нуклеотидов, и им необходим U в последовательности-мишени непосредственно с 5'-стороны от сайта расщепления, и они связывают 4-6 нуклеотидов с 5'-конца от сайта расщепления. Другой класс представляют RNaseP РНК (М1 РНК), которые имеют размер приблизительно от 290 до 400 нуклеотидов. Третьим примером являются рибозимы в виде головки молотка, которые имеют размер приблизительно от 30 до 40 нуклеотидов. Для них необходимо, чтобы с 5'-стороны от сайта расщепления находилась UH последовательность, и они связываются с различными по количеству нуклеотидов последовательностями с обеих сторон от сайта расщепления. Четвертый класс составляют шпилечные рибозимы, которые имеют размер приблизительно 50 нуклеотидов. Для них необходима последовательность-мишень GUC непосредственно с 3'-конца от сайта расщепления, и они связываются с 4 нуклеотидами на 5'-конце сайта расщепления и вариабельным количеством на 3'-конце сайта расщепления. Пятая группа представлена рибозимами вируса гепатита дельта (HDV), размер которых составляет приблизительно 60 нуклеотидов.

Другой класс каталитических молекул называют "дезоксирибозимами". Дезоксирибозимы являются одноцепочечными и расщепляют и РНК, и ДНК. Была предложена общая модель для дезоксирибозимов, известная как модель "10-23". Согласно модели "10-23" дезоксирибозимы обладают каталитическим доменом из 15 дезоксирибонуклеотидов, который фланкирован двумя доменами, узнающими субстрат, каждый, состоящий из от семи до девяти дезоксирибонуклеотидов.

Нуклеиновые основания олигонуклеотидных модуляторов по настоящему изобретению могут быть соединены посредством связей между нуклеиновыми основаниями, например пептидиловых связей (как в случае пептидно-нуклеиновых кислот (PNA); Nielsen и др. (1991) Science 254, 1497 и патент США № 5539082) и морфолиновых связей (Qin и др., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10, 11 (2000); Summerton, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7, 187 (1997); Summerton и др., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7, 63 (1997); Taylor и др., J Biol Chem. 271, 17445 (1996); Partridge и др., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6, 169 (1996)), или посредством любой другой природной или модифицированной связи. Олигонуклеиновые основания могут также быть закрытыми нуклеиновыми кислотами (LNA). Nielsen и др., J Biomol Struct Dyn 17, 175 (1999); Petersen и др., J Mol Recognit 13, 44 (2000); Nielsen и др., Bioconjug Chem 11, 228 (2000).

PNA являются соединениями, которые аналогичны олигонуклеотидам, но отличаются по составу. В PNA дезоксирибозный остов олигонуклеотида замещен пептидным остовом. Каждая субъединица пептидного остова присоединена к встречающемуся в природе или не встречающемуся в природе нуклеиновому основанию. PNA зачастую имеет ахиральный полиамидный остов, состоящий из N-(2-аминоэтил)глициновых групп. Для представления комплементарной нуклеиновой кислоте пуриновые или пиримидиновые основания связаны с каждой субъединицей через метиленовый карбонильный линкер (1-3). PNA связывается с комплементарной РНК или ДНК в параллельной или антипараллельной ориентации по правилам спаривания оснований Уотсона-Крика. Незаряженность олигомеров PNA усиливает стабильность гибридных PNA/ДНК (РНК) дуплексов по сравнению с природными гомодуплексами.

Морфолино-нуклеиновые кислоты получили такое название, потому что они состоят из субъединиц морфолина, каждая из которых содержит одну из четырех генетических оснований (аденин, цитозин, гуанин и тимин), соединенных с 6-членным морфолиновым кольцом. От восемнадцати до двадцати пяти субъединиц указанных четырех типов субъединиц соединены в определенном порядке неионными фосфородиамидатными межсубъединичными связями с образованием морфолинового олигомера. Указанные морфолиновые олигомеры со своими 6-членными морфолиновыми группами, составляющими остов, соединенные неионными связями, представляют по существу лучшие антисмысловые свойства, чем РНК, ДНК и их аналоги, имеющие 5-членный рибозные или деоксирибозные остовы, соединенные ионными связями (см. www.gene-tools.com/Morphol-inos/body_morpholinos.HTML).

LNA является классом аналогов ДНК, который обладает некоторыми свойствами, которые делают его главным кандидатом в качестве модулятора по настоящему изобретению. Мономеры LNA являются бициклическими соединениями, по структуре аналогичными РНК-мономерам. LNA с ДНК и РНК разделяют большинство химических свойств, а именно являются растворимыми в воде, могут быть разделены посредством электрофореза в геле, осаждены этиловым спиртом и т.д. (Tetrahedron, 54, 3607-3630 (1998)). Однако введение мономеров LNA или в ДНК, или в РНК олигомеры приводит к высокой термостабильности дуплексов с комплементарной ДНК или РНК, при этом подчиняясь правилам спаривания оснований Уотсона-Крика. Такая высокая термостабильность дуплексов, образованных с олигомерами LNA, вместе с обнаружением, что затравки, содержащие на 3'-конце LNA, являются субстратами для ферментативного удлинения, например, реакции PCR, используются в настоящем изобретении для значительного увеличения специфичности обнаружения различных нуклеиновых кислот в in vitro анализах, описанных в настоящей заявке. Способы амплификации индивидуальных аллелей являются высокодифференциальными (перекрестные реакции не отображаются), и в одной пробирке могут протекать несколько реакций. См., например, патент США № 6316198.

Псевдоциклические олигомерные нуклеиновые основания (PCO) могут также использоваться в качестве модулятора в настоящем изобретении (см. патент США № 6383752). PCO содержат два олигонуклеотидных сегмента, которые соединены посредством своих 3'-3' или 5'-5' концов. Один из сегментов PCO ("функциональный сегмент") обладает некоторой функциональностью (например, антисмысловой олигонуклеотид, комплементарный мРНК-мишени). Другой сегмент ("защитный сегмент") является комплементарным 3'-или 5'-концам функционального сегмента (в зависимости от конца, через который он присоединен к функциональному сегменту). В результате коплементарности между функциональным и защитным сегментами, в отсутствие нуклеиновых кислот-мишеней (например, РНК) в PCO образуются внутримолекулярные псевдоциклические структуры. PCO более стабильны, чем обычные антисмысловые олигонуклеотиды из-за наличия 3'-3' или 5'-5' связей и образования внутримолекулярных псевдоциклических структур. Исследования фармакокинетики, распределения в тканях и стабильности на мышах предполагают, что PCO обладают более высокой in vivo стабильностью и фармакокинетикой и распределением в тканях, сходным с таковым для сахарофосфатных олигонуклеотидов в целом, но быстрой элиминацией из ряда тканей. Если молекулы флуорофора и гасителя правильным образом присоединены к PCO по настоящему изобретению, молекула будет флуоресцировать, если она находится в линейной конфигурации, и флюоресценция будет погашена в циклической конформации.

Основанные на пептиде модуляторы аптамеров представляют альтернативный класс молекул модуляторов олигонуклеотидов или их аналогов. Модуляторы указанного класса оказались особенно полезными в том случае, когда достаточно активные олигонуклеотидные модуляторы аптамера-мишени нельзя изолировать из-за нехватки достаточных одноцепочечных областей для обеспечения нуклеации между мишенью и олигонуклеотидным модулятором. Кроме того, пептидные модуляторы обеспечивают биодоступность и фармакокинетику, отличные от олигонуклеотидных модуляторов.

Олигосахариды, как и аминогликозиды, могут связываться с нуклеиновыми кислотами и могут быть использованы для модулирования активности аптамеров. Синтетический препарат, который внедряется между аптамером и мишенью и либо нарушает или модифицирует связывание аптамера с мишенью, также может быть использован в качестве терапевтического регулятора. Такие синтетические препараты могут быть идентифицированы посредством скрининга кандидатов в анализе, который измеряет изменения в связывании аптамера с мишенью в присутствии и в отсутствие синтетического препарата, или при использовании in vivo или in vitro анализа, который измеряет различие в биологическом эффекте аптамера на мишень в присутствии и в отсутствие синтетического препарата. Как только идентифицирован синтетический препарат, который проявляет желательный эффект, с целью оптимизации химической структуры для достижения желательного эффекта регуляции могут быть использованы методики, такие как комбинаторные подходы.

Для идентификации и отбора модуляторов по настоящему изобретению могут быть использованы стандартные анализы связывания. Неограничивающими примерами являются анализы задержки подвижности в геле и анализы BIACORE. То есть тестируемые модуляторы можно ввести в контакт с аптамерами для связывания в тестовых условиях или обычных физиологических условиях и провести определение, связывается ли в действительности тестируемый модулятор с аптамером. Тестируемые модуляторы, в отношении которых уставлено, что они связываются с аптамером, могут быть проанализированы в адекватных анализах биологической активности (которые будут изменяться в зависимости от аптамера и его молекулы-мишени, например, анализы свертывания) для определения, может ли тестируемый модулятор воздействовать на биологический эффект, проявленный аптамером по отношению к своей молекуле-мишени.

Анализ задержки подвижности в геле является методикой, которую используют для оценки способности к связыванию. Например, фрагмент ДНК, содержащий тестируемую последовательность, сначала инкубируют с тестируемым белком или смесью, содержащей предполагаемые связываемые белки, и затем разделяют в геле посредством электрофореза. Если фрагмент ДНК связывается с белком, то он будет больше в размере, и поэтому его передвижение будет задержано в сравнении со свободным фрагментом. Например, одним методом для электрофоретического анализа задержки подвижности в геле может быть (a) контактирование в смеси белка, связывающего нуклеиновую кислоту с нерадиоактивной или радиоактивно меченной молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей молекулярный зонд в подходящих условиях для обеспечения специфичных взаимодействий связывания между белком и зондом с образованием комплекса, в котором указанный зонд выбран из группы, состоящей из дцДНК, оцДНК и РНК; (b) электрофорез смеси; (c) перенос, используя перенос на блота при положительном давлении или капиллярный перенос, комплекса на мембрану, где мембраной является положительно заряженный нейлон; и (d) детекция комплекса, связанного с мембраной, посредством детекции нерадиоактивной или радиоактивной метки в комплексе.

Технологией Biacore измеряют события связывания на поверхности сенсорного чипа, таким образом, взаимодействующее вещество, присоединенное к поверхности, определяет специфичность анализа. Определение специфичности взаимодействия включает просто анализ, могут ли различные молекулы связываться с прикрепленным взаимодействующим веществом. Связывание приводит к немедленному изменению сигнала поверхностного плазмонного резонанса (SPR) таким образом, что непосредственно очевидно, происходит ли взаимодействие или нет. Биодатчики на основе SPR наблюдают за взаимодействием посредством измерения массовых концентраций биомолекул, расположенных близко к поверхности. Поверхности придают специфичность посредством прикрепления одного из взаимодействующих партнеров. Образец, содержащий другой(ие) партнер(ы), протекает по поверхности: если молекулы из образца связываются с взаимодействующим веществом, присоединенным к поверхности, изменяется локальная концентрация и измеряется SPR ответ. Указанный ответ прямопропорционален массе молекул, которые связались с поверхностью.

SPR возникает, когда в определенных условиях свет отражается от проводящей пленки на поверхности раздела двух сред с различными показателями преломления. В технологии Biacore средой являются образец и стекло сенсорного чипа, и проводящей пленкой является тонкий слой золота на поверхности чипа. SPR вызывает снижение интенсивности отраженного света при определенном угле отражения. Указанный угол меняется в зависимости от показателя преломления вблизи поверхности на противоположной стороне от отраженного света. Когда молекулы, находящиеся в образце, связываются с сенсорной поверхностью, концентрация и, следовательно, показатель преломления у поверхности изменяются, и детектиуют SPR ответ. Построение графика зависимости ответа от времени в течение взаимодействия представляет количественную меру прогресса взаимодействия. Технология Biacore измеряет минимальную интенсивность угла отраженного света. Свет не поглощается образцом: вместо этого световая энергия рассеивается через SPR в золотой пленке. Значения SPR ответа выражаются в резонансных единицах (RU). Одна RU представляет изменение угла минимальной интенсивности на 0,0001°. Для большинства белков это приблизительно эквивалентно изменению концентрации приблизительно на 1 пг/мм² на сенсорной поверхности. Точный коэффициент перевода RU в концентрацию у поверхности зависит от свойств сенсорной поверхности и природы молекулы, ответственной за изменение концентрации.

Существует ряд других анализов, которые могут определить, способен ли олигонуклеотид или его аналог, пептид, полипептид, олигосахарид или синтетический перарат связываться с аптамером таким образом, что модифицируется взаимодействие с мишенью. Например, анализы задержки электрофоретической подвижности (EMSA), калориметрическое титрование, сцинтилляционные анализы сближения, анализы седиментационного равновесия, использующие аналитическое ультрацентрифугирование (см., например, www.cores.utah.edu/interaction), анализы поляризации флуоресценции, анализы анизотропии флюоресценции, анализы интенсивности флюоресценции, анализы резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET), анализы связывания с нитроцеллюлозным фильтром, ELISA, ELONA (см., например, патент США № 5789163), РИА анализы или анализы равновесного диализа могут использоваться для оценки способности агента связываться с аптамером. Могут быть выполнены прямые анализы, в которых напрямую определяется взаимодействие между агентом и аптамером, или могут быть выполнены анализы по конкуренции или вытеснению, в которых определяется способность агента вытеснять аптамер от его мишени (например, см. Green, Bell и Janjic, Biotechniques 30 (5), 2001, стр. 1094 и патент США № 6306598). Как только идентифицирован кандидатный модулирующий агент, его способность модулировать активность аптамера в отношении его мишени может быть подтверждена в анализах биологической активности. В качестве альтернативы, если идентифицирован агент, который может модулировать взаимодействие аптамера с его мишенью, такие анализы связывания могут быть использованы для проверки того, что агент взаимодействует с аптамером напрямую, и для измерения аффинности указанного взаимодействия.

В другом варианте осуществления для идентификации регулятора, который связывается с аптамером, сайтом(ами) взаимодействия регулятора и аптамера, и относительной аффинности связывания агентов с аптамером может использоваться масс-спектрометрия (см., например, патент США № 6329146, Crooke и другие). Такие масс-спектральные методы также могут быть использованы для скрининга химических смесей или библиотек, в частности комбинаторных библиотек, на индивидуальные соединения, которые связываются с выбранным аптамером-мишенью, которые могут быть использованы в качестве модуляторов аптамера. Кроме того, масс-спектроскопические методы могут использоваться для одновременного скрининга нескольких аптамеров-мишений против, например, комбинаторной библиотеки соединений. Кроме того, масс-спектроскопические методы могут быть использованы для идентификации взаимодействия между несколькими видами молекул, в частности «синтетическими препаратами» и сайтом межмолекулярного взаимодействия в комплексе аптамер-мишень.

In vivo или in vitro анализы, которые оценивают эффективность регулятора в отношении изменения взаимодействия между аптамером и мишенью, являются специфичными для заболевания, которое лечат. Существует широкий спектр стандартных анализов для определения биологических свойств, которые известны и могут быть использованы. Примеры анализов на биологическую активность предоставлены в патентах, процитированных в настоящей заявке, которые описывают определенные аптамеры для конкретных приложений.

Настоящее изобретение также представляет способы для идентификации модуляторов аптамеров. Модуляторы могут быть идентифицированы в общем посредством анализов на связывание, молекулярного моделирования или in vivo, или in vitro анализов, в которых измеряется изменение биологической функции. В одном варианте осуществления связывание модулятора с нуклеиновой кислотой определяют посредством анализа задержки подвижности в геле. В другом варианте осуществления связывание модулятора с аптамером определяют посредством анализа Biacore.

В одном варианте осуществления модулятор обладает способностью, по существу, связываться с аптамером в растворе с концентрацией менее одного (1,0) микромоль (мкМ), предпочтительно менее 0,1 мкМ и более предпочтительно менее 0,01 мкМ. Под "по существу" имеется в виду, что по меньшей мере 50-процентное снижение биологической активности мишени наблюдается посредством модуляции в присутствие мишени, и 50% снижение обозначено здесь как значение IC₅₀.

Фармацевтические композиции

Аптамеры или модуляторы по настоящему изобретению могут быть составлены в фармацевтические композиции, которые могут включать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент. Точная природа композиции будет зависеть, по меньшей мере частично, от природы аптамера и/или модулятора, включая любые стабилизирующие модификации, и пути введения. Как правило, аптамер или модулятор вводят внутривенно, внутримышечно, внутриперитонеально, подкожно, перорально или местно, по необходимости.

Фармацевтически полезные композиции, содержащие аптамер или модулятор по настоящему изобретению, могут быть составлены согласно известным методам, таким как посредством приготовления смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Примеры таких носителей и методов составления могут быть найдены в Remington's Pharmaceutical Sciences. Для составления фармацевтически приемлемой композиции, подходящей для эффективного введения, такие композиции будут содержать эффективное количество аптамера или модулятора. Такие композиции могут содержать смеси более одного соединения.

В способах по настоящему изобретению соединения могут образовать активный ингредиент и, как правило, применяются в смеси с подходящими фармацевтическими разбавителями, эксципиентами или носителями (все вместе обозначаемые здесь как материалы "носителя"), выбранными подходящим образом относительно намеченной формы введения, то есть пероральные таблетки, капсулы, эликсиры, сиропы, свечи, гели и т.п., и согласующимися с обычной фармацевтической практикой.

Для перорального приема в форме таблетки или капсулы активный компонент лекарственного средства может быть объединен с пероральным нетоксичным фармацевтически приемлемым инертным носителем, таким как этанол, глицерин, вода и т.п. Кроме того, при желании или необходимости, подходящие связывающие средства, смазывающие средства, дезинтегрирующие средства и окрашивающие средства могут также быть включены в смесь. Подходящие связывающие средства включают, без ограничения, крахмал, желатин, природные сахара, такие как глюкоза или бета-лактоза, сахаристые вещества из кукурузы, природные и синтетические смолы, такие как камедь, трагакант или альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлоза, полиэтиленгликоль, воск и т.п. Смазывающие средства, используемые в таких лекарственных формах, включают, без ограничения, олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия и т.п. Дезинтегрирующие средства включают, без ограничения, крахмал, метилцеллюлозу, агар-агар, бентонит, ксантановую камедь и т.п.

В случае жидких форм активный компонент лекарственного средства может быть объединен с подходящими ароматизированными суспендирующими или диспергирующими средствами, такими как синтетическая и природная камеди, например трагакант, камедь, метилцеллюлоза и т.п. Другие диспергирующие средства, которые могут быть использованы, включают глицерин и т.п. Для парентерального введения желательны стерильные суспензии и растворы. Изотонические композиции, которые, как правило, содержат подходящие консервирующие средства, используются, если желательно внутривенное введение.

Композиции для местного применения, содержащие активный компонент лекарственного средства, могут быть смешаны с разнообразными материалами-носителями, известными в данной области техники, такими как, например, спирты, гель с алоэ, аллантоин, глицерин, масла с витаминами А и E, минеральное масло, PPG2 миристил пропионат и т.п., для получения, например, спиртовых растворов, дезинфицирующих средств для местного применения, дезинфицирующих кремов, гелей для кожи, лосьонов для кожи и шампуней в композициях на основе геля или крема.

Соединения по настоящему изобретению могут также применяться в форме липосомных систем доставки, например, малых однослойных везикул, больших однослойных везикул и многослойных везикул. Липосомы могут быть составлены из разнообразных фосфолипидов, таких как холестерин, стеариламин или фосфатидилхолины.

Соединения по настоящему изобретению могут быть также объединены с растворимыми полимерами в качестве наводимых носителей лекарственного средства. Такие полимеры могут включать поливинилпирролидон, пиран сополимер, полигидроксипропилметакриламидфенол, полигидроксиэтиласпартамидфенол или полиэтиленоксидполилизин, замещенный остатками пальмитоила. Кроме того, соединения по настоящему изобретению могут быть соединены (предпочтительно через ковалентную связь) с полимером из класса биодеградируемых полимеров, полезных для достижении контролируемого высвобождения лекарственного средства, например полиэтиленгликолем (ПЭГ), полимолочной кислотой, полиэпсилонкапролактоном, полигидроксимасляной кислотой, полиортоэфирами, полиацеталями, полидигидропиранами, полицианоакрилатами и поперечносшитыми или амфифильными блок-сополимерами гидрогелей. Холестерин и подобные молекулы могут быть связаны с аптамерами для увеличения и пролонгирования биодоступности.

Соединения могут применяться напрямую (например, самостоятельно или в липосомальной композиции или в комплексе с носителем (например, ПЭГ)) (см., например, патент США № 6147204, патент США № 6011020). В одном варианте осуществления разнообразные модуляторы могут быть связаны с единственной молекулой ПЭГ. Модулятор может быть предназначен для одного или различных аптамеров. В тех вариантах осуществления, в которых применяются различные модуляторы к одному аптамеру, происходит увеличение авидности в силу множественных взаимодействий связывания с аптамером. В дополнительном варианте осуществления несколько молекул ПЭГ могут быть присоединены друг к другу. В указанном варианте осуществления один или более модуляторов к одному аптамеру или различным аптамерам могут быть связаны с каждой молекулой ПЭГ. Это также приводит к увеличению авидности каждого модулятора к своей мишени.

Липофильные соединения и неиммуногенные высокомолекулярные соединения, с которыми могут быть составлены модуляторы по настоящему изобретению для применения по настоящему изобретению и могут быть получены посредством любого из различных методов, теперь известных в области техники, или впоследствии разработанных. Как правило, их получают из фосфолипида, например дистеароилфосфатидилхолина, и они могут включать другие материалы, такие как нейтральные липиды, например холестерин, и также модификаторы поверхности, такие как положительно заряженные (например, стериламин или аминоманноза или производные соединения аминоманнитола холестерина) или отрицательно заряженные (например, диацетилфосфат, фосфатидилглицерол) соединения. Многослойные липосомы могут быть составлены посредством общепринятых методик, то есть посредством осаждения выбранного липида на внутренней стенке подходящего контейнера или сосуда посредством растворения липида в подходящем растворителе, и затем испарения растворителя для получения тонкой пленки на внутренней поверхности сосуда или посредством сушки распылением. Затем в сосуд добавляют водную фазу с закручивающим или интенсивно перемешивающим движением, что приводит к образованию MLV. UV могут быть далее получены посредством гомогенизации, обработки ультразвуком или продавливания (через фильтры) MLV. Кроме того, UV можно получить посредством методик удаления детергента. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения комплекс включает липосому с нацеленным(и) аптамером(ами), связанным(и) с поверхностью липосомы и инкапсулированным терапевтическим или диагностическим средством. Предсформированные липосомы могут быть модифицированы для связывания с аптамерами. Например, катионная липосома связывается с нуклеиновой кислотой посредством электростатических взаимодействий. В качестве альтернативы, нуклеиновая кислота, присоединенная к липофильному соединению, такому как холестерин, может быть добавлена к предсформированным липосомам, при этом холестерин становится связанным с липосомальной мембраной. В качестве альтернативы, нуклеиновая кислота может связаться с липосомой во время составления липосомы.

Способы введения

Предпочтительными путями введения средств по настоящему изобретению в организм млекопитающего являются парентеральный, внутривенный, внутрикожный, внутрисуставный, внутрисиновиальный, интратекальный, внутриартериальный, внутрисердечный, внутримышечный, подкожный, внутриорбитальный, интракапсулярный, интраспинальный, интрастернальный, местный, трансдермальный пластырь, посредством ректального, влагалищного или уретрального суппозитория, перитонеальный, чрескожный, носовой распылитель, хирургический имплант, посредством внутреннего хирургического нанесения на ткань, посредством инфузомата или через катетер. В одном варианте осуществления средство и носитель вводятся в композиции для медленного высвобождения, такой как имплант, болюс, микрочастица, микросфера, наночастица или наносфера. Для стандартной информации относительно фармацевтических композиций см. Ansel, и др., Pharmaceutical dosage Forms and Drug Delivery Systems, Sixth Edition, Williams & Wilkins (1995).

Аптамеры или модуляторы по настоящему изобретению могут применяться парентерально посредством инъекции или посредством длительной инфузии. Хотя к ткани, которую предстоит лечить, можно, как правило, получить доступ в организме посредством системного введения, и поэтому чаще всего лечение проводится посредством внутривенного введения терапевтических композиций, представлены другие ткани и методики доставки, где существует вероятность того, что ткань-мишень содержит молекулу-мишень.

Таким образом, аптамеры и модуляторы по настоящему изобретению, как правило, применяются перорально, местно к сосудистой ткани, внутривенно, интраперитонеально, внутримышечно, подкожно, внутрь полости, трансдермально, и могут быть доставлены посредством перистальтических методов. Как отмечено выше, фармацевтические композиции могут быть введены пациенту разнообразными путями, например перорально, местно к сосудистой ткани, внутривенно, интраперитонеально, внутримышечно, подкожно, внутрь полости, трансдермально, и могут быть доставлены посредством перистальтических методов. Репрезентативные неограничивающие подходы для местного введения к сосудистой ткани включают (1) покрытие или пропитывание ткани кровеносного сосуда гелем, содержащим лиганд нуклеиновой кислоты, для доставки in vivo, например, посредством внедрения покрытого или пропитанного сосуда вместо поврежденного или патологически измененного сегмента сосудистой ткани, который был удален или обойден; (2) доставка через катетер к сосуду, к которому желательна доставка; (3) закачивание композиции нуклеиновой кислоты-лиганда в сосуд, который должен быть имплантирован пациенту. В качестве альтернативы, нуклеиновая кислота-лиганд может быть введена в клетки посредством микроинъекции или посредством инкапсулирования липосом. Преимущественно, нуклеиновые кислоты-лиганды по настоящему изобретению могут применяться в однократной суточной дозе, или общая суточная дозировка может вводиться несколькими отдельными дозами. Соответственно, модулятор представлен посредством любого подходящего средства для изменения эффекта нуклеиновой кислоты-лиганда путем введения модулятора.

Терапевтические композиции, содержащие модуляторы полипептидов по настоящему изобретению, традиционно вводятся внутривенно, например, посредством инъекции единичной дозы. Термин "единичная доза" при применении в ссылке на терапевтическую композицию по настоящему изобретению относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве унитарных дозировок субъекту, причем каждая единица содержит предопределенное количество активного вещества, которое было подобрано с целью достижения желательного терапевтического эффекта, находясь в необходимом разбавителе, то есть носителе или среде.

Композиции вводятся таким способом, который совместим с лекарственной композицией, и в терапевтически эффективном количестве, как описано в настоящем описании. Подходящие режимы введения являются вариабельными, но в общем виде представляют первое введение, за которым следуют повторные дозы через интервалы в один или более часов в виде последующей инъекции или посредством другого пути введения. В качестве альтернативы рассматривается непрерывная внутривенная инфузия, которая является достаточной для поддержания концентрации в крови в диапазонах, определенных для in vivo методов лечения.

В рамках настоящего описания термины "фармацевтически приемлемый", "физиологически переносимый" и их грамматические вариации, поскольку они относятся к композициям, носителям, разбавителям и реактивам, используются как взаимозаменяемые и представляют, что материалы могут быть введены без существенных или изнуряющих токсичных побочных эффектов.

Фармацевтически полезные композиции, содержащие модулятор по настоящему изобретению, могут быть составлены согласно известным способам, таким как посредством смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Примеры таких носителей и способов составления могут быть найдены в Remington's Pharmaceutical Sciences. Для получения фармацевтически приемлемой композиции, подходящей для эффективного введения, такие композиции должны содержать эффективное количество аптамера. Такие композиции могут содержать смеси более одного модулятора.

ПРИМЕРЫ

Способы измерения свертывающей активности

Стандартные показатели свертывания включают анализы основанного на плазме протромбинового времени (ПВ) и активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) как в плазме, так и в цельной крови, и анализ основанного на цельной крови времени активного свертывания крови (ВАС). В то время, как активаторы, используемые для запуска свертывания в каждом из указанных анализов, различны, все они имеют общую характеристику - образование сгустка является конечной точкой анализа. Важно, что в указанных in vitro анализах для образования достаточного количества фибрина, необходимого для достижения конечной точки, достаточны низкие уровни тромбина, ~10-30 нМ. Указанный уровень тромбина представляет превращение только 3-5% протромбина в тромбин и сопоставим с количеством тромбина, производимого во время инициирующей фазы реакции свертывания (Butenas и др., 2003; Mann и др., 2003). Таким образом, указанные анализы сообщают в значительной степени об инициирующей фазе реакции свертывания и не полностью отражают значение недостаточности или ингибирования факторов свертывания крови, прежде всего вовлеченных в фазу распространения свертывания.

Способ, в котором стандартные основанные на свертывании анализы отражают активность FIX/IXa, иллюстрируется посредством их способности детектировать или не детектировать патологические показатели свертывания у пациента с тяжелой гемофилией А (недостаточность FVIII) или B (недостаточность FIX). Признаком гемофилии является изолированное удлинение АЧТВ, поскольку у пациента с гемофилией патологические АЧТВ, но нормальные ПВ (Bolton-Maggs и Pasi, 2003). Клеточная модель свертывания объясняет парадокс относительно того, почему у пациентов с недостаточностью FVIII или FIX определяют нормальные PT. Анализ ПВ начинают со сверхфизиологических уровней тканевого фактора, достаточных для того, чтобы привести к образованию сгустка через 11-15 секунд. Поэтому высокие уровни комплекса тканевой фактор-FVIIa, используемого для инициации реакции, быстро приводят к образованию FXa в количестве, которое достаточно для получения достаточного количества тромбина, чтобы достигнуть образования сгустка в качестве конечной точки, даже в отсутствие FVIII или FIX. Таким образом, даже существенное ингибирование активности FIX/FIXa не скажется на значении анализа ПВ, поскольку роль FIX в инициировании свертывания в указанном анализе маскируется или обходится. Таким образом, фармакологические ингибиторы FIXa, такие как анти-FIXa аптамер RB006, как ожидают, не увеличат значения ПВ.

Оба анализа АЧТВ плазмы или цельной крови запускаются заряженным участником, таким как целит или каолин, поверхностью фосфолипида и кальцием в количествах, достаточных для образования сгустка через ~28-35 секунд. У пациентов с гемофилией B (и A) регистрируют патологические значения АЧТВ; однако, величина увеличения АЧТВ у указанных пациентов конечна (то есть является ограниченным значением), поскольку в анализе в значительной степени определяется инициирующая фаза свертывания. Не существует строгой корреляции между тяжестью гемофилии B у пациента и значением его АЧТВ, поскольку АЧТВ зависит от других факторов свертывания крови в дополнение к FIX. Поэтому лучшим критерием для интерпретации, каким образом фармакологическое ингибирование FIXa скажется при проведении анализа АЧТВ, является анализ FIX плазмы. Анализ FIX плазмы является вариацией стандартного метода АЧТВ, в котором перед выполнением АЧТВ тестируемую плазму разбавляют в буфере и смешивают с FIX-дефицитной плазмой таким образом, что уровень FIX в тестируемой плазме является первичной детерминантой времени образования сгустка. Указанный анализ, как правило, используют для определения тяжести гемофилии B (то есть для определения уровней FIX), или диагностики приобретенных ингибиторов FIX. Результаты анализа FIX интерпретируют посредством сравнения времени образования сгустка в тестируемом образце со стандартной кривой FIX-уровня, который получают путем серийного разведения нормальной плазмы в буфере перед смешиванием с FIX-дефицитной плазмой. В таблице 1 представлена типичная стандартная кривая уровня FIX, полученная для нормальной человеческой плазмы. [Обратите внимание: Абсолютные времена АЧТВ в указанном анализе зависят от реактивов]. Как видно из таблицы 1, при уровнях FIX, составляющих 25% от нормального (то есть снижение на 75%), АЧТВ времена образования сгустка превышают норму в 1,4 раза. При уровнях FIX, составляющих ~3% от нормы (то есть снижение на 97%), АЧТВ времена образования сгустка превышают норму в 2 раза и при FIX уровнях, составляющих <1% от нормального (то есть снижение >99%), АЧТВ времена образования сгустка превышают норму в 2,5 раза. У носителей гемофилии B (то есть уровни FIX ~50% от нормы) определяют нормальные значения АЧТВ (Bolton-Maggs и Pasi, 2003), что согласуется с данными стандартной кривой уровня FIX. В совокупности полученные наблюдения указывают на то, что значительный процент активности FIX должен быть заингибирован прежде, чем будет удлиняться АЧТВ.

Таблица 1 Стандартная кривая анализа активности FIX в плазме человека
% уровня FIX	Время образования свертка по АЧТВ	Коэффициент превышения времени образования свертка
100*	48,0	1,0
50	58,6	1,2
25	65,4	1,4
12,5	75,1	1,6
6,25	85,1	1,8
3,13	97,0	2,0
1,56	105,8	2,2
0,78	119,7	2,5
*100% уровень FIX представляет разведение нормальной объединенной человеческой плазмы в буфере 1:5

Поскольку анализы ВАС используются прежде всего в операционных и лабораториях, в которых выполняют катетеризацию, с целью контроля антикоагуляции во время вмешательств, существует незначительное количество данных относительно того, какое влияние на ВАС оказывает снижение активности FIX/FIXa, поскольку пациентов с гемофилией, как правило, лечат заместительной терапией фактором (или подобной терапией) перед прохождением таких процедур. Однако, поскольку ВАС является анализом, конченой точкой которого является образование сгустка крови, который запускается заряженными частицами, то эффект фармакологического ингибирования FIXa в ВАС анализе вероятно является отображением такового, который наблюдают в анализе АЧТВ. Таким образом, ожидается, что удлинение ВАС не будет наблюдаться, пока не достигнута существенная степень ингибирования FIXa (>50%). Следовательно, по аналогии с анализом АЧТВ, величина удлинения ВАС, вероятно, будет скромна по сравнению с удлинением, наблюдаемым с нефракционированным гепарином. Наконец, в ответ на ингибирование FIXa анализ, вероятно, достигнет насыщения. Такое подобие в реакциях АЧТВ и ВАС было продемонстрировано на обезьянах, которых лечили различными дозами RB006 в неклинических исследованиях токсичности.

Эффекты противосвертывающей системы REG1 на показатели свертываемости

Предыдущие данные показывают, что анти-FIXa аптамеры не удлиняют ПВ как in vitro, так и после внутривенного введения животным (Rusconi и др., 2004, Nat Biotechnol. 22 (11):1423-8; Rusconi и др., 2002, Nature 419 (6902):90-4; Dyke, 2006, Circulation.114 (23):2490-7). Как показано на фиг.3, RB006 проявляет дозозависимое увеличение АЧТВ в объединенной нормальной человеческой плазме in vitro. Полученные данные указывают на то, что для RB006 АЧТВ кривая доза-ответ является самой чувствительной от 0 до 30-50 мкг/мл, и затем выходит на плато. Указанные особенности, включая фазу повышения и фазу плато АЧТВ кривой дозы-ответа согласуются в плазмах от всех видов, в которых RB006 или предшествующие анти-FIX аптамеры проявляют перекрестную реактивность, включая человека, свинью, мышь и обезьяну (Rusconi и др., 2004, Nat Biotechnol. 22 (11):1423-8). Максимальное значение АЧТВ, достигнутое в ответ на обработку плазмы in vitro анти-FIXa аптамером, зависит от используемого АЧТВ реагента и вида. Важно, однако, что указанный максимум АЧТВ согласуется с полным или почти полным ингибированием активности FIXa. Это подтверждается тем фактом, что максимальное значение АЧТВ в ответ на анти-FIXa аптамер эквивалентно АЧТВ в человеческой плазме, содержащей уровень FIX <1% от нормы (но нормальный в отношении уровней всех других факторов свертывания крови), и АЧТВ в плазме FIX-нокаутных мышей Rusconi и др., 2004, Nat Biotechnol. 22 (11):1423-8). Таким образом, плато АЧТВ в ответ на RB006 вероятно отражает насыщение ингибирования FIX/FIXa аптамером.

Кроме того, сравнение данных на фиг.3 со стандартной кривой анализа FIX плазмы в таблице 1 представляет понимание активности RB006. АЧТВ увеличивается в ~1,4 раза в ответ на RB006 при концентрации RB006 ~5 мкг/мл, указывая, что данная концентрация RB006 достаточна для ингибирования активности FIX плазмы на ~75%. Кроме того, основываясь на анализе FIX плазмы, почти 95% ингибирование FIX плазмы (2,0-кратное увеличение АЧТВ) достигается при концентрации RB006 от 10 до 15 мкг/мл.

Для оценки индивидуальной вариабельности эффекта противосвертывающего средства RB006 были проведены in vitro исследования посредством измерения зависимого от концентрации RB006 удлинения АЧТВ в плазме пациентов. Сравнение in vitro RB006 АЧТВ кривой доза-ответ в объединенной нормальной человеческой плазме против плазмы от пациентов представлено на фиг.4.

Как показано на фиг.4, зависимое от концентрации увеличение RB006 АЧТВ очень похоже для плазмы каждого субъекта. Кроме того, зависимое от концентрации увеличение RB006 АЧТВ в плазме пациентов очень похоже на таковое в объединенной нормальной человеческой плазме (20 доноров в пуле). RB006 также увеличивает время свертывания крови по измерению в анализе ВАС (Rusconi и др., 2004, Nat Biotechnol. 22 (11):1423-8). Однако интерпретация изменения ВАС как функции концентрации RB006 в настоящее время ограничена из-за трудности выполнения in vitro исследований доза-ответ с ВАС, поскольку указанный анализ требует свежей цельной крови, и чувствителен ко времени.

Нейтрализацию противосвертывающей активности RB006 антидотом RB007 измеряли in vitro, используя анализ АЧТВ. Как показано на фиг.5, поскольку концентрация RB007 увеличена относительно фиксированной концентрации RB006 в объединенной человеческой плазме, изменение в значении АЧТВ возвращается к начальным уровням, свидетельствуя о полной нейтрализации противосвертывающей активности посредством RB007. Минимальный молярный избыток RB007, который необходим для полной нейтрализации RB006 in vitro в человеческой плазме, составляет приблизительно от 3- до 4-кратного (т.е. молярное отношение антидота к олигонуклеотидной части аптамера). Это согласуется с измеренной термодинамической стабильностью дуплекса RB006-RB007 (T_пл.~90°C).

Данные, представленные на фиг.5, также служат основанием для выбора отношения дозы антидота RB007 к дозе лекарственного средства RB006, используемого в неклиническом фармакологическом исследовании безопасности и исследованиях токсичности и клинических испытаниях. Минимальный молярный избыток RB007 относительно RB006, который необходим для достижения полной нейтрализации RB006 in vitro в человеческой плазме, составляет от 3- до 4-кратного. Учитывая разность в молекулярном весе RB007 (5269 Да, соль натрия) и RB006 (~50964 Да, соль натрия), это преобразовывается в весовое соотношение антидот:лекарственное средство 0,5:1. Поскольку это является результатом in vitro и поэтому не предсказывает, каким образом фармакокинетика любого из компонентов будет влиять на нейтрализацию лекарственного средства in vivo, весовое соотношение антидот:лекартсвенное средство 0,5:1 отражает минимальное отношение антидота, который, как ожидается, эффективно нейтрализовал бы лекарственное средство. Поэтому в качестве начальной дозировки в неклинических и клинических исследованиях было выбрано небольшое кратное минимальному соотношению эффективной дозы in vitro, весовое соотношение антдот:лекарственное средство 2:1.

Суммируя указанное выше, анти-FIXa аптамер RB006 является мощным ингибитором фактора свертывания FIXa, способным к полному или почти полному ингибированию активности FIXa in vitro. Противосвертывающая активность RB006 так же, как и нейтрализация активности аптамера посредством RB007, может быть эффективно проконтролирована посредством анализов АЧТВ и ВАС. Из in vitro исследований соотношения между процентом ингибирования FIX и изменениями в АЧТВ были хорошо определены для RB006. Соответствующее молярное отношение антидота к аптамеру, достаточное для достижения полного ингибирования активности аптамера, было также определено в in vitro исследованиях, из которых было выведено отношение дозы мг/кг антидот:аптамер 2:1, выбранное для противосвертывающей системы REG1.

Неклиническая фармакология, распределение лекарственного средства и токсичность

Фармакологическая активность противосвертывающей системы REG1 и ее индивидуальных компонентов, лекарственного средства и антидота (или менее активные прототипы лекарственного средства и антидота, названные RB002 и RB004 соответственно), была продемонстрирована in vitro и в клинически значимых моделях животных.

Противосвертывающую активность анти-FIXa аптамера оценивали в системных исследованиях антикоагуляции на свиньях (Rusconi и др., 2004, Nat Biotechnol. 22 (11):1423-8), в моделях экстрапульмонального кровообращения на овцах и в фармакологическом исследовании безопасности на яванских макаках. Антитромботическая активность анти-FIXa аптамера была также продемонстрирована в модели повреждения артерии на мышах (Rusconi и др., 2004, Nat Biotechnol. 22 (11):1423-8). Нейтрализующая активность антидота в отношении лекарственного средства была продемонстрирована in vitro в человеческой плазме (Rusconi и др., 2002, Nature 419 (6902):90-4), в системные модели антикоагуляции на свиньях, в моделях хирургической травмы на мышах (то есть пересечение хвоста у животных на фоне выраженной антикоагуляции) (Rusconi и др., 2004, Nat Biotechnol. 22 (11):1423-8), в моделях экстрапульмонального кровообращения на овцах и в фармакологическом исследовании безопасности на яванских макаках. Кроме того, в исследованиях системной антикоагуляции на свиньях была продемонстрирована способность лекарственного средства к повторному введению вскоре после нейтрализации антидотом предшествующей дозы лекарственного средства.

Характеристика фармакокинетики противосвертывающей системы REG1 нуждалась в биоаналитической стратегии, которая полагалась на новую методологию количественного определения уровней аптамера, антидота и комплекса аптамер/антидот в образцах плазмы. Указанные методы были применены к образцам, собранным после in vivo исследований токсичности, которые допускали определение фармакокинетик всех трех молекулярных составляющих в условия однократного и многократного дозирования на обезьянах и мышах.

Было проведено всестороннее исследование безопасности противосвертывающей системы REG1. Первичные исследования токсичности были выполнены на обезьянах и мышах в условиях дозирования, которые моделировали намеченное применение средства в начальных клинических испытаниях (то есть с последовательным введением аптамера, через 3 часа после которого вводили антидот). Были протестированы клинически кратные дозировки каждого компонента от меньших к большим в том же самом соотношении доз, которое предназначено для клинического применения, и для обоих видов эффекты аптамера и антидота были проверены отдельно. В обоих исследованиях на обезьянах было сформировано несколько групп лечения, которые получали однократные дозы аптамера, антидота или обе тестируемые позиции по схеме, которая имитировала намеченное введение в начальных клинических испытаниях. Кроме того, в 14-дневное исследование на мышах и в однократное и многократное исследования токсичности на обезьянах были включены группы, которым вводили повторные дозы в течение двух недель (14 суточных доз для мышей и 7 доз, вводимых через день в течение двух недель, для обезьян). Специализированные конечные точки были включены в исследования токсичности для оценки фармакодинамических ответов, экспозиции к компонентам REG1 и эффектов олигонуклеотидов как класса соединений. Основные исследования токсичности были дополнены оценкой фармакологической безопасности на обезьянах (используя радиотелеметрию), списком генетических анализов токсичности и исследованием на совместимость крови.

Исследования противосвертывающей и нейтрализующей лекарственное средство активности на свиньях

Возможность повторно вводить аптамер RB006 после нейтрализации антидотом RB007 начальной дозы аптамера оценивали в модели системной антикоагуляции на свиньях. В указанный исследованиях вторую дозу лекарственного средства вводили через 30 минут после введения антидота. 30-минутное окно между введением антидота и повторным введением аптамера было выбрано для того, чтобы получить ясную экспериментальную демонстрацию нейтрализации противосвертывающей активности первой дозы аптамера. Как показано на фиг.6, пик противосвертывающей активности и время достижения пика противосвертывающей активности после второй дозы аптамера были по существу одинаковыми для начальной дозы аптамера, что свидетельствует о том, что повторное введение аптамера после нейтрализации антидотом первой дозы аптамера выполнимо. Полученные данные согласуются с наблюдаемой фармакокинетикой RB007 и у мышей, и у обезьян, которые указывают на то, что RB007 обладает очень коротким временем полужизни в плазме (то есть несколько минут) и не накапливается в плазме до детектируемой концентрации даже при существенно более высоких дозах, чем используемые в настоящем исследовании. Учитывая период полужизни антидота, вероятно, что аптамер можно эффективно повторно вводить через более короткий интервал времени, чем 30 минут после введения антидота.

Эффективность противосвертывающей системы REG1 при аорто-коронарном шунтировании (АКШ) с экстрапульмональным кровообращением на овцах

REG1 можно использовать в качестве обратимого антидота противосвертывающего средства при вмешательствах по реваскуляризации коронарного русла [аорто-коронарное шунтирование (АКШ) и чрескожное вмешательство на сердце (PCI)] в качестве обратимого антидота противосвертывающего средства для применения у больных, включая людей, с острыми коронарными синдромами, и в качестве противосвертывающего средства при других показаниях, при которых было бы выгодно применять обратимый антидот для антитромботической или противосвертывающей терапии. Исследования, описанные в настоящей заявке, предназначены для определения диапазона доз противосвертывающего компонента REG1, RB006, необходимого для поддержания экстрапульмонального шунта (CPB) в раскрытом состоянии у животного, которому выполняют операцию АКШ с CPB, и определение соответствующей дозы антидотного компонента REG1, RB007, необходимого для нейтрализации RB006 в настоящей модели.

RB006 (противосвертывающее средство) внутривенно вводили 10 овцам в начале операции аорто-коронарного шунтирования. В конце операции внутривенно вводили RB007 (средство, нейтрализирующее RB006) для полной нейтрализации эффектов RB006. После 28±3 дней всех животных усыпляли.

Собирали репрезентативные образцы правой и левой почек, печени, легкого и всего головного мозга. Сердца промывали струей раствора Рингера с лактатом или физиологическим солевым раствором до очищения от крови и фиксировали методом перфузии под давлением при ~100 мм рт.ст. 10% нейтральным забуференным формалином (NBF) в течение по меньшей мере 6 часов. После завершения фиксации, сердца помещали в 10% NBF. Репрезентативные образцы ткани, собранные во время аутопсии, фиксировали иммерсией 10% NBF.

Сердца рассекали поперек приблизительно через каждый 1 см (как буханку хлеба) и исследовали на предмет патологических изменений. По десять срезов каждого сердца собирали и заливали в парафин. Три из десяти секций включали: анастомоз LCX, аортальный анастомоз и середина трансплантата. Остальные семь секций включали: стенка правого предсердия, стенка левого предсердия, межпредсердная перегородка, собственно стенка правого желудочка, собственно стенка левого желудочка, межжелудочковая перегородка и верхушка. Все парафиновые блоки, содержащие ткань миокарда, разрезали на две части, одну - для окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) и другую - для окрашивания по Masson's Verhoeff Elastin (MVE). Образцы почек, печени, легкого и головного мозга заливали в парафин и разрезали следующим образом: один срез каждой почки, один срез печени, один срез легкого и один срез каждого из четырех образцов ткани мозга, в общей сложности восемь срезов. Все полученные микропрепараты окрашивали H&E.

Корреляции между макроскопическими и гистологическими наблюдениями в настоящем исследовании указывают на то, что большинство патологических изменений относятся либо к хирургической процедуре (например, спайки), или эвтаназии (например, пена в трахее и бронхах). Спайки являются распространенными последствиями указанного типа процедур, и в настоящем исследовании не были расценены как чрезмерные.

У одного животного был обнаружен маленький, минимально присоединенный тромб в аортальном анастомозе. Тромб, как кажется, не затруднял ток крови в трансплантате. Никаких характерных микроскопических признаков, свидетельствующих об этом, не было. Данные микроскопии в месте анастомоза были сходны по типу и амплитуде с таковыми для других экспериментальных животных в обеих группах. С одним исключением: никакого макроскопического признака тромбоза или окклюзии в пределах любой части шунта коронарной артерии не было ни у одного экспериментального животного. Случайное образование тромба весьма обычно в указанной модели; следовательно, связь с введением RB006 расценивается как сомнительная.

Фармакодинамическая активность противосвертывающей системы REG1 у яванских макак

In vitro противосвертывающая активность RB006 в плазме яванских макак отражена как зависимое от концентрации удлинение времени образования сгустка в анализе АЧТВ. Как может быть замечено на фиг.7, RB006 АЧТВ кривая доза-ответ является самой чувствительной в интервале от 0 до 50 мкг/мл, и затем выходит на плато, как было отмечено и для других видов. Кривые доза-ответ для обезьяны и человека подобны за исключением того, что диапазон реакции у людей больше. В плазме человека наблюдается зависимое от концентрации увеличение АЧТВ до приблизительно 200 мкг/мл, тогда как в плазме обезьяны кривая концентрация-ответ достигает плато при приблизительно 50 мкг/мл. Плато кривой для плазмы человека достигается при значении АЧТВ, которое эквивалентно определяемому для плазмы человека, содержащей <1% активности FIX в плазме, и вероятно происходит из-за насыщения мишени, FIXa. Анализы FIX плазмы проводили для облегчения в интерпретации RB006 АЧТВ кривой доза-ответ для плазмы обезьяны. Как показано в таблице 2, АЧТВ в плазме обезьяны чувствительно к уровню FIX. Однако величина ответа на снижение уровня FIX невелика. 75%-ное снижение уровня FIX приводит к 1,4-кратному увеличению АЧТВ, a >95%-ное снижение уровня FIX приводит к удвоению АЧТВ, и снижение уровня FIX на 99,9% в плазме приводит к 2,5-кратному увеличению АЧТВ.

Таблица 2 Стандартная кривая анализа активности FIX в плазме яванских макак
% уровня FIX	АЧТВ время свертывания	Коэффициент увеличения времени свертывания
100*	35,1	1,0
50	41,9	1,2
25	49,4	1,4
12,5	55,9	1,6
6,25	62,2	1,8
3,13	68,0	1,9
1,56	74,7	2,1
0,78	77,7	2,2
0,39	83,8	2,4
0,098	88,1	2,5
*100% уровень FIX представляет 1:5 разведение нормальной объединенной плазмы явянских макак в буфере. В качестве источника FIX-дефицитной плазмы использовали FIX-дефицитную плазму человека (George King Biomedical).

Сравнение данных на фиг.7 с данными, представленными в таблице 2, указывает, что ~6 мкг/мл RB006 необходимо для ингибирования приблизительно 90% активности FIX плазмы у обезьян (то есть при указанной концентрации происходит 1,6-кратное увеличение АЧТВ), и что >95% ингибирование активности FIX плазмы происходит при концентрациях RB006 10-12 мкг/мл. In vitro RB006 АЧТВ кривая доза-ответ плазмы обезьян выходит на плато при приблизительно 2,5-кратном увеличении от исходного значения (исходное значение ~24 секунды, максимальное значение АЧТВ ~60 секунд), что согласуется с амплитудой увеличения АЧТВ, наблюдаемого в анализе FIX плазмы при уровне FIX <0,1% от нормального уровня FIX (см. таблицу 2). Следовательно, плато для RB006 АЧТВ кривой доза-ответ вероятно представляет насыщение мишени в плазме обезьяны (то есть полное ингибирование активности FIX). В заключение, % ингибирования FIX против концентрации RB006 в плазме обезьяны in vitro в общем виде сходно с наблюдаемым in vitro в плазме человека, причем основные отличия заключаются в том, что диапазон концентрации RB006 от начального до максимального АЧТВ у людей шире, и подъем доза-ответ является более сглаженным для плазмы человека, чем для плазмы обезьяны.

In vivo активность RB006 и RB007 для яванских макак

Связь между противосвертывающими свойствами RB006 и комплекса RB006/RB007 и уровнями указанных соединений в плазме оценивали в фармакологическом исследовании безопасности REG1-TOX001 на обезьянах. Кратко, 12 обезьян распределяли на три группы лечения. Группа 1 получала анти-FIXa аптамер RB006, группа 2 получала антидот RB006, RB007, и группе 3 вводили противосвертывающую систему REG1, то есть RB006, после которого - RB007 (через три часа). Дозы увеличивали в два раза, причем первую дозу вводили в день 4 исследования, и вторую дозу вводили в день 13. Чтобы лучше понять зависимость доза-ответ для RB006, четырех обезьян, зачисленных в группу 1 (RB006, только аптамер), распределяли на две группы на день 13, где два животных получали низкую дозу (группа 1a, 5 мг/кг RB006) и два животных получали высокую дозу (группа 1b, 30 мг/кг RB006).

Как показано на фиг.8, введение RB006 в дозах в интервале от 5 до 30 мг/кг приводило к выраженной антикоагуляции у обезьян. Среднее значение АЧТВ для каждого уровня дозы превышало 60 секунд в течение от 0,25 до 24 часов после введения RB006, что эквивалентно уровню FIX плазмы у обезьян <0,1% от нормального. В ответ на введение RB006 происходит дозозависимое увеличение АЧТВ.

Однако зависимость доза-ответ не сразу очевидна вследствие того, что вплоть до 6-часового отрезка времени после введения RB006 уровень RB006 в плазме превышает концентрацию, при которой in vitro АЧТВ кривая доза-ответ достигает плато (~40-50 мкг/мл; см. таблицу 3 и фиг.7). В моменты времени, выходящие за 6 часов после введения RB006, когда концентрация RB006 сокращается ниже указанного уровня, зависимость доза-ответ более очевидна. АЧТВ у обезьян, получающих дозы RB006 5 и 15 мг/кг, определяли, пока оно не возвратилось к исходному значению. Среднее значение АЧТВ возвращалось к исходному уровню через 120 часов при уровне дозы 5 мг/кг и через 192 часа при уровне дозы 15 мг/кг, что согласуется и с in vitro АЧТВ кривой доза-ответ (фиг.7), и с наблюдаемым периодом полужизни, составляющим для RB006 в обезьянах приблизительно 12 часов (см. таблицу 3). Данные времени активного свертывания (ВАС) цельной крови отражали данные АЧТВ (данные не показаны).

Данные токсикокинетики собирали при нескольких временных точках в течение первых 24 часов после введения RB006, используя анализ ELISA с гибридизацией двойных олигомеров. Как показано в таблице 3, концентрация RB006 возрастала как функция вводимой дозы, и период полужизни RB006 находился в 12-часовом диапазоне. Согласуясь с данными, представленными на фиг.8, сравнение уровней RB006 в плазме (таблица 3) с in vitro кривой доза-ответ, представленной на фиг.7, указывает на то, что животные пребывали в состоянии глубокой антикоагуляции в течение первых 24 часов после введения RB006 при всех уровнях доз. Указанные уровни доз значительно превосходят предложенный клинический диапазон. Существует превосходное соответствие между средним значением концентрации RB006 через 24 часа после введения у животных в группе 1а и средним значением АЧТВ у данных животных. Средняя концентрация RB006 у животных, которые получали 5 мг/кг RB006 через 24 часа, составляла 15,9 мкг/мл, и среднее значение АЧТВ составляло 61,1 секунды. Это очень благоприятно сочетается с ожидаемым результатом, основанным на in vitro кривой доза-ответ RB006 у обезьян (см. фиг.7). Поэтому настоящее исследование подтверждает практическую значимость АЧТВ для мониторирования уровня антикоагуляции у обезьян, которые получали RB006, и полученные данные выступают в поддержку применения АЧТВ для мониторирования состояния антикоагуляции у людей, получающих RB006 в начальных клинических исследованиях.

Таблица 3 Уровни RB006 в плазме у животных группы 1, REG1-TOX001 (мкг/мл)
Время после инъекции (часы)	Уровни доз в группе 1 (животные/уровень дозы)
5 мг/кг (n=2)*	15 мг/кг (n=4)	30 мг/кг (n=2)*
Перед введением	0,2	<0,04	0,2
0,25	59,8	179,8±28,9	465,5
3	66,6	145,6±32,5	328,9
6	42,1	101,5±13,4	275,3
24	15,9	51,1±11,2	164,6
*На 13 день эксперимента животных разделяли на группы 1а (5 мг/кг) и 1b (30 мг/кг). Для указанных уровней доз представлен средний уровень в плазме двух животных на уровень доз. RB006 у животных групп 1а и 1b на момент времени перед введением является остаточным от дозы 15 мг/кг в день 4. LLOQ настоящего анализа составляет <0,04 мкг/мл.

У животных группы 2, которым вводили только антидот RB007, средние значения АЧТВ и ВАС не изменялись в ответ на введение RB007 на всех тестируемых уровнях доз (30 и 60 мг/кг). Данные токсикокинетики фиксировали в различные временные точки в течение первых 24 часов после введения RB007, используя анализ ELISA с гибридизацией двойных олигомеров. Как показано в таблице 4, низкие, но детектируемые уровни антидота присутствовали в плазме животных, получающих RB007 через 0,25 часа после инъекции 30 мг/кг в день 4 или 60 мг/кг в день 13. Полученные уровни были очень вариабельны, но в целом были зависимы от дозы. Уровень антидота после введения был очень низкий в сравнении с концентрацией аптамера (в группе 1) после внутривенной инъекции. Таким образом, становится ясно, что при введении только антидота, он имеет очень короткий период полужизни в плазме, и в значительной степени выводится из циркуляции через 15 минут после инъекции.

Таблица 4 Уровни RB007 в плазме у животных группы 2, REG1-TOX001 (мкг/мл)
Время после инъекции RB007 (часы)	Уровни доз в группе 2 (4 животных/доза)
30 мг/кг	60 мг/кг
Перед введением	<0,01	<0,01
3,25	0,4±0,1	0,6±0,5
6	0,02±0,01*	<0,02***
24	0,01±0,01**	<0,01***
* 1 животное при <LLOQ 0,01 было включено в вычисления ** 3 животных при <LLOQ 0,01 были включены в вычисления *** Среднее среди LLOQ

Данные АЧТВ у животных, которым вводили RB006, через 3 часа после которого вводили RB007 (группа 3), показаны на фиг.9. Согласуясь с данными на животных, которым вводили только RB006, введение RB006 на указанных уровнях доз приводит к состоянию выраженной антикоагуляции, со средним значением AЧТВ на 0,25 и 3 часа после введения, которое согласуется с по существу полным ингибирование FIX при обоих уровнях доз. Последующее введение RB007 быстро и полностью нейтрализовало противосвертывающие эффекты RB006 у обезьян, причем среднее значение АЧТВ возвращается к исходному значению в течение 15 минут после введения RB007 (первая временная точка) в случае обоих тестируемых уровней доз RB006/RB007. У животных группы 3, которым вводили 30/60 мг/кг, RB006/RB007, АЧТВ определяли в течение 5 дней после введения RB006. Данные АЧТВ, собранные за данный период времени, указывают на то, что противосвертывающие эффекты RB006 были нейтрализованы в течение длительного времени без признака возобновления антикоагуляции на протяжении более 120 часов, или приблизительно 10 периодов полужизни RB006 у обезьяны (фиг.9). Длительность нейтрализации противосвертывающей активности RB006 антидотом RB007 полностью согласуется с наблюдаемой термодинамической стабильностью настоящего комплекса лекарственное средство-антидот.

Данные токсикокинетики собирали в течение 24 часов после введения RB006 у животных группы 3 (таблица 5). Для животных группы 3 измеряли концентрации в плазме и свободного RB006 (то есть RB006, не связанного с RB007), и в комплексе с RB006 (то есть RB006, связанный с RB007). Согласуясь с данными АЧТВ, представленными на фиг.9, средние значения концентрации RB006 в плазме на 0,25 и 3 часа после введения были очень высоки. В течение 15 минут после введения RB007 средняя концентрация свободного RB006 уменьшалась в 5000-10000 раз до уровней, меньше нижнего предела измерения (LLOQ) используемого анализа. Сопутствуя снижению уровней свободного RB006, средняя концентрация в плазме RB006 в составе комплекса увеличивалась с меньше LLOQ анализа до от ~125 до 220 мкг/мл при уровнях доз 15/30 и 30/60 мг/кг, соответственно, свидетельствуя о том, что быстрое снижение концентраций свободного RB006 было обусловлено связыванием RB007 с RB006. Концентрация свободного RB006 оставалась ниже LLOQ анализа в течение не менее 3 часов после введения RB007, что согласуется с результатами АЧТВ. На 21 час после введения RB007 (через 24 часа после введения RB006) очень низкие уровни RB006 определялись у нескольких животных (среднее значение только 0,17 мкг/мл или ниже). Однако полученные уровни RB006 являлись слишком низкими для того, чтобы проявлять поддающийся измерению противосвертывающий эффект, согласуясь с отсутствием удлинения АЧТВ через 24 часа и дольше у животных, которым вводили противосвертывающую систему REG1.

Таблица 5 Группа 3 REG1-TOX001: уровни в плазме свободного и в составе комплекса RB006 (мг/мл)
Время с момента инъекции RB006 (часы)	Уровни доз в группе 3
15/30 мг/кг RB006+RB007	30/60 мг/кг RB006+RB007
Свободный RB006	RB006 в составе комплекса	Свободный RB006	RB006 в составе комплекса
Перед введением	<0,04	н.о.	0,05±0,01	н.о.
0,25	280,2±64,3	н.о.	467,6±67	н.о.
3,0	214,6±31,8	<0,04	488,4±68,6	<0,04
3,25	<0,04	125,1±7,9	<0,04	218,2±27,2
6	<0,04	98,7±20,5	<0,04	184,8±28,9
24	0,14±0,08*	8,3±4,5	<0,04±0,01**	22,3±12
* 1 животное при LLOQ <0,04 мкг/мл было включено в вычисления ** 3 животных при LLOQ <0,04 мкг/мл были включены в вычисления RB007 вводили при t=3 часа сразу после 3-часового забора крови, (н.о.) не определено.

Сущность неклинических фармакологических исследований на обезьянах

Представленные исследования демонстрируют, что RB006 является мощным противосвертывающим средством у обезьян, которое способно достигать по существу полного ингибирования активности FIX в течение 24 часов или дольше после однократной внутривенной инъекция лекарственного средства в дозах, превышающих клинические. Сравнение in vitro исследований противосвертывающей активности RB006 на обезьянах с данными АЧТВ и токсикокинетики в результате исследования фармакологической безопасности демонстрирует хорошее соответствие между ожидаемым и наблюдаемым удлинением АЧТВ в зависимости от концентрации RB006 в плазме. Поэтому анализ АЧТВ будет служить полезным инструментом для мониторирования антикоагуляции, вызванной введением RB006. Сходство между in vitro RB006-АЧТВ кривыми доза-ответ для человека и обезьяны предполагает, что данные, полученные в настоящем исследовании на обезьянах (REG1-TOX001), так же, как и крупное общее исследование токсичности, которое проводилось на обезьянах (REG1-TOX003), будут служить полезным руководством в предсказании ответа человека на введение RB006. Наконец, АЧТВ и данные токсикокинетики REG1-TOX001 демонстрируют, что RB007 является очень эффективным антидотом RB006. В течение 15 минут после внутривенного болюсного введения RB007 животным, которым вводили RB006, средние значения АЧТВ возвращались к уровням до введения RB006 и оставались на данном исходном уровне в течение всего периода мониторирования (вплоть до 120 часов). Наблюдаемая нейтрализация противосвертывающей активности RB006 посредством RB007 была полностью подтверждена данными по токсикокинетике и согласуется с измеренной термодинамической стабильностью комплекса RB006-RB007. Исследования токсикокинетики продемонстрировали, что уровни свободного RB006 уменьшались до значений ниже LLOQ анализа в течение 15 минут после введения RB007, сопутствуя значительному повышению концентрации RB006 в составе комплекса, и без значительного увеличения уровней свободного RB006 на протяжении токсикокинетического анализа (24 часа после введения RB006). Поэтому данные, полученные в исследованиях на обезьянах, продемонстрировали, что система антикоагуляции REG1 проявляет себя как предполагалось в отношении достижения стабильной, длительной и доступной для мониторирования антикоагуляции после однократной внутривенной инъекции аптамера, после которой происходит быстрая, полная и длительно действующая нейтрализация активности аптамера при внутривенной болюсной инъекции антидота. Такие характеристики системы антикоагуляции REG1 были достигнуты при от низких до высоких кратностях намеченного клинического диапазона доз (то есть подходящие дозы для исследований токсичности), но без неблагоприятных эффектов у животных.

Токсикокинетика REG1

Для осуществления количественного анализа концентраций свободного аптамера (RB006), свободного антидота (RB007) и комплекса аптамер/антидот (RB006/RB007) в плазме у обезьян и мышей были разработаны и утверждены биоаналитические методы. Указанные методы были применены для анализа образцов, полученных во время исследования фармакологической безопасности на обезьянах (исследование № REG1-TOX001), 14-дневного исследования на мышах (исследование № REG1-TOX002) и исследования однократного/многократного введения на обезьянах (исследование № REG1-TOX003). Для всех трех исследований были образованы отдельные группы животных, которым вводили или только аптамер, или только антидот, или аптамер, через 3 часа после которого следовал антидот. Уровни многократных доз для каждого условия введения проверяли во всех исследованиях, и в два из настоящих исследований (14-дневное исследование на мышах и исследование однократного/многократного введения на обезьянах) также включали повторное введение тестируемых средств. Уровни доз аптамера, тестируемые в настоящих исследованиях, колебались от 0,25 до 45 мг/кг у обезьян и от 2,5 до 22,5 мг/кг у мышей. Дозы тестируемого антидота в два раза превышали таковые для аптамера (то есть до 90 мг/кг у обезьян и 45 мг/кг у мышей). Такое соотношение сходно с таковым, которое предполагается использовать в клинических испытаниях.

Для всех трех исследований результаты токсикокинетики были сходны в отношении описания следующих свойств противосвертывающей системы REG1.

- Концентрации аптамера в плазме после внутривенной инъекции были пропорциональны дозе в широком диапазоне доз со скромной степенью вариации между животными. Никакие гендерные различия не были очевидны ни у обезьян, ни у мышей.

- Клиренс аптамера из плазмы был относительно медленный (то есть предполагаемое время полужизни составляло по меньшей мере 12 часов у обезьян и ~8 часов у мышей). Такой медленный клиренс был ожидаем на основании структуры ПЭГилированного аптамера и согласуется с литературными сообщениями относительно фармакокинетики других ПЭГилированных олигонуклеотидов. Минимальный клиренс аптамера, в комбинации с его высокой степенью ингибирования фактора IX, представлен для относительно стабильной степени антикоагуляции в течение 6 часов, основываясь на измерении фармакодинамических маркеров, то есть активированного частичного тромбопластинового времени и времени активного свертывания. Указанный профиль является желательным свойством аптамерного компонента противосвертывающей системы REG1.

- Внутривенная инъекция только антидота (без предшествующего введения аптамера) приводила к очень низким уровням в плазме, даже в первый раз забора пробы после инъекции (10-15 минут). Уровни антидота, измеренные в указанные ранние временные точки, были на порядки ниже, чем таковые для аптамера (то есть по сравнению с уровнями аптамера в тех группах, которые получали один только аптамер), несмотря на то, что уровни дозы антидота были вдвое выше. В совокупности, данные по антидоту указывают на то, что у него очень короткий период полужизни в плазме, если его принимают отдельно. Применение в относительно высоком уровне доз (30 мг/кг) у обезьян через день в течение 7 доз (14 дней) не приводило к аккумуляции антидота в плазме.

- Для групп, которые получали аптамер и через 3 часа после этого получали антидот (то есть полная противосвертывающая система REG1), концентрация свободного аптамера резко снижалась в течение нескольких минут после введения антидота до уровня ниже или немного выше пределов количественного определения (используя очень чувствительный анализ на основе гибридизации), что свидетельствует о полном связывании циркулирующего аптамера антидотом. Как было отмечено при лечении только одним антидотом, в данных условиях уровни свободного антидота были очень низкие. Связывание аптамера антидотом было связано с фактически полной нейтрализацией активности аптамера (то есть нормализация параметров коагуляции), что согласуется с предполагаемым действием противосвертывающей системы REG1.

- Параллельно с элиминацией свободного аптамера, комплекс аптамера/антидота детектировали в плазме на уровнях, сопоставимых с полным связыванием аптамера антидотом. Комплекс элиминировался из плазмы со скоростью, немного более быстрой, чем таковая для свободного аптамера (то есть сравнимой со скоростью клиренса аптамера в группах, которым вводили только аптамер), но намного более низкой скоростью, чем свободный антидот, как было ожидаемо из-за наличия группы полиэтиленгликоля в составе комплекса (полученного из аптамера). Обширное элиминирование комплекса аптамер/антидот из плазмы наблюдалось в течение 21 часа после введения антидота. При повторном введении аптамера и антидота (система коагуляции REG1) обезьянам каждый день в течение двух недель не происходило никакого накопления в крови комплекса или свободного аптамера, никакого изменения в фармакокинетике аптамера (то есть в течение периода времени до введения антидота) и никаких признаков кумулятивной антикоагуляции, осуществляемой аптамером.

- Единственное отличие между фармакокинетикой у мышей и обезьян составляло несколько более длинный период полужизни аптамера у обезьян (по меньшей мере 12 часов, по сравнению с ~8 часами у мышей).

Клиническое применение REG1 у людей

При выборе способа антикоагуляции для использования у индивидуального пациента или популяции пациентов клиницисты принимают во внимание особенности различных фармакологических стратегий. Учитывая, что основным неблагоприятным эффектом антикоагуляции является кровотечение (то есть ненормально увеличенная фармакологическая активность), для показаний интенсивной терапии идеальное противосвертывающее средство было бы 1) доставляемое внутривенно или подкожно, 2) немедленно терапевтическим, 3) легко дозируемым, чтобы не требовать частого контроля, и наиболее важно, 4) немедленно и предсказуемо обратимо. Противосвертывающая система REG1 была разработана в ответ на неудовлетворенную медицинскую потребность в эффективном, безопасном и быстро обратимом противосвертывающем средстве.

REG1 может использоваться во многих клинических ситуациях для лечения людей и других животных, нуждающихся в таком лечении. Например, REG1 можно использовать при процедурах реваскуляризации коронарных и периферических сосудов, связанных с заболеванием артерий и окклюзиями, в качестве нейтрализуемого антидотом противосвертывающего средства. В частности, REG1 можно использовать в качестве нейтрализуемого антидотом противосвертывающего средства при процедурах реваскуляризации коронарного русла (аорто-коронарное шунтирование (АКШ) и чрескожное вмешательство на сердце (PCI)), в качестве нейтрализуемого антидотом противосвертывающего средства для применения у больных с острыми коронарными синдромами, и в качестве противосвертывающего средства при других показаниях, при которых было бы выгодно применять нейтрализуемое антидотом средство для антитромботической или противосвертывающей терапии. Заболевания и процедуры, для которых могут быть использованы способы по настоящему изобретению, включают, но не ограничены, процедуры по трансплантации периферических сосудов, включая связанные с подвздошными, каротидными, плечевыми, аортой, почечными, брыжеечными, бедренными, подколенными, большеберцовыми и перитонеальными сосудами; профилактика тромбоза глубоких вен; профилактика легочной эмболии после ортопедической операции или у больных раком; профилактика фибрилляции предсердий; профилактика тромботического инсульта; и при показаниях, требующих экстракорпорального кровообращения крови, включая, без ограничения, гемодиализ и экстракорпоральную мембранную оксигенацию. Дополнительные примеры потенциальных заболеваний и процедур, при которых могут быть использованы способы по настоящему изобретению, включают, но без ограничения, пациентов, которым проводится операция на сердце с экстрапульмональным кровообращением; пациентов, у которых образуются тромбы в сердце, или с периферической эмболизацией; и пациентов, у которых другие состояния гиперкоагуляции. Способы по настоящему изобретению также могут быть полезны для профилактики DVT и эмболии легочной артерии у иммобилизированных пациентов и для поддержания функционирования постоянных внутривенных катетеров и систем для внутриартериального или внутривенного введения.

Диапазон доз противосвертывающего компонента REG1, RB006, будет зависеть от показания. Например, доза RB006 у людей может составлять приблизительно от 0,1 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг. При определенных показаниях диапазон доз будет приблизительно от 0,5 мг/кг до приблизительно 9 мг/кг, приблизительно от 0,75 мг/кг до приблизительно 8 мг/кг, приблизительно от 1 мг/кг до приблизительно 7 мг/кг, приблизительно от 1,5 мг/кг до приблизительно 6,0 мг/кг, приблизительно от 2,0 мг/кг до приблизительно 5,0 мг/кг, приблизительно от 2,5 мг/кг до приблизительно 4,0 мг/кг. При определенных показаниях лекарственный компонент будет применяться в дозе, необходимой для поддержания раскрытого состояния во время процедуры. При определенных показаниях будет вводиться только RB006, без последующего введения нейтрализирующего антидота.

Соответствующая доза антидотного компонента REG1, RB007, необходимого для нейтрализации или частичной нейтрализации RB006, зависит от количества введенного RB006. Доза антидота может варьировать в массовом соотношении антидот:лекарственное средство (миллиграммы антидота:миллиграммы лекарственного средства), от приблизительно 0,1:1 до приблизительно 20:1, от приблизительно 0,25:1 до приблизительно 15:1, от приблизительно 0,5:1 до приблизительно 12:1, от приблизительно 0,75 до приблизительно 10:1, от приблизительно 1:1 до приблизительно 9:1, от приблизительно 1,5:1 до приблизительно 8:1, от приблизительно 2:1 до приблизительно 7,5:1, от приблизительно 2,5:1 до приблизительно 6:1, от приблизительно 3:1 до приблизительно 5:1.

Самым важным свойством противосвертывающей системы REG1, которое содействует развитию уверенности в ее безопасном клиническом применении, является хорошо установленная способность антидота к предсказуемой нейтрализации фармакологической активности аптамера дозозависимым образом.

Оценка противосвертывающей системы REG1 на людях

Настоящее исследование стало первым, в котором противосвертывающую систему REG1 оценивали на людях. Исследования однократных внутривенных возрастающих доз (IV) противосвертывающей системы REG1 проводили на здоровых добровольцах. Субъектов в настоящем исследовании рандомизированно распределяли либо для получения тестируемого средства, либо плацебо в одной из трех схем с одним из четырех (4) различных уровней доз. В каждой схеме на каждом уровне дозы субъекты были рандомизированы 7:1, лечение против плацебо, получающие REG1 или плацебо. Для всех инъекций плацебо использовали инъекции 0,9% хлорида натрия USP. Для получения REG1 или плацебо на каждом уровне дозы субъектов рандомизировали.

Для сведения рисков к минимальным и безопасности субъектов, привлеченных к настоящему исследованию, к максимальному в следующем порядке были образованы три схемы введения:

Схема 1: после плацебо лекарственного средства следовал активный антидотный компонент RB007, или после плацебо лекарственного средства следовал плацебо антидота.

Схема 2: после активного лекарственного средства RB006 следовал активный компонент RB007, или после плацебо лекарственного средства следовал плацебо антидота.

Схема 3: после активного лекарственного средства RB006 следовал плацебо антидота, или после плацебо лекарственного средства следовал плацебо антидота.

В схеме 1 оценивали антидотный компонент противосвертывающей системы REG1 (RB007). Каждый субъект по указанной схеме получал инъекцию плацебо в момент времени 0 (то есть время, когда проводили первую болюсную инъекцию). Через три (3) часа субъекты получали внутривенную инъекцию активного антидотного компонента (RB007), в то время как один (1) субъект получал плацебо.

В схеме 2 оценивали комбинацию активного лекарственного компонента противосвертывающей системы REG1 (RB006), после которого следовал активный антидотный компонент противосвертывающей системы REG1 (RB007). Субъекты по указанной схеме получали инъекцию активного лекарственного компонента (RB006) в момент времени 0, и один (1) получал плацебо. Через три (3) часа субъекты, которые получили активный лекарственный компонент, получали инъекцию активного антидотного компонента (RB007), в то время как один (1) субъект, который получил плацебо вместо лекарственного компонента, получал плацебо вместо антидота.

В схеме 3 оценивали активный лекарственный компонент противосвертывающей системы REG1 (RB006). Субъекты по указанной схеме получали инъекцию активного лекарственного средства (RB006) в момент времени 0, и один (1) получал плацебо вместо антидота. Через три (3) часа все субъекты получали плацебо вместо антидота.

Исследуемый активный лекарственный компонент (RB006) вводили в четырех (4) уровнях доз: (1) низкая доза (15 мг RB006); (2) промежуточная низкая доза (30 мг RB006); (3) промежуточная высокая доза (60 мг RB006); и (4) высокая доза (90 мг RB006). Стартовая доза и последующие возрастающие дозы были выбраны для достижения максимальных концентраций в плазме, которые определяют три (3) ключевых аспекта in vitro АЧТВ кривой доза-ответ для RB006 в объединенной нормальной человеческой плазме: низкая доза для достижения максимальной концентрации в плазме, при которой АЧТВ начинает повышаться в RB006 in vitro кривой доза-ответ (~4 мкг/мл); две (2) промежуточные дозы для достижения концентраций в плазме, которые ограничивают IC₅₀ в in vitro RB006 АЧТВ кривой доза-ответ (~8-16 мкг/мл); и высокая доза для достижения концентрации в плазме, при которой in vitro RB006 АЧТВ кривая доза-ответ начинает выходить на плато (~25 мкг/мл).

Исследуемый активный антидотный компонент (RB007) вводили в четырех (4) соответствующих уровнях доз, эквивалентных двойному уровню дозы лекарственного средства (RB006) на основе мг/кг: (1) низкая доза (30 мг RB007); (2) промежуточная низкая доза (60 мг RB007); (3) промежуточная высокая доза (120 мг RB007); и (4) высокая доза (180 мг RB007).

В таблице 6 в общих чертах приведены дозы для каждой группы фазы 1A настоящего исследования.

Исследуемый лекарственный компонент (RB006), исследуемый антидотный компонент (RB007) и соответствующие им плацебо вводили в виде инъекции в течение одной (1) минуты. Исследуемый лекарственный компонент REG1 или плацебо вводили в момент времени 0 и антидотный компонент или плацебо вводили в три (3) часа.

Таблица 6 Запланированные дозы для трех схем введения фазы 1а
Группа	Схема 1: плацебо + антидот (RB007), мг	Схема 2: лекарственное средство (RB006), мг + антидот (RB007), мг	Схема 3: лекарственное средство (RB006), мг + плацебо
Уровень дозы 1: низкая доза	30	15	30	15
Уровень дозы 2: промежуточная низкая доза	60	30	60	30
Уровень дозы 3: промежуточная высокая доза	120	60	120	60
Уровень дозы 4: высокая доза	180	90	180	90

REG1 оценивали на здоровых добровольцах для определения профиля безопасности и описания PK и PD ответа противосвертывающей системы REG1. Настоящее исследование было первым, в котором противосвертывающая система, в которой используется аптамер и олигонуклеотидный антидот аптамера, применялась на людях. Результаты указывают на то, что после внутривенной болюсной инъекции лекарственного средства по АЧТВ детектировалась реакция доза-ответ с быстрым и продолжительным возвращением к начальному уровню АЧТВ после болюсной внутривенной инъекции антидота. Для ВАС наблюдали подобный паттерн, как и для АЧТВ. ПВ оставалось неизменным в сравнении с исходным уровнем.

Субъектам вводили RB006 или 0,9% физиологический солевой раствор в виде внутривенной болюсной инъекции в нулевой момент времени и противосвертывающий эффект оценивали в течение длительного времени посредством измерения АЧТВ плазмы (фиг.10). Значения АЧТВ для каждой группы лечения представлены в виде среднего значения ± с.о.с. удельного АЧТВ. Удельным АЧТВ является значение АЧТВ для индивидуального субъекта в данный момент времени, поделенное на исходное значение АЧТВ до введения RB006 для данного субъекта. Значение 1 указывает на отсутствие ответа на RB006, и значение >1 указывает на противосвертывающий эффект. Отчетливый ответ на дозу по значению удельного АЧТВ наблюдается при увеличении дозы RB006 с 15 мг до 60 мг. Время полужизни в качестве фармакодинамической активности RB006 при определении по анализу АЧТВ, как кажется, составляет по меньшей мере от 12 до 18 часов, поскольку это является временем, за которое среднее удельное АЧТВ субъектов, которым вводили 60 мг RB006, достигает максимального удельного АЧТВ, определяемого у субъектов, которым вводили 30 мг RB006.

Субъектам вводили RB006 или 0,9% физиологический солевой раствор (плацебо) путем внутривенной болюсной инъекции в нулевой момент времени и затем или RB007, или плацебо путем внутривенной болюсной инъекции через 3 часа после введения RB006. Противосвертывающий эффект после введения RB006 детектировали в течение длительного времени посредством измерения АЧТВ плазмы (фиг.11). Значения АЧТВ для каждой группы лечения представлены в виде среднего значения ± с.о.с. удельного АЧТВ. Удельным АЧТВ является значение АЧТВ для индивидуального субъекта в данный момент времени, поделенное на исходное значение АЧТВ до введения RB006 для данного субъекта. Отчетливый ответ на дозу по значению удельного АЧТВ наблюдается при увеличении дозы RB006 с 15 мг до 90 мг. Введение RB007 приводило к полной, быстрой (в течение 5 минут) и длительной нейтрализации фармакологической активности RB006, что подтверждается возвращением удельного АЧТВ к исходным значениям после введения RB007.

Схемы лечения проводили так, как описано в вышеуказанных фиг.10 и 11. Сравнение фармакодинамического ответа у субъектов, которым вводили 60 мг RB006, за которым через 3 часа следовало введение RB007 или плацебо, демонстрирует быструю и длительную нейтрализующую активность RB007 (фиг.12). Введение RB007 эффективно устраняет состояние последующей антикоагуляции у субъектов, как это показано при сравнении площади под кривой АЧТВ ответа с 3 до 24 часов в присутствии или в отсутствие введения RB007.

Возможность введения противосвертывающей системы REG1 в виде внутривенной болюсной инъекции, которое не приводит к активации комплемента у приматов, является неожиданной, учитывая ассоциацию активации комплемента и, следовательно, токсичность, наблюдаемую при введении, ранее наблюдаемую при подобных болюсных инъекциях других типов олигонуклеотидных молекул. См., например, Galbraith и др. (1994) "Complement activation and hemodynamic changes following intravenous administration of phosphorothioate oligonucleotides in the monkey," Antisense Research and Development 4:201-206; и Levin, A. A., Monteith, D. K., Leeds, J. M., Nicklin, P. L., Geary, R. S., Butler, M., Templin, M. V., и Henry, S. P. (1998). Toxicity of oligonucleotide therapeutic agents, In Handbook of Experimental Pharmacology, G. V. R. e. a. Born, ed. (Berlin: Springer-Verlag), pp. 169-215.

Стратегический анализ параметров дозирования

На фиг.13 показан более детальный анализ относительного увеличения АЧТВ по сравнению с исходным после 0-3 часов для всех субъектов, которые получали RB006. Согласуясь с данными испытаний на обезьянах, уровень АЧТВ достигает максимума и выходит на плато в течение нескольких часов. Данные были проанализированы путем определения площади под кривой удельного АЧТВ по сравнению с исходным значением, измеренными в течение первых трех часов после введения. На фиг.19 показано, каким образом ответ на RB006 соотносится с % ингибирования FIX. Полученные данные демонстрируют, что можно заингибировать >99% активности FIX пошаговым образом, используя противосвертывающее средство.

На фиг.14 представлены AUC_0-3 для каждого субъекта, которые приведены в порядке уровня дозы RB006 (15, 30, 60 или 90 мг). Поскольку относительный эффект измеряется более 3 часов, значение "3" указывает на отсутствие ответа, значение 6 указывает в среднем на 2-кратное увеличение относительно исходного и т.д.

На фиг.15 показана рассчитанная на вес доза RB006 как функция уровня дозы RB006. На фиг.16 изображена связь между фармакодинамическим эффектом RB006 (AUC_0-3) и "нормированной на вес" дозы RB006. Нормированная на вес доза находится в интервале от 0,2 мг/кг до 1,6 мг/кг с диапазоном AUC_0-3 от приблизительно 3 до 10 единиц. Диаграмма демонстрирует, что существует отчетливая связь между ответом и дозой противосвертывающего средства, нормированной на вес, с довольно низкой вариабельностью между субъектами.

Как показано на фиг.20 и 21, существует отчетливая связь индекса массы тела (ИМТ) зарегистрированных субъектов с уровнем дозы RB006. ИМТ 19-25 соответствует норме, 25-30 соответствует избыточному весу и >30 соответствует ожирению. Субъекты в настоящем исследовании располагались по ИМТ от приблизительно 16 до ИМТ более 35. Индекс массы тела (ИМТ) является показателем, рассчитываемым по весу и росту человека. ИМТ является надежным индикатором ожирения у людей. ИМТ не измеряет телесный жир напрямую, но в исследованиях было показано, что ИМТ коррелирует с прямыми способами измерениями телесного жира, такими как подводное взвешивание и двухэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия (DXA). ИМТ может считаться альтернативой прямым методам измерения телесного жира. ИМТ одинаково вычисляют для взрослых и детей. Вычисление основано на следующих формулах:

Единицы измерения	Формула и метод вычисления
Килограммы и метры (или сантиметры)	Формула: вес (кг)/[рост (м)]2
Метод вычисления: [вес (кг)/рост (м)/рост (м)]
В метрической системе формулой для расчета ИМТ является вес в килограммах, деленный на квадрат роста в метрах. Поскольку рост часто измеряют в сантиметрах, для выражения роста в метрах нужно рост в сантиметрах разделить на 100.
Фунты и дюймы	Формула: вес (lb)/[рост (in)]2×703
Метод вычисления: [вес (lb)/рост (in)/рост (in)]×703
Для вычисления ИМТ нужно вес в фунтах (lb) разделить на квадрат роста в дюймах (in) и умножить на коэффициент пересчета 703.

На фиг.17 показана дозировка, нормированная на ИМТ, для субъектов, получающих RB006, как функция от уровня дозы RB006. На фиг.18 изображена связь между AUC_0-3 для RB006 с дозой, нормированной на ИМТ. Дозировки варьировали от 0,5 мг/ИМТ до приблизительно 4,5 мг/ИМТ. Диапазон AUC_0-3 составлял от приблизительно 3 до 10 единиц. Как можно заметить на диаграмме, между фармакодинамическими параметрами и дозировкой, нормированной на ИМТ, существует отчетливая связь. Указанная связь является еще более явной, чем связь с дозой, нормированной на вес, с меньшей вариабельностью. Связь ИМТ с удельной AUC_0-3 указывает на то, что лекарственное средство, вероятно, главным образом распределяется в центральной части туловища, а не на периферии или не в соответствующих тканях. Указанное распределение оказывает дополнительную поддержку применению системы REG1 в качестве противосвертывающего средства для парентерального введения.

Оценка системы REG1 у больных со стабильной стенокардией

Исследования проводили на 50 пациентах со стабильной стенокардией, принимающих аспирин и/или клопидогрел. Пациенты были случайным образом распределены на три группы (только RB006, RB006, за которым следовал RB007, или только плацебо) с 4 уровнями дозировок RB006 и RB007.

Начальные характеристики включали средний возраст 61 год (интерквартильный размах (IQR) 56-68), 20% женщин, у 80% в анамнезе чрескожное вмешательство на коронарных сосудах и у 34% в анамнезе аорто-коронарное шунтрование. Медиана АЧТВ через 10 минут после однократной внутривенной (IV) болюсной инъекции низкой, промежуточной низкой, промежуточной высокой и высокой доз RB006 составляла 29,2 секунды (IQR 28,1-29,8), 34,6 секунды (IQR 30,9-40,0), 46,9 секунды (IQR 40,3-51,1) и 52,2 секунды (IQR 46,3-58,6), p<0,0001, (нормальный диапазон АЧТВ 27-40 секунд). RB007 возвратило АЧТВ до <10% выше верхнего предела нормы с медианой 1 минута (IQR 1-2) (фиг.1) без возвратного увеличения вплоть до 7 дней. Несмотря на применение двойной антитромбоцитарной терапии у 38% субъектов не было никаких значимых кровотечений или других серьезных нежелательных осложнений.

На фиг.20 представлены результаты сравнения реакции АЧТВ при четырех аптамер/антидот дозировках в сравнении с плацебо. Группе 1 "низкая доза" вводили 15 мг RB006 в момент времени 0 и 30 мг антидота RB007 в момент времени 3 часа путем внутривенной болюсной инъекции. Группе 2 "промежуточная низкая доза" вводили 30 мг RB006 в момент времени 0 и 60 мг антидота RB007 в момент времени 3 часа в виде внутривенной болюсной инъекции. Группе 3 "промежуточная высокая доза" вводили 50 мг RB006 в момент времени 0 и 100 мг антидота RB007 в момент времени 3 часа в виде внутривенной болюсной инъекции. Группе 4 "высокая доза" вводили 75 мг RB006 в момент времени 0 и 150 мг антидота RB007 в момент времени 3 часа в виде внутривенной болюсной инъекции. И при 50, и при 75 мг/кг RB006 определяли выраженное увеличение АЧТВ, которое было полностью нейтрализовано при введении RB007 в 2-кратной концентрации аптамера.

Повторное дозирование системы REG1

Исследования проводили на 38 пациентах с общим хорошим состоянием здоровья. Были сформированы три группы лечения: группа 1, в которой субъекты получали однократную дозу аптамера (0,75 мг/кг RB006) в дни 1, 3 и 5, после которых следовала фиксированная доза антидота (1,5 мг/кг RB007) через один час; и группы 2 и 3, в которых субъекты получали однократную дозу аптамера RB006 (0,75 мг/кг) в дни 1, 3 и 5, после которых следовали однократные различные дозы RB007, вводимые через один час. Титрование дозы RB007 у субъектов в группах 2 и 3 представлено в таблице A ниже.

Таблица A Соотношение доз антидота (RB007) и лекарственного средства (RB006) для групп 2 и 3
День	Отношение антидот:лекарственное средство	RB007 (мг/кг):RB006 (мг/кг)
Группа 2
1	2:1	1,5:0,75
3	1:1	0,75:0,75
5	0,5:1	0,375:0,75
Группа 3
1	0,2:1	0,15:0,75
3	1:1	0,75:0,75
5	TBD1	TBD:0,75
1 Отношение антидот:лекарственное средство, исследуемое в день 5, было между 0,1:1 и 1:1, и было основано на результатах АЧТВ дней 1 и 3. 2 Доза антидота составляла от 0,075 мг/кг до 0,75 мг/кг.

Доза RB006 (0,75 мг/кг) была выбрана на основании нормированного на вес ответа на RB006. В среднем, указанная нормированная на вес доза RB006 увеличивала АЧТВ субъектов в 2 раза. Аптамер RB006, антидот и соответствующие им плацебо вводили в виде инъекции в течение одной (1) минуты. На фиг.21 показано взвешенное по времени АЧТВ после введения RB006 (0,75 мг/кг) в дни 1, 3 и 5 при различных дозировках антидота.

На фиг.22 показан процент эффекта на АЧТВ от введения RB006 в соответствующих группах. Приблизительно 270% увеличение АЧТВ было отмечено после введения 0,75 мг/кг аптамера во всех трех группах, и оно значительно не отличалось в течение трех дней лечения.

На фиг.23 показано среднее АЧТВ в группах, которым вводили RB006 (0,75 мг/кг) и RB007 в различных соотношениях к RB006. RB006 вводили в момент времени 0, и RB007 в перечисленных соотношениях вводили через один час. Как можно отметить из диаграммы, RB007 изменял противосвертывающую дозу антидота к аптамеру. Кроме того, как может быть замечено из фиг.23, эффект инверсии RB007 для каждого из тестируемых соотношений был относительно стабилен в течение длительного времени с постепенным снижением фармакодинамической активности RB006 в течение длительного времени, как ожидалось для настоящего соединения.

На фиг.24 показан процент восстановления взвешенного по времени АЧТВ в группах, которым вводили RB006 (0,75 мг/кг) и RB007 в различных соотношениях с RB006. RB006 вводили в момент времени 0, и RB007 в перечисленных соотношениях вводили через один час. При самом низком протестированном соотношении, 0,125:1, RB007 нейтрализовал эффект RB006 приблизительно на 40%. При 0,2:1 RB007 нейтрализовал эффект RB006 приблизительно на 50%. При 0,3:1 RB007 нейтрализовал эффект RB006 приблизительно на 75%. При 0,5:1 RB007 нейтрализовал эффект RB00 приблизительно на 85%. И при более высоких соотношениях, 1:1 или 2:1, RB007 эффективно полностью нейтрализовал эффект RB006.