тест-система для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина i в образце цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда (варианты)

Формула изобретения

1. Тест-система для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина I в цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда, характеризующаяся тем, что она содержит иммунологическую планшету (1) с окном (2) для внесения исследуемого образца крови и окном (3) для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка (4) для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены подушка (5) с конъюгатами для нанесения исследуемого образца крови, фильтрационная подушка (6) для сепарации исследуемого образца крови, пористая мембрана (7) для проведения иммунохроматографической реакции и абсорбционная подушка (8) для создания тока жидкости, причем на подушке (5) с конъюгатами и поперек последней сформированы первая полоса (9) конъюгата частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, и вторая полоса (10) конъюгата частиц коллоидного золота с первыми мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I, на пористой мембране (7) поперек последней, сформированы конкурирующая полоса (11), содержащая слой адсорбированных первых или вторых моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, первая тестовая полоса (12), содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела, специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, вторая тестовая полоса (13), содержащая адсорбированные вторые моноклональные антитела к тропонину I, и контрольная полоса (14), содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM).

2. Тест-система для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина I в цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда, характеризующаяся тем, что она содержит иммунологическую планшету (1) с окном (2) для внесения исследуемого образца крови и окном (3) для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка (4) для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены подушка (5) с конъюгатами для нанесения исследуемого образца крови, фильтрационная подушка (6) для сепарации исследуемого образца крови, пористая мембрана (7) для проведения иммунохроматографической реакции и абсорбционная подушка (8) для создания тока жидкости, причем на подушке (5) с конъюгами и поперек последней сформированы первая полоса (9) конъюгата частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, и вторая полоса (10) конъюгата частиц коллоидного золота с первыми мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I, на фильтрационной подушке (6) и поперек последней нанесена полоса (16) конъюгата вторых моноклональных антител к тропонину I, связанных с биотином, на пористой мембране (7) поперек последней сформированы конкурирующая полоса (11), содержащая слой адсорбированных первых или вторых моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, первая тестовая полоса (12), содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела, специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, вторая тестовая полоса (13), содержащая адсорбированный авидин или стрептавидин, специфичный к биотину, и контрольная полоса (14), содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM).

3. Тест-система для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина I в цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда, характеризующаяся тем, что она содержит иммунологическую планшету (1) с окном (2) для внесения исследуемого образца крови и окном (3) для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка (4) для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены подушка (5) с конъюгатами для нанесения исследуемого образца крови, фильтрационная подушка (6) для сепарации исследуемого образца крови, пористая мембрана (7) для проведения иммунохроматографической реакции и абсорбционная подушка (8) для создания тока жидкости, причем на подушке (6) с конъюгатами и поперек последней сформированы первая полоса (9) конъюгата частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, и вторая полоса (10) конъюгата частиц коллоидного золота с первыми мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I, на фильтрационной подушке (6) и поперек последней нанесены конкурирующая полоса (11) вторых моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, и полоса (16) конъюгата вторых моноклональных антител к тропонину I, связанных с биотином, на пористой мембране (7) поперек последней сформированы первая тестовая полоса (12), содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела, специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, вторая тестовая полоса (13), содержащая адсорбированный авидин или стрептавидин, специфичный к биотину, и контрольная полоса (14), содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM).

4. Тест-система по пп.1-3, отличающаяся тем, что полосы на подушке (5) с конъюгатами, на фильтрационной подушке (6) и на пористой мембране (7) сформированы параллельно и на расстоянии друг от друга путем пропитки соответствующими реагентами с последующим удалением влаги.

5. Тест-система по пп.1-3, отличающаяся тем, что подушка (5) для нанесения конъюгата выполнена из целлюлозы или стеклянного микроволокна, или полиэфирного микроволокна длиной 15 мм с размером пор 20-25 мкм, толщиной 350 мкм и абсорбционной емкостью не менее 55 мг/см².

6. Тест-система по пп.1-3, отличающаяся тем, что фильтрационная подушка (6) выполнена из пористого материала полисульфона длиной 20 мм, толщиной 600-650 мкм и размером пор 55-57 мкл/см².

7. Тест-система по пп.1-3, отличающаяся тем, что пористая мембрана (7) выполнена из нитроцеллюлозы или полиэфирсульфона длиной 20 мм, толщиной 125-155 мкм, абсорбционной емкостью не менее 30 мг/см² , скоростью течения 90-110 с/40 мм.

8. Тест-система по пп.1-3, отличающаяся тем, что абсорбционная подушка (8) выполнена из пористого материала хлопкового пуха или стеклоцеллюлозного волокна длиной 15 мм и толщиной 400-450 мкм.

9. Тест-система по пп.1-3, отличающаяся тем, что подложка (4) для ламинирования выполнена из полистирола или акрилового адгезивного материала длиной 60 мм, толщиной 230-270 мкм.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к устройствам для иммунохроматографического одновременного выявления сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и белка тропонина I в цельной венозной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда и может быть использовано в биотехнологии, иммунологии и здравоохранении.

Сердечный БСЖК - кардиоспецифический цитоплазматический низкомолекулярный белок (15 кДа), в большом количестве содержащийся в кардиомиоцитах, осуществляет связывание и транспортировку жирных кислот внутри клетки и при некрозе миокарда быстро попадает в кровоток. Достоинством сБСЖК является высокая кардиоспецифичность вследствие максимальной концентрации сБСЖК именно в ткани миокарда. Сердечный БСЖК является ранним маркером некроза миокарда, он обладает сходной с миоглобином кинетикой, однако имеет большую специфичность. Диагностически значимое повышение уровня сБСЖК наблюдается через 1 час от начала болевого синдрома. Уровень сБСЖК в крови достигает максимальных значений через 6 часов после повреждения миокарда и возвращается к нормальному значению через 16-24 ч. Количество сБСЖК в крови увеличивается пропорционально обширности и глубине зоны инфаркта и достигает уровня более 200-300 нг/мл при верхней границе нормы 15 нг/мл. Таким образом, кардиомаркер сБСЖК является наиболее ранним из всех маркеров некроза миокарда, что особенно актуально учитывая стремительность событий, развивающихся при ОКС и высокий уровень неблагоприятных исходов именно первые его сутки. Тест-система по определению сБСЖК оказывает существенную помощь в диагностике ОКС, особенно в ситуациях с нетипичной клинической картиной и отсутствием значимых диагностических изменений электрокардиограммы. Кроме того, повышение уровня сБСЖК является предиктором неблагоприятных событий у больных с ОКС (инфаркт миокарда и сердечно-сосудистая смерть) в течение 1 года. Определение содержания сБСЖК в крови больных с подозрением на ОКС с целью раннего выявления некроза миокарда рекомендовано решением ежегодного конгресса Европейского кардиологического общества в 2000 г.

Тропонин I - белок, входящий в тропониновый комплекс, различие изоформ которого в миокарде и скелетных мышцах составляет около 90%. Благодаря этому, сердечный тропонин-I (сТн-I) является высокочувствительным и высокоспецифичным маркером повреждения миокарда. В норме тропонин I в кровотоке не обнаруживаются. При ишемическом повреждении миокарда тропонины поступают в периферический кровоток, где могут определяться через 6-8 часов. Максимальная концентрация отмечается через 14-28 часов и сохраняется в течение 3-7 суток, образуя длительное «диагностическое окно». Процесс освобождения тропонина I имеет однофазный характер, что обусловлено большим содержанием его цитоплазменной фракции. Если растворенный в цитозоле сБСЖК относительно быстро вымывается из зоны некроза, деструкция сократительного аппарата кардиомиоцитов более продолжительна по времени, поэтому увеличение уровня тропонинов определяется до 3-7 дней после начала ИМ. Этот длительный период выхода тропонинов в кровь увеличивает вероятность того, что положительный результат его определения был правильным, особенно в подострой фазе ИМ. Специфичность и чувствительность методов определения тропонинов в крови при ИМ составляет 92-95%.

Известно устройство для хроматографического анализа для обнаружения аналита в образце (патент РФ № 2124729, МПК G01N 33/53, опубл. 10.01.1999 г.). Устройство включает в себя (1), по меньшей мере, два строго плоских противоблока, один из которых содержит на своей поверхности хроматографическую среду; и (2) средство для установки противоблоков друг против друга и приложения туда давления, достаточного для переноса жидкости с одного противоблока на другой в направлении, строго перпендикулярном к противоблоку с целью нанесения образца на хроматографическую среду для обнаружения и/или определения вслед за тем аналита. Устройство может также включать: (1) по меньшей мере три строго плоских противоблока, отличающихся тем, что один из них содержит на своей поверхности хроматографическую среду, имеющую первый и второй концы; (2) средство для установки противоблоков друг против друга, по меньшей мере, в двух различных комбинациях и приложения туда давления, достаточного для переноса жидкости с одного противоблока к другому в направлении, строго перпендикулярном к противоблокам, так, что образец прикладывается к хроматографической среде и перетекает через нее от первого конца ко второму концу для обнаружения и/или определения аналита на хроматографической среде; и (3) по меньшей мере один аппликатор и один абсорбер, локализованные на одном из противоблоков и расположенные таким образом, что когда противоблок с аппликатором и абсорбером на нем устанавливается напротив противоблока, содержащего хроматографическую среду, на последнюю наносится жидкость, которая перетекает через нее от второго конца к первому, вследствие чего направление движения потока через хроматографическую среду изменяется на обратное, с целью обнаружения и/или определения аналита, осуществляемого после реверса потока через хроматографическую среду.

Однако данное устройство имеет достаточно сложную конструкцию, включает в себя источник повышенного давления для обеспечения прохождения жидкого образца вдоль пористых его элементов, а также не содержит компонентов для обеспечения обнаружения сБСЖК и тропонина I в образцах крови.

Известна тест-система для иммунохроматографического определения сердечного тропонина I для экспресс-диагностики инфаркта миокарда (патент Китая № 101059519, МПК G01N 33/558, опубл. 24.10.2007 г.), содержащая иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены фильтрационная подушка для нанесения исследуемого образца крови, подушка для нанесения конъюгата, пористая мембрана и абсорбционная подушка, причем подушка для нанесения конъюгата пропитана конъюгатом наночастиц коллоидного золота (размер 15-25 нм) с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному тропонину I, на пористой мембране, поперек последней и параллельно друг другу, сформированы тестовая полоса, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела, и контрольная полоса, содержащая адсорбированные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши. Изобретение имеет простую подготовку, действие и высокую чувствительность (1,0 нг/мл) с устойчивым результатом. Повышение концентрации тропонина I при инфаркте миокарда отмечается через 4-6 часов. Кинетика его выхода в кровь может представлять двухфазную кривую с начальным пиком через 15-20 часов и менее высоким вторым пиком через 60-80 часов после развития инфаркта миокарда.

Однако данная тест-система не позволяет выявлять ранний маркер сБСЖК, уровень которого значительно превышает (от 15 нг/мл и выше) по сравнению со здоровыми людьми в первые 1-6 часов после инфаркта миокарда. Уровень сБСЖК в крови достигает максимальных значений через 6 часов после повреждения миокарда и возвращается к нормальному значению через 16-24 ч.

Известна тест-система для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, для экспресс-диагностики инфаркта миокарда (патент Китая № 1704757, МПК G01N 33/558, опубл. 07.12.2005 г.), содержащая иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены фильтрационная подушка для нанесения исследуемого образца крови, подушка для нанесения конъюгата, пористая мембрана и абсорбционная подушка, причем подушка для нанесения конъюгата пропитана конъюгатом частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, на пористой мембране, поперек последней и параллельно друг другу, сформированы тестовая полоса, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела, и контрольная полоса, содержащая адсорбированные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши. Кардиомаркер сБСЖК присутствует в крови здоровых людей. Индивидуальная норма содержания белка варьирует от 5 до 7 нг/мл. Диагностически значение (уровень патологических значений) сБСЖК варьирует от 10 до 15 нг/мл. В результате таких особенностей белка возникает неспецифическое выявления маркера.

В этой связи предлагаемый в данном аналоге иммунохроматографический тест позволяет выявлять ранний маркер сБСЖК в количестве 5 нг/мл, т.е. обладает слишком высокой чувствительностью, что приводит к появлению большого количества ложноположительных результатов и, как следствие, к низкой специфичности и низкой точности теста, что позволяет применять их лишь в качестве ориентировочного теста. Кроме того, данная тест-система не позволяет выявлять поздний маркер тропонин I, что сужает ее функциональные возможности.

Известна тест-система для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты в цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда (патент РФ на полезную модель № 87262, МПК G01N 33/558, опубл. 27.09.2009 г.), содержащая иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены фильтрационная подушка для нанесения исследуемого образца крови, подушка для нанесения конъюгата, пористая мембрана и абсорбционная подушка, причем подушка для нанесения конъюгата пропитана конъюгатом частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, на пористой мембране, поперек последней и параллельно друг другу, сформированы тестовая полоса, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела, и контрольная полоса, содержащая адсорбированные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши. На пористой мембране, поперек последней сформирована конкурирующая полоса, расположенная вдоль края подушки для нанесения конъюгата и содержащая слой адсорбированных первых моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты. Данная тест-система лишена недостатков предыдущего аналога.

Однако тест-система не позволяет выявлять поздний маркер тропонин I, что сужает ее функциональные возможности.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является комбинированный тест-микрочип для диагностики восьми сердечно-сосудистых заболеваний (патент Китая № 2783324, МПК G01N 33/543, опубл. 24.05.2006 г.) и содержит антитела типа anti-crp, anti-Myoglobin, anti-cTnI (сердечный troponin I), anti-cTnT (сердечный troponin Т), anti-nt-probnp, anti-ck-mb (creatine kinase isozymes-MB), anti-h-fabp (сердечный белок, связывающий жирные кислоты), anti-GPBB (glycogen phosphorylase isoenzyme BB).

Однако такой тест является сложным в изготовлении и дорогостоящим изделием, требует специального оборудования для прочтения результатов, что не обеспечивает требованиям «прикроватной» экспресс-диагностики.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание более простой и надежной «прикроватной» комбинированной иммунохроматографической экспресс тест-системы для одновременного быстрого определения сБСЖК и тропонина I.

Указанный технический результат достигается тем, что тест-система (первый вариант ее выполнения) для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина I в цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда, согласно изобретению содержит иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены подушка с конъюгатами для нанесения исследуемого образца крови, фильтрационная подушка для сепарации исследуемого образца крови, пористая мембрана для проведения иммунохроматографической реакции и абсорбционная подушка для создания тока жидкости, причем на подушке с конъюгатами и поперек последней сформированы первая полоса конъюгата частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами (F9), специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, и вторая полоса конъюгата частиц коллоидного золота с первыми мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I (1-60), на пористой мембране и поперек последней сформированы конкурирующая полоса, содержащая слой адсорбированных первых (F9) или вторых (F10) моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, первая тестовая полоса, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела (F10), специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, вторая тестовая полоса, содержащая адсорбированные вторые моноклональные антитела к тропонину I (IC-19), и контрольная полоса, содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM).

Указанный технический результат достигается также тем, что тест-система (второй вариант ее выполнения) для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина I в цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда, согласно изобретению содержит иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены подушка с конъюгатами для нанесения исследуемого образца крови, фильтрационная подушка для сепарации исследуемого образца крови, пористая мембрана для проведения иммунохроматографической реакции и абсорбционная подушка для создания тока жидкости, причем на подушке с конъюгатами и поперек последней сформированы первая полоса конъюгата частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами (F9), специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, и вторая полоса конъюгата частиц коллоидного золота с первыми мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I (I-60), на фильтрационной подушке и поперек последней нанесена полоса конъюгата вторых моноклональных антител к тропонину I (IC-19), связанных с биотином, на пористой мембране и поперек последней сформированы конкурирующая полоса, содержащая слой адсорбированных первых (F9) или вторых (F10) моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, первая тестовая полоса, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела (F10), специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, вторая тестовая полоса, содержащая адсорбированный авидин или стрептавидин, специфичный к биотину, и контрольная полоса, содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM).

Указанный технический результат достигается также тем, что тест-система (третий вариант ее выполнения) для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина I в цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда, согласно изобретению содержит иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены подушка с конъюгатами для нанесения исследуемого образца крови, фильтрационная подушка для сепарации исследуемого образца крови, пористая мембрана для проведения иммунохроматографической реакции и абсорбционная подушка для создания тока жидкости, причем на подушке с конъюгатами и поперек последней сформированы первая полоса конъюгата частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами (F9), специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, и вторая полоса конъюгата частиц коллоидного золота с первыми мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I (I-60), на фильтрационной подушке и поперек последней нанесены конкурирующая полоса вторых моноклональных мышиных антител (F10), специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, и полоса конъюгата вторых моноклональных антител к тропонину I (IC-19), связанных с биотином, на пористой мембране и поперек последней сформированы первая тестовая полоса, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела (F10), специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, вторая тестовая полоса, содержащая адсорбированный авидин или стрептавидин, специфичный к биотину, и контрольная полоса, содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM).

Полосы на подушке с конъюгатами, на фильтрующей подушке и на пористой мембране сформированы параллельно и на расстоянии друг от друга путем пропитки соответствующими реагентами с последующим удалением влаги.

Подушка для нанесения конъюгата выполнена из целлюлоза, или стеклянного микроволокна, или полиэфирного микроволокна длиной 15 мм с размером пор 20-25 мкм, толщиной 350 мкм и абсорбционной емкостью не менее 55 мг/см ².

Фильтрационная подушка выполнена из пористого материала полисульфона длиной 20 мм, толщиной 600-650 мкм и размером пор 55-57 мкл/см². Пористая мембрана выполнена из нитроцеллюлозы или полиэфирсульфона длиной 20 мм, толщиной 125-155 мкм, абсорбционной емкостью не менее 30 мг/см², скоростью течения 90-110 сек/40 мм. Абсорбционная подушка выполнена из пористого материала хлопкового пуха или стеклоцеллюлозного волокна длиной 15 мм и толщиной 400-450 мкм. Подложка для ламинирования выполнена из полистирола или акрилового адгезивного материала длиной 60 мм, толщиной 230-270 мкм.

Указанные технические характеристики элементов тест-системы позволяют надежно функционировать, снижать количество ложноположительных результатов путем повышения специфичности и точности теста и одновременно определять сБСЖК и тропонина I.

Изобретение поясняется следующими чертежами. На фиг.1 приведена схема внешнего вида тест - системы, выполненной в виде иммунологической планшеты. На фиг.2 представлена схема расположения внутренних элементов тест-системы в иммунологической планшете (первый вариант выполнения). На фиг.3 представлена схема расположения внутренних элементов тест-системы в иммунологической планшете (второй вариант выполнения). На фиг.4 представлена схема расположения внутренних элементов тест-системы в иммунологической планшете (третий вариант выполнения).

Тест-система «Кардиотест» для проведения иммунохроматографического анализа содержит иммунологическую планшету 1 с приемным овальным окном 2 для внесения образца цельной крови и прямоугольным окном 3 для просмотра результатов. Внутри иммунологической планшеты 1 размещена подложка 4 для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены подушка 5 с коньюгатами для нанесения исследуемого образца крови, фильтрационная подушка 6 для сепарации исследуемого образца крови, пористая хроматографическая мембрана 7 для проведения иммунохроматографической реакции и абсорбционная подушка 8 для создания тока жидкости.

В первом варианте выполнения тест-системы (фиг.2) на подушке 5 с конъюгатами и поперек последней сформированы первая полоса 9 конъюгата частиц коллоидного золота с моноклональными мышиными антителами (F9), специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, и вторая полоса 10 конъюгата частиц коллоидного золота с мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I (I-60). На пористой мембране 7, поперек последней, сформированы конкурирующая полоса 11, содержащая слой адсорбированных первых (F9) или вторых (F10) моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, первая тестовая полоса 12, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела (F10), специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, вторая тестовая полоса 13, содержащая адсорбированные моноклональные антитела к тропонину I (IC-19), и контрольная полоса 14, содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM). Полосы 9 и 10 на подушке 5 с конъюгатами и полосы 11, 12, 13 и 14 на пористой мембране 7 сформированы параллельно и на расстоянии друг от друга путем пропитки соответствующими реагентами с последующим удалением влаги. Конкурирующая полоса 11 на пористой мембране 7 расположена вдоль и у края фильтрационной подушки 6 для сепарации исследуемого образца крови.

Кроме того, имеется участок 15 для нанесения образца цельной крови на подложке 5, расположенный перед полосами 9 и 10 конъюгатов частиц коллоидного золота с моноклональными антителами. Причем овальное окно 2 планшеты 1 расположено над участком 15 на подложке 5.

Во втором варианте выполнения тест-системы (фиг.3) на подушке 5 с конъюгатами и поперек последней сформированы первая полоса 9 конъюгата частиц коллоидного золота с моноклональными мышиными антителами (F9), специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, и вторая полоса 10 конъюгата частиц коллоидного золота с мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I (I-60). На пористой хроматографической мембране 7 и поперек последней сформированы конкурирующая полоса 11, содержащая слой адсорбированных первых (F9) или вторых (F10) моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, первая тестовая полоса 12, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела (F10), специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, вторая тестовая полоса 13, содержащая адсорбированный авидин или стрептавидин, специфичный к биотину, и контрольная полоса 14, содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM). На фильтрационной подушке 6 и поперек последней нанесена полоса 16 конъюгата моноклональных антител к тропонину I (IC-19), связанных с биотином.

В третьем варианте выполнения тест-системы (фиг.4) на подушке 5 с конъюгатами и поперек последней сформированы первая полоса 9 конъюгата частиц коллоидного золота с моноклональными мышиными антителами (F9), специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, и вторая полоса 10 конъюгата частиц коллоидного золота с мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I (I-60). На фильтрационной подушке 6 и поперек последней сформированы конкурирующая полоса 11, содержащая слой адсорбированных вторых моноклональных мышиных антител (F10), специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, и полоса 16 конъюгата моноклональных антител к тропонину I (IC-19), связанных с биотином. На пористой хроматографической мембране 7 и поперек последней сформированы первая тестовая полоса 12, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела (F10), специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, вторая тестовая полоса 13, содержащая адсорбированный авидин или стрептавидин, специфичный к биотину, и контрольная полоса 14, содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM).

В таблице 1 приведена характеристика материалов, из которых изготовлены элементы тест-системы.

Таблица 1
Характеристика материалов тест-системы
Наименование элемента тест-системы	Состав материалов	Характеристики материалов
Подушка 5 с конъюгатами для нанесения образца крови	целлюлоза или стеклянное микроволокно; или полиэфирное микроволокно;	- размер пор 20-25 мкм; - абсорбционная емкость 55 мг/см2; - высвобождение конъюгата (спустя 90 сек) 89%; - толщиной 350 мкм;
Фильтрационная подушка 6	пористый материал из полисульфона	- толщиной 600-650 мкм; - объем пор 5б,8 мкл/см2 ;
Пористая мембрана 7	нитроцеллюлоза, или полиэфирсульфон, или нейлон, или поливинилиденхлорид на полистирольной подложке	толщина мембраны 125-155 мкм - толщина подложки 100 мкм; - абсорбционной емкостью не менее 30 мг/см2, - скорость потока образца 90-110 сек/40 мм;
Абсорбционная подушка 8	пористый материал из хлопкового пуха, или стеклоцеллюлозное волокно	- толщина 429 мкм; - сухой вес 12,4 мг/см2;
Подложка 4 для ламинирования	белый полистирол или акриловый адгезивный материал	- толщина подложки 254 мкм +/-10%;

Во всех вариантах выполнения тест-системы полосы 9 и 10 на подушке 5 с конъюгатами, полоса 16 на фильтрационной подушке, полосы 12, 13 и 14 на пористой мембране 7 и полоса 11 на мембране 7 (1 и 2 варианты тест-системы) или на фильтрационной подушке 6 (3-й вариант выполнения тест системы) сформированы параллельно и на расстоянии друг от друга путем пропитки соответствующими реагентами с последующим удалением влаги.

В первом (фиг.2) и втором (фиг.3) вариантах выполнения тест-системы конкурирующая полоса 11 на пористой хроматографической мембране 7 расположена вдоль и у края фильтрационной подушки 6 для сепарации исследуемого образца крови, а в третьем варианте выполнения тест-системы (фиг.4) конкурирующая полоса 11 на фильтрационной подушке 6 нанесена вдоль и у края конъюгатной подушки 5.

Конструкция иммунологической планшеты 1 обеспечивает контакт подушек 5 и 6, пористой мембраны 7 и абсорбционной подушки 8 друг с другом и позволяет образцу крови свободно проходить все пористые материалы за счет действия капиллярных сил.

На конъюгатной подушке на линиях 9 и 10 содержание конъюгатов моноклональных антител с частицами коллоидного золота составляет 8-10 единиц оптической плотности (ОП ед). На фильтрационной подушке полоса 16 содержит конъюгат моноклональных антител к тропонину I с биотином в соотношении 1:8-1:16.

На мембране 7 конкурирующая полоса 11 содержит 0,9-1,0 мг/мл моноклональных антител; тестовая полоса 12 содержит 1,0-1,1 мг/мл моноклональных антител; тестовая полоса 13 в третьем варианте выполнения тест-системы содержит авидина (стрептавидина) в концентрации 0,8-1,5 мг/мл, а контрольная полоса 14 содержит поликлональные антитела в количестве 1,3-1,5 мг/мл.

Ниже приведена характеристика антител, используемых в тест-системе для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина I в цельной крови.

1. Мышиные моноклональные антитела, специфичные к белку сБСЖК (FABP)

1.1. Моноклон F9, специфичен к целой молекуле сердечного FABP, тип IgG1 - применяется в полосе 9 (конъюгирован с коллоидными частицами золота) и конкурирующей полосе 11.

1.2. Моноклон F10, специфичен к целой молекуле сердечного FABP, тип IgG1 (наносится на первую тестовую полосу 12 и конкурирующую полосу 11).

2. Мышиные моноклональные антитела, специфичные к белку тропонина I

2.1. Моноклон № 1(I-60) cTnI, тип IgG1, полученный иммунизацией молекулой тропонина I, специфичный к отдельным антигенным детерминантам молекулы cTnI.

2.2. Моноклон № 2 (IC-19) cTnI, тип IgG2b, полученный иммунизацией молекулой тропонина I, специфичен к центральной части молекулы с устойчивой антигенной детерминантой, протестированный от протеолитической деградации антигена (наносится на тестовую полосу 13 в первом варианте) и применяется в полосе 16 (связанный с биотином)

3. Моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM). Аффинно-очищенная фракция иммуноглобулинов кроличьей антисыворотки против к Fc-фрагментов иммуноглобулинов мыши. Применяется для связывания конъюгатов мышиных моноклональных антител на контрольной полосе 14.

Реакция авидин-биотин. Реакция между авидином (стрептавидином) и биотином позволяет осуществлять связь между различными компонентами специфического комплекса на твердой фазе. Для нее характерны высокое значение константы связывания (10¹⁵ М ^-1), легкость присоединения биотина к антителам без заметного нарушения их антительной активности, высокая стабильность авидина (стрептавидина).

Биотин представляет собой один из многих водорастворимых компонентов комплекса витамина В и является коферментом для ферментов карбоксилирования. Его молекулярная масса равна 244,3 Да. Стрептавидин - белок, вырабатываемый бактерией Streptomycces avidinii.

Авидин, получаемый из яиц, представляет собой белок с молекулярной массой 62400 Да и изоэлектрической точкой pI=10,5. Один мг авидина связывает до 14 мкг биотина. Образующийся при этом комплекс устойчив в интервале рН 2-13. Авидин имеет 4 сайта связывания с биотином. Однако из-за стерических напряжений может взаимодействовать только с двумя молекулами биотинилированного белка.

Заявляемая тест-система «Кардиотест» (первый вариант) работает следующим образом. Кровь в объеме 100-150 мкл (3-5 капель) наносится через приемное окно 2 на подушку 5 с конъюгатами. Образец крови, пройдя через подушку 5, под действием капиллярных сил пропитывает полосы 9 и 10, где присутствующие в крови белки-маркеры (сБСЖК и/или тропонин I) вступают в реакцию с соответствующими белку моноклональными антителами, меченными коллоидным золотом, образуя окрашенный иммунный комплекс антиген-антитело. Далее иммунный комплекс впитываются фильтрационной подушкой 6, где происходит сепарация крови (отделение эритрацитарной массы). При определении тропонина I требуется высокая чувствительность тест-системы - 1 нг/мл и выявление как цельной молекулы, так различных ее фрагментов. Предельная способность маркера коллоидного золота выявлять вещество колеблется от 0, 5 до 1 нг/мл выявляемого агента. В предлагаемой конструкции комплексы антиген + антитело, меченное частицами коллоидного золота, формируются сразу на конъюгатной подушке 5 и, тем самым, обеспечивается достаточное время этого контакта и снижается вероятность гидролиза лабильных молекул белка тропонина I. Проходя через конъюгатную подушку 5 и фильтрационную подушку 6, связанный комплекс в некоторой степени концентрируется, не распадается и не оседает на них вместе с эритроцитами, свободно проходит с потоком плазмы на пористую хроматографическую мембрану 7. Образовавшийся окрашенный иммунный комплекс (состоящий из одного иммунного комплекса или двух комплексов) движется под действием капиллярных сил вдоль пористой мембраны 7, пересекает конкурирующую полосу 11 и взаимодействует с нанесенными на ней адсорбированными первыми или вторыми моноклональными мышиными антителами F9 или F10, специфичными к сБСЖК. Функция полосы 11 является снижением аналитической чувствительности теста до 15 нг/мл за счет конкурентного связывания сБСЖК с моноклональными антителами F9 или F10, иммобилизованными на этой полосе 11. Указанная полоса не окрашивается поскольку диагностически значимым считается повышение уровня сБСЖК в крови от 15 нг/мл. Уменьшение аналитической чувствительности теста до 15 нг/мл приводит к увеличению специфичности при сохранении необходимого уровня диагностической чувствительности. Далее иммунный комплекс, перемещаясь под действием капиллярных сил, пересекает первую тестовую полосу 12 и взаимодействует с иммобилизованными на ней вторыми моноклональными мышиными антителами F10 к БСЖК. В результате при наличии сБСЖК в образце крови выше порогового значения первая тестовая полоса 12 окрашивается в пурпурный цвет. Если образец крови не содержит сБСЖК в концентрации выше пороговой, первая тестовая полоса 12 остается не окрашенной. Далее не связавшийся на первой тестовой полосе 12 комплекс движется далее вдоль пористой мембраны 7 до второй тестовой полосы 13 с нанесенными антителами № 2 к тропонину I. Если в образце тропонин I содержится в концентрации 1,1 нг/мл и выше, то вторая тестовая полоса 13 окрашивается в пурпурный цвет (вторая окрашенная полоса). Если же тропонин I в пробе ниже порогового значения (ниже 1,1 нг/мл), то тестовая полоса 13 не окрашивается. Далее не связавшиеся конъюгаты доходят до контрольной полосы 14 и взаимодействуют с иммобилизованными кроличьими поликлональными антителами к иммуноглобулинам мыши. В результате контрольная полоса 14 также окрашивается в пурпурный цвет (третья окрашенная полоса). Контрольная полоса 14 является внутренним контролем теста и, если анализ проведен правильно, должна проявляться всегда, независимо от присутствия сБСЖК и тропонина I в образце крови.

Результаты определяются визуально в течение 5-30 минут. При положительном результате тестирования сБСЖК и тропонина I появляются три окрашенные полосы - две тестовые и контрольная. Если в образце присутствует только ранний маркер сБСЖК, то окрашивается первая линия. Это происходит во временном промежутке от 1 до 24 часов от начала заболевания. Если в образце присутствует более поздний маркер тропонин I, то окрашивается вторая тестовая линия. Временной промежуток от 6 до 48 часов от начало болевого синдрома. Если образец взят в промежутке от 6 до 24 часов от начала заболевания, то проявляются все три полосы. Интенсивность цвета контрольной и тестовых полос может быть различной. При отрицательном результате появляется только одна полоса - контрольная. Если контрольная полоса не проявилась, результаты теста считаются недействительными.

Заявляемая тест-система «Кардиотест» (второй и третий вариант) работает следующим образом.

Кровь в объеме 100-150 мкл (3-5 капель) наносится через приемное окно 2 на подушку 5 с конъюгатами, которая впитывается пористым материалом. Образец крови проходит за счет капиллярных сил вдоль конъюгатной подушки 5. Если в образце присутствует сБСЖК, то он взаимодействует с конъюгатом коллоидного золота и антитела F9 на полосе 9. В результате образуется окрашенный иммунный комплекс антиген-антитело. Образовавшийся окрашенный иммунный комплекс движется под действием капиллярных сил вдоль фильтрационной подушки 6 и мембраны 7, пересекает конкурирующую полосу 11 (во втором варианте конструкции тест-системы на мембране 7, и в третьем варианте конструкции тест-системы на фильтрующей подушке 6) и взаимодействует с нанесенными на ней адсорбированными моноклональными мышиными антителами F9, или F10, специфичными к сБСЖК. Функцией данной полосы 11 является снижение аналитической чувствительности теста не ниже 15 нг/мл за счет конкурентного связывания сБСЖК с моноклональными антителами F9 или F10, иммобилизованными на линии 11, не уменьшая интенсивности окрашивания этой тестовой полосы. Поскольку диагностически значимым считается повышение уровня сБСЖК в крови до 15 нг/мл, то уменьшение аналитической чувствительности теста до 15 нг/мл приводит к увеличению специфичности при сохранении необходимого уровня диагностической чувствительности.

Нанесение на фильтрующую подушку 6 конкурирующей полосы 11 с моноклональными антителами F10 (3-й вариант тест-ситемы) позволяет использовать их в меньшей концентрации, что позволяет экономить реагенты. Например, концентрация антител F10 на конкурирующей линии 11, расположенной на мембране 7, составляет 1 мг/мл, а на фильтрационной подушке 6 требуется концентрация антител F10 на полосе 11 около 0,3 мг/мл. Это свойство определяется местоположением полосы 11 на планшете 1, временем реагирования компонентов, смываемостью антител с материала.

Далее иммунный комплекс движется под действием капиллярных сил вдоль нитроцеллюлозной мембраны 7, пересекает первую тестовую полосу 12 и взаимодействует с иммобилизованными на линии моноклональными мышиными антителами F10 к БСЖК. В результате при наличии сБСЖК в образце крови выше порогового значения первая тестовая полоса 12 окрашивается в пурпурный цвет. Если образец крови не содержит сБСЖК в концентрации выше пороговой, первая тестовая полоса 12 остается не окрашенной.

Если в образце присутствует тропонин I, то данный белок-маркер под действием капиллярных сил впитывается пористым материалом конъюгатной подушки 5, при прохождении которой тропонин I взаимодействует на полосе 10 с конъюгатом коллоидного золота и моноклональных антител (I-60). В результате образуется окрашенный иммунный комплекс антиген-антитело. Образовавшийся окрашенный иммунный комплекс движется под действием капиллярных сил вдоль пористых материалов подушек 5 и 6, пересекает полосу 16 на фильтрационной подушке 6 с нанесенным на нее конъюгатом моноклональных антител к тропонину I (IC-19), связанных с биотином. Образуется тройной комплекс антитело (I-60)-антиген тропонин I-антитело (IC-19).

Далее связавшийся комплекс движется по нитроцеллюлозной мембране 7 до второй тестовой линии 13 с нанесенным авидином (или стрептавидином). Комплекс связывается посредством сродства биотина из комплекса и авидина (стрептавидина), нанесенного на тестовую полосу 13. Если в образце тропонин I содержится в концентрации 0,9-1 нг/мл, то вторая тестовая линия окрашивается в пурпурный цвет (вторая окрашенная полоса 13). Если же тропонин I в пробе ниже порогового значения, то тестовая полоса 13 не окрашивается.

Затем не связавшиеся конъюгаты реагентов доходят до контрольной полосы 14 и взаимодействуют с иммобилизованными кроличьими антителами к иммуноглобулинам мыши. В результате контрольная линия 14 также окрашивается в пурпурный цвет (третья окрашенная полоса 14). Контрольная полоса 14 является внутренним контролем теста и, если анализ проведен правильно, должна проявляться всегда, независимо от присутствия сБСЖК или тропонина I в образце крови.

Результаты определяются визуально в течение 10-30 минут. При наличии в образце сБСЖК и тропонина I появляются три окрашенные полосы - две тестовые и контрольная. Если в образце присутствует только ранний маркер сБСЖК, то окрашивается первая тестовая линия. Это происходит, если забор крови осуществляли во временном промежутке от 1 до 24 часов от начала заболевания. Если в образце присутствует только один более поздний маркер тропонин I, то окрашивается только вторая тестовая линия. Временной промежуток для выявления этого маркера от 6 до 48 часов от начало болевого синдрома. Если образец взят в промежутке от 6 до 24 часов от начала заболевания, то проявляются все три полосы. Интенсивность цвета контрольной и тестовых полос может быть различной.

При отрицательном результате появляется только одна полоса - контрольная. Если контрольная полоса не проявилась, результаты теста считаются недействительными.

Данные исследований, подтверждающие технический результат, достигаемый заявляемой тест-системой. Кардиомаркер сБСЖК присутствует в крови здоровых людей. Индивидуальная норма содержания белка варьирует от 5 до 7 нг/мл. Диагностический уровень (уровень патологических значений) сБСЖК варьирует от 12 до 15 нг/мл. В результате таких особенностей белка возникает неспецифическое выявление маркера. При использовании теста для экспресс-диагностики высокая чувствительность не всегда необходима, что позволяет применять их лишь в качестве ориентировочного теста. Конкурирующая полоса 11 обеспечивает снижение аналитической чувствительности теста до 15 нг/мл за счет конкурентного связывания БСЖК с моноклональными антителами F9, иммобилизованными на этой полосе 11. Поскольку диагностическим значимым считается уровень сБСЖК в крови от 15 нг/мл, то уменьшение аналитической чувствительности теста до 15 нг/мл приводит к увеличению специфичности теста при сохранении необходимого уровня диагностической чувствительности. Действительно, применение конкурирующей полосы 11 позволяет значительно уменьшить количество ложноположительных результатов, при этом не увеличивая количество ложноотрицательных и, таким образом, при сохранении прежнего уровня диагностической чувствительности увеличивается специфичность и, как следствие, точность теста. В таблице 2 (первый вариант) и таблице 3 (второй и третий варианты) приведены данные диагностических показателей заявляемой тест-системы, которые подтверждают заявляемый технический результат.

Тест-система для определения Тропонина I требует высокой чувствительности до 1 нг/мл. Предельная способность маркера коллоидного золота выявлять вещество от 1 нг/мл выявляемого агента.

Во втором и третьем вариантах выполнения тест-системы повышение чувствительности теста обеспечивается за счет взаимодействия биотина и авидина (стрептавидина). Биотин, связанный с антителом, смывается с фильтрационной подушки 6, связывается на тестируемой полосе 13 с авидином (как вариант стрептавидином). Визуализацию этого комплекса обеспечивает конъюгат коллоидного золота.

Заявляемая тест-система позволяет увеличить чувствительность в диапазоне 0,9-1 нг/мл.

Таблица 2
Данные диагностических показателей заявляемой тест-системы (первый вариант)
Время, часы	1-3	3-6	6-12	12-24	24-48
Чувствительность
сБСЖК	88	93	99	98	Не определяется
Тропонин I	Не определяется	50	70	92	95
Специфичность
сБСЖК	94	97	100	98	Не определяется
Тропонин I	Не определяется	70	91	93	95
Точность
сБСЖК	83	91	97	94	Не определяется
Тропонин I	Не определяется	54	87	95	97

Диагностические показатели рассчитывались по формулам:

Чувствительность -

TPR=TP/(TP+FN);

Специфичность -

SPC=TN/(FP+TN);

Точность -

ACC=(TP+TN)/N,

где ТР-достоверно положительный результат,

FN-достоверно отрицательный результат,

FP-ложноположительный результат,

FN-ложноотрицательный результат,

N-количество всех пациентов.

Применение тройного комплекса антитело (I-60) коллоидное золото- антиген тропонин I-антитело (IC-19) биотин, который затем связывается с авидином на тестовой линии, позволяет значительно уменьшить количество ложноотрицательных результатов, при этом не увеличивая количество ложноположительных результатов и, таким образом, при сохранении высокого уровня специфичности обеспечивается увеличение чувствительности определения тропонина I.

Таблица 3
Данные диагностических показателей заявляемой тест-системы (второй и третий варианты)
Время, часы	1-3	3-6	6-12	12-24	24-48
	Чувствительность
сБСЖК	88	93	99	98	Не определяется
Тропонин I	Не определяется	59	94	97	98
	Специфичность
сБСЖК	94	97	100	98	Не определяется
Тропонин I	Не определяется	73	93	95	95

Одновременное определение в заявляемой тест-системе специфичного сБСЖК и тропонина I позволяет обеспечить надежный и быстрый диагноз и увеличить временной интервал диагностики до 48 часов. Комбинация этих маркеров позволяет избежать недостатков тестов, содержащих только один из указанных маркеров. При наличии почечной недостаточности у пациента позволит избежать неспецифических (ложноположительных) реакций. Применение теста позволит врачу при отсутствии у пациента четко выраженной клинической картины инфаркта миокарда и отсутствии четких признаков в кардиограмме, независимо от временного интервала от начала болевого синдрома, принять решение о срочной госпитализации больного. По тем же причинам необходимо иметь комбинированные тесты для диагностики инфаркта миокарда в фельдшерско-акушерских пунктах. Положительный результат анализа позволит обоснованно вызвать скорую помощь или бригаду санавиации из ближайшего места ее нахождения. Малые размеры и вес иммунохроматографических тестов позволяют использовать их участковым врачом или врачом общей практики при посещении больного на дому.