штамм вируса гриппа для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей

Формула изобретения

Штамм вируса гриппа, депонированный в Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН под № 2630, используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики гриппа, вызванного эпидемическим штаммом вируса гриппа A(H3N2). Профилактику осуществляют интраназальной живой гриппозной вакциной (ЖГВ) из штамма вируса гриппа A, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus A-A/17/Перт/09/87(H3N2).

Применяемый до настоящего времени для профилактики гриппа среди взрослых и детей в составе тривалентной ЖГВ вакцинный штамм подтипа A/17/Висконсин/05/84(H3N2) [Патент № 2340671, опубл. 10.12.2008. - БИ № 34] обладает необходимым составом генома 6:2, однако в настоящее время он утратил антигенную актуальность. Вследствие этого штамм не может создавать защиту во время эпидемии, вызванной новой антигенной разновидностью вируса гриппа A(H3N2).

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма новой антигенной разновидности. Этот штамм создавали на основе холодоадаптированного (XA) донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2), используя в качестве источника поверхностных антигенов гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA) эпидемического штамма вируса гриппа A/Перт/16/2009(H3N2).

Заявляемый вакцинный штамм A/17/Перт/09/87(H3N2) получен методом классической генетической реассортации в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) эпидемического вируса A/Перт/16/2009(H3N2) с холодоадаптированным штаммом A/Ленинград/134/17/57(H2N2) с последующей селекцией в присутствии антисыворотки к донору аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2).

Донор аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2) - холодоадаптированный температурочувствительный штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1986. - С.66-83]. Применяемые в настоящее время вакцинные штаммы ЖГВ получают методом реассортации современных эпидемических вирусов с холодоадаптированными (XA) донорскими штаммами, в результате чего образуются реассортанты, имеющие смешанный геном. Гены, кодирующие гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального эпидемического штамма, а шесть генов внутренних и неструктурных белков (PB2, PB1, PA, NP, M, NS) - от безвредного XA донора аттенуации.

Анализ генома созданного вакцинного штамма был выполнен с использованием рестрикционного анализа ДНК-копий сегментов РНК, полученных с помощью обратно-транскриптазной полимеразно-цепной реакции (ОТ-ПЦР) [Klimov A.I. J. Virol. Method. - 1995. - № 55. - P.445-446]. Полученные с помощью ОТ-ПЦР ДНК-копии сегментов PB2, PB1, PA, NP, M и NS обрабатывали соответственно эндонуклеазами рестрикции Tru9I, HindIII, BamHI, AsnI, EcoRI, PvuI, NciI соответственно. Дополнительно копии сегментов PB1, PA и M были обработаны рестриктазами BstXI, AsnI и BciVI. Было показано, что сайты рестрикции в положениях нуклеотидной цепи, характерные для донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2), присутствуют в генах PB2 (1459), PA (107 и 1045), NP (1066) и M (68 и 969). В то же время было установлено, что утрачены сайты рестрикции в генах PB1 (819 и 975) и NS (798), что также характерно для донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2).

Таким образом установлено, что реассортант унаследовал 6 генов негликозилированных белков от донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2).

Обработка ДНК-копии сегмента NA рестриктазой SphI показала, что у реассортанта отсутствует сайт рестрикции в положении 78 нуклеотидной цепи, что свидетельствует о наследовании данного гена от эпидемического вируса A/Перт/16/2009(H3N2).

Принадлежность гемагглютинина родительскому эпидемическому вирусу A/Перт/16/2009(H3N2) была подтверждена путем постановки реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Для этого в 96-луночные планшеты для иммунологических реакций вносили последовательные падающие разведения иммунных антисывороток с шагом 2, соответствующие антигены в стандартной дозе (4 агглютинирующих единицы) и 1% взвесь эритроцитов кур. Титр антигемагглютинирующих антител выражали как величину, обратную наибольшему разведению сыворотки, при котором наблюдалось торможение агглютинации. Установлено, что вакцинный кандидат A/17/Перт/09/87(H3N2) антигенно идентичен родительскому эпидемическому штамму. Таким образом было подтверждено, что реассортант A/17/Перт/09/87(H3N2) имеет формулу генома 6:2.

Определение инфекционной активности проводили в РКЭ, для чего делали ряд падающих десятикратных разведений исследуемого вирусного материала. Зараженные РКЭ инкубировали при следующих температурах: оптимальной (34°C), пониженной до 25°C или повышенной до 40°C. К числу температурочувствительных (имеющих ts фенотип) относили вирусы, которые репродуцировались при повышенной температуре по сравнению с оптимальной с разностью в 5,0-6,0 lg ЭИД₅₀ и более. Если разница титров при оптимальной и пониженной до 25°C температуре не превышала 3,0-3,5 lg EID₅₀, вирусы относили к XA группе. Было показано, что штамм A/17/Перт/09/87(H3N2) является температурочувствительным (разность титров при 33°C и 39°C составляет 8,3 lg ЭИД₅₀/мл) и холодоадаптированным (разность титров при 33°C и 25°C составляет 3,0 lg ЭИД₅₀/мл).

Результат исследований нового штамма вируса гриппа: представленный вакцинный штамм A/17/Перт/09/87(H3N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму - антигенной специфичностью гемагглютинина эпидемического вируса A/17/Перт/09/87(H3N2), структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов (6:2), температурочувствительностью, холодоадаптированностью, что коррелирует с безвредностью для человека, характерной для донора аттенуации.

Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН под № 2630.

Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛУЧЕННОГО ШТАММА.

Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33°C в течение 48 часов - 7,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл.

Гемагглютинирующая активность - 1:256

Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз). Характеристики штамма отражены в паспорте на вакцинный штамм A/17/Перт/09/87(H3N2).

ПАСПОРТ ШТАММА

1. Название штамма - A/17/Перт/09/87(H3N2)

2. Серия - серия 2.

3. Метод получения - реассортация; характеристика родительских вирусов:

а) эпидемический вирус - A/Перт/16/2009(H3N2)

б) донор аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2)

4. Количество пассажей - 7 в процессе рекомбинации+1 накопительный

5. Характеристика штамма до лиофилизации:

а) оптимальные условия репродукции - 33°, 48 часов;

б) гемагглютинирующая активность 1:512;

в) инфекционная активность 7,8 lg ЭИД₅₀ /0,2 мл;

г) чувствительность к ингибиторам: ингибиторорезистентный;

д) разность в показателях инфекционной активности при 33°C и 39°C - 7,8 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;

е) разность в показателях инфекционной активности при 33°C и 25°С - 2,8 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;

ж) структура генома реассортанта:

- гены от эпидемического вируса НА, NA

- гены от донора аттенуации - РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS

6. Характеристика штамма после лиофилизации:

а) дата лиофилизации: 18.01.2010;

б) объем материала в ампуле: 1 мл;

в) количество доз в ампуле: 2;

г) инфекционная активность - 7,5 lg ЭИД₅₀ /0,2 мл

д) гемагглютинируюшая активность - 1:256

7. Рекомендуемое разведение при вакцинации 1:1

8. Антигенная специфичность:

а) гемагглютинина - идентичен вирусу A/Перт/16/2009(H3N2) по данным РТГА с крысиной антисывороткой.

б) нейраминидазы - идентична вирусу A/Перт/16/2009(H3N2) по данным ПЦР-рестрикционного анализа ДНК-копий генов.

9. Безвредность для мышей при подкожном и внутрибрюшинном введении -безвреден.

10. Бактериологический контроль лиофилизированного материала - дата проведения - 2.04.2010 - стерилен.

11. Контроль на отсутствие посторонних вирусов - посторонние вирусы отсутствуют 2.04.2010.

Штамм A/17/Перт/09/87(H3N2) ареактогенен при интраназальном введении для взрослых и детей 6-12 лет, что проверено на волонтерах.

Пример 1. При вакцинации 48 взрослых лиц интраназально рекомбинантным вакцинным штаммом A/17/Перт/09/87(H3N2) с инфекционной активностью 8,3 lg ЭИД₅₀/мл в разведении 1:2 в объеме 0,5 мл сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5°C и средних реакций с кратковременным повышением температуры в диапазоне 37,6-38,5°C не наблюдалось. Слабые температурные реакции (до 37,5°C) наблюдались у трех привитых (6,3%) и у одного человека из группы плацебо (4,6%) (Табл.1).

Таблица 1
Препарат	Число лиц	Температурные реакции	Головная	Общее
37,0-37,5	37,6-38,5	38,6	боль	недомогание
ЖГВ	48	3 (6,3%)	0	0	0	0
Плацебо	22	1 (4,6%)	0	0	2 (9,1)	1 (4,6)

Общие реакции без повышения температуры тела (головная боль, общее недомогание) наблюдались среди получивших препарат плацебо. Из таблицы 1 видно, что вакцинный штамм A/17/Перт/09/87(H3N2) удовлетворяет требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам ЖГВ Приказом Минздрава РФ № 156/29.

Пример 2. Для вакцинации детей использовали гриппозную аллантоисную интраназальную живую сухую вакцину «Ультравак», в которую входили производственные штаммы A/17/Калифорния/2009/38 (H1N1), A/17/Перт/09/87 (H3N2), B/60/Брисбен/08/83. В качестве растворителя использовалась вода для инъекций (серия 010110, 020110, 030110). В качестве препарата «плацебо» применяли стерильный 0,9% раствор хлорида натрия. Вакцину и плацебо вводили однократно, интраназально с помощью одноразового распылителя-дозатора по 0,25 мл в каждый носовой ход. Всего живой гриппозной вакциной было привито 47 школьников в возрасте 7-16 лет и 4 ребенка в возрасте 3-6 лет, «плацебо» получили 32 школьника в возрасте 7-16 лет.

При вакцинации 47 детей 7-16 лет тривалентной ЖГВ, включающей рекомбинантный вакцинный штамм A/17/Перт/09/87(H3N2) с инфекционной активностью 10^7,1 ЭИД₅₀/мл, сильных температурных реакций - с повышением температуры свыше 38,5°C - не наблюдалось. В одном случае отмечено развитие средней реакции в виде кратковременного повышения температуры до 37,5°C. У трех детей отмечалась кратковременная головная боль без температурной реакции; у одного ребенка отмечалась слабость без температурной реакции; у двух детей отмечались катаральные явления в виде умеренной гиперемии зева без температурной реакции. В группе из 32 детей 7-16 лет, получивших плацебо, у одного ребенка отмечалась головная боль без температурной реакции. У четырех детей в возрасте 3-6 лет, привитых тривалентной ЖГВ, никаких реакций не отмечалось. Результаты испытаний приведены в таблице 2.

Результаты исследований показывают, что вакцинный штамм A/17/Перт/09/87(H3N2) удовлетворяет требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам ЖГВ фармакопейной статьей ФСП 42-0417, позволяющей использовать штамм для приготовления вакцины для взрослых и детей.

Таблица 2
Препарат	Число наблюдений	Из них с повышенной температурой тела (t, °C)	Интоксикация, головная боль	Катаральные явления
37	37,1-37,5	37,6-38,5	38,6
ЖГВ 7-16 лет	51	Абс.	0	1	0	0	5	4
%	0	2,1	0	0	10,6	8,5
Плацебо	32	Абс.	0	0	0	0	1	0
%	0	0	0	0	3,1	0
ЖГВ 3-6 лет	4	Абс.	0	0	0	0	0	0
%	0	0	0	0	0	0