штамм streptomyces coeruleorubidus - продуцент антибиотика даунорубицина
Классы МПК: | C12P19/56 с атомом кислорода сахаридного радикала, непосредственно связанным с конденсированной циклической системой из трех или более карбоциклических колец, например дауномицина, адриамицина |
Автор(ы): | Лапчинская Ольда Анастасьевна (RU), Гладких Елена Георгиевна (RU), Макарова Марина Олеговна (RU), Орлова Галина Ивановна (RU), Погожева Валерия Владимировна (RU), Филичева Валентина Андреевна (RU), Харитонова Лидия Александровна (RU), Пономаренко Валерий Иванович (RU), Федорова Галина Борисовна (RU), Катруха Генрих Степанович (RU) |
Патентообладатель(и): | Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе РАМН (НИИНА РАМН) (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2011-07-21 публикация патента:
20.10.2012 |
Изобретение может быть использовано в медицинской промышленности при производстве противоопухолевого антибиотика даунорубицина, эффективного в терапии многих видов рака мягких тканей, рака молочной железы, рака легкого. Штамм Streptomyces coeruleorubidus 1533 ВКМП Ac-890 получен в результате многоступенчатого мутагенного воздействия метилнитрозогуанидина и гамма-лучей 60Со на исходный штамм Streptomyces coeruleorubidus 2679 с последующим отбором мутантов на средах, содержащих стрептомицин и карминомицин в качестве селективных агентов. Антибиотическая активность дауномицинового комплекса, накапливаемого к концу ферментации, увеличена более чем в два раза по сравнению с исходным - 2500 и 950, соответственно. Изобретение обеспечивает повышение продуктивности даунорубицина, а именно содержание даунорубицина в ферментационной жидкости штамма до 2000 мкг/мл, что составляет 80% от его содержания в дауномициновом комплексе. 2 табл., 1 пр.
Формула изобретения
Штамм Streptomyces coeruleorubidus ВКПМ Ac-890 - продуцент антибиотика даунорубицина.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к медицинской промышленности и касается нового штамма-продуцента противоопухолевого антибиотика даунорубицина, принадлежащего к основной группе антилейкемических препаратов и применяемого также в терапии многих видов рака мягких тканей, рака молочной железы, рака легкого. Кроме того, даунорубицин является исходным сырьем для полусинтетического противоопухолевого препарата доксорубицина.
Известен штамм Streptomyces coeruleorubidus 2679 - продуцент антибиотика даунорубицина [1]. Недостатком данного штамма является низкий уровень содержания антибиотика в культуральной жидкости (не более 500 мкг/мл).
Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм-продуцент даунорубицина в результате многоступенчатого мутагенного воздействия метилнитрозогуанидина и гамма-лучей 60Со на исходный штамм № 2679 с последующим отбором мутантов на средах, содержащих стрептомицин и карминомицин в качестве селективных агентов.
Полученный новый штамм - продуцент даунорубицина депонирован в коллекции культур ФГУП ГосНИИгенетика под номером ВКМП Ас-890.
Штамм ВКМП Ас-890 обладает повышенной продуктивностью даунорубицина (2000 мкг в 1 мл культуральной жидкости) и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.
Культурально-морфологические и физиологические признаки штамма ВКМП Ас-890. Температура 28°С; длительность выращивания (7-21) сутки. Споровый посевной материал приготовлен с поверхности десятидневной культуры штамма, выращенного на гороховом агаре. Цвет определен по таблице Бондарцева и Праузера (Таблица 1).
Морфологические признаки. Цепочки спор спиральные. Споры продолговатые и шаровидные, поверхность спор шиповатая, шипы средней величины; спороносцы спиральные, вытянутые.
Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (24-37)°С; оптимум роста 28°С и в диапазонах значений рН (5,0-10,0) с оптимумом роста при рН 7,0. Молоко пептонизирует, сахарозу инвертирует, крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты образует при росте на среде Треснера с пептоном и лимонно-кислым железом. Отношение к углеводам: хорошо использует глюкозу и сахарозу; умеренно - рафинозу, рамнозу; слабо - ксилозу, манит, не использует арабинозу.
Хранение. Штамм хранится в виде спор на стерильной почве с кварцевым песком или на зернах пшена, а также в виде зрелой культуры на агаровых средах под вазелиновым маслом.
Антагонистические свойства. При испытании методом штриха на глюкозонитратном агаре № 2 Гаузе штамм подавляет рост грамположительных и грамотрицательных бактерий и дрожжеподобных грибов. Специфических вирулентных фагов не выявлено, лизиса в процессе ферментации не происходит.
Штамм ВКПМ Ас-890 поясняется следующим примером.
Пример. Для получения спорового материала культуру Streptomyces coeruleorubidus 1533 ВКПМ Ac-890 выращивают в течение (7-10) суток при 28°С на среде № 2 Гаузе следующего состава, %:
Глюкоза | 1,0 |
Пептон | 0,5 |
Бульон Хоттингера (28-30) мг % | 3,0 |
NaCl | 0,5 |
Вода | Водопроводная |
рН до стерилизации | 7,0-7,2 |
Среду стерилизуют в течение 30 мин при давлении в 1,0 атм и 120°С.
Для получения посевного мицелия споры культуры засевают агаровым блочком 2 см2 на жидкую питательную среду следующего состава, %:
Соевая мука | 1,0 |
Глюкоза | 2,0 |
Кальция карбонат | 0,3 |
Натрий хлористый | 0,5 |
Вода | Водопроводная |
рН до стерилизации | 6,8-7,0 |
Посевную культуру выращивают при 28°С в течение 48 ч в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл с наполнением среды 100 мл. Скорость вращения качалки (280-320) об/мин. Количество посевного материала для инокуляции - 7%.
Ферментация проводится на качалке при 28°С на среде (100 мл в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл) следующего состава, %:
Соевая мука | 3,0 |
Глюкоза | 3,0 |
NaCl | 0,3 |
СаСО 3 | 0,3 |
Вода | Водопроводная |
рН до стерилизации | 6,8-7,0 |
Антибиотическая активность, определенная методом ВЭЖХ через 144-168 ч биосинтетического процесса, составляет 2500 мкг/мл, при этом содержание даунорубицина в дауномициновом комплексе - 2000 мкг/мл (80%).
Преимуществом заявленного штамма по сравнению с прототипом является в 4 раза повышенная продуктивность даунорубицина, а именно содержание даунорубицина в ферментационной жидкости штамма-прототипа 500 мкг/мл, а в новом штамме - 2000 мкг/мл, что составляет 80% от его содержания в дауномициновом комплексе. Антибиотическая активность дауномицинового комплекса, накапливаемого к концу ферментации, увеличена более чем в два раза по сравнению с прототипом (Таблица 2) - 2500 и 950, соответственно.
Даунорубицин, полученный на основе биосинтеза нового мутантного штамма, представляет собой кристаллический порошок красного цвета, легко растворимый в метаноле, хлороформе, растворимый в ацетоне и этаноле и нерастворимый в воде. По физико-химическим свойствам, антибактериальной активности и токсичности полностью соответствует требованиям ФС.
Полученный новый штамм может быть использован как микробиологическая основа в промышленном производстве противоопухолевого антибиотика даунорубицина.
ЛИТЕРАТУРА
1. Фомичева Е.В. Изучение компонентного состава рубомициновых комплексов, продуцируемых промышленными штаммами S.coeruleorubidus Ч-157 и 2679 и усовершенствование метода получения рубомицина С. // Дисс.канд. хим. наук. М., (1993 г.).
Таблица 1. | ||||
Культурально-морфологические признаки штамма Streptomyces coeruleorubidus 1533 ВКПМ Ac-890 | ||||
Агаровая среда | Рост воздушного мицелия | Цвет мицелия | Растворимый пигмент | |
Воздушного | Субстрактного | |||
№ 1 Гаузе | Хороший паутинистый | Бледно-розовый (Н 5) | Фиолетовый (А 3) | + |
Овсяная | Хороший | Розовый (Ж 3) | Красно-бурый (З 5) | + |
Чапека (глюкозо-аспарагиновая) | Хороший | От розового до голубовато-серого (Ж 3-Н 7) | Светло-фиолетовый (А 5) | + |
Линденбайна (глицерин-нитратная) | Скудный | Бледно-розовый (Н 5) | Темно-фиолетовый (Б 2) | + |
Глюкозо-нитратная № 2 Гаузе | Скудный | Бледно-розовый (Н 5) | Буровато-красный (Б 4) | + |
Треснера (с пептоном и лимонно-кислым железом) | Образуются меланоидные пигменты | + |
Таблица 2. | ||
Сравнительная антибиотическая активность нового штамма ВКПМ Ас-890 и штамма-продуцента прототипа | ||
Штамм-продуцент | Антибиотическая активность культуральной жидкости, мкг/мл | |
Даунорубицин | Антрациклиновый комплекс | |
Новый штамм | 2000 | 2500 |
Штамм-прототип | 500 | 950 |
Класс C12P19/56 с атомом кислорода сахаридного радикала, непосредственно связанным с конденсированной циклической системой из трех или более карбоциклических колец, например дауномицина, адриамицина